Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

Immunology and Infection

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Summary

Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour découvrir Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Ce protocole peut readly être adapté pour d’autres maladies infectieuses émergentes.

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Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

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Abstract

Puces à haute densité de peptide permettent le criblage de plus de six mille peptides sur une lame de microscope standard unique. Cette méthode peut être appliquée pour la découverte de médicaments, identification des cibles thérapeutiques et l’élaboration du diagnostic. Nous présentons ici un protocole pour découvrir Zika virus (ZIKV) diagnostic des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Un échantillon de sérum humain validé pour les infections ZIKV sont incubée avec un microarray peptides haute densité contenant l’ensemble des protéines ZIKV traduit en 3 423 unique 15 linéaire acides aminés (aa) les résidus avec un chevauchement de résidus 14-aa imprimé en double exemplaire. Coloration avec différents anticorps secondaires dans le même tableau, nous avons détecté des peptides qui lient l’immunoglobuline M (IgM) et les anticorps de l’immunoglobuline G (IgG) présents dans le sérum. Ces peptides ont été choisis pour plus des expériences de validation. Dans ce protocole, nous décrivons la stratégie suivie pour concevoir, traiter et analyser un microarray peptides haute densité.

Introduction

Diagnostic de virus (ZIKV) de zika basé sur les symptômes cliniques est difficile parce qu’elle partage des vecteurs, répartition géographique et des symptômes avec la Dengue et Chikungunya virus infection1. Étant donné le risque de résultats défavorables de la grossesse chez les femmes infectées par ZIKV pendant la grossesse, il est important de distinguer entre les 3 virus. Bien que les tests de diagnostics moléculaires actuels sont spécifiques, ils sont seulement utiles dans le sang ou la salive au cours de la période relativement courte de l’infection aiguë2,3. Analyses sérologiques sont essentiels pour le diagnostic en dehors de cette période initiale d’infection4.

Le développement d’un test sérologique spécifique de ZIKV est difficile pour deux raisons : tout d’abord, les antigènes de Zika répondant par le système immunitaire humain à ne sont pas actuellement connus ; et séquences d’acides aminés flavivirus seconde, conservée induisent la réactivité des anticorps. Notre objectif était de découvrir des peptides spécifiques ZIKV uniques à utiliser dans le diagnostic. Différentes approches ont été développées aux bibliothèques de peptide écran couvrant les protéines entières dont phage, bactérienne, et surface de levure afficher5,6,7,8,9, 10. Notre stratégie a consisté à utiliser un microarray peptides haute densité qui permet des projections de sérologique rapide et peu coûteuse haut débit11,12 , et par la suite les peptides identifiés peuvent être utilisés pour améliorer l’actuelle sérologique tests pour la détection de l’infection à ZIKV.

Ce protocole permet la découverte de Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray » (Figure 1). La biopuce peptide haute densité a été produite à l’aide de la technologie d’impression laser peptide. La séquence entière de protéine ZIKV composé de 3 423 résidus d’acide aminé issu de la souche polynésienne Français (GenBank : KJ776791.2), a été imprimé sur une lame de verre standard dans des blocs de 15 résidus linéaires avec un chevauchement de 14 acides aminés en double exemplaire pour une total de 6 846 taches de peptide. Outre les peptides de séquence protéique Zika entières, la biopuce utilise hémagglutinine grippe peptides (HA) pour les contrôles internes.

Un Zika validé positive échantillon de sérum provenant de Wadsworth Center (Albany, NY), servait à identifier des immunoglobulines M (IgM) et peptides réactifs immunoglobuline G (IgG). Après incubation avec l’exemple du jour au lendemain, la biopuce était tachée avec un anticorps conjugué fluorochrome secondaire (anti-homme IgM ou anti-IgG humaines) et analysée sur un scanner de microarray. Quantification des intensités spots et annotation de peptide a été réalisée avec un logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce.

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Protocol

Ces données font partie d’une étude en cours menée au Collège de dentisterie de l’Université de New York et ont été approuvées par l’Institutional Review Board de la New York University School of Medicine, la CISR # H10-01894. Les échantillons cliniques utilisées dans cette étude ont été dépersonnalisées échantillons précédemment utilisés pour le diagnostic et avec la permission de la Wadsworth Center de New York State Department of Health, Albany, NY.

1. installation de la coulisse de Microarray peptides ZIKV haute densité dans un bac spécifique d’Incubation

  1. Gérer la lame de verre par les bords à l’aide de gants sans poudre. Les dimensions de lame de verre sont 75,4 mm par 25,0 mm et 1 mm d’épaisseur. Placez la diapositive dans le bac de l’incubation avec la surface de la puce vers le haut.
  2. Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de microarray. Afin d’assurer une bonne position, recouvrir les trous de vis de la garniture et la plaque de base.
  3. Placer la partie supérieure de la barre d’État sur le sceau pour créer une chambre de microarray.
  4. Fixez la lame dans la barre d’État en serrant tout aussi les vis moletées l’un après l’autre à la main dans un modèle alternatif à partir de l’angle supérieur gauche, suivie en bas à droite. Placez le couvercle du bac à l’incubation.

2. contexte Interaction Detection : Coloration la biopuce avec anticorps secondaires

Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards et de blocage, des anticorps secondaires dilués) dans le coin de la chambre de microarray.

  1. Incuber les puces avec un tampon standard (1 x en solution saline tamponnée au Phosphate (PBS), 0,05 % de Tween 20, pH 7,4, filtré avec un filtre de 0,45 µm) (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
  2. Retirez le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray. Remplir porte-diapositive vide avec diapositives vides pour éviter la rupture de la diapositive de microarray.
  3. Bloquer la biopuce avec le tampon de blocage (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 60 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
  4. Retirer le tampon de blocage en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  5. Incuber le microarray avec l’anticorps secondaire, fluorochrome d’IgM anti-humaine conjuguée, dilué 1:5 000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans la coloration de la mémoire tampon (10 % bloquant un tampon en mémoire tampon standard) pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/min.
  6. Supprimer l’anticorps secondaire en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  7. Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  8. Immerger la diapositive 2 x dans un tampon de plongement fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).
  9. Sécher la biopuce soigneusement, pendant environ 1 min, en aspirant l’excès de liquide très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement. Analyser la lame dans un scanner de microarray de lecteur.

3. exposition de la biopuce pour héberger le sérum

ATTENTION : Pour effectuer cette étape dans des conditions de sécurité de laboratoire, niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en raison de la nature infectieuse potentielle de l’échantillons de sérum. Travailler au sein d’une classe II hotte de sécurité biologique (BSC).

  1. Inactiver l’échantillon de sérum à 56 ° C pendant 30 min et centrifuger à 16 000 FRC pendant 5 min à 4 ° C13.
    Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (coloration, tampon standard et du sérum dilué) dans le coin de la chambre de microarray.
  2. Diluer l’échantillon de sérum dans un tampon coloration commençant par une dilution de 1 : 1 000 (volume total de 2 000 μL/microarray). Gardez-le à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  3. Incuber la biopuce avec le tampon de coloration (volume total de 2 000 μL/microarray) pendant 15 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
  4. Retirer le tampon de coloration en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  5. Incuber le microarray avec l’échantillon de sérum dilué pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
  6. Retirer l’échantillon de sérum dilué en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  7. Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 μL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.

4. la coloration avec des anticorps de contrôle marqués et des anticorps secondaires

Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards, secondaire dilué et anticorps de l’étiquette) dans le coin de la chambre de microarray.

  1. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration.
    NOTE : Fluorochrome de IgM anti-humain utilisation conjugués anticorps ou anti-humain fluorochrome conjugués anticorps à une dilution de 1:5,000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans un tampon de coloration.
  2. Anticorps de Mix contrôle étiquette (anticorps monoclonal anti-HA fluorochrome conjuguées) à une dilution de 1 : 1 000 (volume total des 2 000 µL/microarray) tampon de coloration avec l’anticorps secondaire préalablement diluée en souillant la mémoire tampon.
  3. Incubez avec la biopuce pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
  4. Retirez le mélange du secondaire dilué et anticorps de l’étiquette en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
  5. Laver 3 x avec un tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray). Chaque lavage est pendant 1 min dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.

5. les biopuces à balayage

  1. Immerger la diapositive 2 x dans le buffer à pendage fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).
  2. Sécher la biopuce soigneusement, environ 1 min, en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement.
  3. Scan de la biopuce, suivant les instructions du scanner. Placez la lame sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.
  4. Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de lecture optique. Définir les paramètres du scanner comme : résolution : 21 µm, intensité pour 700 à 800 canaux nm : 7,0, qualité de numérisation : médium et Offset : 0,8.
  5. Acquérir et enregistrez l’image raw scan sous un format de fichier TIFF 16 bits en niveaux de gris.

6. Microarray Analysis, à l’aide d’un logiciel spécifique

  1. Ouvrez l’image brute (image TIFF). Ouvrez le fichier grid array.
  2. Aligner la grille de tableau à l’image du scan avec les touches de flèche souris ou le clavier de l’ordinateur.
  3. Sélectionnez « Quantifier la sélection » dans le logiciel spécifique, ce qui crée un fichier de lecture qui contient l’intensité du signal pour chaque tache, la valeur d’arrière-plan et la séquence peptidique correspondante.
    Remarque : Ce fichier de sortie peut également être importé dans un programme de feuille de calcul pour une analyse complémentaire et la représentation graphique.

7. stockage de « microarray »

  1. Stocker la biopuce scellée dans l’obscurité à 4 ° C sous oxygène-gaz azote ou argon gratuit.

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Representative Results

Les résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont indiquées à la Figure 2 et la Figure 3. Aucune interaction de fond ont été notées en pré souillant la biopuce avec secondaire anti-homme IgM (données non présentées). Coloration avec un anti-homme IgM conjugué a entraîné plusieurs zones au-dessus des intensités de fluorescence vert fond indiquant la liaison de ces peptides avec IgM dans l’échantillon de sérum de l’hôte (Figure 2). IgG de détection (signal de fluorescence rouge) a révélé seulement quelques peptides (Figure 2).

Le logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce analyse la biopuce après la numérisation. Le fichier de lecture créé contient l’intensité du signal pour chaque tache, la valeur d’arrière-plan et la séquence peptidique correspondante. Les intensités de fluorescence spot de chaque peptide avec une forte réponse IgM ont été visualisées en traçant les valeurs médianes de premier plan vert, obtenus après avoir soustrait le fond de la valeur brute (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Schéma montrant le processus d’analyse pour le Peptide haute densité « microarray ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Images numérisées de peptide Microarray. Images brutes de fluorescence de la coloration de la biopuce peptide après incubation avec un sérum ZIKV échantillon dilué 1/250. La réactivité de l’IgG est représentée en rouge (àgauche) et la réactivité de l’IgM est affichée en vert (àdroite). HA contrôle peptides encadrent la biopuce de peptide. Zoom panneaux montrent groupe de peptides avec des intensités de fluorescence élevée, ce qui indique une forte réponse IgM ou IgG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Virus Zika représentant la séquence Consensus de l’épitope réagissant avec IgM dans l’échantillon de sérum hôte. Valeurs médianes verte au premier plan de chevauchement des peptides ont été tracées sur un graphique. Peptides de l’épitope de la séquence consensus sont surlignées en rouge. Le peptide avec la plus haute intensité de la fluorescence est marqué en gras. Vecteur basé graphisme logiciel a été utilisé pour générer ce chiffre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons conçu un protocole utilisant un microarray peptides haute densité contenant la séquence entière de la protéine du virus Zika (souche polynésienne Français). La biopuce a été fabriquée par impression 3 423 différents peptides linéaires qui se chevauchent. Chaque peptide était 15 acides aminés et variait selon qu’un résidu de son voisin le plus proche dans la séquence (p. ex., résidus 14 chevauchement). Bien que chevauche plus courtes peut être imprimés, la cartographie des épitopes est plus précise des chevauchements plus longtemps. Chaque peptide a été imprimé en double exemplaire pour renforcer la fiabilité.

Il est essentiel pour démarrer le processus de coloration avant la biopuce avec l’anticorps secondaire pour détecter des interactions possibles de fond et les différencier du signal spécifique de l’échantillon. À l’aide d’un tampon de blocage spécifique est aussi importante que les autres tampons blocage comme Bovine Serum Albumin (BSA) ou poudre de lait en poudre peut se traduire par l’intensité du signal réduit. Un échantillon de sérum validés pour les anticorps IgM ZIKV est d’abord incubé avec la biopuce à 1 : 1 000, mais aucun signal n’a été détecté. L’incubation subséquente à une dilution plus faible de 1/500 résulte en un signal de faible intensité provenant de peptides qui réagissaient avec IgM anticorps dans l’échantillon. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque l’échantillon de sérum validés de Zika a été dilué au 1/250. Nous avons ne pas retester l’échantillon de sérum à une concentration plus élevée afin d’éviter une augmentation du signal de fond. Manipulation soigneuse de la biopuce est essentielle pour éviter d’égratigner la surface de microarray. Par conséquent, les solutions tel que nous dilué sérum et tampon standard sont ajoutés et supprimés du coin de la chambre de microarray. Le plateau d’incubation spécifique diapositives fourni par la société qui a fabriqué la biopuce, qui est conçue pour permettre de travailler avec des volumes d’échantillon minimale est tout aussi important pour un résultat réussi. Les dimensions du plateau d’incubation sont 13,0 cm 9,0 cm et 3 cm d’épaisseur. Il y a 3 toboggans désignés des cavités dans la barre d’état d’incubation qui permettent de doser les 3 toboggans différents simultanément. Toutefois, dans cette expérience, nous avons utilisé seulement 1 diapositive. Lames de microscope vierges ont été placés dans les deux autres cavités pour équilibrer la barre d’État et de prévenir la rupture de la diapositive tableau. Le plateau d’incubation se compose de 4 parties : une plaque de base où les lames sont placés dans des cavités désignées ; un scellant composé de silicium pour séparer chaque diapositive des autres ; une partie supérieure qui contient vis moletées pour rejoindre le scellant avec la plaque de base et de créer les chambres de microarray pour l’ajout de solutions pour le dosage par exemple échantillon de sérum ou de tampon de lavage. Le scellant et partie supérieure évitent la contamination ou mélange de solutions entre les diapositives. Le dernier élément de la section est un couvercle afin de minimiser le risque d’évaporation ou de contamination des échantillons de l’environnement. Un agitateur orbital est préférable pour obtenir optimale mouillants et coloration des conditions.

Selon lorsque le virus a infecté l’hôte la résultante Zika IgM spécifiques, la concentration d’anticorps dans le sérum peut être haute ou basse. Par conséquent, il était prévu qu’à l’aide d’un échantillon de sérum avec une concentration plus élevée d’IgM augmenterait l’intensité de signal de fluorescence relative. Après la détection d’IgM, le même échantillon de sérum est incubé à une dilution de 1/250 avec la biopuce, mais un anti-IgG humaines a été utilisé comme l’anticorps secondaire. Alternativement, des classes de différents anticorps peuvent être détectées simultanément au sein de la même « microarray » en utilisant un mélange d’anticorps secondaires, que chacun conjugué avec fluorescence différents colorants. La biopuce même peut être colorée à nouveau auprès d’un échantillon de sérum concentré plus si l’intensité du signal est faible. Si entreposé adéquatement la biopuce est stable pendant plusieurs mois et peut éventuellement être réutilisée.

Quantification des intensités spots et annotations de peptide a été réalisée à l’aide d’un logiciel propriétaire de la société qui a fabriqué la biopuce qui fournit également un fichier « .psf » avec le modèle du format tableau. Le fichier psf est essentiellement une grille qui correspond à l’image de scanner brutes à l’aide du logiciel propriétaire. Un algorithme logiciel analyse les intensités de fluorescence relative de chaque spot en brut (valeur de l’intensité du signal de la tache), fond (valeur estimée du signal causé par les liaisons non spécifiques) et premier plan (soustraits à l’arrière-plan de la brute signal de valeur). Il calcule aussi les valeurs médianes de premier plan et médiane de premier plan global correspondant à la moyenne des deux valeurs spots médians de chaque peptide en double exemplaire. En outre, le logiciel identifie les motifs/épitope de consensus au sein de chevauchement des peptides. Alternativement, les intensités du signal peuvent être quantifiées avec le logiciel du scanner microarray, puis en utilisant le modèle du format tableau, on peut distinguer la séquence peptidique.

Suite à ce protocole, plusieurs candidats prometteurs du peptide ont été identifiées basées sur l’intensité de fluorescence. Une analyse subséquente explosion14 a été utilisée pour identifier les résidus avec réactivité croisée potentielle d’autres flavivirus. Un total de 14 peptides identifiés sont présents seulement dans ZIKV tel qu’indiqué dans 3 bases de données de proteome. Une deuxième série de puces est prévue qui contiendra les peptides sélectionnés du premier tableau. Cela permettra de tester plusieurs échantillons validés ainsi que des échantillons de personnes infectées uniquement par flavivirus autre que ZIKV pour confirmer la spécificité. D’inspection/filtrage, nous adapterons un format de dosage ELISA, revêtement des plaques avec les peptides sélectionnés et tester la liaison aux anticorps spécifiques de ZIKV dans des échantillons de sérum et de salive.

ZIKV traitement requiert travaillant dans les installations de niveau de biosécurité 2 (BSL-2)15. Comme nous avons travaillé avec un sérum échantillon validé pour l’infection de ZIKV que nous avons travaillé dans l’installation de BSL-2 effectuer toute la manipulation de l’échantillon au sein de la classe II (ou supérieur) hotte de sécurité biologique (BSC). C’est pourquoi nous avons inactivé le chauffage de l’échantillon de sérum à 56 ° C pendant 30 min avant l’incubation de l’échantillon avec le « microarray »13. Après inactivation par la chaleur, il est recommandé également continuer à travailler dans un établissement de BSL-2 avec pratique de laboratoire appropriées de bonne sécurité pour éviter les risques d’infection.

La biopuce que nous avons conçu ne contient que les peptides linéaires et les épitopes conformationnels en conséquence qui pourraient être précieuses comme les diagnostics ont été manquées. Cette limitation peut être résolue en utilisant une haute densité « microarray » contenant des peptides cycliques contraints qui imitent en boucle épitope structures16. Ce protocole peut être rapidement adapté à d’autres agents pathogènes parce qu’une fois la séquence protéique connue une nouvelle « microarray » peut être conçu pour découverte de peptides Diagnostics potentiels. Il peut également être adapté pour d’autres applications comme biomarqueur découverte17, découverte de l’antigène et l’épitope pour le développement de vaccins ou de cibles thérapeutiques18,19.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Actuel est confortée par une subvention de supplément administratif SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Concession de NIDCR VIH qui a évolué hors subvention NIDCR U01 DE017855 pour le développement d’un diagnostic de point-of-care confirmation pour le VIH. Nous remercions sincèrement Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) pour son assistance technique et de soutien. Nous remercions également NYU Langone Medical Center pour les LI-COR Odyssey Imaging System.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

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References

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