タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

Cancer Research

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Summary

腫瘍組織から高品質 DNA を取得は、次世代シーケンシングによる遺伝子の変異を分析するための重要な第一歩です。この記事では腫瘍細胞を豊かにし、押印細胞診標本のタッチから無傷の DNA を取得する簡単かつ迅速な方法を提案する.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

管理およびがん患者のための特定の分子標的薬の治療前にがんの突然変異の状態を確認する重要です。臨床設定では、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織は、遺伝学的検査のため活躍しています。ただし、FFPE の DNA は、ホルマリン固定過程における断片化や破損は、一般的に。したがって、FFPE DNA は時々 低品質と量の DNA のための遺伝学的検査の適切ではないです。顕微鏡下で観察することができますタッチ捺印細胞診がん細胞からゲノム DNA を取得する (TIC) の方法をご紹介します。細胞形態と癌細胞数は、チックの標本を使用して評価できます。さらに、2 日以内 TIC サンプルからゲノム DNA の抽出を完了ことができます。合計金額、このメソッドを使用して得られた TIC DNA の品質 FFPE DNA のそれよりも高かった。この迅速かつ簡単な方法では、研究者 (例えば、次世代シーケンス解析、デジタル PCR および量的なリアルタイム PCR) 遺伝学的検査の高品質 DNA を取得し、結果をレポートのターンアラウンド時間を短縮することができます。

Introduction

次世代シーケンシング技術提供している研究者の遺伝の変化、メンデルの病気、遺伝的素因、がん1,2,3 のゲノム情報を解析の飛躍的な発展.がんゲノム アトラス (TCGA) と国際がんゲノム コンソーシアム (ICGC) は、一般的な癌4のいくつかの種類の遺伝子変異の同定を追求してきた。何百もの重要なドライバー遺伝子は正常に識別されているといくつかこれらの分子の薬物開発1,5,6のターゲットにされています。

臨床場面における FFPE 標本は病理診断とがんを含むさまざまな病気の分子テストのため通常使用されます。ただし、ホルマリンで固定過程では、DNA 蛋白質または DNA のクロスリンクが発生した、DNA 断片化を誘導しました。したがって、FFPE DNA サンプルは常に遺伝学的解析に適した DNA7,8,9の低質と量のため。また、FFPE 標本を準備するまでに数日かかるし、技術的なスキルのセクションを正確に準備する必要があります。したがって、高品質そのままな DNA を求める簡便かつ迅速な手法を開発することをお勧めします。

細胞診、病理組織学的診断のための代替方法です。細胞サンプル準備は簡単、以下の FFPE 準備10と比較して高価で、かつ高速なアプローチです。TIC 手法は、センチネル リンパ節と周辺組織のいくつかの年11,12術中迅速診断乳がん患者に行われています。ただし、チックの標本から高品質の DNA を得ることができるかどうかを検討して、その後の遺伝学的解析のため使用するほとんどの報告がありません。細胞診標本が一般的パパニコロー (Pap) またはギムザ染色、染色し、我々 は以前報告量と TIC 標本 (特にギムザ染色サンプル) から抽出した DNA の品質は FFPE から採取した試料よりも優れて組織13。Pap 染色に比べると、少ない汚損プロシージャを必要とする利点を有するギムザ染色.Pap 染色の後、サンプルを固定されているし、ステンド グラス、彼らマウントしますする必要がある媒体 (例えばMalinol)、腫瘍細胞、正常細胞、炎症細胞を顕微鏡など、サンプルの内容を区別するためのマウント。Pap の標本は、取付手順なし準備だない試料を乾燥するために顕微鏡下で細胞を観察することはほとんど不可能。比較では、乾燥した状態で観察することができますギムザ染色、したがって、取り付け手順は迅速に携帯電話評価する必要ありません。レーザーマイクロダイ セクション、ギムザ染色より適切な乾燥標本が必要なため。

本報告では TIC ギムザ染色標本を準備するための簡易迅速法を導入し、チックが dna の FFPE 標本と比較してより良いソースであることを示す.

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Protocol

1. TIC に備えて通常のガラスを使用して迅速に微視的評価スライドします。

  1. 臨床病理組織材料が利用可能は、TIC 準備をできるだけ早くを実行します。TIC 標本を準備すぐにことはできません、滅菌ガーゼに湿らせた生理食塩水で覆われている組織材料を維持し、組織の乾燥を防ぐために冷蔵庫に保管します。
  2. 手術や内視鏡検査によって得られる臨床的に腫瘍 (例えば肝臓、肺、乳房組織) など 5 mm3組織材料を準備します。
    1. 優しく組織の滅菌ガーゼ生理食塩水でコーティングを拭き、組織表面に多くの血液がある場合、血液を取り外します。
    2. 針生検などの顕微鏡標本は、生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで湿らせたサンプルをしてください。
  3. カットしトリミング ナイフで正常組織をトリムし、腫瘤が大きく表示されない場合腫瘍病変の表面を公開します。
  4. 手袋をはめた手で数回通常のガラス スライド上に切除標本の腫瘍表面に接する。触れられた区域は通常のガラス スライドの 80% を視覚的に確認します。
  5. 軽く、ポリエチレン ポリエチレンナフタ レート (PEN) 膜スライドに対して通常のガラス スライドを押して、手袋をはめた手で 2-3 回を優しくこする。視覚的にセルは通常のガラス スライドからペン膜スライドに転送されますを確認します。
  6. ガラスと室内の温度で 5 分間ペン膜スライドを風乾します。
  7. 直接細胞診では、通常のガラス スライドを染色します。ディップ、5 s のための固定液をスライド ガラスとし、染色ギムザ染色液 15 s。
  8. 評価し、迅速な評価のため顕微鏡で完全腫瘍内容と通常のガラス スライドのセルを画面します。いくつかの条件に基づいて腫瘍細胞を評価します。原子力の拡大、異常核型、豊富なクロマチン、セルの不平等な配分、細胞極性、細胞サイズ、コンポーネント/細胞質成分の核の比率

2. 遺伝子検査のペン膜スライド フィルムの準備

  1. 腫瘍細胞型を示します迅速な微視的評価 (ステップ 1.8) で 60% 以上は DNA の抽出のペン膜スライドの腫瘍に触れた映画はナイフで切ったし、手の手袋をはめた。カット フィルムをピンセットと手袋をはめた手で滅菌遠心チューブに転送します。
  2. 腫瘍細胞型は、迅速な微視的評価 (ステップ 1.8) によって (腫瘍内容の 60% 未満) 低として決定された、使用レーザーはレーザーキャプチャーマイクロダイ セクションと、腫瘍のサンプルを入手します。
    1. ギムザ染色標準プロトコルを使用して腫瘍細胞を評価するを実行します。
    2. 適切なレーザー キャプチャ マイクロダイ セクションによる PEM 膜のスライドのフィルムをカットします。
    3. カット フィルムをピンセットと手袋をはめた手で滅菌遠心チューブに転送します。
    4. DNA の抽出 (プロトコルがここで停止することができます) まで 4 ° C でフィルムを含む遠心チューブを格納します。

3. DNA の抽出

  1. 製造元の指示に従って FFPE DNA 抽出キットを使用して、変更を加えるチックまたは FFPE 組織サンプルからの DNA 抽出を実行します。相当のキットは FFPE DNA 抽出ステップで利用可能です。
  2. 組織換散バッファーの 180 μ L を追加 (pH = 8.3) 手動 200 μ L ピペットでフィルムを含む遠心チューブに。5 の最大速度 (約 2,500 rpm) で渦のミキサーとボルテックスによって手動 20 μ L ピペットとミックス プロティナーゼ K の 20 μ L を追加 s。
  3. 空気インキュベーターで一晩 56 ° C でサンプルをインキュベートします。
  4. それぞれ 90 ° c 1 時間 10 分のヒート ブロックで FFPE とチックのサンプルをインキュベートします。簡単にスピン ・ ダウン 5 1,500 × g で遠心チューブ ミニ遠心室温で s。
  5. 200 μ L ピペットとミックス サンプル徹底的に 5 の最大速度で 200 μ L の換散バッファーに追加 s。
  6. 200 μ L ピペットとエタノール (96 ~ 100%) の 200 μ L を追加し、よく混ぜる 5 の最大速度で s の簡潔に 5 1,500 × g で遠心管でスピンダウン ミニ遠心室温で s。
  7. 慎重に 1,000 μ L ピペットおよび 25 ° C で 1 分間 6,000 × g で遠心分離をしてスピン列に lysate の全体を転送します。
  8. 手袋をはめた手で、きれいな 2 mL 管でスピン列を置き、プラスチック廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。
  9. 500 μ L の洗浄バッファーを 1,000 μ L ピペットと 6,000 x g で 25 ° C で 1 分間遠心スピン列に追加します。
  10. 手袋をはめた手で、きれいな 2 mL 管でスピン列を置き、プラスチック廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。
  11. 500 μ L の洗浄バッファーを 1,000 μ L ピペットと 6,000 x g で 25 ° C で 1 分間遠心スピン列に追加します。
  12. プラスチックの廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。スピン列を手袋をはめた手できれいな 1.5 mL 遠心チューブに置き、膜を乾燥する 25 の ° C で 3 分間 20,000 × g で遠心分離機にします。
  13. 手袋をはめた手で DNA 低バインド チューブにスピン列を配置します。
    1. 100 μ L ピペットと膜の中心に 40-50 μ L の溶出バッファーを追加します。
    2. 5 分の 20,000 × g で遠心する 25 ° C で 1 分間室温でインキュベートします。
    3. (プロトコルがここで停止することができます)、次のステップまでの-20 ° C で DNA サンプルを格納します。

4 量的なリアルタイム PCR による DNA の品質推定

  1. 次のように、ピペット滅菌遠心管のマスター ミックスを調製: リアルタイム PCR マスター ミックス、20 の 1 μ L × 2 の 10 μ L RNase P プライマー プローブ ミックス x (増幅サイズ: 87 bp)、および 8 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー水の。
  2. 次のように 1 つの滅菌遠心チューブに 2 番目のマスター ミックスを準備: リアルタイム PCR マスター ミックス、20 の 1 μ L × 2 の 10 μ L RNase P プライマー プローブ ミックス x (増幅サイズ: 268 bp)、および 8 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー水の。
  3. 5 点の標準曲線の人間制御ゲノム DNA (キットに付属) のシリアル希薄を 4 回実行し、絶対 DNA 濃度13を決定します。
  4. 20 μ L ピペット光 96 ウェル反応板の別の井戸に (手順 4.1 と 4.2 で準備) 2 つの準備されたマスター ミックスの 19 μ L を追加します。
  5. 2 μ L ピペットで反応混合物を含んでいる井戸を分離する FFPE DNA または TIC DNA の 1 μ L を追加します。ないのテンプレート コントロールの反応混合物を含む独立した井戸にヌクレアーゼ フリー水 1 μ L を追加します。
  6. 光学用粘着フィルムの非粘着側を押しながら戻って映画の中心からのバックアップ保護の皮をむきます。慎重にフィルム上にアプリケーターをドラッグ、96 ウェル プレートでフィルムをシールします。
  7. 優しくミックス 96 ウェル プレート ミキサーを用いた 10 96 ウェル プレート 2,000 rpm で室温で s。室温で 3 分間 1,000 x g で簡単にプレートを遠心します。
  8. リアルタイム PCR 機器と挿入 96 ウェル プレートの電源を入れます。次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 95 ° C、20 s、1 s と 60 ° C、20 s の使用「標準的な曲線」と「高速モード」の 95 ° c 45 サイクルが続く
  9. DNA (相対的な定量化; の比率と DNA の断片化を評価します。長い私アンプリコンの RQ) を取得 (268 bp) 短い増幅する (87 bp)。RQ は、短い私アンプリコン13の長い私アンプリコンの平均値の平均値です。

5. 次世代シーケンシング ライブラリの準備

  1. 製造元の指示に従って次世代シーケンシングのシーケンシング ライブラリを準備します。
  2. 次のようにサンプルごと滅菌遠心チューブにマルチプレックス PCR マスター ミックスを準備: マルチプレックス PCR 反応液、4 μ ≤6 μ L チックまたは FFPE DNA (1 100 ng)、プライマー プール x 5 x 5 の 4 μ L 20 μ L までヌクレアーゼ フリー水を加える。
    1. チューブをタップして優しく PCR チューブとミックスにマルチプレックス PCR マスター ミックスを追加します。
    2. 簡単にスピン ・ ダウン 5 1,500 × g で遠心チューブ ミニ遠心室温で s。
  3. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 2 分、99 ° C に続いて 99 ° C の 20 サイクル 15 s と 60 ° C、4 分および保持のステップ 10 ° C簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
    注: は、プライマーのペアの数に基づいてサイクルの数を決定します。
  4. PCR チューブのふたを開けるし、2 μ L ピペットと制限酵素の 2 μ L を追加します。PCR チューブをタップして優しく PCR チューブとミックスのふたを閉じます。簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  5. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 10 分、10 分、20 分の 60 ° C の 55 ° C に 50 ° C、ホールディング ステップ 10 ° C簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  6. それぞれよく含んでいるピペットと消化液の PCR 産物通りにアダプター結紮マスター ミックスを追加: アダプター結紮ソリューションの 4 μ L、バーコードの 0.5 μ L、アダプターの 0.5 μ L、ヌクレアーゼ フリー水 2 μ L、2 μ L の DNA のリガーゼ。そっと軽くたたくことによって PCR チューブとミックスの蓋を閉じます。簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  7. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 22 ° C、30 分、5 分、5 分のための 72 ° C のための 68 の ° C、ホールディング ステップ 10 ° C
  8. 製造元の指示に従って磁気ビーズの配列ライブラリを浄化します。
  9. 1.5 mL DNA 低バインド チューブにアダプター結紮ライブラリ ソリューションを転送します。1st精製 DNA 低バインド チューブに磁気ビーズの 45 μ L を追加します。チューブを叩くことによって穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
  10. 磁気ラックで DNA 低結合管を配置し、ソリューションが明確になるまで室温で 2 分間インキュベートします。慎重に磁気ビーズを乱すことがなく 200 μ L ピペットで上澄みを廃棄します。
  11. 200 μ L ピペットと作りたての 70% のエタノールの 150 μ L を追加し、チューブ--側にビーズを洗浄する磁石を移動します。磁気ビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に廃棄します。
  12. 第 2 洗浄の 5.11 のステップを繰り返します。
  13. 5 1,500 × g で遠心するミニと簡単にスピン ・ ダウン チューブ室温で s。磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、慎重に 10 μ L ピペットとエタノール液滴を破棄します。
  14. ビーズを分散させるために磁気ビーズの餌を含んでいる DNA の低結合管に低 TE の 50 μ L を追加します。常温で 2 分間インキュベートします。
  15. 磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、ソリューションがクリアされるまで、2 分間室温でインキュベートします。
  16. 新しい DNA 低バインド チューブに上清の 50 μ L を転送し、磁性体ビーズ 2nd浄化のため 100 μ L ピペットを 75 μ L を追加します。チューブを叩くことによって穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
  17. 磁気ラックで DNA 低結合管を配置し、ソリューションが明確になるまで室温で 2 分間インキュベートします。慎重に磁気ビーズを乱すことがなく 200 μ L ピペットで上澄みを廃棄します。
  18. 200 μ L ピペットと作りたての 70% のエタノールの 150 μ L を追加し、チューブ--側にビーズを洗浄する磁石を移動します。磁気ビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に廃棄します。
  19. 第 2 洗浄手順 5.18.
  20. 5 1,500 × g で遠心するミニと簡単にスピン ・ ダウン チューブ室温で s。磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、慎重に 10 μ L ピペットとエタノール液滴を破棄します。
  21. ビーズを分散させるために磁気ビーズの餌を含んでいる DNA の低結合管に低 TE の 50 μ L を追加します。常温で 2 分間インキュベートします。
  22. 磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、ソリューションがクリアされるまで、2 分間室温でインキュベートします。
  23. 100 μ L ピペットで新しい DNA 低結合管に精製されたライブラリを含む上清の 45 μ L を転送します。

6. 量的なリアルタイム PCR によるライブラリの濃度を定量化します。

  1. 製造元の手順13によると各ライブラリの濃度を決定します。
    1. 次のように 20 の希釈液を準備: ミックス 2 μ L の精製されたライブラリと 38 μ L の DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水 2 μ L、100 μ L ピペット。
    2. 7.3 のステップまで-20 ° C で原液のライブラリを保存します。
  2. 200-fold 希釈液を次のように準備: 20 の希釈精製のライブラリの (6.1 の手順で準備) の 5 μ L を混ぜると DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水の 45 μ L。
  3. 2,000-fold 希釈液を次のように準備: 200-fold 希釈精製ライブラリの (6.2 の手順で準備) の 5 μ L を混ぜると DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水の 45 μ L。
  4. 次のように反応のマスター ミックスを調製: ミックス マスター ミックス ソリューション × 2 の 10 μ L と滅菌遠心チューブにプライマー プローブ分析ソリューション x 20 の 1 μ L ピペット、し、チューブをタップしてミックスします。光の 96 ウェル反応の井戸に反応マスター ミックスの 11 μ L を追加します。
  5. 10 μ L ピペットの各ウェルに 2,000-fold 希釈ライブラリの 9 μ L、各標準のコントロールの 9 μ L またはヌクレアーゼ フリー水の 9 μ L を追加します。
  6. 光学用粘着フィルムの非粘着側を押しながら戻って映画の中心からのバックアップ保護の皮をむきます。
    1. 慎重にフィルム上にアプリケーターをドラッグ、96 ウェル プレートでフィルムをシールします。
    2. 96 ウェル プレート ミキサーを用いた 10 96 ウェル プレートを軽くミックス室温で s。
    3. 室温で 3 分間 1,000 x g で簡単にプレートを遠心します。
  7. リアルタイム PCR 機器と挿入 96 ウェル プレートの電源を入れます。次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 2 分、95 ° C、20 ° C、50 s、1 s と 60 ° C、20 s の使用「標準的な曲線」と「高速モード」の 95 ° C の 40 のサイクルが続く
  8. 2,000 qPCR で定める濃度を乗じて原液ライブラリ濃度を計算します。

7. 次世代シーケンシング

  1. 実行条件を計画し、ソフトウェアの実行パラメーターを設定します。
    1. [計画] タブ] をクリックし、[テンプレート]、適切な実行方法を選択しています。
    2. アプリケーションおよび技術の種類を選択し、[次へ] をクリックします。
    3. 楽器、サンプル調製キット (オプション)、ライブラリ キット タイプ、テンプレート キット、シーケンス キットを選択、校正モードを基本、チップの種類、コントロール シーケンス (オプション) とバーコードのセット、[次へ] をクリックします。
    4. プラグインを選択し、[次へ] をクリックします。
    5. プロジェクトを選択し、[次へ] をクリックします。
    6. 既定の参照および対象地域のベッド ファイルを選択します。
    7. サンプル名を入力、バーコードを選択し、[実行計画] をクリックします。
  2. テンプレートの準備を行い、チップの製造元の指示に従って自動計測器で読み込み。使用する前に 45 分間室温で試薬カートリッジを解凍します。
  3. 手順 6.8 で計算ライブラリ濃度に応じてヌクレアーゼ フリー水で希釈していないライブラリを希釈し、20 pM ライブラリを作る。
    1. シーケンスと氷上店のプールされたライブラリを準備します。
    2. サンプル チューブの下部に 100 μ L ピペットでプールされたライブラリの 25 μ L を追加します。48 時間以内のプールされたライブラリを使用します。
  4. 電源を入れ、自動化装置のカバーを開けます。
    1. シーケンス処理チップ、チップのアダプター、濃縮カートリッジ、先端カートリッジ、PCR プレート、PCR フレーム シール、回復チューブ、ソリューション カートリッジおよび試薬カートリッジを自動計測器の適切な位置に配置します。
    2. [実行設定] をタッチし、[手順] 画面に。
    3. カバーを閉じ、画面上の [チェック開始] をタッチします。
    4. デッキ後スキャン プロセス、画面で [次へ] をタッチします。
    5. (キット型、チップ型、チップ サンプル ID 計画) 表示内容を調べ、時間を設定画面で [OK] をタッチします。
  5. チップの読み込みを終えて。
    1. 画面の [次へ] をタッチし、カバーを開きます。
    2. 手袋をはめた手でチップ アダプターからシーケンス チップをアンロードします。
    3. チップの容器にチップを置くパラフィルムとストア シーケンス反応まで 4 ° c のラップ。
    4. 手袋をはめた手で自動計測器の適切な位置から濃縮カートリッジ、PCR プレート、PCR フレーム シール、回復チューブ、ソリューション カートリッジおよび試薬カートリッジを削除します。
    5. ヒント空カートリッジを手袋をはめた手で自動計測器の廃棄物の先端の位置に転送します。
    6. [次へ] をタッチし、カバーを閉じます。
    7. [スタート] をタップし、4 分間の紫外線照射による自動計測器をきれいします。
  6. 1,000 mL の超純水、0.22 μ m フィルター フロー フィルター ユニット フィルター ソリューションでナトリウムの緑泥石のタブレットを溶解します。
    1. シーケンス計測器の電源を入れます。
    2. [クリーン] のタッチと配列計測器の画面で [次へ]。
    3. 250 mL フィルター滅菌ナトリウムの緑泥石溶液とその後 250 mL の純水でシーケンス楽器をきれいに。
  7. [初期化] をタッチし、画面上の適切なシーケンス キットを選択します。
    1. 手袋をはめた手で適切な位置に灰色の荷送人をインストールします。
    2. (キットに付属) 洗浄液、(水酸化ナトリウム 100 mM の 350 μ L を含む) pH 調整液、pH 標準液 (キットに付属) とシーケンス計測器を初期化します。
  8. 100 μ L ピペット dATP、dGTP、dCTP、dTTP のヌクレオチド (キットに付属) (キットに付属) 50 mL チューブの 20 μ L を追加します。
    1. 手袋をはめた手で適切な位置に灰色の荷送人をインストールします。
    2. 50 mL チューブとシーケンス処理機器にネジをロードします。
    3. 約 25 分かかる初期化の手順を開始する画面で [次へ] をタップします。
  9. 初期化手順を完了するには。
    1. 画面上の [実行] をタップし、適切なライブラリの準備計測器を選択します。
    2. チップの二次元バーコードをスキャンします。
    3. 適切な位置にシーケンス処理チップを挿入します。
    4. チップのクランプと器のドアを閉じます。
    5. タッチ [チップ チェック]、[次へ]、およびシーケンスの実行を開始する画面で [OK]。
  10. シーケンス反応後データを転送し、シーケンス サーバー13,17にパイプラインのデータ分析を実行します。

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Representative Results

図 1は、DNA の抽出に TIC 標本作製から全体のプロセスを示しています。特に、TIC サンプルからゲノム DNA を取得するのみ 2 日間を要します。スライド処理の前に腫瘍ストレージの効果を評価しました。組織検体はすぐにスライドに触れられたとき、および組織は、生理食塩水湿らせた滅菌・ ガーゼ 1 h (図 2) のために保たれた腫瘍細胞がスライド ガラス上に接続されていたことがわかった。しかし、組織は、室温で保たれた、時腫瘍細胞添付されませんでしたよくスライドに。準備されたスライドは、3 カ月、4 ° C で格納できます。したがって、乾燥のための標本を許可しないことが重要です。

我々 は本手法の有用性を検討したし、FFPE を用いて標本と比較します。14 の腫瘍の標本、TIC と FFPE サンプルの調製し、腫瘍内容と純度が TIC 標本から評価されることを確認しました。後、ギムザ染色を行い、顕微鏡で腫瘍細胞と腫瘍の形態の数で評価できます。したがって、定期的に腫瘍細胞を評価し、その後 DNA の品質チェックを実行することができた。

DNA 量と質は、量的なリアルタイム PCR13,14,15によって推定されました。我々 は DNA 量の絶対量とゲノム DNA の劣化度の指標である RQ 値を決定しました。FFPE 標本 (表 1) と比較して TIC 試料を用いた DNA の収量が達成されたことがわかった。また、TIC DNA の RQ 値が大幅に比べ FFPE DNA の (図 3p = 10-82-スチューデントの両側tテスト x 2.3)。チックと異なる腫瘍から抽出した TIC DNA は FFPE DNA (図 3) と比較して質の高いことがわかった FFPE DNA の RQ 値についても検討します。TIC DNA は FFPE DNA のよりも断片化が示唆されました。

次に TIC DNA を次世代シーケンス解析に使用できるかどうかを評価します。FFPE と TIC DNA は、大腸癌や転移性肝癌患者 (図 4 a) から得られるから調製しました。PCR 増幅とライブラリの準備をがんホット スポット パネルを使用して実施し、その後ターゲット シーケンスを行った。結果として、 APC Q1367 * 識別された FFPE のサイト 1 (表 2) から抽出された TIC DNA。さらに、両方の FFPE のAPC S1356 *、 KRAS G12D およびTP53 M237I を検出し、チックの DNA は、2、3、および 4 (表 2) サイトから抽出しました。同一体細胞突然変異が同じ腫瘍部位 (図 4 b表 2) から調製したペアの FFPE と TIC DNA サンプルで識別されたことが示唆されました。特に、大腸癌 (サイト 2、サイト 1 ではない) とサイト 2 から腫瘍クローン転移肝臓 (図 4 b表 2) ことを示唆している転移性肝癌の 2 つのサンプルの間同じ体細胞突然変異が検出されました。一緒にこれらの調査結果は TIC DNA が高い品質、次世代シーケンシングなど遺伝学的検査の広い範囲に適していますをお勧めします。

Figure 1
チックの試料から DNA を得るため 1. 概略図を図します。腫瘍組織は TIC サンプルを準備してスライド ガラスに触れられます。腫瘍形態, 顕微鏡下で内容を評価した後腫瘍 DNA を抽出、遺伝子検査に使用します。チックを使用することにより、腫瘍 DNA 得られる臨床病理標本 2 日以内。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。TIC のサンプルの準備。切除腫瘍の標本がすぐに生理食塩水湿らせた滅菌・ ガーゼ 1 h (中央) のために通常のガラス スライド (左側のパネル) に触れるし、(右) 1 時間室温で保管します。サンプル #1 は肝細胞癌とサンプル 2 は乳がんだった。顕微鏡写真は顕微鏡にデジタル カメラを使用して撮影されました。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。定量的リアルタイム PCR 解析によって推定される DNA 品質チェックします。チックと FFPE DNA は大腸からの 14 の腫瘍組織から抽出した (n = 8)、胃 (n = 4)、および転移性肝癌 (n = 2)。TIC ギムザと彼 FFPE サンプル間の相対的な定量化スコアの比較。TIC DNA の RQ 値した FFPE DNA のそれよりも有意に高かった。2 つのグループ間の統計的解析を行ったとp-値を Excel を使用して対になっていない 2 尾 Student のt検定によって算出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。次世代シーケンス解析データ TIC と FFPE の DNA を使用しています。(A) マクロスコ ピックおよび顕微鏡画像。TIC ギムザとサンプル (サイト 3 および 4) 大腸癌 (サイト 1 と 2) と転移性肝臓癌から染色 FFPE 彼の代表的なイメージ。マクロ画像のスケール バー: 1 cm、顕微鏡画像のスケール バー: 100 μ m (B) 熱地図各腫瘍部位の体細胞突然変異の分布を示す (n = 8)。チックと FFPE DNA 標本間で同じ変異が検出されました。対立の分数の値は 100% (ピンク) 1% (ライトピンク) から卒業カラー スケールで示されます。灰色の列は、特定の突然変異を認めなかった.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

TIC ギムザ (n = 14) FFPE 彼 (n = 14)
合計 DNA (ng) 合計 DNA (ng)
サンプル 腫瘍部位 短い 長い RQ 短い 長い RQ
"Site1" コロン 1495 1247 0.83 939 349 0.37
Site2 コロン 991 1057 1.07 556 204 0.37
サイト 3 肝臓 467 511 1.09 130 39 0.3
サイト 4 肝臓 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 コロン 749 598 0.8 529 205 0.39
Site6 330 286 0.86 211 98 0.46
Site7 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 コロン 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 コロン 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 コロン 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 1501 1200 0.8 274 132 0.48
Site13 コロン 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 コロン 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

テーブル 1。DNA 品質データ。ペア チック (n = 14) FFPE 標本 (n = 14) 胃ガン、肝臓、結腸から準備されました。TIC 染色ギムザと、ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色 FFPE サンプル。DNA サンプルが得られ、RNaseP 軌跡を増幅 2 つのプライマー組で量的なリアルタイム PCR による定量 (長い私アンプリコン (268 bp) と短い増幅 (87 bp))。RQ 価値は以下の通り計算された: 長い私アンプリコンの平均値が短い私アンプリコンの平均値を分割します。SD、標準偏差;RQ、相対定量

サンプル名 場所 準備 遺伝子シンボル 突然変異 位置 参照 バリアント コーディング カバレッジ 対立遺伝子の割合
大腸癌 サイト 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
大腸癌 サイト 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
大腸癌 サイト 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
大腸癌 サイト 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
大腸癌 サイト 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
大腸癌 サイト 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
大腸癌 サイト 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
大腸癌 サイト 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
転移性肝癌 サイト 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
転移性肝癌 サイト 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
転移性肝癌 サイト 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
転移性肝癌 サイト 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
転移性肝癌 サイト 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
転移性肝癌 サイト 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
転移性肝癌 サイト 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
転移性肝癌 サイト 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
転移性肝癌 サイト 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
転移性肝癌 サイト 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
転移性肝癌 サイト 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
転移性肝癌 サイト 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

表 2。ペアの FFPE とターゲット シーケンス解析によって検出された TIC DNA の突然変異の比較。チックのペアと FFPE サンプルの調製 2 大腸癌 (サイト 1 と 2) と 2 転移性肝臓癌 (サイト 3 および 4)。これらの DNA のサンプルで対象のシーケンスを行い体細胞突然変異が同定されました。チックと FFPE DNA 標本間同一変異プロファイルであった。

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Discussion

本研究ではチックを使用して臨床病理標本から腫瘍 DNA を取得するための代替方法を提案します。TIC 準備非常にシンプルかつ FFPE のメソッドは、特別な楽器10の要件なしと比較してより少ない時間を必要があります。(図 1) 2 日以内は、DNA の抽出に TIC 準備からすべての手順を完了できます。このメソッド従って遺伝学的検査を行うため所要時間が短くなります。特に、これは分子の解析に必要な日数の短縮に重要な利点を提供します。この短い所要時間では、すぐに分子標的薬を必要とする進行がん患者に適切な治療を提供することが出来ます。このメソッドは、したがって腫瘍における遺伝子変化の解析およびがん治療の分子標的薬の管理のための利点を提供します。

TIC DNA を用いた遺伝学的解析の成功のいくつかの重要なポイントがあります。腫瘍組織は化学療法などの治療や他の治療のため壊死かもしれません。したがって、注意は、可能な限りの腫瘍内の壊死のセクションからのサンプリングを避けるために TIC 標本作成に必要です。さらに、初期の顕微鏡的評価は非常に重要な手順です。さらに、腫瘍組織の乾燥を防ぐことが成功した TIC のサンプル準備のため必要です。腫瘍組織が乾燥すると、これがスライド ガラスの少ない接続されたセルに発生します。また、腫瘍組織の変性につながる乾燥細胞型腫瘍と形態を観察することは困難こと。

TIC の DNA を使用するいくつかの潜在的な利点があります。まず、我々 は顕微鏡を用いた最初の評価中に腫瘍の細胞型を確認できます。間質細胞、リンパ球などの正常細胞がティッシュ サンプルの豊富なこれらの正常細胞の汚染は腫瘍細胞の体細胞変異を検出することを防ぐと思います。サンプルの迅速な微視的評価は、腫瘍細胞性の評価と適切な腫瘍 DNA サンプルされた DNA の抽出の前に TIC 標本から得られるかどうかの推定に役立つことがあります。第二に、我々 の結果を示した、TIC DNA が質・量ともに。FFPE の DNA は、ターゲット シーケンス、エキソーム配列、全ゲノム シーケンス16,17,18,,1920など次世代シーケンス解析のために使用されています。アーカイブの FFPE DNA も日常的に遺伝子解析21,22, FFPE DNA はホルマリン固定の中に断片化することができますが使用されます。これは pcr や DNA 抽出、シーケンスの範囲、対象地域での均一性の欠如の原因で問題が発生することができます、シーケンス エラー23,24のリスクを高めます。対照的に、TIC DNA が断片化されていなければ、核酸に影響を少なくしてアルコール固定のため可能性があります。FFPE DNA のようなない TIC DNA を断片化しているこれらのサンプル次世代シーケンス解析、リアルタイム PCR およびデジタル PCR のより適切ななります。確かに、我々 は以前に見せました TIC 腫瘍標本から DNA を次世代シーケンス解析、"TIC seq"と呼ばれる方法で使用できる、結果は正確に腫瘍の体細胞変異13を捕えることができました。第三に、この手法は材料の広い範囲のために適当です。現在のレポートでは、標本を使用しました。手術組織、リンパ節転移に加えて気管支または内視鏡的生検は TIC DNA を準備するため使用できます。

結論としては、チックのサンプルを使用して質の高い腫瘍 DNA を準備するための簡易迅速法を提案する.このメソッドは遺伝学的解析の分野で新たな可能性を拡大し、臨床の場面における精密医学を促進するため。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

参加に同意すること、病院と患者のすべての医療および補助的なスタッフに感謝しますガブリエル白狼、エダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) このレポートの下書きを編集してから、博士に感謝いたします。本研究は、ゲノム研究プロジェクト (容湖とミズーリ州) は、山梨県からの助成金から、安田医療財団 (容湖) 補助金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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References

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