Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

Cancer Research

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Summary

Erhalten qualitativ hochwertige genomischen DNA von Tumorgewebe ist ein wichtiger erster Schritt für die Analyse von genetischer Veränderungen, die Sequenzierung der nächsten Generation. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um Tumorzellen zu bereichern und intakte DNA von Touch Impressum Zytologische Proben erhalten.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

Es ist entscheidend für die Mutationszucht Status bei Krebs vor Verwaltung und Behandlung der spezifische molekulare zielgerichtete Medikamente für Krebspatienten zu bestimmen. In der klinischen Einstellung sind Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe für Gentests verbreitet. Proteinkinase DNA ist jedoch in der Regel beschädigt und bei der Fixierung mit Formalin fragmentiert. Proteinkinase DNA ist daher manchmal nicht ausreichend für die genetische Untersuchung wegen geringer Qualität und Quantität der DNA. Hier präsentieren wir eine Methode der Touch Impressum Zytologie (TIC), genomischen DNA von Krebszellen zu erhalten, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Zelle Morphologie und Krebs-Zell-Zahlen können mit TIC Proben ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Extraktion von genomischer DNA aus TIC Proben innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden. Den Gesamtbetrag und die Qualität der TIC DNA erhalten mit dieser Methode war höher als die der Proteinkinase DNA. Diese schnelle und einfache Methode erlaubt Forschern, qualitativ hochwertige DNA für genetische Untersuchungen (z.B., nächste Generation Sequenzierung Analyse, digitale PCR und quantitative Real-Time PCR) zu erhalten und um die Bearbeitungszeit für die Berichterstattung über Ergebnisse zu verkürzen.

Introduction

Nächste Generation Sequencing Technologie hat Forscher erhebliche Fortschritte bei der Analyse von Genominformationen in genetischen Variationen, Mendelian Krankheit, erbliche Veranlagung und Krebs 1,2,3 bereitgestellt . Die Cancer Genome Atlas (TCGA) und internationalen Krebs Genom Konsortium (ICGC) haben die Identifizierung der genetischen Veränderungen, die in verschiedenen Arten von gemeinsamen Krebserkrankungen4verfolgt. Hunderte von wesentlicher Treiber Krebsgene erfolgreich identifiziert worden, und einige dieser Moleküle sind für Droge-Entwicklung1,5,6angestrebt.

In der klinischen Einstellung sind FFPE-Proben für die pathologische Diagnose und molekulare Tests für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs gebräuchlich. Jedoch bei der Fixierung mit Formalin, tritt Vernetzung der DNA-Protein oder DNA-DNA und DNA-Fragmentierung wird induziert. Somit eignen sich FFPE DNA-Proben nicht immer zur genetischen Analyse wegen der geringen Qualität und Quantität der DNA-7,8,9. Darüber hinaus dauert es mehrere Tage FFPE-Proben vorbereiten und technisches Geschick ist notwendig, um die Abschnitte genau vorbereitet. Daher ist es wünschenswert, eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung qualitativ hochwertige intakte DNA zu entwickeln.

Zytologie ist eine alternative Methode für die pathologische Diagnose. Zytologische Probenvorbereitung ist eine einfachere, weniger teuer und schneller Ansatz im Vergleich zu FFPE Vorbereitung10. Die TIC-Technik wurde auf Sentinel-Lymphknoten und marginale Gewebe von Patientinnen mit Brustkrebs für intraoperative Schnelldiagnose für einige Jahre11,12durchgeführt. Allerdings gibt es einige Berichte, die untersucht, ob qualitativ hochwertige genomischer DNA aus TIC Proben extrahiert werden kann und für spätere genetische Analyse verwendet. Zytologische Präparate sind häufig mit Papanicolaou (Pap) oder Giemsa Färbung gefärbt, und wir haben bereits berichtet, dass die Menge und Qualität der von TIC Proben (vor allem Giemsa gefärbten Proben) extrahierte DNA Proben aus FFPE überlegen sind Gewebe-13. Verglichen mit PAP-Färbung, hat Giemsa Färbung einen Vorteil in weniger befleckenden Verfahren erfordern. Pap-Färbung, nach die Proben wurden behoben, und gebeizt, müssen sie montiert werden mit Montage Medium (z. B.Malinol) Probe Inhalt, z. B. Tumorzellen normalen Zellen und entzündlichen Zellen unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Wenn die Pap-Probe ohne Montage Schritt bereit ist, ist es fast unmöglich, die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, weil die Probe getrocknet ist. Zum Vergleich: Giemsa Färbung im getrockneten Zustand beobachtet werden, daher die Montage-Schritt ist nicht erforderlich für schnelle zelluläre Bewertung. Für Mikrodissektion ist die Giemsa Färbung besser geeignet, da trockene Proben erforderlich.

In diesem Bericht wir stellen eine einfache und schnelle Methode für die Zubereitung von TIC Exemplare mit Giemsa Färbung und zeigen, dass TIC eine bessere Quelle für DNA verglichen mit FFPE-Proben.

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Protocol

(1) TIC Vorbereitung für schnelle mikroskopische Beurteilung mit normalem Glas gleitet

  1. Nach klinischen pathologischen Gewebe Materialien zur Verfügung stehen durchführen Sie die TIC-Vorbereitung so bald wie möglich. Wenn TIC Proben sofort vorbereitet werden können, halten Sie die Gewebe Materialien bedeckt mit Kochsalzlösung befeuchtet steriler Gaze und lagern im Kühlschrank Trocknen des Gewebes zu verhindern.
  2. Bereiten Sie 5 mm3 Gewebematerial wie soliden Tumoren (z.B.Leber, Lunge und Brustgewebe) klinisch durch Operation oder Endoskopie gewonnen.
    1. Sanft reinigen Sie das Gewebe mit steriler Gaze beschichtet mit physiologischer Kochsalzlösung und entfernen Sie Blut zu, wenn die Gewebeoberfläche eine Menge Blut hat.
    2. Halten Sie für mikroskopische Präparate wie Biopsiematerial die Probe mit steriler Gaze getränkt in physiologischer Kochsalzlösung befeuchtet.
  3. Schneiden Sie und trimmen Sie das normale Gewebe mit einem Trimmmesser und setzen Sie die Oberfläche des Tumors Läsion, aus, wenn die Tumormassen grob nicht sichtbar sind.
  4. Berühren Sie die Tumor-Oberfläche der resezierten Exemplare auf einem normalen Objektträger mehrmals mit behandschuhten Händen. Bestätigen Sie visuell, dass berührte Bereich über 80 % der normalen Glas Folie ist.
  5. Leicht andrücken der normalen Glas Folie gegen eine Polyethylen naphthalate (PEN) Membran Folie und 2-3 Mal mit behandschuhten Händen einmassieren. Bestätigen Sie visuell, dass die Zellen aus der normalen Objektträger in Stift Membran Folie übertragen werden.
  6. Trocknen Sie das Glas und Stift Membran Folien für 5 min bei Raumtemperatur an der Luft.
  7. Färben Sie die normalen Objektträger für direkte zytologische Untersuchung. Tauchen Sie den Objektträger mit Fixativ Lösung für 5 s und dann Fleck mit Giemsa Färbung Lösung für 15 s.
  8. Bewerten und Bildschirm Tumor Inhalte und Zellularität auf normales Glas Folie vollständig mit einem Mikroskop für schnelle Beurteilung. Tumorzellen, die auf der Grundlage mehrerer Kriterien zu bewerten; nukleare Erweiterung, abnorme Karyotyp, reichlich Chromatin, ungleiche Verteilung der Zellen, Verhältnis von nuklearen Komponente/zytoplasmatischen Komponente, Zellengröße und Zellpolarität.

2. Vorbereitung des Stift-Membran-Dia-Film für Gentests

  1. Wenn das Beispiel Tumor Zellularität zeigt mehr als 60 % durch schnelle mikroskopische Beurteilung (Schritt 1,8), den Tumor berührt Film der Stift Membran Folien für DNA-Extraktion mit einem Messer geschnitten und behandschuhten Händen. Übertragen Sie den geschnittenen Film zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pincette und Handschuhen.
  2. Wenn der Tumor Zellularität so niedrig (weniger als 60 % des Inhalts Tumor) durch schnelle mikroskopische Beurteilung (Schritt 1,8) bestimmt wurde, nutzen Sie Laser Capture Microdissection und einholen Sie Tumorproben.
    1. Führen Sie Giemsa Färbung um die Tumorzellen unter Verwendung von standard-Protokollen zu beurteilen.
    2. Schneiden Sie die Folie von der PEM-Membran-Folie von geeigneten Laser Capture Microdissection.
    3. Übertragen Sie den geschnittenen Film zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pincette und Handschuhen.
    4. Speichern Sie den Film-haltigen Microcentrifuge Schlauch bei 4 ° C bis DNA-Extraktion (das Protokoll kann hier angehalten werden).

3. DNA-Extraktion

  1. Durchführen Sie DNA-Extraktion aus den TIC oder FFPE Gewebeproben mit einem FFPE DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen. Eine gleichwertige Kit ist verfügbar für die Proteinkinase DNA Extraktionsschritt.
  2. Fügen Sie 180 µL Gewebe Lyse Puffer (pH = 8.3) mit dem Film-haltigen Microcentrifuge Schlauch mit einer manuellen 200 µL Pipette. Fügen Sie 20 µL Proteinase K mit einer manuellen 20 µL Pipette und Mix durch Vortexen mit einem Vortex-Mixer mit maximaler Geschwindigkeit (ca. 2500 u/min) für 5 s.
  3. Inkubieren Sie die Proben bei 56 ° C über Nacht mit einem Luft-Inkubator.
  4. Bzw. Inkubieren Sie die Proteinkinase und TIC Proben bei 90 ° C in einem Hitze-Block für 1 h und 10 min. Kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  5. Hinzufügen 200 µL Puffer lyse der Probe mit einem 200-µL Pipette und Mischung gründlich durch Vortexen mit maximaler Geschwindigkeit für 5 s.
  6. 200 µL Ethanol (96-100 %) mit einer 200-µL Pipette und gründlich mischen von vortexen mit maximaler Geschwindigkeit für 5 s. kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  7. Übertragen Sie sorgfältig die gesamte lysate auf die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° C.
  8. Setzen Sie die Spin-Säule in einer sauberen 2-mL-Kollektion-Röhre mit behandschuhten Händen, und verwerfen Sie dem Sammelrohr mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox.
  9. Die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° c 500 µL Waschpuffer hinzufügen
  10. Setzen Sie die Spin-Säule in einer sauberen 2-mL-Kollektion-Röhre mit behandschuhten Händen, und verwerfen Sie dem Sammelrohr mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox.
  11. Die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° c 500 µL Waschpuffer hinzufügen
  12. Das Sammelröhrchen mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox zu verwerfen. Setzen Sie die Spin-Säule in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit behandschuhten Händen und Zentrifugieren bei 20.000 x g für 3 min bei 25 ° C um die Membran zu trocknen.
  13. Setzen Sie die Spin-Säule in einem DNA-niedrige Bindung Rohr mit behandschuhten Händen.
    1. Das Zentrum der Membran mit einer 100 µL Pipette 40-50 µL der Elution Puffer hinzufügen.
    2. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Zentrifuge bei 20.000 x g für 1 min bei 25 ° C.
    3. Speichern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C erst im nächsten Schritt (das Protokoll kann hier angehalten werden).

4. Einschätzung der Qualität der DNA durch Quantitative Real-Time PCR

  1. Bereiten Sie den master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette, wie folgt: 10 µL 2 x Echtzeit-PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Sonden Mix (Amplikons Größe: 87 bp), und 8 µL steriler Nuklease-freies Wasser.
  2. Der zweite master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch wie folgt vorbereiten: 10 µL 2 x Echtzeit-PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Sonden Mix (Amplikons Größe: 268 bp), und 8 µL steriler Nuklease-freies Wasser.
  3. Durchführen Sie Verdünnungsreihen menschlicher Kontrolle genomic DNA (beiliegenden) 4 Mal für ein fünf-Punkte-Standardkurve und bestimmen Sie die absolute DNA-Konzentrationen13.
  4. Fügen Sie 19 µL der zwei vorbereiteten Meister Mischungen (vorbereitet in Schritt 4.1 und 4.2) in separaten Vertiefungen eines optische Reaktion der 96-Well-Platte mit einem 20-µL Pipette.
  5. Fügen Sie 1 µL FFPE DNA oder TIC-DNA, Brunnen, enthält die Reaktion Mischung mit einer 2-µL Pipette zu trennen. Fügen Sie 1 µL Nuklease-freies Wasser in einen separaten Brunnen mit der Reaktion-Mix für die keine Vorlage-Kontrolle.
  6. Halten der nichtklebenden Seite des optischen Klebefolie und ziehen Sie die schützende Rückendeckung von der Mitte des Films. Vorsichtig ziehen Sie den Applikator über den Film und versiegeln Sie den Film über die 96-Well-Platte zu.
  7. Vorsichtig mischen die 96-Well-Platte mit einer 96-Well-Platte-Mixer für 10 s bei Raumtemperatur bei 2.000 u/min. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
  8. Schalten Sie die Echtzeit-PCR Instrument und Einfügen der 96-Well-Platte. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s. Verwendung "Standardkurve" und "schnell-Modus."
  9. Bewerten Sie DNA-Fragmentierung mit dem Verhältnis von DNA (relative Quantifizierung; RQ) erhalten für die lange Amplifikate (268 bp), die kurzen Amplifikate (87 bp). RQ ist der Mittelwert der lange Amplikons/der Mittelwert der kurzen Amplikons13.

5. Vorbereitung der nächsten Generation Sequenzierung Bibliothek

  1. Bereiten Sie die Sequenzierung-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Die Multiplex-PCR-master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch pro Probe wie folgt vorbereiten: 4 µL 5 x Multiplex PCR-Reaktion-Lösung, 4 µL 5 x Grundierung Pool, ≤6 µL TIC oder Proteinkinase DNA (1-100 ng), und fügen Sie Nuklease-freies Wasser bis zu 20 µL.
    1. Hinzu kommen die Multiplex-PCR-master-Mix eine PCR Rohr und Mischung sanft durch Tippen auf das Rohr.
    2. Kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  3. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 99 ° C für 2 min, gefolgt von 20 Zyklen von 99 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min und halten Schritt 10 ° C. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen, die basierend auf der Anzahl von Primer-Paaren.
  4. Öffnen Sie den Deckel der PCR-Röhre, und fügen Sie 2 µL Restriktionsenzym mit einer 2-µL Pipette. Schließen Sie den Deckel des PCR-Röhrchen und Mischung sanft durch Tippen auf das PCR-Röhrchen. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  5. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 50 ° C für 10 min, 55 ° C für 10 min, 60 ° C für 20 min, und halten Schritt 10 ° C. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  6. Fügen Sie die Adapter-Ligatur master-Mix in die nun jeweils die verdaute PCR-Amplifikate mit einer Pipette wie folgt: 4 µL Adapter Ligatur Lösung 0,5 µL Barcode, 0,5 µL des Adapters, 2 µL Nuklease-freies Wasser und 2 µL DNA Ligase. Schließen Sie den Deckel des PCR-Röhrchen und Mischung sanft durch Antippen. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  7. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 22 ° C für 30 min, 68 ° C für 5 min, 72 ° C für 5 min, und halten Schritt 10 ° C.
  8. Reinigen Sie die Sequenzierung Bibliothek mit magnetischen Beads nach den Anweisungen des Herstellers.
  9. Übertragen Sie die Adapter ligiert Bibliothek Lösung in 1,5 mL DNA niedrige unverbindliche Rohr. Fügen Sie 45 µL des magnetischen Beads in das DNA niedrige unverbindliche Rohr für die 1St -Reinigung. Durch Tippen auf das Rohr vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Legen Sie die DNA-niedrige Bindung Röhre in einem magnetischen Rack, dann 2 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, bis die Lösung klar ist. Sorgfältig entsorgen des Überstands mit einer 200-µL Pipette ohne störende magnetische Beads.
  11. Fügen Sie 150 µL von frisch zubereiteten 70 % Ethanol mit einer 200-µL Pipette hinzu, dann verschieben Sie die Tube Seite zu Seite des Magneten, die Perlen zu waschen. Sorgfältig entsorgen des Überstands ohne störende magnetische Beads.
  12. Wiederholen Sie Schritt 5.11 für einen zweiten Waschgang.
  13. Spin-down der Röhre kurz mit Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, und entsorgen Sie sorgfältig die Ethanol-Tröpfchen mit einer 10 µL Pipette.
  14. Fügen Sie 50 µL TE tief in das DNA-Low-Bindung-Rohr mit magnetischen Beads Pellet um die Perlen zu verteilen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  15. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min, bis die Lösung klar ist.
  16. Übertragen Sie 50 µL Überstand in das neue DNA niedrige unverbindliche Rohr und fügen Sie 75 µL des magnetischen Beads mit einer 100 µL Pipette für die 2Nd -Reinigung. Durch Tippen auf das Rohr vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  17. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, dann 2 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, bis die Lösung klar ist. Sorgfältig entsorgen des Überstands mit einer 200-µL Pipette ohne störende magnetische Beads.
  18. Fügen Sie 150 µL von frisch zubereiteten 70 % Ethanol mit einer 200-µL Pipette hinzu, dann verschieben Sie die Tube Seite zu Seite des Magneten, die Perlen zu waschen. Sorgfältig entsorgen des Überstands ohne störende magnetische Beads.
  19. Wiederholen Sie Schritt 5.18 für einen zweiten Waschgang.
  20. Kurz spin-down das Rohr mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, und entsorgen Sie sorgfältig die Ethanol-Tröpfchen mit einer 10 µL Pipette.
  21. Fügen Sie 50 µL der niedrigen TE in das DNA-Low-Bindung-Rohr mit magnetischen Beads Pellet um die Perlen zu verteilen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  22. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min, bis die Lösung klar ist.
  23. Die 45 µL des Überstands mit gereinigtem Bibliothek in das neue DNA niedrige unverbindliche Rohr mit einer 100 µL Pipette zu übertragen.

(6) quantifizieren Sie die Bibliothek-Konzentration durch Quantitative Real-Time PCR

  1. Bestimmen Sie die Konzentration der jede Bibliothek gemäß des Herstellers Anweisungen13.
    1. Bereiten Sie eine 20-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 2 µL der gereinigten Bibliothek und 38 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr mit einer 2-µL und 100 µL Pipette.
    2. Speichern Sie die unverdünnten Bibliotheken bei-20 ° C bis Schritt 7.3.
  2. Bereiten Sie eine 200-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 5 µL der 20-fold verdünnter gereinigten Bibliothek (in Schritt 6.1 vorbereitet) und 45 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr.
  3. Bereiten Sie eine 2,000-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 5 µL der 200-fold verdünnter gereinigten Bibliothek (in Schritt 6.2 vorbereitet) und 45 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr.
  4. Die Reaktion-master-Mix wie folgt vorbereiten: 10 µL 2 x master-Mix Lösung und 1 µL 20 x Primer-Sonden-Assay-Lösung in sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette, vermischen dann durch Tippen auf das Rohr. Fügen Sie 11 µL der Reaktion-master-Mix in die Vertiefungen einer optischen 96-Well-Reaktion.
  5. Jede Vertiefung mit einer 10 µL Pipette 9 µL der 2,000-fold verdünnter Bibliothek, 9 µL jeder standard-Steuerelement oder 9 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen.
  6. Halten Sie die nichtklebenden Seite optische Klebefolie und ziehen Sie die schützende Rückendeckung von der Mitte des Films.
    1. Vorsichtig ziehen Sie den Applikator über den Film und versiegeln Sie den Film über die 96-Well-Platte zu.
    2. Vorsichtig mischen die 96-Well-Platte mit einer 96-Well-Platte-Mixer für 10 s bei Raumtemperatur.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
  7. Schalten Sie die Echtzeit-PCR Instrument und Einfügen der 96-Well-Platte. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s. Verwendung "Standardkurve" und "schnell-Modus."
  8. Berechnen Sie unverdünnt Bibliothek Konzentration durch Multiplikation der Konzentration von 2.000 mit qPCR ermittelt.

(7) next Generation Sequencing

  1. Planen Sie den laufen Zustand und legen Sie den laufen Parameter innerhalb der Software.
    1. Klicken Sie auf [Register "Plan"] und [Vorlage], und wählen Sie die entsprechende run-Methode.
    2. Wählen Sie die Anwendung und Technik aus, und klicken Sie auf [weiter].
    3. Wählen Sie das Instrument, Probe Vorbereitungssatz (optional), Kit Bibliothekstyp, Vorlage Kit, Sequencing Kit, Basis Kalibriermodus, chip-Typ, Sequenz (optional) und Barcode zusammengestellt und klicken Sie auf [weiter].
    4. Wählen Sie Plugins und klicken Sie auf [weiter].
    5. Wählen Sie Projekt aus und klicken Sie auf [weiter].
    6. Wählen Sie Standard-Referenz und Bett-Dateien für Ihre gezielte Gegend.
    7. Geben Sie den Probennamen, wählen Sie den Barcode, und klicken Sie auf [Plan ausführen].
  2. Vorlage-Vorbereitung durchführen und chip-laden in einem automatisierten Instrument nach den Anweisungen des Herstellers. Die Reagenzkassette bei Raumtemperatur für 45 min vor dem Gebrauch auftauen.
  3. Verdünnen der unverdünnten Bibliothek mit Nuklease-freies Wasser entsprechend der Bibliothek-Konzentration in Schritt 6,8 berechnet und 20 Uhr Bibliotheken zu machen.
    1. Bereiten Sie eine gepoolte Bibliothek für Sequenzierung und Shop auf Eis.
    2. Fügen Sie 25 µL der gepoolten Bibliothek mit einer 100 µL Pipette auf den Boden des Probenröhrchens. Verwenden Sie die gepoolte Bibliothek innerhalb von 48 h.
  4. Schalten Sie ein und öffnen Sie die Abdeckung des automatischen Instruments.
    1. Legen Sie die Sequenzierung Chip, Chip-Adapter, Bereicherung Patrone, Tipp Patrone, PCR Platte, PCR-Frame Dichtung, Erholung Rohr, Lösung Patrone und Reagenzkassette an die gewünschte Position des automatisierten Instruments.
    2. Tippen Sie auf [Setup ausführen] und [Schritt für Schritt] auf dem Bildschirm.
    3. Schließen Sie die Abdeckung, und tippen Sie auf [Start überprüfen] auf dem Bildschirm.
    4. Nach dem Deck scan-Prozess, tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm.
    5. Prüfen Sie den Displayinhalt (Kit-Typ, Chip, chip-ID, Proben-ID, Pläne), stellen Sie die Zeit, und tippen Sie auf [OK] auf dem Bildschirm.
  5. Nach Beendigung der Chip-laden:
    1. Tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm, und öffnen Sie die Abdeckung.
    2. Entladen den Sequenzierung Chip von Chip Adapter mit behandschuhten Händen.
    3. Platzieren Sie den Chip in der Chip-Container, Rap mit Parafilm und Store bei 4 ° C bis die Sequenzierung Reaktion.
    4. Die Anreicherung Patrone, PCR Platte PCR Frame Dichtung, Erholung Rohr, Lösung Patrone und Reagenzkassette entfernt aus der entsprechenden Position des automatisierten Instruments mit behandschuhten Händen.
    5. Übertragen Sie eine Patrone leer-Tip auf die Abfälle Tipp-Position des automatisierten Instrument mit behandschuhten Händen.
    6. Tippen Sie auf [weiter] und schließen Sie die Abdeckung.
    7. Tippen Sie auf [Start] und reinigen Sie der automatisierten Instrument durch ultraviolette Strahlen für 4 min.
  6. Lösen Sie eine Natrium-Chlorit-Tablette in 1.000 mL Reinstwasser und Filter-Lösung mit einer Filtereinheit 0,22 µm Filter fließen.
    1. Schalten Sie das Instrument der Sequenzierung.
    2. Tippen Sie auf [Clean] und [weiter] auf dem Bildschirm des Gerätes Sequenzierung.
    3. Reinigen Sie die Sequenzierung Instrument mit 250 mL Filter sterilisiert Natrium-Chlorit-Lösung und anschließend 250 mL Reinstwasser.
  7. Berühren Sie [initialisieren] und wählen Sie das entsprechende Sequencing Kit auf dem Bildschirm.
    1. Installieren Sie einen grauen Versender an der entsprechenden Stelle mit behandschuhten Händen.
    2. Initialisieren Sie die Sequenzierung Instrument mit der Waschlösung (mitgelieferten), die pH-Anpassung-Lösung (mit 350 µL 100 mM Natriumhydroxid) und der pH-Standardlösung (mitgelieferten).
  8. Fügen Sie 20 µL dATP, dGTP, dCTP und dTTP Nukleotide (mitgelieferten) in 50 mL Röhrchen (sofern im Kit) mit einer 100 µL Pipette.
    1. Installieren Sie einen grauen Versender an der entsprechenden Stelle mit behandschuhten Händen.
    2. Laden Sie die 50-mL-Tube und Schraube auf die Sequenzierung Instrument.
    3. Tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm, um die Initialisierung Schritt zu beginnen, der dauert ca. 25 Minuten.
  9. Nach Abschluss den Initialisierung Schritt:
    1. Berühren Sie [Run] auf dem Bildschirm und wählen Sie die entsprechende Bibliothek Vorbereitung Instrument.
    2. Scannen Sie den zweidimensionalen Barcode des Chips.
    3. Stecken Sie die Sequenzierung Chip auf die gewünschte Position.
    4. Schließen Sie die Chip-Klemme und Instrument Tür.
    5. Berühren Sie [Chip überprüfen], [Next] und [OK] auf dem Bildschirm, um die Sequenzierung Lauf starten.
  10. Übertragen Sie nach der Sequenzierung Reaktion die Daten und Datenanalyse Pipeline für die Sequenzierung Server13,17ausführen.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt den gesamten Prozess von der Vorbereitung TIC Proben zur DNA-Extraktion. Insbesondere übernimmt die Prozedur nur zwei Tage genomischen DNA von TIC Proben zu erhalten. Wir bewerten alle Effekte der Tumor Lagerung vor der Verarbeitung der Folie. Wir fanden, dass Tumorzellen auf dem Objektträger befestigt wurden, wenn Gewebeproben sofort auf die Folie berührt wurden und Geweben in Kochsalzlösung befeuchtet steril-Gaze für 1 h (Abbildung 2) gehalten wurden. Jedoch Wenn Gewebe bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden, waren die Tumorzellen nicht gut mit der Folie verbunden. Unterschiedliche Musterpräparate könnte drei Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Daher ist es wichtig, nicht zu die Proben trocknen lassen.

Wir untersuchten das Dienstprogramm unserer Methode und vergleichen ihn mit Exemplare erworben mit Proteinkinase. TIC und FFPE-Proben aus 14 Tumor Proben vorbereitet wurden, und wir bestätigen, dass Tumor Inhalt und Reinheit von TIC Proben beurteilt werden können. Nachdem wir Giemsa Färbung durchgeführt, könnte die Zahl der Tumorzellen und die Tumor-Morphologie von Mikroskopie bewertet werden. So konnten wir routinemäßig bewerten die Tumorzellen und führen Sie anschließend einen DNA-Qualitäts-Check.

Die DNA-Menge und Qualität wurden durch quantitative Real-Time PCR13,14,15geschätzt. Wir entschlossen die absoluten Mengen der DNA und der RQ-Wert, der ein Indikator für den Abbau von genomischer DNA ist. Die Ergebnisse zeigten, dass eine höhere DNA-Ausbeute erreicht wurde mit Hilfe der TIC-Proben im Vergleich zu den FFPE-Proben (Tabelle 1). Darüber hinaus die RQ-Werte der TIC DNA wurden deutlich höher verglichen mit derjenigen der FFPE-DNA (Abbildung 3, p = 2,3 x 10-8, zweiseitigen Student- t -Tests). Wir bewerten auch die RQ-Werte der TIC und FFPE DNA extrahiert aus verschiedenen Tumorarten und festgestellt, dass die TIC-DNA höher Qualität im Vergleich zu der Proteinkinase DNA (Abbildung 3) war. Diese Ergebnisse zeigten, dass die TIC-DNA weniger fragmentiert als die Proteinkinase-DNA war.

Wir als nächstes geprüft, ob die TIC-DNA für die nächste Generation Sequenzierung Analyse verwendet werden könnten. Proteinkinase und TIC DNA wurden von primären kolorektalen Karzinomen und metastasierten Leberkrebs erhalten von einem Patienten (Abb. 4A) vorbereitet. PCR-Amplifikation und Bibliothek Vorbereitung wurden durchgeführt mit dem Krebs-Hotspot-Panel und anschließend gezielte Sequenzierung durchgeführt wurde. Infolgedessen wurde APC Q1367 * Proteinkinase und TIC DNA extrahiert vom Standort 1 (Tabelle 2) identifiziert. Darüber hinaus APC S1356 *, KRAS G12D und TP53 M237I erkannt wurden, in beiden Proteinkinase und TIC DNA extrahiert von Seite 2, 3 und 4 (Tabelle 2). Diese Ergebnisse vorgeschlagen, dass die identischen somatischen Mutationen in gekoppelten Proteinkinase und TIC DNA-Proben aus dem gleichen Ort des Tumors (Abbildung 4 b und Tabelle 2) identifiziert wurden. Insbesondere wurden die gleichen somatischen Mutationen erkannt, zwischen primären kolorektalen Karzinomen (Standort 2, nicht Seite 1) und zwei metastasierendem Leberkrebs Proben, was darauf hindeutet, dass die Tumor-Klone aus Standort 2, Leber (Abbildung 4 b und Tabelle 2 metastasieren). Zusammen schlagen diese Erkenntnisse, dass die TIC-DNA hochwertig ist und eignet sich für eine Vielzahl von genetischen Tests einschließlich Sequenzierung der nächsten Generation.

Figure 1
Abbildung 1. Schaltplan für den Erhalt der DNA aus einer TIC-Probenvorbereitung. Das Tumorgewebe wird auf der Folie Glas zur Vorbereitung der TIC-Probe berührt. Nach Prüfung der Tumor-Morphologie und Inhalte unter dem Mikroskop kann die Tumor-DNA extrahiert und für Gentests verwendet werden. Mithilfe von TIC kann der Tumor DNA einer klinischen pathologischen Probe innerhalb von zwei Tagen entnommen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vorbereitung der TIC-Proben. Resected Tumor Proben wurden sofort in ein normales Glas Folie (linken), gehalten in Kochsalzlösung befeuchtet steril-Gaze für 1 h (Mitte), berührt und bei Raumtemperatur 1 h (rechts) aufbewahrt. Beispiel #1 war das Leberzellkarzinom und Probe #2 war Brustkrebs. Mikroskopische Bilder wurden mit einer Digitalkamera an ein Mikroskop montiert erfasst. Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. DNA-Qualitäts-Check durch quantitative Echtzeit-PCR-Analyse geschätzt. TIC und FFPE-DNA wurden aus 14 Tumorgewebe aus kolorektalen extrahiert (n = 8), Magen (n = 4), und metastasierten Leberkrebs (n = 2). Vergleich der relativen Quantifizierung Scores zwischen TIC-Giemsa und FFPE-er Proben. RQ-Werte der TIC DNA waren deutlich höher als die der Proteinkinase DNA. Statistische Analyse zwischen den beiden Gruppen wurde durchgeführt und p-Werte wurden berechnet, indem ungepaarte zweiseitigen Student t -Test mit Excel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Nächsten Generation Sequenzierung Analysedaten mithilfe von TIC und FFPE DNA. (A) makroskopische und mikroskopische Aufnahmen. Repräsentative Bilder von TIC-Giemsa und FFPE-HE-Färbung von Darmkrebs (Seite 1 und 2) und metastasiertem Karzinom der Leber Proben (Seite 3 und 4). Maßstabsleiste in makroskopischen Bilder: 1 cm, Maßstabsleiste in mikroskopische Aufnahmen: 100 µm. (B) Heatmap zeigt die Verteilung der somatische Mutationen für jeden Tumor-Standort (n = 8). Identische Mutationen wurden zwischen gepaarten TIC und FFPE DNA Proben nachgewiesen. Werte von Allelen Fraktionen entnehmen Sie bitte Graduierung Farbskala von 1 % (hellrosa) auf 100 % (rosa). Graue Spalten zeigte keine identifizierten Mutation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-HE (n = 14)
Gesamt-DNA (ng) Gesamt-DNA (ng)
Probe Tumor-Website Kurze Lange RQ Kurze Lange RQ
Site1 Doppelpunkt 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Site2 Doppelpunkt 991 1057 1.07 556 204 0,37
Site3 Leber 467 511 1.09 130 39 0,3
Site4 Leber 2172 2115 0,97 488 127 0.26
Site5 Doppelpunkt 749 598 0,8 529 205 0,39
Site6 Magen 330 286 0,86 211 98 0,46
Site7 Magen 636 499 0.78 154 84 0,55
Site8 Magen 27 27 1.01 135 81 0,6
Site9 Doppelpunkt 1986 1611 0.81 476 163 0,34
Site10 Doppelpunkt 280 218 0.78 209 83 0,39
Arbeitstag11 Doppelpunkt 1546 575 0,37 366 159 0,43
Site12 Magen 1501 1200 0,8 274 132 0,48
Website13 Doppelpunkt 1556 1404 0,9 326 179 0,55
Site14 Doppelpunkt 1565 1210 0,77 680 295 0,43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabelle 1. DNA-Qualitätsdaten. Gepaart TIC (n = 14) und FFPE-Proben (n = 14) wurden vorbereitet von Darm, Leber und Magen-Krebs. TIC-Proben wurden mit Giemsa gefärbt und FFPE-Proben wurden gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (HE). DNA-Proben extrahiert und mit zwei Primer RNaseP Locus Verstärkung durch quantitative Real-Time PCR quantifiziert wurden (lange Amplifikate (268 bp) und kurze Amplifikate (87 bp)). RQ-Werte wurden wie folgt berechnet: der Mittelwert der langen Amplikons geteilt Bythe Mittelwert der kurzen Amplikons. SD, Standardabweichung; RQ, relative Quantifizierung

Probenname Lage Vorbereitung Gen-symbol Mutation Position Referenz Variant Codierung Abdeckung Allele Bruchteil
Primäre Darmkrebs Seite 1 PROTEINKINASE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45 %
Primäre Darmkrebs Seite 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 PROTEINKINASE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 PROTEINKINASE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 PROTEINKINASE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56 %
Primäre Darmkrebs Seite 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 PROTEINKINASE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 PROTEINKINASE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 PROTEINKINASE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 PROTEINKINASE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 PROTEINKINASE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 PROTEINKINASE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62 %
Metastasierendem Leberkrebs Seite 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95 %

Tabelle 2: Vergleich von Mutationen in gekoppelten Proteinkinase und TIC DNA durch gezielte Sequenzierung Analyse erkannt. TIC gepaart und FFPE-Proben wurden vorbereitet von 2 primäre kolorektale Karzinome (Seite 1 und 2) und 2 metastasierten Leberkrebs (Seite 3 und 4). Gezielte Sequenzierung erfolgte mit dieser DNA-Proben und somatische Mutationen identifiziert. Mutation-Profile wurden zwischen gepaarten TIC und FFPE DNA Proben identisch.

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Discussion

In dieser Studie haben wir eine alternative Methode für den Erhalt der Tumor DNA aus klinischen pathologischen Proben mit TIC vorgestellt. TIC-Zubereitung ist sehr einfach und benötigt weniger Zeit im Vergleich zu FFPE Methoden, ohne die Forderung nach speziellen Instrumenten10. Alle Verfahren von der TIC-Vorbereitung zur DNA-Extraktion können innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1) abgeschlossen werden. Diese Methode verkürzt somit die Turnaround-Zeit für die Durchführung von Gentests. Bemerkenswert ist, bietet dies einen erheblichen Vorteil bei der Verkürzung der Anzahl der Tage für die molekulare Analyse benötigt. Diese kurze Bearbeitungszeit lässt sich sofort eine geeignete Therapie für Patienten mit progressiven bieten, die Molekular zielgerichtete Medikamente benötigen. Diese Methode bietet also Vorteile für Analysen von genetischen Veränderungen in Tumoren und Verwaltung von molekular zielgerichtete Medikamente für die Krebstherapie.

Es gibt einige wichtige Punkte für den Erfolg von TIC-DNA für die genetische Analyse verwenden. Wegen Behandlungen wie Chemotherapie oder andere Behandlungen möglicherweise Tumorgewebe nekrotisch. Daher ist Vorsicht geboten bei der Vorbereitung von TIC Proben Probenahme aus nekrotischen Abschnitten in den Tumor so weit wie möglich zu vermeiden. Weitere mikroskopische Erstprüfung ist sehr wichtig für die spätere Verfahren. Darüber hinaus ist die Verhinderung der Trocknung von Tumorgewebe für erfolgreiche TIC Probenvorbereitung erforderlich. Wenn der Tumorgewebe getrocknet sind, führt dies zu weniger angeschlossenen Zellen auf dem Objektträger. Es wird auch schwierig, den Tumor Zellularität und Morphologie zu beobachten, weil führt zu einer Degeneration des Tumorgewebe trocknen sein.

Es gibt einige potenzielle Vorteile für die Verwendung von TIC DNA. Erstens können wir den Tumor Zellularität während der ersten Bewertung mit Mikroskopie überprüfen. Wenn normale Zellen wie Lymphozyten und Stromazellen Zellen reichlich in den Gewebeproben wurden, verhindert die Verschmutzung dieser normalen Zellen somatische Mutationen in den Tumorzellen zu erkennen. Schnelle mikroskopische Beurteilung der Proben kann helfen, die Bewertung der Tumor Zellularität und Einschätzung der ob ausreichende Tumor DNA-Proben aus den TIC-Proben vor der DNA-Extraktion gewonnen wurden. Zweitens zeigten unsere Ergebnisse, dass die TIC-DNA hoch in Qualität und Quantität. Proteinkinase DNA wurde für die nächste Generation Sequenzierung Analyse einschließlich gezielte Sequenzierung, Exome Sequenzierung und ganze Genom-Sequenzierung16,17,18,19,20verwendet. Archival FFPE-DNA ist auch routinemäßig für Genanalyse21,22, verwendet, jedoch FFPE DNA während Formalin Fixierung fragmentiert sein kann. Dies kann Probleme bei PCR-Amplifikation oder DNA-Extraktion, verursacht einen Mangel an Sequenz Berichterstattung, Einheitlichkeit auf Zielregionen, und erhöhen Risiko für Sequenz Fehler23,24. Im Gegensatz dazu ist TIC DNA nicht fragmentiert, die möglicherweise durch die Alkohol-Fixierung, die hat weniger Einfluss auf die Nukleinsäure. Wie TIC DNA wie die Proteinkinase DNA nicht fragmentiert ist, werden diese Proben besser geeignet für die nächste Generation Sequenzierung Analyse, Real-Time PCR und digitale PCR. In der Tat zeigten wir zuvor, dass TIC DNA aus einer Tumor-Probe in eine Methode namens "TIC-Seq" Next Generation Sequencing Analyse verwendet werden kann und die Ergebnisse konnte der Tumor somatische Mutationen13genau erfassen. Drittens ist diese Technik für eine Vielzahl von Materialien. In dem vorliegenden Bericht haben wir chirurgische Proben verwendet. Neben chirurgischen Gewebe, metastatischen Lymphknoten, kann Bronchien oder endoskopische Biopsie verwendet werden, für die Zubereitung von TIC DNA.

Abschließend stellen wir eine einfache und schnelle Verfahren zur Herstellung von qualitativ hochwertigen Tumor-DNA mit TIC-Proben. Diese Methode wird neue Möglichkeiten im Bereich der genetischen Analyse zu erweitern und Präzisionsmedizin in der klinischen Einstellung zu fördern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Wir danken allen medizinischen und Dienstpersonal des Krankenhauses und die Patienten für die Zustimmung zur Teilnahme. Wir bedanken uns bei Gabrielle White Wolf, PhD, Edanz-Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für einen Entwurf des Berichts bearbeiten. Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Genome Research Project aus der Präfektur Yamanashi (YH und M.O.) und einen Zuschuss von der YASUDA Medical Foundation (YH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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