Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

Cancer Research

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Summary

Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

Il est essentiel de déterminer le statut mutationnel dans le cancer avant administration et traitement des médicaments ciblés moléculaires spécifiques pour les patients atteints de cancer. Dans le contexte clinique, fixés au formol les tissus inclus en paraffine (FFIP) sont largement utilisés pour les tests génétiques. Cependant, FFPE ADN est généralement endommagé et fragmentée au cours du processus de la fixation par le formol. Par conséquent, FFPE ADN n’est parfois pas suffisant pour les tests génétiques en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN. Nous présentons ici une méthode de cytologie d’empreinte tactile (TIC) pour obtenir l’ADN génomique des cellules cancéreuses, qui peut être observé au microscope. Nombre de cellules du cancer et de la morphologie cellulaire peut être évalué à l’aide de spécimens TIC. En outre, l’extraction de l’ADN génomique provenant d’échantillons TIC peut être complétée dans les deux jours. Le montant total et la qualité des TIC ADN obtenu à l’aide de cette méthode était supérieur à celui de la FFPE ADN. Cette méthode simple et rapide permet aux chercheurs d’obtenir des ADN de haute qualité pour les tests génétiques (par exemple, analyse de la génération prochaine séquence, numérique de PCR et PCR quantitative en temps réel) et de raccourcir le délai pour la présentation des résultats.

Introduction

Prochaine génération technologie de séquençage a fourni des chercheurs des progrès importants dans l’analyse de l’information de génome de variations génétiques, maladies mendéliennes, prédispositions héréditaires et cancer 1,2,3 . Le Cancer Genome Atlas (TCGA) et l’International Cancer Genome Consortium (oncologie) ont poursuivi l’identification des altérations génétiques dans plusieurs types de cancers communs4. Des centaines de gènes de pilote au cancer essentielles ont été identifiées avec succès, et certaines de ces molécules sont ciblés pour drug development1,5,6.

Dans le contexte clinique, échantillons FFPE sont couramment utilisés pour le diagnostic pathologique et tests moléculaires pour diverses maladies, y compris le cancer. Toutefois, au cours du processus de la fixation par le formol, la réticulation ADN-protéines ou d’ADN intervient et fragmentation de l’ADN est induite. Ainsi, les échantillons FFPE ADN ne conviennent pas toujours pour l’analyse génétique en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN7,8,9. En outre, il faut plusieurs jours pour préparer des échantillons FFPE et habileté technique n’est nécessaire d’établir avec précision les sections. Par conséquent, il est souhaitable d’élaborer une méthode simple et rapide pour obtenir qualité ADN intact.

Cytologie est une méthode alternative pour le diagnostic pathologique. Préparation des échantillons cytologiques est plus simple, moins coûteux et plus rapide approche contre FFIP préparation10. La technique TIC a été réalisée sur les ganglions sentinelles et marginales tissus de patients atteints de cancer du sein pour un diagnostic rapide peropératoire pour quelques années11,12. Cependant, il y a peu de rapports qui ont tenté de déterminer si l’ADN génomique de haute qualité peut être extraites de spécimens TIC et utilisé pour l’analyse génétique ultérieure. Les échantillons cytologiques sont couramment tachées de Papanicolaou (Pap) ou la coloration de Giemsa, et nous avons déjà indiqué que la quantité et la qualité de l’ADN extrait d’échantillons TIC (en particulier les échantillons colorés au Giemsa) sont supérieurs aux échantillons prélevés FFIP 13de tissus. Par rapport à la coloration de Pap, coloration de Giemsa a un avantage d’exiger moins méthodes de coloration. Dans la coloration de Pap, après que les échantillons ont été fixés et colorés, ils doivent être montés avec montage moyen (par exemple, Malinol) pour distinguer le contenu de l’échantillon, telles que les cellules tumorales, les cellules normales et des cellules inflammatoires au microscope. Si le spécimen de Pap est préparé sans l’étape de montage, il est presque impossible d’observer des cellules au microscope parce que l’échantillon est séché. En comparaison, la coloration au Giemsa peut être observée à l’état séché, l’étape de montage n’est donc pas nécessaire pour une évaluation rapide cellulaire. Pour microdissection, coloration de Giemsa est plus appropriée car il nécessite des spécimens secs.

Dans ce rapport, nous présenter une méthode simple et rapide pour la préparation de spécimens TIC avec coloration de Giemsa et démontrer que les TIC est une meilleure source d’ADN par rapport aux échantillons FFPE.

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Protocol

1. TIC préparation rapide évaluation microscopique à l’aide de verre Normal glisse

  1. Effectuer la préparation TIC dès que possible après que le tissu pathologique clinique matériaux sont disponibles. Si les spécimens TIC ne peuvent immédiatement être préparés, conserver les matériaux de tissu recouverts de solution saline humidifiée-gaze stérile et stocker au réfrigérateur pour éviter le dessèchement des tissus.
  2. Préparer 5 mm3 matériel tissulaire telles que des tumeurs solides (par exemple, du foie, des poumons et les tissus du sein) cliniquement obtenu par chirurgie ou par endoscopie.
    1. Doucement, essuyer le tissu avec une gaze stérile recouverte de sérum physiologique et enlever le sang, si la surface du tissu a beaucoup de sang.
    2. Pour les échantillons microscopiques tels que les matériaux de la biopsie, garder l’échantillon imbibé stérile-gaze imbibée de sérum physiologique.
  3. Couper et tailler le tissu normal avec un couteau de parage et exposer la surface de la lésion tumorale, si les masses de la tumeur ne sont pas visibles grossièrement.
  4. Touchez la surface de la tumeur des spécimens réséqués sur une lame de verre normal plusieurs fois avec des mains gantées. Confirmer visuellement que la zone touchée est supérieure à 80 % de la lame de verre normal.
  5. Légèrement, appuyez sur la lame de verre normale contre une diapositive de membrane polyéthylène naphtalate (PEN) et frottez doucement 2 ou 3 fois avec des mains gantées. Confirmer visuellement que les cellules sont transférées de la lame de verre normal à la diapositive de membrane de stylo.
  6. Sécher à l’air le verre et le PEN membrane diapositives pendant 5 min à température ambiante.
  7. Colorer la lame de verre normale pour l’examen cytologique direct. Tremper les lames de verre avec une solution de fixation pour 5 s et puis tache avec la solution pour 15 de coloration au Giemsa s.
  8. Évaluer et entièrement avec un microscope pour une évaluation rapide de l’écran le contenu de la tumeur et de la cellularité sur la lame de verre normal. Évaluer les cellules tumorales basées sur plusieurs critères ; l’élargissement nucléaire, caryotype anormal, chromatine abondante, une répartition inégale des cellules, rapport de la composante nucléaire de composant/cytoplasmique, la taille des cellules et polarité cellulaire.

2. préparation du Film diapositive PEN Membrane pour les tests génétiques

  1. Si l’échantillon montre cellularité de la tumeur, plus de 60 % par une rapide évaluation microscopique (étape 1.8), couper le film tumeur-touché des PEN membrane diapositives pour l’extraction de l’ADN avec un couteau et gantés mains. Transférer le film coupe dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pincette et mains gantées.
  2. Si la cellularité de la tumeur a été déterminée comme étant faible (moins de 60 % du contenu tumeur) par rapide évaluation microscopique (étape 1.8), utiliser le laser microdissection de saisie et obtenir des échantillons de tumeur.
    1. Effectuer afin d’évaluer les cellules tumorales à l’aide de protocoles standard de coloration de Giemsa.
    2. Couper le film de la diapositive de membrane PEM par microdissection de saisie de laser approprié.
    3. Transférer le film coupe dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pincette et mains gantées.
    4. Conserver le tube microtubes contenant du film à 4 ° C jusqu'à l’extraction de l’ADN (le protocole peut être suspendu ici).

3. Extraction d’ADN

  1. Effectuer l’extraction de l’ADN des échantillons de tissu TIC ou FFIP, à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN FFIP selon les instructions du fabricant avec des modifications mineures. Il existe un kit équivalent pour l’étape d’extraction FFPE ADN.
  2. Ajouter 180 µL de tampon de lyse tissulaire (pH = 8,3) au tube microtubes contenant du film avec une pipette manuelle 200 µL. Ajouter 20 µL de protéinase K avec une pipette manuelle 20 µL et mélanger au vortex avec un agitateur Vortex à vitesse maximale (environ 2 500 tr/min) pendant 5 s.
  3. Incuber les échantillons à 56 ° C pendant la nuit avec un incubateur de l’air.
  4. Incuber les échantillons FFPE et TIC à 90 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 h et 10 min, respectivement. Tournez brièvement en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  5. Ajouter 200 µL de tampon de lyse de l’échantillon avec une pipette de 200 µL et mélanger soigneusement au Vortex à vitesse maximale pendant 5 s.
  6. Ajouter 200 µL d’éthanol (96-100 %) avec une pipette de 200 µL et homogénéiser au Vortex à vitesse maximale pendant 5 s. brièvement tournez en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  7. Transvaser avec soin tout le lysat de la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  8. Placer la colonne dans un tube propre 2 mL collection avec des mains gantées et jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination.
  9. Ajouter 500 µL de tampon de lavage à la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  10. Placer la colonne dans un tube propre 2 mL collection avec des mains gantées et jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination.
  11. Ajouter 500 µL de tampon de lavage à la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  12. Jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination. Placer la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL propre avec des mains gantées et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à 25 ° C, sécher la membrane.
  13. Placer la colonne dans un tube de liaison ADN-doux avec des mains gantées.
    1. Ajouter 40-50 µL de tampon d’élution au centre de la membrane avec une pipette 100 µL.
    2. Incuber à température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
    3. Stocker les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu’au niveau suivant (le protocole peut être suspendu ici).

4. estimation de qualité de l’ADN par PCR Quantitative en temps réel

  1. Préparer le mélange maître dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pipette, comme suit : 10 µL de 2 x PCR en temps réel Master Mix, 1 µL de 20 x RNase P sonde Primer Mix (taille de l’amplicon : 87 bp) et 8 µL d’eau stérile exempte de nucléase.
  2. Préparer le deuxième mélange maître dans un des tubes de microcentrifuge stérile comme suit : 10 µL de 2 x PCR en temps réel Master Mix, 1 µL de 20 x RNase P sonde Primer Mix (taille de l’amplicon : 268 bp) et 8 µL d’eau stérile exempte de nucléase.
  3. Effectuer des dilutions successives de l’ADN génomique de contrôle de l’homme (fourni dans le kit) 4 fois pour une courbe standard de cinq points et déterminer l’absolue de concentrations ADN13.
  4. Ajouter 19 µL des deux mélanges maîtres préparés (préparé à l’étape 4.1 et 4.2) dans un puits distinct d’une optique 96 puits réaction avec une pipette de 20 µL.
  5. Ajouter 1 µL de FFPE ADN ou d’ADN de TIC aux différents puits contenant le mélange réactionnel avec une pipette de 2 µL. Ajouter 1 µL d’eau exempte de nucléase dans un puits distinct contenant le mélange réactionnel pour l’aucun contrôle de modèle.
  6. Tenez le côté non adhésive d’un film adhésif optique et Décollez la sauvegarde depuis le centre du film de protection. Doucement, faites glisser l’applicateur sur le film et le film le joint sur la plaque à 96 puits.
  7. Mélanger délicatement la plaque à 96 puits en utilisant un mélangeur plaque 96 puits pendant 10 s à la température ambiante à 2 000 tr/min. Centrifuger la plaque brièvement à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
  8. Allumez l’appareil de PCR en temps réel et les insérer la plaque à 96 puits. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 95 ° C pendant 20 s, suivie de 45 cycles de 95 ° C pour 1 s et 60 ° C pendant 20 s. utilisation « courbe standard » et « mode rapide ».
  9. Évaluer la fragmentation de l’ADN avec le ratio de l’ADN (quantification relative ; RQ) obtenues pour l’amplicon long (268 bp) à l’amplicon court (87 bp). QR est la valeur moyenne de la valeur moyenne de l’amplicon/le long de l' amplicon court13.

5. préparation de la prochaine génération séquençage bibliothèque

  1. Se préparer à la bibliothèque de séquençage pour le séquençage de génération suivant selon les instructions du fabricant.
  2. Préparer le mélange maître de multiplex PCR dans un tube de microcentrifuge stérile par exemple comme suit : 4 µL de 5 x solution de réaction PCR Multiplex, 4 µL de 5 x piscine apprêt, µL ≤6 TIC ou FFPE ADN (ng 1-100) et ajouter jusqu'à 20 µL d’eau exempte de nucléase.
    1. Ajouter le mélange maître de PCR multiplex à un tube PCR et mélanger doucement en tapant sur le tube.
    2. Tournez brièvement en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  3. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 99 ° C pendant 2 min, suivie de 20 cycles de 99 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 4 min et tenue pas 10 ° C. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
    NOTE : Déterminer le nombre de cycles basés sur le nombre de paires d’amorces.
  4. Ouvrez le couvercle du tube PCR et ajoutez 2 µL de l’enzyme de restriction avec une pipette de 2 µL. Fermer le couvercle du tube PCR et mélanger doucement en tapant sur le tube PCR. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  5. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 50 ° C pendant 10 min, 55 ° C pendant 10 min, 60 ° C pendant 20 min, et tenue pas 10 ° C. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  6. Ajoutez le mélange maître de ligature adaptateur dans le chaque cupule contenant les amplicons PCR digérés avec une pipette comme suit : 4 µL de solution de ligature d’adaptateur, 0,5 µL de codes à barres, 0,5 µL d’adaptateur, 2 µL d’eau exempte de nucléase et 2 µL de DNA ligase. Fermer le couvercle du tube PCR et mélanger doucement en tapotant. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  7. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 22 ° C pendant 30 min, 68 ° C pendant 5 min, 72 ° C pendant 5 min, et tenue pas 10 ° C.
  8. Purifier la bibliothèque de séquençage avec billes magnétiques selon les instructions du fabricant.
  9. Transférer la solution adaptateur-ligaturé bibliothèque dans le tube de liaison faible d’ADN de 1,5 mL. Ajouter 45 µL de billes magnétiques dans le tube de faible liaison ADN pour la purification dest 1. Mélanger doucement en tapant sur le tube et laisser incuber 5 min à température ambiante.
  10. Placer le tube de liaison ADN-basse dans un support magnétique, puis incuber pendant 2 min à température ambiante jusqu'à ce que la solution est claire. Soigneusement, éliminer le surnageant avec une pipette de 200 µL sans déranger les billes magnétiques.
  11. Ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % fraîchement préparée avec une pipette de 200 µL, puis déplacez le tube à côté de l’aimant pour laver les perles. Soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger les billes magnétiques.
  12. Répétez l’étape 5.11 pour un second lavage.
  13. Tournez brièvement en bas du tube avec mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique et jeter avec précaution les gouttelettes de l’éthanol avec une pipette de 10 µL.
  14. Ajouter 50 µL de basse TE dans le tube de faible liaison d’ADN contenant le culot de billes magnétiques pour disperser les perles. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
  15. Placer le tube de faible liaison ADN dans une grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 2 min, jusqu'à ce que la solution est claire.
  16. Transférer les 50 µL de liquide surnageant dans le nouveau tube de faible liaison ADN et ajouter 75 µL de billes magnétiques avec une pipette 100 µL de purification 2nd . Mélanger doucement en tapant sur le tube et laisser incuber 5 min à température ambiante.
  17. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique, puis incuber pendant 2 min à température ambiante jusqu'à ce que la solution est claire. Soigneusement, éliminer le surnageant avec une pipette de 200 µL sans déranger les billes magnétiques.
  18. Ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % fraîchement préparée avec une pipette de 200 µL, puis déplacez le tube à côté de l’aimant pour laver les perles. Soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger les billes magnétiques.
  19. Répétez l’étape 5.18 pour un second lavage.
  20. Tourner brièvement dans le tube avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique et jeter avec précaution les gouttelettes de l’éthanol avec une pipette de 10 µL.
  21. Ajouter 50 µL de faible TE dans le tube de faible liaison d’ADN contenant le culot de billes magnétiques pour disperser les perles. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
  22. Placer le tube de faible liaison ADN dans une grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 2 min, jusqu'à ce que la solution est claire.
  23. Transférer les 45 µL du liquide surnageant contenant la bibliothèque purifiée dans le nouveau tube de faible liaison ADN avec une pipette 100 µL.

6. quantifier la Concentration de bibliothèque par PCR Quantitative en temps réel

  1. Déterminer la concentration de chaque bibliothèque selon les instructions d'13 du fabricant.
    1. Préparer une solution de dilution 20 fois comme suit : mélangez 2 µL de bibliothèque purifiée et 38 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de liaison faible d’ADN avec une pipette 2 µL et 100 µL.
    2. Conserver les bibliothèques non dilués à-20 ° C jusqu'à l’étape 7.3.
  2. Préparer une solution de 200-fold dilution comme suit : mélanger 5 µL de la bibliothèque de purifié diluée 20 fois (préparée à l’étape 6.1) et 45 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de faible liaison ADN.
  3. Préparer une solution de 2,000-fold dilution comme suit : mélanger 5 µL de la 200-fold bibliothèque de purifié diluée (préparée à l’étape 6.2) et 45 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de faible liaison ADN.
  4. Préparer le mélange de réaction de maître comme suit : mélangez 10 µL de 2 x solution de mélange principal et 1 µL de 20 x solution Test amorce-sonde en tubes de microcentrifuge stérile avec une pipette, puis mélanger en tapant sur le tube. Ajouter 11 µL du mélange maître réaction dans les puits d’une réaction de 96 puits optique.
  5. Ajouter 9 µL de la 2,000-fold bibliothèque diluée, 9 µL de chaque contrôle standard ou 9 µL d’eau exempte de nucléase dans chaque puits avec une pipette de 10 µL.
  6. Tenez le côté non adhésif du film adhésif optique et Décollez la sauvegarde depuis le centre du film de protection.
    1. Doucement, faites glisser l’applicateur sur le film et le film le joint sur la plaque à 96 puits.
    2. Mélanger délicatement la plaque à 96 puits en utilisant un mélangeur plaque 96 puits pendant 10 s à température ambiante.
    3. Centrifuger la plaque brièvement à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
  7. Allumez l’appareil de PCR en temps réel et les insérer la plaque à 96 puits. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 20 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pour 1 s et 60 ° C pendant 20 s. utilisation « courbe standard » et « mode rapide ».
  8. Calculer la concentration de bibliothèque non dilué en multipliant la concentration déterminée avec le qPCR de 2 000.

7. la prochaine génération séquençage

  1. Planifier la condition d’exécution et définissez le paramètre d’exécution au sein du logiciel.
    1. Cliquez sur [ongletPlan] et [modèle], puis sélectionnez la méthode d’exécution appropriée.
    2. Sélectionnez l’application et le type de technique et cliquez sur [suivant].
    3. Sélectionnez l’instrument, kit de préparation d’échantillon (facultatif), type de bibliothèque de kit, kit de modèle, kit de séquençage, mode étalonnage de base, type de puce, jeu de séquence (facultatif) et code à barres de contrôles et cliquez sur [suivant].
    4. Sélectionnez plugins et cliquez sur [suivant].
    5. Sélectionnez le projet et cliquez sur [suivant].
    6. Choisissez référence par défaut et les fichiers du lit de la région ciblée.
    7. L’exemple de nom de type, sélectionnez le code à barres et cliquez sur [exécuter pour le Plan].
  2. Effectuer la préparation du modèle et la puce de chargement dans un instrument automatisé selon les instructions du fabricant. Dégelez la cartouche de réactif à température ambiante pendant 45 min avant utilisation.
  3. Diluer la bibliothèque non diluée avec de l’eau exempte de nucléase selon la concentration de bibliothèque calculée à l’étape 6,8 et faire 20 bibliothèques de pM.
    1. Préparer une bibliothèque mis en commun pour le séquençage et le magasin sur la glace.
    2. Ajouter 25 µL de la bibliothèque mis en commun avec une pipette µL 100 vers le bas du tube échantillon. Utilisez la bibliothèque regroupée sous 48 h.
  4. Mettez sous tension et ouvrez le couvercle de l’instrument automatisé.
    1. Placer la puce de séquençage, adaptateur puce, enrichissement cartouche, cartouche de pointe, plaque PCR, joint d’huisserie PCR, tube de récupération, cartouche de solution et cartouche de réactif à la position appropriée de l’instrument automatisé.
    2. Appuyer sur [la mise en place Run] et [étape] sur l’écran.
    3. Fermer le couvercle et appuyer sur [Start check] sur l’écran.
    4. Après le pont les processus de numérisation, appuyer sur [suivant] sur l’écran.
    5. Vérifiez le contenu de l’affichage (type de kit, type de puce, puce plans d’ID, ID d’échantillon,), régler l’heure et appuyer sur [OK] sur l’écran.
  5. Après avoir terminé le chargement de la puce :
    1. Appuyer sur [suivant] sur l’écran et ouvrir le couvercle.
    2. Déchargé de la puce de séquençage de l’adaptateur de puce avec des mains gantées.
    3. Placer la puce dans le récupérateur, rap avec parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que la réaction de séquençage.
    4. Retiré la cartouche de l’enrichissement, plaque PCR, joint d’huisserie PCR, tube de récupération, cartouche de solution et cartouche de réactif de la position appropriée de l’instrument automatisé avec des mains gantées.
    5. Transférer une cartouche vide-pointe à la position de pointe des déchets de l’instrument automatisé avec des mains gantées.
    6. Appuyer sur [suivant] et fermer le couvercle.
    7. Appuyer sur [Start] et nettoyer l’instrument automatisé par rayons ultraviolets pendant 4 min.
  6. Dissoudre un comprimé de chlorite de sodium dans 1 000 mL d’eau ultrapure et solution de filtration avec une unité de filtrage de flux filtre 0,22 µm.
    1. Allumez l’appareil de séquençage.
    2. Toucher [Clean] et [suivant] sur l’écran de l’instrument de séquençage.
    3. Nettoyer l’appareil de séquençage avec 250 mL de solution de chlorite de sodium stérilisée par filtration et par la suite 250 mL d’eau ultrapure.
  7. Appuyer sur [Initialize] et sélectionnez le kit de séquençage approprié sur l’écran.
    1. Installer un expéditeur gris à l’endroit voulu avec des mains gantées.
    2. Initialiser l’instrument de séquençage avec la solution de lavage (fourni dans le kit), la solution de réglage du pH (contenant 350 µL d’hydroxyde de sodium de 100 mM) et la solution étalon de pH (fourni dans le kit).
  8. Ajouter 20 µL de dATP, la dCTP, dGTP et dTTP nucléotides (fourni dans le kit) en tubes de 50 mL (fournis dans le kit) avec une pipette 100 µL.
    1. Installer un expéditeur gris à l’endroit voulu avec des mains gantées.
    2. Charger le tube de 50 mL et visser sur l’appareil de séquençage.
    3. Appuyer sur le [suivant] sur l’écran pour commencer à l’étape d’initialisation, qui prend environ 25 min.
  9. Après avoir terminé l’étape d’initialisation :
    1. Appuyer sur [Run] sur l’écran et sélectionner l’instrument de préparation bibliothèque appropriée.
    2. Scanner le code-barres bidimensionnel de la puce.
    3. Insérez la puce de séquençage sur la position appropriée.
    4. Fermer la porte de pince et instrument de puce.
    5. Toucher [cocher puce], [page suivante] et [OK] sur l’écran pour lancer l’exécution de séquençage.
  10. Après la réaction de séquençage, transférer les données et exécuter le pipeline analyser les données sur le serveur de séquençage13,17.

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Representative Results

La figure 1 montre l’ensemble du processus de préparation d’éprouvettes TIC à l’extraction de l’ADN. Notamment, la procédure prend deux jours seulement pour obtenir de l’ADN génomique provenant d’échantillons TIC. Nous avons évalué les effets de stockage de la tumeur avant le traitement de la diapositive. Nous avons constaté que les cellules tumorales étaient fixés sur la lame de verre lorsque des échantillons de tissus ont été immédiatement touchés sur le toboggan, et lorsque les tissus étaient conservés dans la saline humide-gaze stérile pendant 1 h (Figure 2). Toutefois, lorsque les tissus ont été maintenus à température ambiante, les cellules tumorales ne étaient pas bien fixés sur la diapositive. Lames préparées pourraient être conservés à 4 ° C pendant trois mois. Par conséquent, il est important de ne pas laisser les échantillons sécher.

Nous avons examiné l’utilité de notre méthode et comparez-le avec les spécimens acquis à l’aide de FFIP. TIC et FFIP échantillons ont été préparés de 14 échantillons de tumeur, et nous a confirmé que la pureté et le contenu de la tumeur pouvaient être évaluées depuis les spécimens TIC. Après que nous avons effectué la coloration au Giemsa, a pu évaluer le nombre de cellules tumorales et la morphologie de la tumeur par microscopie. Nous avons ainsi pu évaluer systématiquement les cellules tumorales et par la suite effectuer un contrôle de qualité de l’ADN.

Qualité et la quantité d’ADN ont été estimés en temps réel quantitative PCR13,14,15. Nous avons déterminé les quantités d’ADN absolues et la valeur RQ, qui est un indicateur de niveau de dégradation de l’ADN génomique. Les résultats ont montré qu’un rendement plus élevé de l’ADN a été réalisé en utilisant les spécimens TIC par rapport avec les échantillons FFPE (tableau 1). En outre, les valeurs RQ de l’ADN de TIC ont été significativement plus élevée comparées à celle de la FFPE ADN (Figure 3, p = 2,3 x 10-8, test t de Student bilatéral). Nous avons aussi évalué les valeurs RQ de la TIC et de la FFPE ADN extraite de types de tumeurs différentes et constaté que l’ADN de TIC était plus élevé en qualité par rapport à l’ADN FFIP (Figure 3). Ces résultats indiquent que l’ADN de TIC est plus cohérente que l’ADN FFIP.

Ensuite, nous avons évalué si l’ADN de TIC pourraient être utilisé pour l’analyse de séquençage de génération suivante. FFIP et TIC ADN ont été préparés de cancer colorectal primitif et un cancer métastatique du foie provenant d’un patient (Figure 4 a). L’amplification par PCR et préparation de la bibliothèque ont été réalisées en utilisant le panneau de Hotspot Cancer et séquençage ciblé par la suite a été réalisé. En conséquence, APC Q1367 * a été identifié en FFIP et TIC ADN extrait du Site 1 (tableau 2). En outre, APC S1356 *, G12D KRAS et TP53 M237I ont été détectés dans les deux FFIP et TIC ADN extrait du Site, 2, 3 et 4 (tableau 2). Ces résultats suggèrent que les mutations somatiques identiques ont été identifiées dans des paires d’échantillons FFPE et TIC ADN préparés à partir du même site de la tumeur (Figure 4 b et tableau 2). Notamment, les mêmes mutations somatiques ont été détectées entre cancer colorectal primitif (Site 2, pas de Site 1) et deux échantillons d’un cancer métastatique du foie, ce qui suggère que les clones de tumeur du Site 2 métastases au foie (Figure 4 b et tableau 2). Ensemble, ces résultats suggèrent que l’ADN de TIC est de haute qualité et est conçu pour un large éventail de tests génétiques, y compris de séquençage de la génération suivant.

Figure 1
Figure 1 schéma d’obtention d’ADN d’une préparation d’échantillon TIC. Le tissu tumoral est touché sur la vitre de la diapositive pour préparer l’échantillon TIC. Après évaluation de la morphologie de la tumeur et le contenu sous un microscope, l’ADN de la tumeur peut être extrait et utilisé pour des tests génétiques. En utilisant les TIC, la tumeur ADN peut provenir d’un échantillon clinique pathologique dans les deux jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Préparation des échantillons TIC. Resected les échantillons de tumeur ont été immédiatement touchés sur une lame de verre normal (panneau de gauche), conservée dans la saline humide-gaze stérile pendant 1 h (au milieu) et conservés à température ambiante pendant 1 h (à droite). Exemple #1 était un carcinome hépatocellulaire et échantillon #2 était le cancer du sein. Photos microscopiques ont été capturées à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope. Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Contrôle de qualité d’ADN estimée par analyse PCR quantitative en temps réel. TIC et FFPE ADN ont été extraites de 14 tissus tumoraux du cancer colorectal (n = 8), estomac (n = 4) et un cancer métastatique du foie (n = 2). Comparaison des scores quantification relative entre les échantillons TIC-Giemsa et FFIP-HE. Valeurs RQ d’ADN TIC étaient significativement supérieurs à celui de la FFPE ADN. Analyse statistique entre les deux groupes a été réalisée et les p-valeurs ont été calculées par test de t non apparié à deux points de l’étudiant à l’aide d’Excel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Prochaine génération séquençage analyse données à l’aide des TIC et la FFPE ADN. (A) Macroscopic et images microscopiques. Images représentant des TIC-Giemsa et FFIP-HE coloration du cancer colorectal (site 1 et 2) et du foie métastatique prélèvements (site 3 et 4). Barre d’échelle dans les images macroscopiques : 1 cm, échelle en images microscopiques : 100 µm. (B) chaleur carte montrant la répartition des mutations somatiques pour chaque site de la tumeur (n = 8). Des mutations identiques ont été détectées parmi des échantillons appariés de TIC et de la FFPE ADN. Les valeurs de fractions alléliques sont indiqués dans l’échelle de couleurs de graduation de 1 % (rose clair) à 100 % (rose). Colonnes grises ont montré aucune mutation identifiée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-HE (n = 14)
ADN total (ng) ADN total (ng)
Échantillon Site de la tumeur Court Long RQ Court Long RQ
Site1 Colon 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Site2 Colon 991 1057 1.07 556 204 0,37
Site3 Foie 467 511 1.09 130 39 0,3
Site de Microsoft4 Foie 2172 2115 0,97 488 127 0,26
Site5 Colon 749 598 0,8 529 205 0,39
Lieu6 Estomac 330 286 0,86 211 98 0,46
Site Windows7 Estomac 636 499 0,78 154 84 0.55
Microsoft8 Estomac 27 27 1.01 135 81 0,6
Site9 Colon 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 Colon 280 218 0,78 209 83 0,39
Site11 Colon 1546 575 0,37 366 159 0,43
12 Estomac 1501 1200 0,8 274 132 0,48
Internet13 Colon 1556 1404 0,9 326 179 0.55
Site14 Colon 1565 1210 0,77 680 295 0,43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tableau 1. Données de qualité de l’ADN. TIC jumelé (n = 14) et d’échantillons FFPE (n = 14) ont été préparés à partir du côlon, du foie et cancer de l’estomac. Échantillons TIC ont été colorés au Giemsa et échantillons FFPE ont été colorées à l’hématoxyline et éosine (HE). Des échantillons d’ADN ont été extraites et quantifiés par quantitative PCR en temps réel avec deux paires d’amorces amplifiant locus RNaseP (long amplicon (268 bp) et court amplicon (87 bp)). RQ valeurs ont été calculées comme suit : la valeur moyenne de l’amplicon long divisé bythe valeur moyenne de l’amplicon court. SD, écart-type ; RQ, quantification relative

Exemple de nom Emplacement Préparation Symbole de gène Mutation Position Référence Variante Codage Couverture Fraction allélique
Cancer colorectal primitif Site 1 FFIP APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45 %
Cancer colorectal primitif Site 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72 %
Cancer colorectal primitif Site 2 FFIP APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77 %
Cancer colorectal primitif Site 2 FFIP KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52 %
Cancer colorectal primitif Site 2 FFIP TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73 %
Cancer colorectal primitif Site 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89 %
Cancer colorectal primitif Site 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56 %
Cancer colorectal primitif Site 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86 %
Cancer métastatique du foie Site 3 FFIP APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92 %
Cancer métastatique du foie Site 3 FFIP KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62 %
Cancer métastatique du foie Site 3 FFIP TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91 %
Cancer métastatique du foie Site 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97 %
Cancer métastatique du foie Site 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64 %
Cancer métastatique du foie Site 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95 %
Cancer métastatique du foie Site 4 FFIP APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93 %
Cancer métastatique du foie Site 4 FFIP KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60 %
Cancer métastatique du foie Site 4 FFIP TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92 %
Cancer métastatique du foie Site 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94 %
Cancer métastatique du foie Site 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62 %
Cancer métastatique du foie Site 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95 %

Le tableau 2. Comparaison des mutations appariés FFIP et TIC ADN détectées par l’analyse de séquençage ciblé. Échantillons appariés TIC et FFIP sont préparés à partir de 2 cancers côlorectaux primaires (Site 1 et 2) et 2 cancers du foie métastatiques (Site 3 et 4). Séquençage ciblé a été effectué avec ces échantillons d’ADN et des mutations somatiques ont été identifiées. Profils de mutation sont identiques entre les paires d’échantillons FFPE ADN et de TIC.

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Discussion

Dans cette étude, nous avons présenté une méthode alternative pour l’obtention de tumeur ADN des échantillons pathologiques cliniques utilisant les TIC. Préparation des TIC est très simple et nécessite moins de temps par rapport aux méthodes FFIP, sans la nécessité d’instruments spéciaux10. Toutes les procédures de la préparation de TIC à l’extraction de l’ADN peuvent être complétées dans les deux jours (Figure 1). Cette méthode raccourcit ainsi le délai d’exécution pour effectuer des tests génétiques. Notamment, cela apporte des avantages importants en réduisant le nombre de jours requis pour l’analyse moléculaire. Ce délai court nous permet d’offrir immédiatement un traitement approprié pour cancéreux progressistes qui ont besoin de médicaments ciblés moléculairement. Cette méthode fournit ainsi des avantages pour analyses des altérations génétiques dans les tumeurs et l’administration de médicaments moléculairement ciblés pour le traitement du cancer.

Il y a quelques points clés pour la réussite de l’utilisation des TIC ADN pour l’analyse génétique. Tissus de la tumeur peuvent être nécrotiques en raison des traitements comme la chimiothérapie ou d’autres traitements. Donc, prudence est nécessaire dans la préparation de spécimens TIC afin d’éviter le prélèvement d’échantillons dans les sections nécrotiques dans la tumeur autant que possible. En outre, l’évaluation initiale microscopique est très importante pour les procédures suivantes. En outre, empêchant le séchage des tissus tumoraux est nécessaire pour la préparation des échantillons TIC réussie. Si les tissus tumoraux sont séchées, cela se traduit par moins de cellules attachées sur la lame de verre. Il sera également difficile à observer la cellularité de la tumeur et la morphologie séchage entraîne une dégénérescence des tissus tumoraux.

Il y a certains avantages potentiels à l’ADN de TIC. Tout d’abord, nous pouvons vérifier la cellularité de la tumeur au cours de la première évaluation au microscope. Si les cellules normales, telles que les lymphocytes et les cellules stromales, abondaient dans les échantillons de tissus, la contamination de ces cellules normales empêcherait la capacité de détecter des mutations somatiques dans les cellules tumorales. Rapide évaluation microscopique des échantillons peut aider à l’évaluation de la cellularité de la tumeur et l’estimation de savoir si les échantillons d’ADN de tumeur adéquates ont été obtenues des échantillons de TIC avant l’extraction de l’ADN. Deuxièmement, nos résultats ont montré que l’ADN de TIC est à la fois riches en qualité et en quantité. FFPE ADN a été utilisé pour la prochaine analyse de séquençage de génération y compris le séquençage ciblé, séquençage de l’exome et génome séquençage16,17,18,19,20. D’archivage FFPE ADN est aussi couramment utilisé pour analyse génétique21,22, mais FFPE ADN peut être fragmenté durant la fixation au formol. Cela peut entraîner des problèmes dans l’amplification par PCR ou extraction de l’ADN, provoquant un manque de couverture de la séquence, uniformité au régions cibles et augmenter le risque d’erreur de séquence23,24. En revanche, la TIC ADN n'est pas fragmenté, qui peut être due à la fixation de l’alcool qui a moins d’influence sur l’acide nucléique. Comme les TIC ADN n’est pas fragmenté comme l’ADN FFIP, ces échantillons sera plus appropriés pour l’analyse de la génération prochaine séquence, PCR en temps réel et PCR numérique. En effet, nous avons montré précédemment que TIC l’ADN d’un échantillon de la tumeur peut être utilisé dans l’analyse de la séquence de nouvelle génération, une méthode appelée « TIC-seq », et les résultats pourraient capturer précisément la tumeur mutations somatiques13. En troisième lieu, cette technique est applicable pour une large gamme de matériaux. Dans le présent rapport, nous avons utilisé des spécimens chirurgicales. En plus de tissus chirurgicaux, les ganglions lymphatiques métastatiques, biopsie bronchique ou endoscopique peut être utilisé pour préparer l’ADN de TIC.

En conclusion, nous présentons une méthode simple et rapide pour préparer l’ADN de tumeur de haute qualité en utilisant des échantillons TIC. Cette méthode va développer de nouvelles possibilités dans le domaine de l’analyse génétique et aider à promouvoir la médecine de précision en milieu clinique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Nous remercions tout le personnel médical et auxiliaire de l’hôpital et les patients pour consentir à participer. Nous remercions Gabrielle White Wolf, Ph.d., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour éditer une ébauche du présent rapport. Cette étude a été financée par une subvention de Genome Research Project de la préfecture de Yamanashi (Y.H. et M.O.) et une subvention de la YASUDA Medical Foundation (Y.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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References

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