Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

Cancer Research

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Summary

Obtención de ADN genómico de la alta calidad de los tejidos del tumor es un primer paso esencial para el análisis de alteraciones genéticas mediante la siguiente secuencia de generación. En este artículo presentamos un método simple y rápido para enriquecer las células tumorales y obtener ADN intacto del toque de muestras de citología de impresión.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

Es fundamental para determinar el estado mutacional en cáncer antes de la administración y tratamiento de drogas específicas moleculares específicas para pacientes con cáncer. En el ajuste clínico, tejidos de (FFPE) parafina-encajado formalina-fijos son ampliamente utilizados para las pruebas genéticas. Sin embargo, FFPE ADN generalmente dañado y fragmentado durante el proceso de fijación con formalina. Por lo tanto, FFPE ADN a veces no es adecuado para las pruebas genéticas debido a baja calidad y cantidad de ADN. Aquí presentamos un método de la citología de impresión táctil (TIC) para obtener ADN genómico de las células cancerosas, que puede ser observado bajo el microscopio. Número de células de cáncer y morfología celular puede ser evaluado utilizando a muestras TIC. Además, la extracción de DNA genómico de muestras TIC se puede terminar dentro de dos días. La cantidad total y calidad de ADN TIC obtenidos mediante este método fue mayor que el de ADN FFPE. Este método rápido y simple permite a los investigadores para obtener ADN de calidad para pruebas genéticas (p. ej., análisis de secuenciación de próxima generación, digital PCR y PCR cuantitativo en tiempo real) y para acortar el tiempo de respuesta para informar los resultados.

Introduction

Última generación tecnología de secuenciación ha proporcionado los investigadores avances significativos en el análisis de información del genoma en las variaciones genéticas, enfermedad mendeliana, predisposición hereditaria y cáncer 1,2,3 . El Atlas de genoma del cáncer (TCGA) y el Consorcio Internacional del genoma del cáncer (ICGC) han seguido la identificación de alteraciones genéticas en algunos tipos de cánceres comunes4. Cientos de genes de la conductor de cáncer esenciales han sido correctamente identificados y algunas de estas moléculas se apunta para drogas desarrollo1,5,6.

En el ajuste clínico, muestras FFPE comúnmente se utilizan para diagnosis patológica y moleculares para varias enfermedades, incluyendo cáncer. Sin embargo, durante el proceso de fijación con formalina, ADN-proteína o DNA-DNA Cross-linking ocurre y se induce la fragmentación del ADN. Así, muestras de ADN de FFPE no son siempre adecuadas para análisis genético debido a baja calidad y cantidad de ADN7,8,9. Además, tarda varios días para preparar a las muestras FFPE y habilidad técnica es necesario preparar correctamente las secciones. Por lo tanto, es conveniente desarrollar un método simple y rápido para obtener ADN intacto de alta calidad.

La citología es un método alternativo para el diagnóstico patológico. Preparación de la muestra citológica es un más simple, menos costoso y más rápido acercamiento comparado con FFPE preparación10. La técnica TIC se ha realizado sobre los nodos de linfa del centinela y los tejidos marginales de pacientes de cáncer de mama para el diagnóstico rápido intraoperatorio para algunos años11,12. Sin embargo, hay algunos informes que han examinado si el ADN genómico de alta calidad puede extraerse muestras TIC y utilizado para el posterior análisis genético. Las muestras citológicas son comúnmente teñidas con Papanicolaou (Pap) o tinción de Giemsa, y divulgado previamente que la cantidad y calidad del ADN extraído de muestras TIC (especialmente Giemsa-manchada las muestras) son superiores a las muestras obtenidas de FFPE los tejidos13. En comparación con la tinción de Papanicolau, tinción de Giemsa tiene una ventaja que requieren menos procedimientos de tinción. En la tinción de Pap, después las muestras se han fijado y teñido, debe ser montados con montaje medio (e.g., Malinol) para distinguir el contenido de la muestra, tales como las células tumorales, las células normales y células inflamatorias bajo un microscopio. Si la muestra de Pap está preparada sin el paso de montaje, es casi imposible observar las células bajo un microscopio porque la muestra se seca. En comparación, la coloración de Giemsa se observan en el estado seco, por lo tanto, el paso de montaje no es necesario para la rápida evaluación celular. Para microdisección, tinción de Giemsa es más conveniente porque requiere a especímenes secos.

En este informe, introducir un método simple y rápido para la preparación de especímenes TIC con la tinción de Giemsa y demuestran que el TIC es una mejor fuente de ADN en comparación con especímenes FFPE.

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Protocol

1. TIC preparación para evaluación microscópica rápida utilizando vidrio Normal se desliza

  1. Realizar la preparación de TIC tan pronto como sea posible después de tejido patológico clínico materiales están disponibles. Si muestras TIC no pueden estar preparadas inmediatamente, conserve los materiales de tejido cubiertos con solución salina humedecida gasa estéril y guarde en el refrigerador para prevenir la resequedad de los tejidos.
  2. Preparar 5 mm3 tejido material como tumores sólidos (p. ej., hígado, pulmón y los tejidos de la mama) clínico obtenido por cirugía o endoscopia.
    1. Suavemente Limpie el tejido con gasa estéril con suero fisiológico y retirar la sangre, si la superficie del tejido tiene mucha sangre.
    2. Para muestras microscópicas tales como material de la biopsia, mantenga la muestra humedecida con gasa estéril empapada en suero fisiológico.
  3. Corte y recorte el tejido normal con un cuchillo de cortar y exponer la superficie de la lesión tumoral, si las masas de tumor no están visibles totalmente.
  4. Toque la superficie del tumor de los especímenes resecados en un portaobjetos de vidrio normal varias veces con las manos enguantadas. Confirmar visualmente que el área tocado está sobre el 80% de lo portaobjetos de vidrio normal.
  5. Suavemente presione el portaobjetos de cristal normal contra una lámina de membrana de polietileno Polinaftalato de etileno (PEN) y frote suavemente 2 - 3 veces con las manos enguantadas. Confirmar visualmente que las células se transfieren desde el portaobjetos de cristal normal a la diapositiva de la membrana de la pluma.
  6. Seque el cristal y pluma membrana portaobjetos durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  7. Mancha de la corredera de vidrio normal para examen citológico directo. Sumergir el portaobjetos con la solución fijadora para 5 s y luego tinción con Giemsa, coloración de la solución por 15 s.
  8. Evaluar y la pantalla el contenido del tumor y celularidad en el portaobjetos de vidrio normal con un microscopio para la evaluación rápida. Evaluar las células del tumor basadas en varios criterios; agrandamiento nuclear, cariotipo anormal, abundante cromatina, distribución desigual de las células, ratio de componente nuclear citoplasmática componentes, tamaño y polaridad celular.

2. preparación de la película de diapositiva la membrana pluma para pruebas genéticas

  1. Si la celularidad tumoral se muestra más del 60% por la evaluación microscópica rápida (paso 1.8), cortar la película tumor-tocado de pluma membrana diapositivas de extracción de ADN con un cuchillo y con guantes las manos. Transferencia de la película cortada a un tubo de microcentrífuga estéril con un pincette y manos enguantadas.
  2. Si la celularidad del tumor se determinó como baja (menos del 60% de los contenidos de tumor) por evaluación microscópica rápida (paso 1.8), laser del uso del microdissection de la captura y obtención de muestras de tumor.
    1. Llevar a cabo para evaluar las células del tumor mediante protocolos de tinción de Giemsa.
    2. Corte la película de la diapositiva de membrana PEM por microdisección de captura láser apropiado.
    3. Transferencia de la película cortada a un tubo de microcentrífuga estéril con un pincette y manos enguantadas.
    4. Guarde el tubo de microcentrífuga de película que contiene a 4 ° C hasta la extracción de ADN (Protocolo puede hacer una pausa aquí).

3. extracción de ADN

  1. Realizar la extracción de ADN de las muestras de tejido TIC o FFPE usando un kit de extracción de ADN de FFPE según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Un kit equivalente está disponible para el paso de extracción de ADN de FFPE.
  2. Añadir 180 μl de tampón de lisis del tejido (pH = 8,3) en el tubo de microcentrífuga que contiene la película con una pipeta de 200 μL manual. Añadir 20 μl de proteinasa K con una pipeta de 20 μl manual y mezclar con un vórtex con un mezclador de tipo vórtex a máxima velocidad (aproximadamente 2.500 rpm) durante 5 s.
  3. Incubar las muestras a 56 ° C durante la noche con una incubadora de aire.
  4. Incubar las muestras FFPE y TIC a 90 ° C en un bloque de calor para 1 h y 10 min, respectivamente. Girar brevemente por el tubo de microcentrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente con una mini centrífuga.
  5. Añadir 200 μL de tampón de lisis a la muestra con una pipeta de 200 μl y mezclar completamente por Vortex a máxima velocidad durante 5 s.
  6. Añada 200 μL de etanol (96-100%) con una pipeta de 200 μl y mezcle bien por Vortex a máxima velocidad durante 5 s. brevemente girar hacia abajo el tubo de microcentrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente con una mini centrífuga.
  7. Cuidadosamente transfiera todo el lisado a la columna de vuelta con una pipeta de 1.000 μl y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min a 25 ° C.
  8. Colocar la columna de spin en un tubo de recogida limpio de 2 mL con las manos enguantadas y deseche el tubo de la colección que contiene el flujo a través en una caja de plástico de desecho.
  9. Añadir 500 μl de tampón de lavado a la columna de vuelta con una pipeta de 1.000 μl y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min a 25 ° C.
  10. Colocar la columna de spin en un tubo de recogida limpio de 2 mL con las manos enguantadas y deseche el tubo de la colección que contiene el flujo a través en una caja de plástico de desecho.
  11. Añadir 500 μl de tampón de lavado a la columna de vuelta con una pipeta de 1.000 μl y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min a 25 ° C.
  12. Deseche el tubo de la colección que contiene el flujo a través en una caja de plástico de desecho. Colocar la columna de spin en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL con las manos enguantadas y centrifugar a 20.000 x g durante 3 min a 25 ° C para secar la membrana.
  13. Colocar la columna de spin en un tubo de unión de ADN bajo con las manos enguantadas.
    1. Añadir 40-50 μl de tampón de elución al centro de la membrana con una pipeta 100 μl.
    2. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifugar a 20.000 x g durante 1 min a 25 ° C.
    3. Almacenar las muestras de ADN a-20 ° C hasta el siguiente paso (el protocolo puede ser una pausa aquí).

4. estimación de la calidad del ADN por PCR cuantitativa en tiempo Real

  1. Preparar la mezcla principal en un tubo de microcentrífuga estéril con una pipeta, como sigue: 10 μl de 2 x en tiempo real PCR Master Mix, 1 μl de 20 x Rnasa P Primer sonda Mix (tamaño de amplicón: 87 bp) y 8 μl de agua estéril libre de nucleasas.
  2. Preparar la mezcla principal segundo en un tubo de microcentrífuga estéril como sigue: 10 μl de 2 x en tiempo real PCR Master Mix, 1 μl de 20 x Rnasa P Primer sonda Mix (tamaño de amplicón: 268 bp) y 8 μl de agua estéril libre de nucleasas.
  3. Realizar diluciones seriadas de ADN genómico humano control (suministrado en el kit) 4 veces para una curva estándar de cinco puntos y determinar la absoluta de concentraciones de ADN13.
  4. Añadir 19 μl de la mezcla principal preparada dos (preparado en el paso 4.1 y 4.2) en pocillos distintos de una placa de reacción de 96 pocillos óptico con una pipeta de 20 μl.
  5. Añadir 1 μl de ADN FFPE o TIC DNA para separar pozos que contiene la mezcla de reacción con una pipeta de 2 μl. Añadir 1 μl de agua libre de nucleasas en un pozo independiente que contiene la mezcla de reacción para el no control de la plantilla.
  6. Mantenga el lado no adhesivo de una película óptica y retire la protección de copia de seguridad del centro de la película. Suavemente arrastra el aplicador sobre la película y la película del sello sobre la placa de 96 pocillos.
  7. Mezcle suavemente la placa de 96 pozos utilizando un mezclador de placa de 96 pocillos para 10 s a temperatura ambiente a 2.000 rpm. Centrifugar la placa brevemente a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
  8. Energía en el instrumento PCR en tiempo real e Inserte la placa de 96 pocillos. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando el siguiente protocolo: 95 ° C por 20 s, seguido por 45 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C durante 20 s. curva de uso"estándar" y "modo rápido".
  9. Evaluar la fragmentación del ADN con la proporción de ADN (cuantificación relativa; RQ) obtenidos para el amplicon largo (268 bp) para el amplicon corta (87 bp). RQ es el valor medio del valor medio largo el amplicón del amplicón corta13.

5. preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación

  1. Preparar la biblioteca de la secuencia para la siguiente secuencia de generación según las instrucciones del fabricante.
  2. Preparar la mezcla principal de multiplex PCR en un tubo de microcentrífuga estéril por cada muestra como sigue: 4 μL de 5 x solución de reacción de Multiplex PCR, 4 μL de 5 x piscina primer ≤6 μl TIC o FFPE DNA (1-100 ng) y añadir agua libre de nucleasas hasta 20 μl.
    1. Agregar la mezcla principal de PCR multiplex a un tubo de PCR y mezcla suavemente golpeando ligeramente el tubo.
    2. Girar brevemente por el tubo de microcentrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente con una mini centrífuga.
  3. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando el siguiente protocolo: 99 ° C por 2 min, seguido de 20 ciclos de 99 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min y celebración paso 10 ° C. Girar brevemente por el tubo PCR con una mini centrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente.
    Nota: Determinar el número de ciclos basados en el número de pares de cartilla.
  4. Abra la tapa del tubo PCR y añadir 2 μl de la enzima de restricción con una pipeta de 2 μl. Cierre la tapa del tubo de PCR y mezcla suavemente golpeando ligeramente el tubo PCR. Girar brevemente por el tubo PCR con una mini centrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente.
  5. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando el siguiente protocolo: 50 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 10 min, 60 ° C por 20 min, y celebración paso 10 ° C. Girar brevemente por el tubo PCR con una mini centrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente.
  6. Añadir a la mezcla principal de ligadura del adaptador en el cada uno bien con los amplicones PCR digerido con una pipeta como sigue: 4 μL de solución de ligadura adaptador, 0.5 μl de código de barras, 0.5 μl de adaptador, 2 μl de agua libre de nucleasas y 2 μl de ADN ligasa. Cierre la tapa del tubo de PCR y mezcla suavemente golpeando. Girar brevemente por el tubo PCR con una mini centrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente.
  7. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando el siguiente protocolo: 22 ° C por 30 min, 68 ° C por 5 min, 72 ° C por 5 min, y celebración paso 10 ° C.
  8. Purificar la biblioteca de secuencia con granos magnéticos según las instrucciones del fabricante.
  9. Transferir la solución de biblioteca de ligarse por el adaptador en el tubo de 1,5 mL ADN vinculante bajo. Añadir 45 μl de bolas magnéticas en el tubo de baja obligatoria de ADN para la purificación delst 1. Mezcle suavemente golpeando ligeramente el tubo e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  10. Coloque el tubo de enlace ADN-low en un magnético para luego incubar durante 2 min a temperatura ambiente hasta que la solución es clara. Descartar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 200 μL sin perturbar las bolas magnéticas.
  11. Añadir 150 μL de etanol al 70% recién preparada con una pipeta de 200 μl y mover el tubo de lado a lado del imán para lavar los granos. Descartar cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las bolas magnéticas.
  12. Repita el paso 5.11 para un segundo lavado.
  13. Girar brevemente por el tubo con mini centrifugar a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente. Coloque el tubo de baja unión DNA en un soporte magnético y deseche cuidadosamente las gotas de etanol con una pipeta de 10 μl.
  14. Añada 50 μl de TE baja en el tubo de unión baja de ADN que contiene el sedimento de bolas magnéticas para dispersar a los granos. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
  15. Coloque el tubo de baja unión de ADN en una rejilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos hasta que la solución es clara.
  16. Transferir 50 μl del sobrenadante en el tubo de baja obligatoria de ADN nuevo y añadir 75 μl de bolas magnéticas con una pipeta 100 μL para la purificación de 2nd . Mezcle suavemente golpeando ligeramente el tubo e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  17. Coloque el tubo de baja unión de ADN en un magnético para luego incubar durante 2 min a temperatura ambiente hasta que la solución es clara. Descartar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 200 μL sin perturbar las bolas magnéticas.
  18. Añadir 150 μL de etanol al 70% recién preparada con una pipeta de 200 μl y mover el tubo de lado a lado del imán para lavar los granos. Descartar cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las bolas magnéticas.
  19. Repita el paso 5.18 para un segundo lavado.
  20. Girar brevemente por el tubo con una mini centrífuga a 1.500 x g durante 5 s a temperatura ambiente. Coloque el tubo de baja unión DNA en un soporte magnético y deseche cuidadosamente las gotas de etanol con una pipeta de 10 μl.
  21. Añadir 50 μl de TE baja en el tubo de unión baja de ADN que contiene el sedimento de bolas magnéticas para dispersar a los granos. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
  22. Coloque el tubo de baja unión de ADN en una rejilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos hasta que la solución es clara.
  23. Transferir el 45 μl del sobrenadante que contiene la biblioteca purificada en el tubo de baja obligatoria de ADN nuevo con una pipeta 100 μl.

6. cuantificar la concentración de la biblioteca mediante PCR cuantitativa en tiempo Real

  1. Determinar la concentración de cada biblioteca según las instrucciones13 el fabricante.
    1. Preparar una solución de 20-fold de la dilución como sigue: se mezclan 2 μl de biblioteca purificada y 38 μl de agua libre de nucleasas en un tubo de unión baja de ADN con una pipeta de 2 μl y 100 μl.
    2. Almacenar las bibliotecas sin diluir a-20 ° C hasta el paso 7.3.
  2. Preparar una solución de 200-fold de la dilución como sigue: mezclar 5 μl de la 20-fold biblioteca de purificada diluida (preparada en el paso 6.1) y 45 μl de agua libre de nucleasas en un tubo de unión baja de ADN.
  3. Preparar una solución de 2,000-fold de la dilución como sigue: mezclar 5 μl de la 200-fold biblioteca de purificada diluida (preparada en el paso 6.2) y 45 μl de agua libre de nucleasas en un tubo de unión baja de ADN.
  4. Preparar la mezcla de reacción principal como sigue: mezclar 10 μl de 2 x solución de mezcla principal y 1 μl de 20 x solución de ensayo primer sonda en tubo de microcentrífuga estéril con una pipeta, luego mezclar golpeando suavemente el tubo. Añadir 11 μl de la mezcla principal de reacción en los pocillos de reacción de 96 pocillos óptico.
  5. Añadir 9 μl de la 2,000-fold biblioteca diluida, 9 μl de cada control estándar o 9 μl de agua libre de nucleasas en cada pocillo con una pipeta de 10 μl.
  6. Mantenga el lado no adhesivo de película óptica y retire la protección de copia de seguridad del centro de la película.
    1. Suavemente arrastra el aplicador sobre la película y la película del sello sobre la placa de 96 pocillos.
    2. Mezcle suavemente la placa de 96 pozos utilizando un mezclador de placa de 96 pocillos para 10 s a temperatura ambiente.
    3. Centrifugar la placa brevemente a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
  7. Energía en el instrumento PCR en tiempo real e Inserte la placa de 96 pocillos. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando el siguiente protocolo: 50 ° C por 2 min, 95 ° C por 20 s, seguido por 40 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C durante 20 s. curva de uso"estándar" y "modo rápido".
  8. Calcular la concentración de no diluido biblioteca multiplicando la concentración determinada con qPCR por 2.000.

7. la siguiente secuencia de generación

  1. Plan de la condición de funcionamiento y establezca el parámetro de funcionamiento dentro del software.
    1. Haga clic en [Plan tab] y [plantilla] y seleccione el método de ejecución adecuado.
    2. Seleccione la aplicación y el tipo de técnica y haga clic en [siguiente].
    3. Seleccionar el instrumento, kit de preparación de muestras (opcional), tipo de biblioteca kit, kit plantilla, kit de secuenciación base modo de calibración, tipo de chip, control de secuencia (opcional), y el código de barras y haga clic en [siguiente].
    4. Seleccione complementos y haga clic en [siguiente].
    5. Seleccione el proyecto y haga clic en [siguiente].
    6. Seleccione referencia predeterminada y los archivos de la cama de la región específica.
    7. Escriba el nombre de muestra, seleccione el código de barras y haga clic en [ejecutar Plan].
  2. Preparación de plantilla y carga en un instrumento automatizado según las instrucciones del fabricante de la viruta. Descongelar el cartucho de reactivo a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de su uso.
  3. Diluir la biblioteca sin diluir con agua libre de nucleasa según la concentración de biblioteca calculado en el paso 6.8 y hacer 20 bibliotecas de pM.
    1. Preparar una biblioteca combinada para secuenciación y almacén en el hielo.
    2. Añada 25 μl de la biblioteca combinada con pipeta 100 μL en la parte inferior del tubo de muestra. Utilizar la biblioteca agrupada dentro de 48 h.
  4. Encendido y abra la tapa del instrumento automatizado.
    1. Colocar chip de secuenciación, adaptador de la viruta, cartucho de enriquecimiento, cartucho de punta, placa de PCR, PCR marco sello, tubo de recuperación, solución del cartucho y cartucho de reactivo a la posición apropiada del instrumento automatizado.
    2. Toque [Set carrera] y [paso a paso] en la pantalla.
    3. Cierre la tapa y presione [Start check] en la pantalla.
    4. Después de la plataforma de análisis proceso, toque [siguiente] en la pantalla.
    5. Compruebe el contenido de la pantalla (tipo kit, chip, chip planes de identificación, identificación de la muestra,), ajustar la hora y toque [OK] en la pantalla.
  5. Después de terminar la carga de viruta:
    1. Toque [siguiente] en la pantalla y abra la tapa.
    2. Descargado el chip de la secuencia del adaptador de la viruta con las manos enguantadas.
    3. Coloque el chip en el contenedor de virutas, rap con parafilm y almacenar a 4 ° C hasta que la reacción de secuenciación.
    4. Quitar el cartucho de enriquecimiento, placa de PCR, sello marco PCR, tubo de recuperación, solución del cartucho y cartucho de reactivo de la posición apropiada del instrumento automatizado con las manos enguantadas.
    5. Transferencia de un cartucho de punta de vacío a la posición de desechos de la punta del instrumento automatizado con las manos enguantadas.
    6. Presione [siguiente] y cierre la tapa.
    7. Presione [Inicio] y limpie el instrumento automatizado por los rayos ultravioletas durante 4 minutos.
  6. Disolver una tableta de clorito de sodio en 1.000 mL de agua ultrapura y solución de filtro con una unidad de filtro de flujo de filtro de 0,22 μm.
    1. Energía en el instrumento de la secuencia.
    2. Presione [Clean] y [siguiente] en la pantalla del instrumento de la secuencia.
    3. Limpie el instrumento de la secuencia con 250 mL de solución de clorito de sodio filtro esterilizado y posteriormente 250 mL de agua ultrapura.
  7. Toque [inicializar] y seleccione el kit de secuenciación apropiada en la pantalla.
    1. Instalar un cargador gris en el lugar apropiado con las manos enguantadas.
    2. Inicializar el instrumento de la secuencia con la solución de lavado (proporcionado en el kit), la solución de ajuste de pH (contiene 350 μl de hidróxido de sodio 100 mM) y la solución estándar de pH (incluido en el kit).
  8. Añadir 20 μl de nucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP (proporcionado en el kit) en tubos de 50 mL (incluidos en el kit) con una pipeta 100 μl.
    1. Instalar un cargador gris en el lugar apropiado con las manos enguantadas.
    2. Cargar el tubo de 50 mL y el tornillo en el instrumento de la secuencia.
    3. Presione [siguiente] en la pantalla para iniciar el paso de inicialización, que tarda aproximadamente 25 minutos.
  9. Después de completar el paso de inicialización:
    1. Toque [Run] en la pantalla y seleccionar el instrumento de preparación adecuada de la biblioteca.
    2. Escanear el código de barras bidimensional de la viruta.
    3. Inserte el chip de la secuencia en la posición adecuada.
    4. Cierre la puerta de la abrazadera y el instrumento de chip.
    5. Toque [verificación de Chip], [siguiente] y [OK] en la pantalla para iniciar el funcionamiento de la secuencia.
  10. Después de la reacción de secuenciación, transferencia de datos y realizar análisis de datos de la tubería en el servidor de la secuencia13,17.

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Representative Results

La figura 1 muestra el proceso de preparación de muestras TIC para la extracción de ADN. En particular, el procedimiento toma sólo dos días para obtener ADN genómico de muestras TIC. Se evaluaron los efectos de almacenamiento de tumor antes de la elaboración de diapositivas. Encontramos que las células del tumor fueron atadas en el portaobjetos de cristal cuando muestras de tejido fueron inmediatamente tocadas en la diapositiva, y cuando los tejidos se mantuvieron en solución salina humedecida-gasa estéril durante 1 hora (figura 2). Sin embargo, cuando los tejidos se mantuvieron a temperatura ambiente, las células del tumor no fueron bien atadas a la diapositiva. Muestras preparadas podrían almacenarse a 4 ° C durante tres meses. Por lo tanto, es importante no dejar que las muestras a secar.

Examinó la utilidad de nuestro método y comparar con ejemplares adquiridos utilizando FFPE. TIC y FFPE muestras se prepararon de 14 muestras de tumor, y nos confirmó que podrían evaluarse tumor contenido y pureza de los especímenes TIC. Después realizamos la coloración de Giemsa, el número de células del tumor y la morfología del tumor se podría evaluar por microscopía. Así fuimos capaces de evaluar regularmente las células del tumor y posteriormente realizar una verificación de calidad de ADN.

La calidad y cantidad de ADN fueron estimadas por tiempo real cuantitativo PCR13,14,15. Determinamos las cantidades de ADN absolutas y el valor RQ, que es un indicador del nivel de degradación de la DNA genomic. Los resultados mostraron que un mayor rendimiento de ADN fue alcanzado usando a las muestras TIC en comparación con los especímenes FFPE (tabla 1). Además, los valores RQ de la DNA de TIC fueron significativamente superiores con respecto a de la DNA de FFPE (figura 3, p = 2.3 x 10-8, pruebas de t de Student dos colas). También se evaluaron los valores RQ de la TIC y FFPE ADN extraído de los tipos de tumores diferentes y encontró que el ADN de TIC fue mayor en calidad en comparación con el ADN de FFPE (figura 3). Estos resultados indicaron que el ADN de TIC menos fragmentado que la DNA FFPE.

A continuación se evaluó si el ADN de TIC podría utilizarse para el análisis de secuenciación de próxima generación. FFPE y TIC ADN fueron preparados del cáncer colorrectal primario y metastásico cáncer hepático Obtenido de un paciente (Figura 4A). Biblioteca preparación y amplificación por PCR se llevaron a cabo mediante el Panel de Hotspot de cáncer y se realizó secuenciación específica posteriormente. Como resultado, APC Q1367 * fue identificado en FFPE y TIC la DNA extraída del sitio 1 (tabla 2). Además, APC S1356 *, G12D KRAS y TP53 M237I fueron detectados en ambos FFPE y TIC ADN había extraído del sitio de 2, 3 y 4 (tabla 2). Estos resultados sugieren que las mutaciones somáticas idénticas fueron identificadas en las muestras pareadas de FFPE y TIC ADN preparadas desde el mismo sitio del tumor ( tabla 2yFigura 4B ). En particular, se detectaron las mismas mutaciones somáticas entre cáncer colorrectal primario (sitio 2, sitio no 1 de) y dos muestras de cáncer de hígado metastásico, lo que sugiere que los clones de tumor del sitio 2 metastatizan al hígado (Figura 4B y tabla 2). Juntos, estos resultados sugieren que el ADN de TIC es de alta calidad y es conveniente para una amplia gama de pruebas genéticas, incluyendo la secuencia de la generación siguiente.

Figure 1
Figura 1 diagrama esquemático para la obtención de ADN de una preparación de la muestra TIC. El tejido del tumor se toca en el cristal de la diapositiva para preparar la muestra TIC. Después de la evaluación de la morfología del tumor y el contenido bajo un microscopio, el ADN del tumor puede extraerse y utilizado para las pruebas genéticas. Mediante el uso de TIC, el tumor ADN puede obtenerse una muestra patológica clínica dentro de dos días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Preparación de muestras TIC. Resected especímenes de tumor inmediatamente se tocó un portaobjetos de vidrio normal (panel izquierdo), en solución salina humedecida-gasa estéril durante 1 hora (media) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 h (derecha). Muestra #1 fue de carcinoma hepatocelular y muestra #2 fue el cáncer de mama. Imágenes microscópicas fueron capturadas usando una cámara digital montada en un microscopio. Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Control de calidad de ADN estimado por análisis PCR cuantitativo en tiempo real. TIC y FFPE ADN fueron extraídos 14 tejidos del tumor de colon (n = 8), estómago (n = 4) y cáncer del hígado metastásico (n = 2). Comparación de los puntajes de cuantificación relativa entre muestras TIC-Giemsa y el FFPE-él. Valores RQ de TIC ADN fueron significativamente más altos que el de ADN FFPE. Se realizó análisis estadístico entre los dos grupos y p-valores se calcularon por la prueba de t no apareados dos colas de los estudiantes utilizando Excel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Siguiente generación secuenciación análisis datos utilizando TIC y ADN FFPE. Imágenes microscópicas y macroscópica (A). Imágenes representativas de TIC-Giemsa y tinción de muestras (sitio 3 y 4) del cáncer colorrectal (sitio 1 y 2) y carcinoma metastático de hígado FFPE-HE. Barra de escala en las imágenes macroscópicas: 1 cm, barra de escala en imágenes microscópicas: 100 μm. (B) mapa mostrando la distribución de las mutaciones somáticas de cada sitio del tumor (n = 8). Se detectaron mutaciones idénticas entre muestras apareadas de TIC y FFPE ADN. Valores de fracciones alélicas se indican en la escala de color de la graduación del 1% (rosa claro) 100% (rosa). Columnas grises no demostraron ninguna mutación identificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-HE (n = 14)
ADN total (ng) ADN total (ng)
Muestra Sitio del tumor Corto Largo RQ Corto Largo RQ
Site1 Colón 1495 1247 0,83 939 349 0.37
Site2 Colón 991 1057 1.07 556 204 0.37
Descarga3 Hígado 467 511 1.09 130 39 0.3
Site4 Hígado 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 Colón 749 598 0,8 529 205 0.39
Site6 Estómago 330 286 0.86 211 98 0,46
Site7 Estómago 636 499 0,78 154 84 0.55
Site8 Estómago 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 Colón 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 Colón 280 218 0,78 209 83 0.39
Site11 Colón 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 Estómago 1501 1200 0,8 274 132 0.48
13 Colón 55±6 1404 0,9 326 179 0.55
Site14 Colón 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabla 1. Datos de la calidad del ADN. TIC emparejados (n = 14) y FFPE especímenes (n = 14) fueron preparados del colon, el hígado y el cáncer de estómago. Muestras TIC fueron teñidas con Giemsa, y muestras FFPE fueron manchadas con hematoxylin y eosina (HE). Muestras de ADN fueron extraídas y cuantificó por PCR cuantitativa en tiempo real con dos pares de cartilla amplificación locus RNaseP (amplicon largo (268 bp) y amplicon corta (87 bp)). Se calcularon los valores RQ como sigue: el valor medio de amplicones largo dividido valor medio bythe de amplicones corto. SD, desviación estándar. RQ, cuantificación relativa

Nombre de la muestra Ubicación Preparación Símbolo del gene Mutación de Posición Referencia Variante Codificación de Cobertura Fracción alélica
Cáncer colorrectal primario Sitio 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Cáncer colorrectal primario Sitio 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A de 1968 77%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A de 1967 89%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
Cáncer colorrectal primario Sitio 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A de 1964 97%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A de 1965 93%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
Cáncer del hígado metastásico Sitio 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

Tabla 2. Comparación de mutaciones en pares FFPE y TIC ADN detectado por análisis de secuencias específicas. TIC emparejado y FFPE muestras se prepararon de los cánceres colorrectales primarios 2 (sitio 1 y 2) y 2 cáncer de hígado metastásico (sitio 3 y 4). Secuencia específica se realizó con estas muestras de ADN y las mutaciones somáticas se identificaron. Perfiles de mutación eran idénticos entre muestras apareadas de TIC y FFPE ADN.

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Discussion

En este estudio, se presenta un método alternativo para la obtención de tumor ADN de especímenes patológicos clínicos utilizando TIC. Preparación de TIC es muy simple y necesita menos tiempo en comparación con métodos FFPE, sin la necesidad de instrumentos especiales10. Todos los procedimientos de la preparación de TIC para la extracción de ADN se pueden terminar dentro de dos días (figura 1). Este método por lo tanto acorta el tiempo de respuesta para realizar pruebas genéticas. En particular, esto proporciona una ventaja significativa en reducir el número de días requeridos para el análisis molecular. Este tiempo corto nos permite ofrecer inmediatamente una terapia apropiada para pacientes con cáncer progresivo que requieren fármacos molecularmente dirigidos. Así, este método proporciona beneficios para el análisis de alteraciones genéticas en los tumores y la administración de fármacos molecularmente dirigidos para la terapia del cáncer.

Hay algunos puntos clave para el éxito del uso de TIC ADN para análisis genético. Los tejidos del tumor pueden ser necróticos por tratamientos como quimioterapia u otros tratamientos. Por lo tanto, precaución es necesario en la preparación de especímenes de la TIC para evitar muestras de secciones necróticas en el tumor tanto como sea posible. Además, la evaluación microscópica inicial es muy importante para los procedimientos posteriores. Además, prevenir la sequedad de los tejidos del tumor se requiere para la preparación de la muestra de éxito TIC. Si se secan los tejidos del tumor, esto resulta en menos células adjuntas en el portaobjetos de cristal. También será difícil observar la morfología y la celularidad del tumor porque el secado conduce a la degeneración de los tejidos del tumor.

Existen algunos beneficios potenciales al uso de TIC ADN. En primer lugar, podemos comprobar la celularidad del tumor durante la primera evaluación con microscopia. Si las células normales, tales como linfocitos y células del estroma, fueron abundantes en las muestras de tejido, la contaminación de estas células normales impediría la capacidad de detectar las mutaciones somáticas en las células del tumor. Rápida evaluación microscópica de las muestras puede ayudar a la evaluación de la celularidad del tumor y la valoración de si las muestras de ADN tumoral adecuada fueron obtenidas de las muestras TIC antes de la extracción de ADN. En segundo lugar, nuestros resultados demostraron que el ADN de TIC es alta en calidad y cantidad. FFPE DNA se ha utilizado para la siguiente generación que ordenaba análisis incluyendo específico secuenciación, secuenciación del exoma y genoma secuencia16,17,18,19,20. Archivo de FFPE de ADN se utiliza habitualmente para análisis genético21,22, no obstante FFPE ADN puede ser fragmentado durante la fijación con formol. Esto puede provocar problemas en la amplificación por PCR o la extracción de ADN, provocando una falta de cobertura de secuencia, uniformidad en las regiones de destino y aumentar el riesgo de error de secuencia23,24. Por el contrario, ADN de TIC no está fragmentada, que puede ser debido a la fijación de alcohol que tiene menos influencia en el ácido nucleico. ADN de TIC no está fragmentada como la DNA FFPE, estas muestras será más convenientes para el análisis de secuenciación de próxima generación, PCR en tiempo real y PCR digital. De hecho, previamente demostramos que DNA TIC de un espécimen del tumor puede ser utilizado en el análisis de secuenciación de última generación, un método llamado "TIC-seq", y los resultados podrían capturar precisamente el tumor mutaciones somáticas13. En tercer lugar, esta técnica es aplicable para una amplia gama de materiales. En el presente informe, se utilizan a especímenes quirúrgicos. Además de los tejidos quirúrgicos, nodo de linfa metastático, biopsia bronquial o endoscópica se puede utilizar para la preparación de ADN de TIC.

En conclusión, presentamos un método simple y rápido para la preparación de ADN de alta calidad tumor utilizando TIC. Este método ampliará nuevas posibilidades en el campo del análisis genético y ayudar a promover la medicina de precisión en el ajuste clínico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Agradecemos a todo el personal médico y auxiliar del hospital y los pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle blanco lobo, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto de este informe. Este estudio fue apoyado por una subvenciones para proyecto de investigación del genoma de la Prefectura de Yamanashi (Y.H. y M.O.) y una beca de la YASUDA médica Fundación (albergue).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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