生物哺乳动物细胞光交联图谱和 Bioorthogonal 化学中化学探针的遗传受体优化

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Chemistry

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Summary

本文提出了一种简便的荧光分析方法, 用于评价将非规范氨基酸 (ncAAs) 纳入哺乳动物细胞表达的蛋白质中的氨基酰 tRNA 合成酶/tRNA 对的效率。介绍了 ncAAs 在 G 蛋白耦合受体 (受体) 研究中的应用, 包括结合位点的光交联映射和活细胞的 bioorthogonal GPCR 标记。

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

非规范氨基酸 (ncAAs) 的基因融合通过琥珀停止密码子抑制是一个强大的技术, 安装人工探针和反应基团直接在蛋白质的活细胞。每个 ncAA 都由一个专用的正交抑制-tRNA/氨基酰 tRNA 合成酶 (AARS) 对导入宿主有机体。不同 ncAAs 的并网效率有很大差异, 在某些情况下是不理想的。通过操作 AARS 或 tRNA 可以提高正交对。然而, tRNA 或 AARS 的定向进化使用大型图书馆和死/活选择方法是不可行的哺乳动物细胞。在此基础上, 提出了一种简便、稳健的荧光检测方法, 用于评价哺乳动物细胞中正交对的有效性。该化验允许在合理的时间内进行适量的 AARS/tRNA 变种的筛查。利用这一方法生成新的 tRNAs, 显著提高 pyrrolysine 正交系统的效率, 以及 ncAAs 在 G 蛋白耦合受体 (受体) 的研究中的应用, 这是 ncAA 的挑战对象。诱变。首先, 系统地将一张照片交联的 ncAA 在一个受体的胞外表面, 在完整的受体的结合部位直接映射到活细胞中。其次, 通过将最后一代 ncAAs 加入 GPCR, 证明了用荧光染料进行超快无催化剂受体标记, 利用 bioorthogonal 应变促进逆翅果桤木 cycloaddition (SPIEDAC) 在活细胞上的作用。由于 ncAAs 可以被广泛地应用于任何蛋白质, 它的大小, 该方法是普遍感兴趣的一些应用。此外, ncAA 公司不需要任何特殊的设备, 很容易在标准生物化学实验室进行。

Introduction

化学探针在蛋白质中的遗传结合是一种有效的方法, 可以直接在活细胞的本机语境中研究蛋白质功能的结构和动态方面。如今, 数以百计的非规范氨基酸 (ncAAs) 配备了最不同的化学基团, 可以通过生物合成1,2,3,4,专门纳入蛋白质。在他们之间, 你发现光敏 ncAAs 例如相片交联 5, 相片6, 7, 8, 9 和相片转换氨基酸10,11, 含氨基酸的烯烃和炔烃无催化剂 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 17、携带丹磺18、香豆9、19、prodan20、21显影的氨基酸以及配备其他生物物理探针的氨基酸作为以及与后平移修改1,2,3,4,22,23,24,25

ncaa 的遗传编码是由一个专门的氨基酰 tRNA 合成酶 (AARS) 配对的同源抑制-tRNA, 其中结合了 ncaa 的反应琥珀停止密码在定期核糖体合成。ncAARS/tRNA 对被设计成在宿主有机体中是正交的,不与内生对进行交叉交谈。该技术在原核和真核宿主中都有很好的建立, 并且很容易适用于哺乳动物细胞。对 ncAA 纳入哺乳动物细胞是基于三主要正交系统: tyrosyl 系统, 结合 TyrRS 从大肠杆菌26与 tyrosyl 琥珀色抑制器从 B. 嗜热脂肪 27(EcTyrRS/Bst山药对),大肠杆菌leucyl 系统 (EcLeuRS/tRNACUA对)6,18,28和古细菌 pyrrolysyl 系统 (PylRS/tRNAPyl对)3, 藉以 tRNAPyl是自然琥珀抑。一般来说, 每个 ncAA 都被一个专业的 ncAARS 认可。根据 ncaa 的结构, ncAARS 是通过 TyrRS、LeuRS 或 PylRS 的定向进化获得的, 尽管一些合成酶系可以接受不止一个 ncaa。

将正交对通过简单地使用质粒载体导入细胞中。最常见和有效的质粒是 bicistronic 和编码的合成酶和 tRNA 形成正交对29。第二种质粒编码的兴趣的蛋白质, 轴承一个琥珀密码子在指定的修改地点被联合转染。ncAA 只是添加到细胞生长培养基中。然而, 不同的专业群体经常使用不同的质粒结构, 即使是同一个 ncAA 的合并。构造在基因的排列不同在载体, 合成酶的类型, 密码子使用在合成酶基因, 促进者用法, tRNA 的变异和 tRNA 表达盒的数量。另外, 由于不同合成酶系的催化效率、tRNA 的质量和其他因素的不同, 不同 ncAAs 的结合效率可能会有很大的差异,30。因此, 在手边有一个快速而可靠的方法来评估正交对的效率, 无论是选择最适合的系统为理想的应用和执行一些优化步骤, 以提高整体蛋白表达收益 率。

我们已经建立了一个简单和稳健的荧光检测方法来评估正交对29 (图 1) 的效率。在该检测中, 细胞与质粒编码的正交对, 连同 bicistronic 报告质粒编码两个绿色荧光蛋白轴承一个琥珀停止密码子在允许的位置 (EGFP标记) 和mCherry 基因。全细胞裂解物的红色和绿色荧光在一个96井板上的平板阅读器上以不同的通道读出。绿色荧光的强度与琥珀色抑制的效率直接相关, 而红荧光强度则直接估计出所测样品的大小和转染效率。关于基于荧光辅助细胞分类的类似化验, 请阅读3132, 该化验结果立即全面评估了整个细胞的蛋白质表达, 这更代表通常的实验条件, 并提供一个更容易的数据获取和处理标准软件。总的来说, 该方法的主要优点是可以同时分析大量样品中的介质。利用这一方法, 我们筛选了一个合理设计的抑制 tRNAs 库, 以提高 Pyl 正交系统30的效率。这项工作描述的实验协议, 以执行这一试验, 并显示其应用的例子, 包括优化的正交对组合的照片交联的叠氮基苯丙氨酸 (Azi) 和比较采用不同氨基酸的效率 (图 2)。

在过去的几年中, ncAA 的工具已经被证明是非常强大的研究 G 蛋白耦合受体的结构和功能方面 (受体)33,34,35,36,37,38. 在人类中, 受体形成了一个大家庭的膜受体 (800 名成员), 并代表治疗药物的主要目标。受体的直接结构表征仍然具有挑战性, 对其进行研究需要补充生物化学方法。我们率先使用的照片交联 ncAAs 地图 GPCR 表面和发现配体绑定口袋34。利用我们的优化系统 Azi 合并, 我们系统地纳入 Azi 整个 juxtamembrane 领域的 GPCR 直接在活体哺乳动物细胞。在紫外线照射下, Azi 形成一种高度反应的 nitrene 物种, 共价键捕获相邻分子。当配体添加到系统中时, Azi 作为近距离探针来揭示受体的位置接近束缚配体。这样, 在 B 类 GPCR 内促肾上腺皮质激素释放因子受体类型 1 (CRF1R) 33 上首次公布了神经肽激素 Urocortin I (Ucn1) 的结合模式。最近, 我们在同一受体38上公开了不同的激动剂和拮抗器的结合模式。其他受体39404142的其他肽和小分子配体的 orthosteric 和构结合点也采用了类似的方法。本文介绍了在 GPCR 表面光交联测绘实验室中应用的实验协议。该方法相对快速, 简单, 不需要任何特殊设备, 因此适用于标准生物化学实验室。重要的是, 该方法不仅提供了一个有价值的工具, 不仅可以识别3D 结构数据稀缺的配体结合点, 而且还可以补充现有的体外数据, 并从完全后 translationally 修改后的受体中得到信息。活细胞的生理环境。

新近开发的新型 ncAAs 轴承, 适用于超快无催化剂 bioorthogonal 化学的侧链化学基团, 已开辟了将最后一代显影安装到蛋白质中的超级分辨率成像的可能性。直接在活单元格2,43上。 此类化学锚包括 SCOK14中的紧张 cyclooctyne, 双环 [6.1. 0] 壬炔BCNK12, 17, 和跨 cyclooctenes 在 TCO *K13, 15, 17 等 ncAAs窝藏冰片16,17,44或 cyclopropene45,46基团。bioorthogonal 化学的笨重 ncAAs 由 PylRS 的变体组成, 通常表示为 PylRSAF (指示m Y271A Y349F 中的突变 barkeri 和 PylRS), 以及其他即席进化 ncAARSs 17, 44. bioorthogonal 锚与四嗪类试剂47 通过逆电子需求翅果-桤木 cycloaddition 的反应, 在几分43, 48 内给出高标号率。然而, 这一强大的方法, 以标签受体是一个挑战, 由于整体效率低的正交 ncAA 公司合并系统。利用我们的增强 Pyl 系统, 我们最近展示了这种氨基酸的高产量纳入受体和超快 GPCR 标记在活体哺乳动物细胞表面30。标记的受体仍然功能, 因为他们的生理内化后激活受体与激动剂。本文介绍了将 bioorthogonal 锚定为受体的实验协议, 以及下面的标记步骤。用小亮显影装备受体是通过先进显微技术研究活细胞 GPCR 结构动力学的第一个基本步骤。

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Protocol

1. 基于荧光的筛选效率 (图 1)

  1. 维持 Dulbecco 修饰鹰培养基中的 HEK293 细胞 (DMEM; 高葡萄糖, 4 毫米谷氨酰胺, 丙酮酸) 补充 10% (v/v) 胎牛血清 (血清), 100 U/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素在37°c, 95% 湿度和 5% CO2
  2. 在转染前的前一天将细胞播种。
    1. 分离细胞为5分钟在37°c 在0.05% 胰蛋白酶或 PBS 补充与0.5 毫米 EDTA。使用1毫升胰蛋白酶/EDTA 的10厘米菜。用10卷的完全培养基淬火, 并通过吹打并用重悬细胞。使用 hemocytometer49计算挂起的单元格数。
    2. 种子 6.0 x 105 HEK293 细胞每井6井板在2毫升完全生长培养基。分别为野生型 EGFP 和模拟转染样品准备尽可能多的井作为样品数量和另外两个井。
  3. 显微镜下控制汇流 (由细胞占据的区域)。染细胞在70% 汇合使用聚乙烯亚胺 (裴) 试剂。
    1. 1h. 在转染之前, 加入适当数量的新的 ncaa 股票解决方案, 所有的水井为最终的 ncaa 浓度为 0.25-0. 5 毫米。将 ncaa 纳入所有水井, 包括野生型阳性对照和模拟转染细胞, 以防止由 ncaa 对细胞生长的影响可能引起的荧光信号的差异。
      注意:要准备库存解决方案, 用 0.2-0.5 米氢氧化钠将 ncAA 分解为 0.1-0.5 米。然而, 在使用前, 一些 ncAAs 可能需要在亚砜和/或中和四卷1米 HEPES (pH 7.4) 的初始增溶。通常, 制造商建议制定一套库存解决方案的协议。
    2. 在离心管中, 混合1µg 质粒 dna 编码的 ncAARS/tRNA 对测试与1µg 的报告质粒 dna (pcDNA3.0 EGFP183TAG-mCherry)。在不同的管, 准备一个相同的转染使用 EGFP 野生型参考和模拟转染。
      注意:ncAARS/tRNA 对的质粒编码中嵌入的 tRNA 盒的拷贝数取决于应用。为便于克隆, 在筛选不同的 tRNAs 时建议使用 1 tRNA 拷贝, 而在测试不同的 ncAARS 或将不同的 ncAAs 由同一正交对组合在一起时, 建议使用4个拷贝 (尽管不是绝对必要)。
    3. 每个包含 DNA 的管中添加100µL 乳酸缓冲盐水 (磅), 含20毫米乳酸钠在 pH 4.0 和150毫米氯化钠。简单地混合。
    4. 每管包含的 DNA 在 lbs 添加6µL 1 µg/µL 裴在磅 (比裴/DNA = 3/1 瓦特/w) 和漩涡立即。在 RT 孵育10-15 分钟。
    5. 从每个井中提取400µL 细胞培养基, 并将其添加到 DNA 培合剂中, 以中和 pH 值。将 DNA 混合物运球到细胞上。
      注意:DMEM 通常含有苯酚红作为 pH 指标。在中和步骤中, 添加在管内的混合物的颜色将由黄色 (酸性) 变为红色 (中性)。虽然在酸性 ph 值下, 在 LBS 中形成 dna 复合体给出了最高的转染率50, 但 dna-裴复合物可以在 pH 值 7.4 (例如无血清 DMEM) 中直接形成。如果使用 DMEM 形成 DNA 络合物, 跳过中和步骤1.3.5。在任何情况下, 在形成复合物时, 混合物中不存在血清。
  4. 收获细胞48小时后转染。
    1. 吸入培养基和冲洗细胞一次与2毫升预热 PBS (37 °c)。添加800µL 的 PBS 补充0.5 毫米 EDTA 和孵化20分钟在37摄氏度。通过吹打来分离和暂停单元格。
    2. 将细胞悬浮液转移到含有200µL PBS 的1.5 毫升管中, 辅以5毫米氯化镁2
    3. 离心机为2分钟, 在 800 x g, 并丢弃上清。
      注意:协议可以在这里暂停。在这种情况下, 在液体 N2中将小球冻结, 并在-80 摄氏度处存储多达一个月。总是戴眼睛防护护目镜。
  5. 添加100µL 三裂解缓冲 (50 毫米三盐酸 pH 8.0, 150 毫米氯化钠, 1% 海卫 X-100, 1 毫米 EDTA 和新鲜添加 PMSF) 到细胞丸和在冰上孵育30分钟。为了促进裂解, 漩涡每5分钟。
  6. 在4摄氏度和 1.4万 x g 上旋转10分钟的细胞碎片, 将上清的90µL 转移到黑色96井板中. 使用带有荧光模块的板读取器测量 EGFP 和 mCherry 荧光。
    注意:使用适当的励磁和发射过滤器 EGFP (λabs: 488 毫微米; λem: 509 毫微米) 和 mCherry (λabs: 588 毫微米; λem: 611 nm)。测量的 EGFP 值将跨越从模拟转染细胞获得的最小值和最大值之间的范围, 通常从野生型 EGFP 获得。注意在仪器中设置正确的测量窗口。
  7. 计算了该方法的有效性, 以样品荧光与野生型 EGFP 表达的荧光比值为例。所有值都归一化为 mCherry 荧光。
    Equation 1

2. ncAAs 到受体中的遗传纳入配体-GPCR 相互作用的光交联映射 (图 3)

  1. 维持 HEK293T 细胞在 DMEM 补充与 10% (v/v) 血清, 100 U/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素在37°c, 95% 湿度和 5% CO2
  2. 种子细胞转染前的前一天。
    1. 分离细胞为5分钟在37°c 在0.05% 胰蛋白酶或 PBS 补充与0.5 毫米 EDTA。使用1毫升胰蛋白酶/EDTA 的10厘米菜。淬火与10卷的完整培养基和并用重悬细胞通过吹打上下。使用 hemocytometer49计算挂起的单元格数。
    2. 种子 5.0 x 105 293T 细胞每井在2毫升完全成长媒介在6井板材。对于每个要筛选的位置, 为绑定控制33,38准备1井每配体加一井。一个额外的井, 被转染野生类型 (重量) 受体可能被纳入检查的表达水平的突变体。
  3. 后天, 控制汇合 (被细胞占据的区域) 在显微镜下。染细胞在70% 汇合使用裴。
    1. 1h 在转染前, 将 Azi 添加到所有井中, 最终浓度为0.5 毫米。
      1. 准备一个0.5 米 Azi 的库存解决方案。每 6-井板, 称1.2 毫克 Azi 入管子并且溶化它在15µL 0.5 M 氢氧化钠。稀释1.2 毫升完整介质中的库存溶液, 并将混合物的200µL 添加到每个井中。
        注意:为每个实验准备一个 Azi 的新的库存解决方案。叠氮化物在水溶液中有很短的半衰期, 特别是在碱性 pH 值的情况下, AziRS 包含完好的, 但也含有退化的形态。
    2. 染总金额为2µg DNA 每井: 1 µg 质粒编码的标志标记 GPCR 轴承的标签密码子在所需的位置和1µg 的质粒编码的正交对 Azi (E2AziRS51和4副本的同源抑制器-tRNA Bst山药)33,38
      注意:当包括一个量比较检查表达水平, 染的质粒 DNA 较低的重量受体。根据 GPCR 的不同, 0.2-0.5 µg 的质粒编码, 其受体产量与突变质粒的1.0 µg 相似。染在所有井中都有相同数量的 dna, 用模拟 (例如一个空向量) 填满丢失的 dna。
    3. 按 1.3. 3-1. 3.5 的说明进行。
    4. 48 h 转染后, 进行与步骤2.4 的照片交联的配体或转到步骤2.5 直接收获和分析验证受体表达。
  4. 配体的照片交联。
    1. 准备一个1,000x 配体库存溶液。将肽配体溶于亚砜中100µM 的浓度。
      注意:配体浓度依赖于配体-GPCR 相互作用的离解常数 KD 。最后浓度为 100 x KD是可取的。如果肽配体是三氟乙酸酸 (TFA) 的盐, 则在计算分子量时考虑 TFA 的重量 (在肽中每基氨基酸的 1 x TFA)。此外, 考虑到肽是普遍吸湿。避免重复冷冻肽粉, 永远不要打开一个肽容器, 直到它没有达到室温。
    2. 稀释配体储存液 1:1, 000 在包含5毫米 2-(12.5-羟乙基)-4-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)-盐酸 pH 值 2, 1 毫米氯化钠的 HEPES 离解缓冲器 (HDB) 中, 由 0.1% BSA、0.01% 海卫 x 100、7.4 mm 氯化镁140组成的装订缓冲器和5毫米氯化钾, 每 Azi GPCR 的突变体准备1毫升。用1毫升的配体溶液取代细胞培养基。在 RT 孵化10分钟。
      注意:调整孵化时间到特定 GPCR, 对配体动力学和受体内化进行核算。延长孵化时间不会提高交联率。
    3. 在 365 nm 的 UV 交联剂中照射样品20分钟, 用 5 x 8 W 管和 ~ 5 厘米到细胞的距离。通过吹打分离细胞并将其转移到1.5 毫升的反应管中。在 800 x g 上将细胞颗粒3分钟, 然后丢弃上清。
    4. 将蛋白酶抑制剂 (PI) 鸡尾酒片溶于1毫升25毫米 EDTA/小时2O 以制作50x 库存溶液。整除的 PI 库存解决方案, 并存储在-20 摄氏度。稀释50x 库存1:25 在 HDB 和并用重悬细胞小球在50µL 2 x PI 在 HDB。将液体中的单元格闪烁-冻结2
      注意:戴上护眼护目镜。在这一点上, 样品可以存储在摄氏-80 摄氏度, 长达一个月。继续执行步骤2.6。
  5. 直接的细胞收获。
    1. 吸入培养基。在 HDB 中加入800µL 0.5 毫米 EDTA。在 RT 或冰上孵化10分钟。
    2. 通过吹打和向下分离细胞, 并将它们转化为1.5 毫升的反应管。在 HDB 中添加200µL 5 mM 氯化镁2 。在 800 x g 上将细胞颗粒3分钟, 然后丢弃上清。
    3. 并用重悬细胞颗粒在50µL 2 x PI 在 HDB 和闪光冷冻在液体N2。戴上护眼护目镜。
      注意:在这一点上, 样品可以储存在-80 摄氏度, 长达1月。
  6. 细胞裂解。
    1. 在水浴中解冻细胞在37°c 为 30-45 s 和漩涡简要地。从现在起保持样品的冷。颗粒膜在 2500 x g 和4°c 为10分钟丢弃上清, 其中含有大量胞浆蛋白。
    2. 并用重悬50µL HEPES 裂解缓冲液中含有50毫米 HEPES 盐酸 pH 7.5, 150 毫米氯化钠, 10% 甘油, 1% 海卫 X-100, 1.5 毫米氯化镁2, 1 毫米 EGTA, 1 毫米的微丸和新鲜添加 2 X PI 鸡尾酒。完全混合。每5分钟溶解30分钟的冰和涡旋细胞。
    3. 在 1.4万 x g 和4摄氏度下, 将细胞碎片向下旋转10分钟。立即将上清液转移到新的反应管上。
      注意:立即进行分析。裂解物可以储存在摄氏-20 摄氏度, 但是, 每一个冻融周期都会损害结果的质量。
  7. 西方污点分析。
    1. 要准备样品, 取3-5 µL 裂解液并将其填满7µL 与 H2o 添加2µL 1 M 和3µL 4 x 样本缓冲区, 其中包含63毫米三盐酸 pH 6.8, 2% SDS, 10% 甘油和0.04% 溴酚蓝色。孵育30分钟, 在37摄氏度。
    2. 当 GPCR 是糖化和微弱或沾污带是一个问题, deglycosylate 样品与 PNGase F 增加信号强度和锐化波段。根据供应商的协议, 在10µL 的总容积中使用3-5 µL 裂解液和 deglycosylate。添加3µL 4 x 示例缓冲区。
      注意:膜蛋白在多个部位和状态下通常是糖化的, 这会损害 SDS 页分析中分辨率的质量。但是, 不要 deglycosylate 样本来分析 Azi GPCR 突变体的表达水平, 因为它与评估细胞表面完全糖化、成熟受体的部分有关。
    3. 通过标准的 SDS 页和印迹转移蛋白, 通过 PVDF 膜解决样品。
      警告:丙烯酰胺是神经毒性。戴上手套, 保护眼睛。
    4. 在4摄氏度的5% 脱脂牛奶中, 用20毫米三盐酸 pH 7.4、0.15 米氯化钠和0.1% 吐温 20, 将1小时的膜阻挡在 RT 或隔夜的室温下。
    5. 用抗配体抗体对膜进行探针-共轭二次抗体。在与 tb 之间进行清洗。为了检测 Azi-GPCR 的表达水平, 用商用的 HRP 抗体探测膜 (参见材料表)。
    6. 使用自制的 ECL 试剂进行增强化学发光 (ecl) 反应, 在黑暗中检测信号5分钟。

3. 活哺乳动物细胞受体的超快 Bioorthogonal 标记

注意:该协议针对4井腔盖玻片 (井区 = 2.2厘米2) 进行了优化。对于不同的大小, 协议必须相应地进行缩放。

  1. 显微镜切片表面涂层。在无菌罩下进行全过程。
    1. 在50毫米硼酸盐缓冲器 (pH 8.5) 的浓度为1毫克/毫升, 制备聚 d-赖氨酸氢溴酸盐 (MW=500-550 kDa) (PDL) 股票溶液。贮存在4摄氏度, 可达6月。不要冻结。
    2. 稀释的 PDL 股票解决方案1:40 在无菌的超纯水到最终浓度的25µg/毫升 (工作解决方案), 然后过滤解决方案通过0.22 µm 无菌过滤器。
      注意:工作解决方案可存储在4摄氏度, 长达3月。
    3. 用500µL 的 PDL 工作解决方案, 充分覆盖显微镜下各井的底部。孵育20分钟在 RT 和吸入的 PDL 工作解决方案。
      注意:PDL 工作解决方案最多可使用三次。如果需要重新使用该解决方案, 请将所用的解决方案从涂层的幻灯片转移到新鲜的无菌管, 并相应地给管子贴上标签。切勿将再生溶液与新鲜溶液混合使用。
    4. 用700µl 无菌的超纯水冲洗每个井 3 x, 让干燥至少1小时。
      注意:准确冲洗井是非常重要的, 因为 PDL 溶液的残留物对细胞是有毒的。涂层的幻灯片可以直接使用显微镜或存储长达一周的4摄氏度。
  2. 维持 HEK293T 细胞在 DMEM 补充与 10% (v/v) 血清, 100 U/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素在37°c, 95% 湿度和 5% CO2
  3. 种子细胞转染前的前一天。
    1. 分离细胞为5分钟在37°c 在0.05% 胰蛋白酶或 PBS 补充与0.5 毫米 EDTA。使用1毫升胰蛋白酶/EDTA 的10厘米菜。用10卷的完全培养基淬火, 并通过吹打并用重悬细胞。使用 hemocytometer49计算挂起的单元格数。
    2. 种子 1.0 x 105 HEK293T 细胞每井 (区域 2.2 cm²) 在600µL 染料自由完全 DMEM。
      注意:为成像目的, 从一开始就不含任何染料的介质中工作是非常方便的。染料自由 DMEM 配方是商业上可用的。
  4. 控制汇流 (被细胞占据的区域) 在显微镜下, 用脂质为基础的转染试剂染70% 汇合的细胞。
    1. 1 h 在转染前, 在0.2 米氢氧化钠和 15% (v/v) 亚砜上准备一个新的100毫米的 TCO * K 的库存解决方案。
    2. 每井, 混合3µl 的 TCO * K 库存解决方案与12µl 1 米 HEPES pH 7.4。将解决方案轻轻地添加到井中, 最终拥有 TCO * K 浓度为0.5 毫米。
    3. 每井准备500的 DNA。在离心管中, 稀释 200 pcDNA3.1_CRF1R-95 标记 EGFP, 200 ng 的质粒编码为MbPylRSAF/tRNAPyl正交对 (四盒 tRNAM15) 和 100 ng pcDNA3.1_Arrestin3质粒在50µL 培养基 (无染料, 无血清, 无抗生素)。
      注意:一般而言, Arrestin 的联合转染没有必要观察 GPCR 内化。然而, 转染 Arrestin3 加速了 CRF1R 的内化, 这在分析许多突变体的内化时非常方便。
    4. 稀释1.25 µL 脂基转染试剂 (2.5 µL 每1µg 的 DNA) 在50µL 培养基 (无染料, 无血清, 无抗生素), 并添加溶液的 dna 混合物。漩涡立即和孵化5-10 分钟在 RT. 将 DNA 脂质复合物添加到细胞中。
      注意:根据我们的经验, 以脂质为基础转染的细胞的形态学看起来比与裴转基因的细胞更具生理性。由于裴给出更高的转染效率, 裴应该是首选的下游应用, 如西方印迹, 而脂质的转染是一个更好的选择染细胞进行成像实验。
  5. 24 h 后转染, 标签的受体与荧光染料。
    1. 在超纯 H2O 中, 在亚砜和10毫克/毫升 DNA 染色染料库存溶液中制备0.5 毫米染料四嗪类溶液。
    2. 将100µL 介质从每个井转移到1.5 毫升的反应管中。添加1.8 µL 的染料四嗪类溶液和0.3 µL 的 DNA 染色染料库存溶液。将含有染料的培养基转回到井中, 在37摄氏度时孵育5分钟。
      注意:四嗪类橙荧光染料的最终浓度为1.5 µM。
    3. 吸入培养基, 用 PBS 轻轻冲洗两次细胞, 以去除过量的染料。添加600µL 完全染料游离生长培养基预热到37摄氏度。
  6. 荧光显微镜和受体内化。
    1. 使用适合于 GFP (λabs的滤镜, 可视化 63x (或类似) 放大倍数下的标记受体: 488 毫微米; λem: 509 nm), 橙色荧光染料 (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) 和 DNA 染色染料 (λabs: 350 毫微米;λem: 461 nm)。在激活受体之前, 用每个过滤器拍照。
    2. 用 200 nM 的 Ucn1 促进受体内部化。
      1. 在亚砜中制备200µM 的 1000 x Ucn1 库存溶液。
        注意:根据肽的溶解度, 你可以在纯净的水或缓冲中准备存货。
      2. 将100µL 培养基从井中转移到1.5 毫升反应管中, 加入0.6 µL 的肽激动剂库存溶液。把介质移回井中。
      3. 观察显微镜下的内部化。使用前面提到的过滤器, 在清楚发现的内部化发生 (10-15 分钟到小时, 取决于 Arrestins 的受体和过度表达) 之后拍照。

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Representative Results

荧光检测的轮廓在图 1中描述。这项化验在三宗申请中使用。首先, 对 Pyl 正交对中的赖氨酸 (中行) 的一些 tRNA 变体进行筛选。赖氨酸 (中行) 是一种与 Pyl 类似的氨基酸 sterically。由于 Pyl 在商业上不可用, 赖氨酸 (中行) 通常被用作 PylRS 的标准基板。筛选的 tRNAs 基于 tRNAPyl。每个 tRNA 变种在回路和茎的单基或基对的突变承担合理设计, 以提高 tRNA 稳定性和与真核转化机械的相容性。我们最近的工作30中描述了有关 tRNA 设计的所有详细信息。在图 2A中描述了典型的结果: 不同的 tRNAs 给出了不同的抑制效率, 这清楚地反映在测量荧光量中。生物 triplicates 的小误差条表明, 这些值具有很高的重现性。在第二位, E2AziRS2651的两个基因变体, 其中包含了照片交联剂 p 叠氮基 (Azi), 被评估。E2AziRS 是从大肠杆菌TyrRS 派生的。一个基因变体使用本机大肠杆菌密码子的用法, 而第二个是密码子-优化用于在智人。荧光分析表明, 密码子优化的变体提供更高的蛋白质产量 (图 2B)。最后, 比较了 bioorthogonal 中不同氨基酸的加入率 (图 2C)。此处介绍的所有 ncAAs (BCNK、TCO * K 和 SCOK) 均由相同的正交 MbPylRSAF/tRNAPyl 对组成。赖氨酸 (Z) 也被这对合并, 并作为一个积极的控制。为了说明荧光检测的可靠性, 对 GPCR CRF1R 进行了平行的 ncAA 合并实验。进行了西方污点分析以估计 GPCR 表达式 (图 2B, C)。用 CRF1R 观察了荧光法中 EGFP 的相同趋势。值得注意的是, 当使用密码子优化的 E2AziRS 基因与原生基因相比, Azi 在 CRF1R 中的应用得到了高度提高, 这表明即使根据荧光分析, 对可溶性蛋白 (EGFP) 的 1.5-2 倍的适度改善也可以对更具挑战性的膜蛋白表达水平的影响更大 (图 2B)。作为一般说明, 关于每个应用程序使用的 tRNA 盒的数量, 在筛选不同的 tRNAs 时, 建议只有一个 tRNA 卡带, 以促进克隆程序。当筛选不同的 ncAARS 或不同 ncAAs 的合并效率由同一正交对, 四串联重复的 tRNA 盒是首选, 以达到最高的收益率的 ncAA 成立。

Azi 的优化系统包括人性化的 E2AziRS 基因被部署到地图 CRF1R 的装订袋, 并定义了5种不同配体的结合路径: 两个肽激动剂 Ucn1 和 CRF, 三肽拮抗因子 Ucn1 (8-40),crf (9-41) 和dFX通用报告格式 (12-41) (图 3)。当接近 GPCR C 总站3334时, Azi 合并的效率以前显示为减少, 但我们的 Azi 合并优化系统使 Azi 突变体与标记站点的可比表达式级别在 GPCR 基因的不同部分 (图 4A)。图 4B中的结果显示了对 CRF1R 的胞外环 2 (ECL2) 和螺旋 V 的筛选, 作为配体结合袋的代表部分。一个带在正确的大小的交联产品表明, 位置是在配体受体复合物的接近度, 即它是结合袋的一部分。多次交联命中被发现与所有配体测试, 揭示了不同的结合模式的肽激动剂和拮抗。值得注意的是, 交联命中的模式提供了有关受体结构元素的信息。一些连续命中, 如观察在 ECL2 (位置 F260-R263 与拮抗剂) 建议一个灵活的循环区域。在螺旋 V (D269/Y270、Y272/Q273、I277) 中发现的每三到四个残滓的模式都指向螺旋结构。屏幕可以扩展到 GPCR 的所有相关域。如果一个3D 结构或受体的分子模型存在, 配体足迹可以通过突出每个配体的交联命中来可视化 (图 5)。

荧光和西方印迹数据 (图 2C) 表明 TCO 是 bioorthogonal 化学的 ncAA, 它通过MbPylRSAF获得最高效率。不同的 PylRS 突变体可能会使其他单击 ncAAs17的合并率更高, 但在本研究中未对它们进行测试。TCO * K 被并入 CRF1R-EGFP 融合蛋白中, 并通过 SPIEDAC 化学 (图 6A) 安装在受体 (图 6B) 上的一个小亮荧光。作为特定标记的证明, 标签的荧光应该只在表达受体的细胞 (图 6B中的绿色细胞) 中可见, 而不是在暗细胞中, 从而在每个实验中提供内部负控制。使用超快 SPIEDAC 化学标记的受体仍在起作用。加入多肽激动剂后, 在细胞质中观察到荧光隔间, 揭示 GPCR 内化的生理过程 (图 6C)。融合 EGFP 的信号在任何时候都与荧光染料进行了局部定位, 确认了 GPCR 的选择性双正交标记。

Figure 1
图 1: 基于荧光的检测方法来评估停止密码子抑制的效率。在 ncAA 的存在下, HEK293 细胞与两种质粒共转染。一种质粒编码为所需的 ncAARS 和抑制 tRNA。第二种质粒编码的 EGFP 基因轴承一个标记停止密码子在一个许可的网站和 mCherry 控制。转染两天后, 全细胞裂解物的绿色和红色荧光测量在一个板块阅读器中。由于 EGFP N 段上游的停止密码子 (灰色) 不是荧光, 全长 EGFP (绿色) 的收益率直接关系到 ncAA 的效率, 而 mCherry (红色) 为规范化提供独立的参考。通过停止密码子抑制的 EGFP 量与常规平移获得的野类 EGFP 量的比值, 给出了正交系统的效率 (无琥珀色抑制)。图是从 Serfling, R. & 硬币修改, 我;将非自然氨基酸纳入哺乳动物细胞表达的蛋白质中, 方法酶学, 2016, 580, 89-107。29复制由 Elsevier 的版权清除中心允许。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 荧光法的代表性应用。(A)筛选 tRNAPyl变体30。HEK293 细胞与报告粒和质粒编码为MbPylRS/tRNA 对 (一个副本 tRNA) 进行了联合转染。条形表示 EGFP 与野生型 EGFP 相比, 从赖氨酸 (中行) 中获得的相对荧光。(B)评估密码子使用对 ncAARS 基因的影响。(左面板)E2AziRS 两种不同基因变体转染细胞的荧光检测。(1) 密码子的使用从大肠杆菌和 (2) 人性化的基因。(右面板)CRF1R95Azi标志的西方污点分析。用抗旗抗体检测全长受体。肌动蛋白β被用作负荷控制。(C)评估为 bioorthogonal 化学设计的三 ncAAs 的并网效率。(左面板)本实验使用的 ncAAs 结构。(1) LysZ, 被用作正控制, (2) BCNK, (3) TCO * K 和 (4) SCOK。(中央小组)用质粒编码转染的 HEK293 细胞的荧光分析MbPylRSAF和四份 tRNA15 从 (a) 到合并 (1)、(2)、(3) 和 (4)。(右面板)CRF1R-FLAG 突变体的印迹分析四 ncAAs 的一个在位置95。肌动蛋白β被用作负荷控制。小组 A 被适应了从 Serfling, R... 设计师 tRNAs 通过 pyrrolysine 系统有效地将非规范氨基酸纳入哺乳动物细胞核酸水库. 46 (1), 1-10 (2018), 并根据创作共享进行复制归因许可证。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: Azi 介导的照片交联映射的示意图表示形式.激活叠氮基功能 (黄色星) 被放置在受体 (灰色) 的一个定义的位置。当叠氮基组靠近束缚配体 (红色) 时, 在紫外线照射下形成共价交联产物 (黄色圆圈表示交联部位)。将叠氮基组纳入受体的不同位置, 揭示了配体的结合面 (紫色), 代表了结合袋。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 将 Azi 在整个 CRF1R 中合并为装订袋的照片交联映射。(A) Azi-CRF1R-FLAG 突变体对野生型受体的表达水平的比较。Azi 合并站点分布在整个受体中, 如顶行所示。裂解物了全细胞的反旗西方印迹。肌动蛋白β被用作负荷控制。(B)显示了用抗 CRF 或 anti-Ucn1 抗体探测的西方印迹。Azi 替换的残余物在上部列被表明。细胞与右侧列出的配体一起孵化, 其次是紫外线照射在 365 nm 和裂解。在10% 页的 deglycosylated 上, 用 PNGase F 对样品进行了解析, 并用西方印迹进行了分析。deglycosylated ligand-CRF1R 复合体以 40 kDa33的明显兆瓦运行。未检测到非交联配体 (兆瓦 ~ 3-4 kDa)。这一数字的两个面板都已从塞德尔, L............。Elife6 10.7554/eLife 27711 并根据创作共享归属许可证进行复制。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:B 类 GPCR CRF1R 上的肽激动剂和拮抗药的脚印.CRF1R 跨膜域的表面表征。CRF1R 在 Azi 取代时交联配体的位置突出。多肽激动剂 crf 和 Ucn1 的脚印突出显示在洋红, 拮抗药 crf (9-41) 和 Ucn1 (8-40) 的脚印在蓝色。拮抗剂dFXCRF (12-41) 的足迹以橙色突出显示。七跨膜螺旋 I-VII 由罗马数字表示。(A, B)从薄膜平面上装订袋的侧面视图。(C)顶部视图进入绑定口袋, 从胞外侧。从塞德尔、L 等方面转载了结构的洞察力, 通过肽类激素在活的人类细胞中活化 B G 蛋白偶联受体。Elife6 10.7554/eLife 27711 并根据创作共享归属许可证进行复制。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: SPIEDAC 在活细胞上标记 CRF1R。(A)应变促进逆电子需求翅果-桤木 cycloaddition (SPIEDAC) 的反应方案: ncAA TCO 的 trans-cyclo-2-octene 组与四嗪类荧光组发生反应。(B、C)HEK293T 表达 CRF1R95 tco-EGFP 的单元格。绿色、红色和蓝色通道的代表性图像。刻度条的大小为10µm. (B)单元格用 tetrazine-Cy3 (1.5 µm) 治疗5分钟。只有表达受体 (绿色) 的细胞才会出现标记 (红色)。(C)单元格用 200 nM Ucn1 处理, 在15分钟后成像, 细胞内囊泡对应于内化受体。小组 B 和 C 被修改从 Serfling, R. 等等设计师 tRNAs 在哺乳动物细胞的 pyrrolysine 系统中有效地纳入非规范氨基酸核酸水库46 (1) 1-10 (2018) (牛津大学出版社) 并且根据创造性的共同性归属执照被复制。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

该协议描述了一个简单而可靠的方法, 以评估正交对的效率, 将 ncAAs 纳入哺乳动物细胞表达的蛋白质。这种方法的主要优点是, 在广泛使用的基于资产管制系统的测试中, 它允许同时准备和测量大量的样本, 并提供了使用普通软件可以轻松分析的数据。在哺乳动物细胞中进行正交对分析的中等吞吐量方法的有效性对于新的正交对的发展和现有的改进是非常重要的。事实上, 不可能通过生成大型随机库和哺乳动物系统中的死/活选择来进行正交对的定向进化。通过在相对较短的时间内进行合理的实验努力, 该化验允许筛选小型图书馆 (数以百计的成员)。通过这种方法筛选合理设计的 tRNA 集, 我们可以生成新的 tRNAs, 大大提高 pyrrolysine 系统30的效率。经典组合 EGFP/mCherry 用于荧光读出, 藉以 EGFP 担当公司效率和 mCherry 的记者作为内部控制。EGFP 记者和 mCherry 控制是在同一质粒, 但嵌入两个单独的表达式磁带轴承两个独立的发起人。这样, mCherry 表达与转染效率和细胞计数有关, 但与 EGFP 表达无关, 从而使被测的绿色荧光可以归一化为红色荧光。这不完全是作为两种蛋白质串联的其他记者的情况, 如 EGFP 标记 mCherry7和 iRFP-GFPY39TAG (iRFP 表示红外荧光蛋白)52。在这种结构中, 两种蛋白质都在相同的 mRNA 转录。在真核生物, 基因轴承过早停止密码子接受监视和退化的废话介导衰变 (反导) 机制53。因此, 记者的序列和控制都是同时退化的, 表达两个基因并不严格独立。其他5455也描述了基于荧光素酶记者的类似化验, 而不是萤光记者。虽然酶发光比荧光测量具有更高的灵敏度, 但后者在不同的细胞批次间表现出更高的重现性。

在使用苛刻的蛋白质靶, 如膜蛋白和低丰蛋白时, 绝对需要在哺乳动物细胞中加入 ncAA 的健壮系统。我们在这里展示了一个优化的正交对, 以强健的结合激活 ncAA Azi 到受体。该系统提供均匀的 Azi 合并率整个受体, 允许系统的照片交联映射整个 GPCR 表面和鉴定的配体结合点。该方法的两个主要优点是可以同时对同一受体进行不同的配体分析, 数据来源于活细胞中的受体, 这补充了从体外方法获得的信息。该方法原则上适用于任何蛋白质靶, 也适用于映射蛋白质-蛋白质相互作用的拓扑。此外, 在相关的复杂3338中, 还可以通过2D 交联到近端氨基酸的针点分子间对, 进一步分析所确定的交联位置子集。这种氨基酸对提供空间限制, 适用于在硅片实验中建立精确的相互作用的分子模型33,38。从有条不紊的角度来看, 值得一说的是, 只有交联实验的积极结果才应该得到考虑。没有交联的位置仍然可以在关键半径从配体。当交联剂引入的突变阻碍了本机的相互作用时, 也可能发生假阴性, 但也会发生, 当这些反应的基团从配体处指向, 或被溶剂淬火, 或经过内交联。该方法的关键部分是如何检测交联的发生。首先, 在 SDS 页上解决了全细胞裂解物, 以分离出与受体没有共价键的配体。其次, 利用抗配体抗体, 通过西方印迹检测共价配体受体复合物。对于多肽配体, 高亲和多克隆抗体的配位是最佳选择。作为一种替代方法, 肽配体可以在允许的位置上配有标志标记, 只要标签通过合适的间隔使反旗抗体进入即可。生物素标签也可以使用, 虽然结果可能很难解释由于背景的内源性生物素化蛋白。小分子配体通常是核素的, 尽管标签标记也可能是56,57。Azi 并入受体的协议也已由其他575859发布。然而, 这些协议涉及使用三种质粒进行 Azi, 而我们使用一个更简单的双粒度系统, 包括一个人性化的 E2AziRS 基因, 它提供了更好的结果, 对于非密码子优化一个 (图 2B)。

现代显微技术需要安装非常明亮和有效的显影到感兴趣的蛋白质, 因为基因编码蛋白显影如经典 EGFP 不适合高端应用。因此, 有一个不断的搜索方法, 使安装有机显影到蛋白质, 这导致了流行的捕捉60和光晕61标签, 在其他人之间的发展。然而, 这种标记仍然有几个 kDa 的大小, 这可能扰乱的功能, 目标蛋白, 并留下相当大的不确定性的确切位置的荧光。以少量氨基酸的极小的大小, tetracysteine 主题代表一个更小的选择为更加精确的标记使用荧光素或试卤灵砷化合物 (闪光, ReAsH)62, 63.虽然此方法已经非常成功地应用于 GPCR 研究64,65,66, 它需要广泛的洗涤步骤与硫醇, 它经常遭受高背景, 并且在任何情况下, 它不允许使用单残留分辨率定位标签。取而代之的是, ncAAs 配备了 bioorthogonal 锚, 提供了在单一氨基酸位置安装荧光标签的可能性, 从而减少了干扰目标蛋白的原生构象和功能的风险。bioorthogonal 化学的最后一代 ncAAs, 就像这里使用的 TCO * K13 , 已在活单元格17,43上直接启用了蛋白质标记。该方法适用于细胞表面的蛋白质靶点, 也可用于胞内靶, 只要合适的细胞渗透性染料可用17,67,68。SPIEDAC 化学是几个数量级更快的关于应变促进叠氮基-炔烃 cycloaddition (SPAAC) 和 Staudinger 贝尔托齐在叠氮化物2, 13.事实上, 已经发布了几个协议, 用于 GPCR 标记的基因注册 Azi, 但它们仅适用于孤立的受体体外37,59,69。相反, 我们在这里演示了平滑 bioorthogonal 标记的功能受体在活细胞。我们的协议类似于现有的协议, 使用相同的化学43,48,70, 但我们优化的 ncAA 合并系统扩大了方法的范围 GPCR 研究。实验过程中的一个关键步骤是选择要与 TCO * K 交换的位置, 因为并不是受体内的所有位置都是允许替代或可用于荧光染料的。因此, 应该在一个初步的屏幕上测试几个位置, 以找到最合适的一个。

总之, 这项工作为 ncAAs 的一般应用提供了工具, 包括应用于挑战受体等蛋白质靶点。我们预计, 光交联映射和 bioorthogonal 标记, 目前 ncAAs 的主要应用 GPCR 研究, 将发现许多未来的应用, 以揭示与配体或其他蛋白质 GPCR 相互作用的拓扑, 并研究 GPCR在活细胞中的结构动力学。

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Disclosures

作者没有要声明的冲突。

Acknowledgments

这项工作是由德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG) 根据赠款 CO822/2-1 (艾美诺特计划) 和 CO822/3-1 到中

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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