사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

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Chemistry

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Summary

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

호박 정지 codon 억제를 통해 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 인공 프로브 및 단백질에 반응 moieties 라이브 셀에 직접 설치 하는 강력한 기술입니다. 각 ncAA 호스트 유기 체로 가져온 전용된 직교 억압-tRNA/아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS) 쌍으로 통합 됩니다. 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다, 하 고 어떤 경우에 만족 될 수 있습니다. 직교 쌍은 AARS 또는 tRNA를 조작 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, tRNA 또는 AARS 큰 라이브러리를 사용 하 여 죽은/살아 선택 방법의 감독된 진화 되지 않습니다 가능한 포유류 세포에서. 여기, 손쉬운 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍 포유류 세포에서의 효율성을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 분석 결과 적당 한 노력으로 적절 한 시간 내 AARS/tRNA 변종의 수백 수만 심사 가능 Pyrrolysine 직교 시스템의 효율성을 크게 향상 시킬 새로운 tRNAs 생성 하는이 분석 결과의 사용 설명, G-단백질의 연구 ncAAs의 응용 프로그램과 함께 결합 수용 체 (GPCRs), 미식 축구에 대 한 개체에 도전 mutagenesis입니다. 첫째, 통합 하 여 체계적으로 수용 체의 세포 외 표면에 걸쳐 사진 가교 ncAA, 그대로 수용 체에 다른 ligands의 바인딩 사이트는 라이브 셀에 직접 매핑됩니다. 둘째는 GPCR에 마지막 세대 ncAAs를 통합 하 여 초고속 촉매 무료 수용 체는 형광 염료와 라벨 시연 되는 bioorthogonal 스트레인 승진 역 Diels 오리 나무 cycloaddition (SPIEDAC) 라이브 셀에 악용. NcAAs 크기에 독립적으로 어떤 단백질에 일반적으로 적용할 수 있는로 방법은 응용 프로그램의 수에 대 한 일반적인 관심의 이다. 또한, 번의 전미 대학 설립 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 쉽게 표준 생화학 실험실에서 수행 됩니다.

Introduction

단백질으로 화학 감지기의 유전 결합 구조와 동적 라이브 셀의 네이티브 컨텍스트에서 직접 단백질 기능 측면의 조사를 용이 하 게 하는 강력한 방법입니다. 요즘, 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs) 가장 이질적인 화학 그룹으로 갖춰진 수백 수 있습니다 site-specifically 통합 단백질 생 합성1,2,,34. 서로 한 crosslinkers 사진5, 사진 갇힌6,7,,89 사진 전환 아미노산10, 등 사진에 민감한 ncAAs 발견 11, 아미노산 베어링 긴장 된 알 켄 및 촉매 무료 bioorthogonal 화학2,12,13,14,15,16 alkynes ,17, dansyl18,19coumarin9,및 prodan20,21 fluorophores, 운반 하는 아미노산 및 아미노산으로 다른 생물 프로브 장착 게시물 변환 수정1,2,3,4,22,23,,2425와 마찬가지로 잘.

유전자는 ncAA의 인코딩는 전용된 아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS)는 동족 억압-tRNA, 일반 ribosomal 합성 중 황색 정지 codon에 번의 전미 대학 통합을 쌍으로 사용 됩니다. ncAARS/tRNA 쌍 호스트 유기 체, 생 쌍 하지 잡담에에서 직교 수 있도록 설계 됩니다. 기술은 간결한 및 진 핵 호스트와 쉽게 적용 포유류 세포에서 잘 설립 이다. 포유류 세포에 있는 번의 전미 대학 설립에 대 한 쌍은 세 가지 주요 직교 시스템에 기반으로: B. stearothermophilus27 (Ec tyrosyl 호박 억압 대장균26 에서 TyrRS를 결합 하 여 tyrosyl 시스템 TyrRS /Bst참 마 쌍), 대장균 leucyl 시스템 (Ec그들/tRNA레이CUA 쌍)6,,1828 그리고 archaeal pyrrolysyl 시스템 (PylRS/tRNA Pyl 쌍)3, 그것에 의하여는 tRNAPyl 천연 호박 억압. 일반적으로, 각 ncAA 전문된 ncAARS에 의해 인식 된다. NcAA의 구조에 따라 일부 synthetases 이상의 ncAA를 받아들일 수 있지만 ncAARS TyrRS, 그들 또는 PylRS의 감독된 진화를 통해 얻어진 다.

직교 쌍 단순히 플라스 미드 벡터를 사용 하 여 셀에 가져오기 됩니다. 가장 일반적이 고 효율적인 플라스 미드는 bicistronic 하 고 모두는 합성 및 직교 쌍29를 형성 하는 tRNA를 인코딩합니다. 두 번째 플라스 미드 인코딩 수정에 대 한 지정 사이트에는 호박 codon 베어링 관심사의 단백질에 대 한 공동 transfected 이다. NcAA는 단순히 셀 성장 매체에 추가 됩니다. 그러나, 다른 전문된 그룹 종종 같은 ncAA의 설립에도 플라스 미드 구조물의 다른 이체를 사용합니다. 구문을 벡터은 합성 유형의 합성 유전자, 발기인 사용, tRNA와 tRNA 식 카세트의 수의 변종에 codon 사용법에 유전자의 배열에서 다르다. 또한, 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다른 synthetases, tRNA, 및 다른 요인30의 품질의 다른 촉매 효율성으로 인해 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 손에 원하는 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 시스템을 선택 하 고 전체 단백질 식이 개선 하는 몇 가지 최적화 단계를 수행 하는 직교 쌍의 효율성을 평가 하는 신속 하 고 안정적인 방법을 갖는 것이 중요 생성합니다.

우리는 간단 하 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍29 (그림 1)의 효율성을 평가 하기 위해 설립. 분석 결과, 세포는 플라스 미드 인코딩을 모두 허용 위치 (EGFP태그)에 황색 정지 codon를 베어링 녹색 형광 단백질에 대 한 인코딩 bicistronic 기자 플라스 미드와 직교 쌍에 대 한 공동 transfected와 mCherry 유전자입니다. 전체 세포 lysates의 빨강과 녹색 형광 96 잘 접시에서 플레이트 리더에 별도 채널에서 읽혀집니다. 빨간 형광의 강도 측정된 샘플 크기 transfection 효율의 직접적인 견적 제공 하는 반면 녹색 형광의 강도 직접 호박 억제의 효율성과 상관 한다. 형광에 따라 유사한 분석 실험에 관하여 보조 셀 정렬 (FACS) 읽기31,32, 밖으로 더 전체 세포 인구에 단백질 식의 즉각적이 고 포괄적인 평가 제공 하는 분석 결과 일반적인 실험 조건의 대표는 쉽게 데이터 수집 및 처리 표준 소프트웨어를 제공 합니다. 전반적으로, 분석 결과의 주요 장점은 샘플의 다 수 매체 동시에 분석할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 억압-tRNAs Pyl 직교 시스템30의 효율성을 개선 하기 위해 합리적으로 설계 된 도서관을 상영 했습니다. 이 작업 수행이 분석 결과 사진-가교 ncAA p-azido-L-페닐알라닌 (매)의 설립에 대 한 직교 쌍의 최적화와의 비교를 포함 하 여 그 응용 프로그램의 예를 보여을 실험 프로토콜을 설명 합니다. 다른 아미노산 (그림 2)의 법인 효율성

지난 년 동안 ncAA 도구 구조를 조사 하기 위해 매우 강력한 입증 된 및 기능적 측면의 G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs)33,34,35,,3637 , 38. 인간, GPCRs 막 수용 체 (800 명)의 대 가족을 형성 하 고 치료 약물에 대 한 주요 목표를 나타냅니다. GPCRs의 직접 구조 특성 아직도 도전 이며 보완적인 생 화 확 적인 방법 그들의 조사에 필요한 높은. 우리 사진 가교 ncAAs GPCR 표면 지도 ligand 바인딩 주머니34를 발견 하 고의 사용을 개척 했습니다. 체계적으로 라이브 포유류 세포에서 직접 GPCR의 전체 juxtamembrane 도메인에 걸쳐 매를 통합 매 관에 대 한 최적화 된 시스템을 사용 하 여, 우리. UV 조사에 따라 매를 covalently 이웃 분자 반응성이 매우 높은 nitrene 종 형성. 리간드를 시스템에 추가 될 때 매 근접 프로브는 수용 체의 위치는 바인딩된 ligand 가까이 서 공개를 제공 합니다. 이 방법에서는, Urocortin (Ucn1) 클래스 B GPCR corticotropin 풀어-팩터 수용 체에 입력 1 (CRF1R)33 neuropeptide 호르몬의 바인딩 모드 처음 공개 됐다. 최근에, 우리는 촉진제와38동일한 수용 체 길 항 근의 고유한 바인딩 패턴 공개는. 유사한 접근은 orthosteric와 다른 펩 티 드 및 다른 GPCRs39,40,,4142에 작은 분자 ligands의 allosteric 바인딩 사이트에 다른 사람에 의해 적용 되었다. 이 원고는 GPCR 표면 사진 가교 매핑에 대 한 우리의 실험실에서 적용 실험 프로토콜을 설명 합니다. 메서드는 비교적 빠르고, 간단 하 고 표준 생화학 실험실에 적용 되도록 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다. 중요 한 것은, 접근 제공 뿐만 아니라 ligand 바인딩 사이트 3D 구조 데이터 부족, 식별 뿐만 아니라 기존의 체 외에 데이터에 post-translationally 완전히 수정 된 수용 체에서 정보를 보완 하기 위해 유용한 도구는 살아있는 세포의 생리 적인 환경입니다.

소설 ncAAs 측면 체인 화학 그룹 초고속 촉매 무료 bioorthogonal 화학에 대 한 적합 한 베어링의 최근 개발은 단백질으로 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 마지막 세대 fluorophores 설치 가능성 열었다 라이브에 직접2,43세포. 이러한 화학 앵커 포함 긴장된 cyclooctyne SCOK14, BCNK12,17, bicyclo [6.1.0] nonyne 및 TCO에 트랜스-cyclooctenes * 다른 ncAAs 중 K13,,1517 norbornene16,17,44 또는 cyclopropene45,46 moiety 은닉. 일반적으로 PylRSAF 로 표시 하는 PylRS의 변형에 의해 부피가 ncAAs bioorthogonal 화학에 대 한 통합 (돌연변이 나타내는 Y271A와 Y349F M. barkeri PylRS에), 뿐만 아니라 다른 임시 진화 ncAARSs17 에 의해 , 44. bioorthogonal 앵커 tetrazine 시 약47 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 몇 분43,48내 높은 라벨 수익률을 제공을 통해 반응. 그러나, 레이블을 GPCRs이 강력한 방법의 응용 프로그램 직교 ncAA 법인 시스템의 낮은 전반적인 효율성 때문 도전 하고있다. 우리의 향상 된 Pyl 시스템을 사용 하 여, 우리 최근 GPCRs 및 초고속 GPCR30라이브 포유류 세포 표면에 라벨에 같은 아미노산의 높은 수율 설립을 증명 하고있다. 레이블이 지정 된 수용 체 그들은 생리 적으로 길 항 제와 수용 체 활성화에 따라 내 면 여전히 작동 했다. Bioorthogonal의 설립에 대 한 실험 프로토콜 GPCRs로 고정 하 고 라벨 다음과 설명. 작은 밝은 fluorophores GPCRs 장비 고급 현미경 기술을 통해 라이브 셀에서 GPCR 구조 역학의 연구 향한 첫 기본 단계입니다.

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Protocol

1. 형광 기반 심사 관 효율성 (그림 1)의

  1. Dulbecco의 수정이 글의 중간에 HEK293 세포 유지 (DMEM; 높은 포도 당, 4mm 글루타민, pyruvate) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 100 µ g/mL 스 보완.
  2. 씨 셀 transfection 전날입니다.
    1. 트립 신/PBS 0.5 m EDTA 보충 0.05%에서 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 분리 합니다. 1 mL 트립 신/EDTA를 사용 하 여 10 cm 요리. 완전 한 매체의 10 볼륨 quench 고 pipetting으로 세포를 resuspend. 서 스 펜 션 hemocytometer49를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
    2. 2 mL 완전 한 성장 매체에 6 잘 플레이트의 당 씨 6.0 × 105 HEK293 세포. 각각 야생-타입 EGFP와 모의 페 샘플에 대 한 샘플, 그리고 2 개의 추가적인 우물의 수로 만큼 웰 스를 준비 합니다.
  3. 현미경 아래에서 합류 (셀에 의해 점령 지역)를 제어 합니다. Polyethyleneimine (페이) 시 약을 사용 하 여 ~ 70% 합류에 셀 transfect
    1. transfection, 이전 1 h 0.25-0.5의 마지막 ncAA 농도 대 한 모든 우물에 갓된 ncAA 재고 솔루션의 적절 한 금액을 추가 m m. 야생-타입 긍정적인 제어 및 세포 성장에 ncAA의 효과 의해 발생할 수 있는 형광 신호에서 차이 방지 하기 위해 모의 transfected 세포를 포함 하 여 모든 우물에 ncAA를 추가 합니다.
      참고: 재고 솔루션을 준비, 0.1-0.5 ncAA 분해 사용 하 여 0.2-0.5 M M NaOH. 그러나, 사용 하기 전에 1 M HEPES (pH 7.4)의 4 개 양에 의해 일부 ncAAs DMSO에 초기 가용 화 및 중화를 필요할 수 있습니다. 일반적으로, 제조 업체는 재고 솔루션을 준비 하는 프로토콜을 권장 합니다.
    2. Microcentrifuge 튜브에 플라스 미드 DNA ncAARS/tRNA 쌍 1 µ g 기자 플라스 미드 DNA (EGFP pcDNA3.0183TAG-mCherry)의 테스트에 대 한 인코딩 1 µ g을 혼합. 별도 튜브에 EGFP 야생-타입 참조를 사용 하 여 동일한 transfection 및 모의 transfection를 준비 합니다.
      참고: NcAARS/tRNA 쌍에 대 한 인코딩을 하는 플라스 미드에 포함 된 tRNA 카세트의 복사본의 수는 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 복제를 촉진 하기 위하여 1 tRNA 복사 것이 좋습니다 다른 tRNAs 심사 때 4 복사본 (이기는 하지만 엄격 하 게 필요 하지 않습니다) 권장 하는 반면 때 테스트 다른 ncAARS 또는 다른 ncAAs 같은 직교 쌍의 관.
    3. 각 튜브를 포함 하는 DNA는 100 µ L 버퍼링 된 식 염 수 (파운드) 20 m m 나트륨 젖 산 pH 4.0 및 150 m m NaCl에 포함 된 젖이 나올 추가 합니다. 짧게 믹스.
    4. 각 관에 파운드에 DNA를 포함 된 추가 페이 µ 1 µ g/L의 6 µ L 파운드에 (비율 PEI/DNA = 3/1 w/w)와 소용돌이 즉시. 10-15 분 RT에서 품 어.
    5. 각 우물에서 400 µ L 셀 매체 고 산도 중화 DNA-페이 혼합물에 추가. 세포에 DNA 혼합물 드리블
      참고: DMEM pH 지시자로 보통 페 놀 레드를 포함 한다. 중화 단계 동안 혼합물을 튜브에 추가 색상 레드 (중립) 노랑 (산 성)에서 변경 됩니다. 비록 산 성 pH에서 DNA 단지 파운드에서 형성 가장 높은 transfection 수익률50제공, (예를 들어 있는 혈 청 무료 DMEM) pH 7.4에 직접 또는 DNA-페이 단지에 형성 수 있습니다. DMEM 양식 DNA 단지를 사용 하는 경우 중화 단계를 1.3.5 건너뜁니다. 어떤 경우에, 복합물을 형성 하는 때 아무 혈 청 혼합물에 존재는 필수적 이다.입니다.
  4. 셀 48 h 후 transfection를 수확.
    1. 매체를 발음 하 고 셀 2 mL 미리 데워 공영 (37 ° C)을 한 번 씻어. PBS 0.5 m EDTA 보충의 800 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 분리 하 고 아래로 pipetting으로 세포를 중단.
    2. 200 µ L PBS 5 mM MgCl2보충을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
    3. 800 x g에서 2 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
      참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 이 경우에, 플래시 동결 액체 N2 에서 펠 릿 고-80 ° C에서 최대 한 달 동안 저장 합니다. 항상 눈 보호 고글을 착용.
  5. 100 µ L 트리 스 세포의 용 해 버퍼를 추가 (50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% 트라이 톤 X-100, 1 mM EDTA와 갓 추가 PMSF) 셀 펠 릿 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어. 세포, 소용돌이 마다 5 분을 촉진 한다.
  6. 4 ° C 및 14000 x g에서 10 분 동안 셀 파편 아래로 회전 블랙 96 잘 접시에는 상쾌한의 90 µ L를 전송. EGFP 및 mCherry 형광 형광 모듈 장착 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.
    참고: EGFP에 대 한 적절 한 여기 및 방출 필터를 사용 하 여 (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) 및 mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). 측정된 EGFP 값 모의 transfected 세포에서 얻은 최소 값과 최대 값은 일반적으로 야생-타입 EGFP에서 얻은 범위를 스팬 것 이다. 악기에서 올바른 측정 창 설정 알아서.
  7. NcAA 관 효율 샘플의 형광 및 야생-타입 EGFP 식에서 얻은 형광 간의 비율로 계산 됩니다. 모든 값은 mCherry 형광을 정규화 됩니다.
    Equation 1

2. 사진-가교 매핑의 Ligand GPCR 상호 작용 (그림 3) GPCRs로 ncAAs의 유전 결합

  1. HEK293T 셀 DMEM 10% (v/v) FBS, 100 U/mL 페니실린과 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 100 µ g/mL 스 보충을 유지 합니다.
  2. 종자 세포 transfection 전날입니다.
    1. 트립 신/PBS 0.5 m EDTA 보충 0.05%에서 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 분리 합니다. 1 mL 트립 신/EDTA를 사용 하 여 10 cm 요리. 완전 한 매체의 10 볼륨 quench 고 아래로 pipetting으로 세포를 resuspend. 서 스 펜 션 hemocytometer49를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
    2. 6 잘 플레이트에 2 mL 완전 한 성장 매체에 잘 당 씨 5.0 x 105 293T 세포. 상영 될 각 위치에 대 한 바인딩 컨트롤33,381 ligand 플러스 하나 잘 당 잘 준비. 야생-타입 (wt) 수용 체와 페를 추가 잘 돌연변이 식 수준 확인을 포함할 수 있음.
  3. 다음날, 현미경 합류 (셀에 의해 점령 지역)을 제어 합니다. 페이 사용 하 여 ~ 70% 합류에 셀 transfect
    1. transfection, 이전 1 h 0.5 m m의 최종 농도에 모든 우물에 매를 추가 합니다.
      1. 매의 0.5 M 재고 솔루션을 준비 합니다. 6 잘 플레이트 당 1.2 mg 매 관으로 무게 및 15 µ 0.5 M L에 녹 NaOH. 1.2 mL 전체 매체에 재고 솔루션을 희석 하 고 각 우물에 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다.
        참고: 모든 실험에 대 한 매의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 아 지 드 moiety 기본적인 pH에 특히 수성 솔루션에는 짧은 반감기가 고 있는 AziRS는 그대로 뿐만 아니라 타락된 형태.
    2. 잘 당 2 µ g DNA의 총 금액을 transfect: 1 µ g의 플라스 미드 베어링 원하는 위치와 직교 쌍 매 (E2AziRS51 와 4 부는 동계어의 전용에 대 한 인코딩을 하는 플라스 미드의 1 µ g에 태그 codon 플래그 태그 GPCR에 대 한 인코딩 억압-tRNA BstYam)33,38.
      참고: 식 수준을 확인 하는 wt 비교를 포함 하 여 때 transfect wt 수용 체에 대 한 플라스 미드 DNA의 낮은 금액. 따라 GPCR, 0.2-0.5 wt 수용 체 수율 비슷한 수준의 돌연변이 플라스 미드의 1.0 µ g으로 인코딩 하는 플라스 미드의 µ g. 동일한 양의 모든 우물, 오르고 모의 (예를 들어 빈 벡터)와 함께 누락 된 DNA에에서 DNA transfect
    3. 1.3.3-1.3.5에 설명 된 대로 진행 합니다.
    4. 48 h 후 transfection 단계 2.4는 ligands의 사진-가교로 진행 또는 직접 수확 및 수용 체 식 확인에 대 한 분석을 위한 2.5 단계로 이동 합니다.
  4. 사진-가교는 ligand의.
    1. 1000 x ligand 재고 솔루션을 준비 합니다. DMSO에 100 µ M의 농도에서 펩 티 드 리간드를 분해.
      참고: Ligand 농도 분리 상수 KD GPCR 리간드 상호 작용에 따라 달라 집니다. 100 x의 마지막 농도 KD 추천입니다. 펩 티 드 ligand 소금 trifluoroacetic 산 (TFA)의 경우는 분자량을 계산할 때 TFA의 무게를 고려 (1 펩 티 드에 기본적인 아미노산 당 x TFA). 또한, 펩 티 드 일반 검 습기에 고려 하십시오. 펩 티 드 분말의 반복된 동결을 방지 하 고 실내 온도 도달 하지 않은 때까지 결코 펩 티 드 컨테이너를 엽니다.
    2. 0.1 %BSA, 0.01%의 구성 된 바인딩 버퍼에 ligand 재고 솔루션 1:1,000 희석 트리톤 X 100, 5 mM MgCl2 HEPES 분리 버퍼 (HDB) 12.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 포함 된-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl 그리고 5 m m KCl. 준비 매 GPCR 돌연변이 당 1 mL. Ligand 솔루션의 1 mL에 셀 매체를 바꿉니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어
      참고: Ligand 활동 및 수용 체 국제화에 대 한 회계 특정 GPCR에 보육 시간을 조정 합니다. 보육 시간 연장 가교 수율 향상 되지 않습니다.
    3. 365에 UV crosslinker에서 20 분 샘플을 비추는 5 x 8 W nm 튜브와 ~ 5cm 거리에 있는 셀에. Pipetting으로 세포를 분리 하 고 1.5 mL 반응 관에 그들을 전송. 800 x g에서 3 분에 대 한 셀을 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.
    4. 분해 효소 억제제 (PI) 1 mL 25 mM EDTA/H2O 50 x 재고 솔루션에 칵테일의 태블릿. Aliquot는 PI 솔루션 재고와-20 ° c.에 그것을 저장합니다 HDB에 1시 25분 50 x 주식 희석과 2의 50 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend PI HDB에 x. 플래시 동결 액체 N2에 셀.
      참고: 눈 보호 고글을 착용. 이 시점에서, 샘플은 최대 한 달 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 2.6 단계로 진행 합니다.
  5. 직접 셀 추수입니다.
    1. 매체 발음 HDB에 0.5 m EDTA m 800 µ L를 추가 합니다. 실시간 또는 얼음에 10 분 동안 품 어.
    2. 아래로 pipetting으로 세포를 분리 하 고 1.5 mL 반응 관에 그들을 전송. HDB에 5 mM MgCl2 의 200 µ L를 추가 합니다. 800 x g에서 3 분에 대 한 셀을 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.
    3. 2의 50 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend HDB에 액체 N2에서 플래시 동결 PI x. 눈 보호 고글을 착용.
      참고: 이 시점에서, 샘플은 최대 1 개월-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  6. 세포 세포의 용 해.
    1. 짧게 30-45 s와 소용돌이 37 ° C에서 물 욕조에 세포를 녹여. 샘플 계속 이제 감기. X g와 4 ° C 10 분 2, 500에 펠 릿 막 상쾌한 cytosolic 단백질의 대량 포함 된 삭제 합니다.
    2. 50 µ L HEPES 세포의 용 해 버퍼 50 mM HEPES HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트라이 톤 X-100, 1.5 m m MgCl2, 1mm EGTA, 1mm DTT와 PI 칵테일 x 갓 추가 2를 포함 하는 펠 릿을 resuspend. 철저 하 게 혼합. 셀 얼음과 소용돌이 매 5 분에 30 분 lyse
    3. 14000 x g에서 10 분 및 4 ° c.에 대 한 셀 파편 아래로 회전 즉시 신선한 반응 관에는 상쾌한 전송.
      참고: 지금 당장 분석으로 진행 합니다. 그러나 lysates-20 ° C에서 저장 될 수 있다,, 모든 동결-해 동 주기는 결과의 품질을 손상.
  7. 서쪽 오 점 분석입니다.
    1. 샘플 준비, 3-5 µ L lysate 고까지 작성 하 7 H2o. 추가 2 µ L 1 M DTT와 µ L, 3 µ L 4 x 샘플 버퍼 63 mM Tris HCl pH 6.8, 2 %SDS, 10% 글리세롤과 0.04 %bromphenol 포함 하는 파란색입니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
    2. 당화 이며 희미 하거나 번 밴드는 GPCR 때 문제, 신호 강도 증가 하는 밴드를 선명 하 게 PNGase f deglycosylate 샘플입니다. 공급 업체의 프로토콜을 따르고 10 µ L의 전체 볼륨에 3-5 µ L lysate 및 deglycosylate를 사용 합니다. 샘플 버퍼 x 3 µ L 4를 추가 합니다.
      참고: 막 단백질은 SDS 페이지 분석에서 해결의 품질을 손상 하는 여러 사이트 및 상태, 당화 종종. 그러나, 식 수준 평가 완전히 당화, 세포 표면에 성숙한 수용 체의 부분 관련이 있기 때문에 반대로 플래그 항 체를 사용 하 여 매 GPCR 돌연변이의 분석을 위해 샘플 deglycosylate 하지 않습니다.
    3. 샘플 표준 SDS-PAGE를 통해 해결 하 고 전송 단백질 PVDF 막 오 점.
      주의: 아크릴은 신경 이다. 장갑과 눈 보호를 착용 하십시오.
    4. RT에 1 시간 또는 하룻밤 TBS T 포함 20 mM Tris HCl ph 7.4, 5% 탈지 우유에 4 ° C에서 막 차단 0.15 M NaCl 및 0.1% Tween 20.
    5. 뒤에 HRP 활용 된 이차 항 체는 안티 리간드 항 체로 막 프로브. TBS T와 사이 세척 매 GPCR 식 수준 감지, 상업 HRP 항 체로 막 프로브 ( 재료의 표참조).
    6. 향상 된 화학 (ECL) 반응 수 제 ECL 시 약을 사용 하 여 수행 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 신호를 감지.

3. 초고속 Bioorthogonal 라이브 포유류 세포에 GPCRs의 라벨

참고: 4 잘 연 발된 coverslips 프로토콜 최적화 (잘 지역 = 2.2 c m2). 다른 잘 크기에 대 한 프로토콜을 적절 하 게 조절 해야 합니다.

  1. 현미경 슬라이드의 표면 코팅입니다. 살 균 후드 아래 모든 절차를 실시 합니다.
    1. 폴 리-D-리 신 hydrobromide 준비 (MW = 500-550 kDa) 50mm borate 버퍼 (pH 8.5)에 1 mg/mL의 농도에서 (PDL) 재고 솔루션. 4 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다. 고정 하지 마십시오.
    2. 25 µ g/mL (작업 솔루션)의 최종 농도에 메 마른 초 순수한 물에는 PDL 재고 솔루션 1시 40분을 희석 한 다음 솔루션 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 필터링 합니다.
      참고: 작업 솔루션 4 ° C에서 최대 3 개월까지 저장할 수 있습니다.
    3. 완전히 PDL 작업 솔루션의 500 µ L와 현미경 슬라이드의 각 우물의 바닥을 커버. RT에서 20 분 동안 incubate 고 발음 PDL 작업 솔루션.
      참고: PDL 작업 솔루션은 최대 3 번까지 사용할 수 있습니다. 솔루션을 다시 사용할 경우, 신선한 무 균 튜브에 코팅된 슬라이드에서 사용 되는 솔루션을 전송 및 튜브를 따라 레이블. 결코 혼합 신선한 솔루션과 재활용된 솔루션.
    4. 각 잘 3 x 린스 ~ 700 µ l 살 균 초 순수한 물 및 적어도 1 h 동안 건조 하자.
      참고: 그것은 매우 PDL 솔루션의 잔류물은 세포에 독성으로 정확 하 게, 우물을 씻어 하는 것이 중요입니다. 코팅된 슬라이드 하거나 사용할 수 있습니다 바로 현미경 검사 법에 대 한 4 ° c.에 최대 1 주일까지 저장
  2. HEK293T 셀 DMEM 10% (v/v) FBS, 100 U/mL 페니실린과 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 100 µ g/mL 스 보충을 유지 합니다.
  3. 종자 세포 transfection 전날입니다.
    1. 트립 신/PBS 0.5 m EDTA 보충 0.05%에서 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 분리 합니다. 1 mL 트립 신/EDTA를 사용 하 여 10 cm 요리. 완전 한 매체의 10 볼륨 quench 고 pipetting으로 세포를 resuspend. 서 스 펜 션 hemocytometer49를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
    2. 잘 당 씨 1.0 x 105 HEK293T 셀 (지역 2.2 ²) 600 µ L에서 염료 완전 한 DMEM 무료.
      참고: 목적, 이미징에 대 한 어떤 염료를 포함 하지 않는 중간에 처음부터 작업을 매우 편리 하다. 염료 무료 DMEM 공식 상업적으로 사용할 수 있습니다.
  4. 현미경 아래에서 합류 (셀에 의해 점령 지역)를 제어 하 고 transfect 세포 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 ~ 70% 합류에.
    1. transfection, 이전 1 시간 준비 신선한 100 m m 재고 솔루션 TCO의 * 0.2 M NaOH에 15% (v/v) DMSO K.
    2. 잘, 당 TCO의 3 µ l을 혼합 * 1 M HEPES pH 7.4의 12 µ L K 재고 솔루션. 부드럽게 최종 TCO에 대 한 솔루션 우물에 추가 * 0.5 m m의 K 농도.
    3. 잘 당 500 ng DNA의 총 금액을 준비 합니다. Microcentrifuge 튜브에 희석 200 pcDNA3.1_CRF1R의 ng-95TAG-EGFP, 200 MbPylRS/tRNA에 대 한 인코딩Pyl 직교 쌍 플라스 미드의 ng (tRNA의 4 개의 카세트M15) 및 100 pcDNA3.1_Arrestin3의 ng 50 µ L 매체 (염료, 혈 청-무료, 무료 항생제 무료) 플라스 미드.
      참고: 일반적으로, Arrestin의 공동 transfection GPCR 국제화를 관찰할 필요는 없습니다. 그러나, 공동 transfecting Arrestin3 속도 CRF1R의 국제화는 많은 돌연변이의 국제화를 분석할 때 매우 편리 하다.
    4. 50 µ L 매체 (염료, 혈 청-무료, 무료 항생제 무료) 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (1 µ g의 DNA의 당 2.5 µ L)의 1.25 µ L를 희석 하 고 DNA 혼합물에 솔루션을 추가 합니다. 즉시 소용돌이를 셀에 실시간 추가 DNA-지질 단지 5-10 분을 품 어 고.
      참고: 우리의 경험에서는, 세포의 형태학 페 페이와 지질에 기초를 둔 transfection 보이는 더 생리에 비해 페 셀을 사용 하 여. 더 높은 transfection 효율을 제공 하는 페이, 지질에 기초를 둔 transfection는 transfect 세포 이미징 실험에 대 한 더 나은 선택 페이 서쪽 오 점, 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 선호 해야 합니다.
  5. 24 시간 후 transfection 레이블 형광 염료 수용 체.
    1. DMSO와 울트라 순수 H2o. 염료 재고 솔루션 얼룩 DNA의 10 mg/mL에 0.5 m m 염료 tetrazine 재고 솔루션을 준비
    2. 1.5 mL 반응 관에 각 우물에서 100 µ L 매체를 전송. 염료 tetrazine 재고 솔루션의 1.8 µ L 및 염료 재고 솔루션 얼룩 DNA의 0.3 µ L를 추가 합니다. 다시 우물에 염료를 포함 하는 매체를 전송 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
      참고: Tetrazine-오렌지-형광 염료는 1.5 µ M의 최종 농도가 있다.
    3. 매체를 발음 하 고 부드럽게 염료의 과잉을 제거 하는 PBS로 두 번 셀 린스. 37 ° c 600 µ L 무료 성장 매체 preheated 완전 한 염료의 추가
  6. 형광 현미경 검사 법 및 수용 체의 국제화
    1. 시각화 표시 수용 체에서 63 x (또는 유사한) GFP에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여 확대 (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), 오렌지 형광 염료 (λabs: 550 nm; λem: 570 nm)와 DNA 얼룩 염료 (λ abs: 350 nm; Λem: 461 nm). 수용 체를 활성화 하기 전에 각 필터와 사진을 찍을.
    2. 200를 사용 하 여 수용 체 국제화 촉진 Ucn1의 nM.
      1. DMSO의 200 µ M의 1000 x Ucn1 재고 솔루션을 준비 합니다.
        참고: 펩 티 드의 용 해도 따라 순수한 물 또는 버퍼에 재고를 준비할 수 있습니다.
      2. 1.5 mL 반응 관에 우물에서 100 µ L 매체를 전송 하 고 펩 티 드 주 작동 근 재고 솔루션의 0.6 µ L를 추가 합니다. 우물에 중간 다시를 전송 합니다.
      3. 국제화는 현미경을 관찰 합니다. 국제화 (시간, 수용 체 및 Arrestins의 overexpression에 따라 10-15 분)의 명확 하 게 감지 발생 후 사진을 찍어 설명한 필터를 사용 하 여.

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Representative Results

형광 분석 결과의 개요는 그림 1에 묘사 된다. 분석 결과 세 가지 응용 프로그램에서 채택 된다. 첫 번째 장소에서 tRNA 변종 Pyl 직교 쌍에 의해 Lys(Boc)의 설립에 대 한 수는 상영 된다. Lys(Boc)은 sterically Pyl 유사 아미노산. Pyl 상용으로, Lys(Boc)는 일반적으로 PylRS에 대 한 표준 기판으로 사용. tRNA를 기반으로하는 스크린된 tRNAsPyl. 각 tRNA 변형을 단일 기지 또는 루프에 합리적으로 tRNA 안정성과 진 핵 변환 기계와의 호환성을 개선 하도록 설계 된 줄기의 기본적인 쌍의 변이 맺는 다. 우리의 최근 작품30tRNA 디자인에 대 한 모든 세부 사항은 설명 합니다. 일반적인 결과 그림 2A에 설명 되어: 다른 tRNAs 줄 다른 억제 효율성 측정된 형광의 양을 명확 하 게 반영 됩니다. 생물 triplicates의 작은 오차 막대 값 높은 재현성을 보여줍니다. 2 위에서는 E2AziRS26,51, 통합 사진-crosslinker p-azido-페 (매), 2 개의 유전자 이체 평가 됩니다. E2AziRS는 대장균 TyrRS에서 파생 됩니다. 한 유전자 변종 고용 네이티브 대장균 codon 사용법, 두 번째는 codon 헤 사피엔스에 사용 하기 위해 최적화 된 반면. 형광 분석 결과 코 돈 최적화 된 변종 높은 단백질 수율 (그림 2B) 제공을 보여줍니다. 마지막으로, bioorthogonal 클릭 화학에 대 한 다른 아미노산의 설립 속도 비교 (그림 2C). 여기에 제시 된 모든 ncAAs (BCNK, TCO * K 및 SCOK) 같은 직교 MbPylRSAF/tRNAPyl 쌍으로 통합 됩니다. Lys(Z)이이 쌍으로 또한 통합 그리고 긍정적인 통제로 사용 되었다. 형광 분석 결과의 신뢰성을 설명 하기 위해 병렬 ncAA 합동 실험 GPCR는 CRF1R에 수행 했다. 서쪽 오 점 분석은 GPCR 식 (그림 2B, C)를 추정 실시 됐다. 동일한 동향 관찰 EGFP 형광 분석 결과에 CRF1R와 함께 관찰 되었다. E2AziRS 유전자 코 돈 최적화도 적당 한 개선의 1.5-2-형광 분석 결과 따라 수용 성 단백질 (EGFP)에 대 한 가질 수 있습니다 보여주는 네이티브 유전자에 비해 사용 하는 경우 매 법인 CRF1R으로 매우 강화 되었다 특히,는 더 많은 도전 막 단백질 (그림 2B) 식 수준에 큰 영향을 미칩니다. 각 응용 프로그램에 사용할 tRNA 카세트의 수에 관하여 일반 노트로 하나만 tRNA 카세트가 복제 절차를 촉진 하기 위하여 다른 tRNAs 심사 때 좋습니다. 다른 ncAARS 또는 다른 ncAAs 같은 직교 쌍에 의해의 결합 효율을 심사, 4 개의 협동 카세트 선호 하는 번의 전미 대학 설립의 가장 높은 수확량을 달성 하는 tRNA의 반복.

Humanized E2AziRS 유전자를 포함 하 여 매 관에 대 한 최적화 된 시스템 바인딩 주머니는 CRF1R의 지도 및 5 다른 ligands의 바인딩 경로 정의 배포: 2 명의 펩 티 드 촉진제 Ucn1 및 CRF, 그리고 3 명의 펩 티 드 길 항 제 Ucn1(8-40), CRF (9-41) 고 dFXCRF(12-41) (그림 3). 매 관 효율 이전 GPCR C-말단33,34에 접근할 때 감소를 표시 했다, 하는 동안 매 법인에 대 한 최적화 된 시스템 수 매-돌연변이 태그 사이트와의 비교 식 레벨 GPCR 유전자 (그림 4A)의 다른 부분에서 그림 4B 에서 결과 extracellular 루프 2 (ECL2)의 심사와 나선 ligand 바인딩 주머니의 대표적인 부분으로 CRF1R V. 가교 제품의 정확한 크기에서 밴드 위치 단지 내에 리간드-수용 체 ligand의 근접에서 속 인 다, 즉 그것은 바인딩 주머니의 일부를 보여준다. 여러 개의 가교 안타 모든 ligands 테스트, 펩 티 드 촉진제와는 길 항 제에 대 한 고유한 바인딩 패턴을 공개와 함께 발견 됐다. 특히, 가교 안타의 패턴은 수용 체의 구조 요소에 대 한 정보를 제공합니다. ECL2 (길 항 제와 함께에서 F260-R263 위치)에 관찰로 연속 안타의 수 유연한 루프 영역을 제안 합니다. 조회 수로 모든 3 ~ 4 잔류물 나선형 구조를 향해 나선 V (D269/Y270 Y272/Q273, I277) 힌트에 발견의 패턴입니다. 화면은 GPCR의 모든 관련 도메인을 확장할 수 있습니다. 3D 구조 나 수용 체의 분자 모델 있으면 ligand 발자국 각 ligand (그림 5)에 대 한 가교 안타를 강조 표시 하 여 구상 될 수 있다.

형광 및 서쪽 오 점 데이터 (그림 2C) 제안 하는 TCO * K는 MbPylRSAF에 의해 높은 효율으로 통합 되 면 bioorthogonal 화학에 대 한 미식 축구. 다른 PylRS 돌연변이 다른 클릭 ncAAs17의 높은 법인 수확량을 줄 수도 있습니다 하지만 그들은이 연구에서 테스트 하지 했다. TCO * K CRF1R EGFP 퓨전 단백질으로 통합 되었다 고 수용 체 (그림 6B)에 작은 밝은 fluorophore SPIEDAC 화학 (그림 6A)를 통해 설치 가능. 특정 라벨의 증거로, 라벨의 형광 표시 되어야 합니다 ( 그림 6B에 녹색 셀) 수용 체를 표현 하는 셀에만 어두운 세포에 따라서 제공 하는 각 실험에서 내부 부정적인 통제. 초고속 SPIEDAC 화학을 사용 하 여 표시 하는 수용 체는 아직도 기능적 이다. 펩 티 드 길 항 제를 추가한 후 형광 구획 GPCR 국제화 (그림 6 c)의 생리 적 과정을 드러내는 cytosol에 걸쳐 관찰 했다. 항상, 확인 하는 GPCR의 선택적 biorthogonal 라벨 형광 염료와 공동 화 된 융합된 EGFP의 신호.

Figure 1
그림 1: 정지 codon 억제의 효율성을 평가 하기 위해 분석 결과 형광 기반. HEK293 세포는 ncAA의 존재 2 개의 플라스 미드와 공동 transfected. 한 플라스 미드 원하는 ncAARS와 억압-tRNA 인코딩합니다. 두 번째 플라스 미드 EGFP 유전자 mCherry 컨트롤과 함께 허용 사이트에 태그 정지 codon를 베어링에 대 한 인코딩합니다. Transfection, 후에 2 일 전체 세포 lysates의 녹색과 적색 형광 플레이트 리더에서 측정 됩니다. EGFP N-세그먼트 업스트림 정지 codon (회색)은으로 형광, 전체 길이 EGFP (녹색)의 수익률 직접 상관 한다 ncAA 관 효율 mCherry (레드)는 독립적인 참조를 정규화. 직교 시스템의 효율성 EGFP 정지 codon 억제를 통해 얻은 양과 야생-타입 EGFP 일반 번역 (호박 억제) 하 여 얻은 금액 사이의 비율에 의해 주어진 다. 그림 Serfling에서 수정 R. 및 동전, 난; 2016, 포유류 세포, Enzymology에 방법으로에서 표현 하는 단백질으로 부자연 스러운 아미노산의 결합 580, 89-107. 29 복제 저작권 클리어런스 센터 Elsevier에 의해 허용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 형광 분석 결과의 대표적인 응용 프로그램. (A) tRNA의 상영Pyl 변종30. HEK293 세포 공동 기자 플라스 미드와 플라스 미드 m bPylRS/tRNA 쌍에 대 한 인코딩 transfected 했다 (한 복사 tRNA). 야생-타입 EGFP에 비해 Lys(Boc)의 설립에서 얻은 EGFP의 상대 형광을 나타내는 막대입니다. NcAARS 유전자 코 돈 사용의 영향을 평가 하는 (B) . (왼쪽된 패널) E2AziRS의 2 개의 다른 유전자 변형 형광 분석 결과 셀의 페. ( 대장균 과 (2) 인간 답게 유전자에서 1) codon 사용법. (오른쪽 패널) CRF1R95Azi의 서쪽 오 점 분석-플래그. 전체 길이 수용 체는 항 기 항 체에 의해 감지 됩니다. 말라 β 제어 로드로 사용 되었다. (C) 3 ncAAs bioorthogonal 화학을 위한 법인 효율성 평가. (왼쪽된 패널) 이 실험에 사용 된 ncAAs의 구조입니다. (긍정적인 통제, (2) BCNK, (3) TCO로 사용 되었다 1) LysZ, * K와 (4) SCOK. (중앙 패널) HEK293 세포의 형광 분석 결과 페는 플라스 미드 통합 MbPylRSAF 를 (A)에서 tRNA15의 4 개의 사본을 인코딩 (1), (2)와 (3) 및 (4). (오른쪽 패널) 서양 가릴 위치 95에서 4 ncAAs 중 베어링 CRF1R 플래그 돌연변이의 분석. 말라 β 제어 로드로 사용 되었다. A 1-10 (2018) Serfling, pyrrolysine 시스템 포유류 세포 핵 산 res. 46 (1)에 의해 정식이 아닌 아미노산의 효율적인 통합 R. 외. 디자이너 tRNAs에서에서 적응 패널과 크리에이 티브 코몬즈에 따라 재생 된다 저작자 표시 라이센스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 매 중재 사진 가교 매핑의 도식 대표. 사진-활성화 azido 기능 (노란색 별표)는 수용 체 (회색) 내에서 정의 된 위치에 배치 됩니다. 화학식 가교 제품 UV 조사에 따라 형성 된다 azido 그룹은 바인딩된 ligand (레드)에 인접 위치 하 고 있으며 때 (노란색 원 표시 가교 사이트). 수용 체의 다른 위치에 azido 그룹의 설립 바인딩 주머니를 나타내는 ligand의 바인딩 표면을 (보라색)를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : CRF1R 바인딩 주머니의 사진-가교 매핑에 걸쳐 매의. (A) 야생-타입 수용 체를 향해 매-CRF1R-플래그 돌연변이의 표현 레벨의 비교. 매 법인 사이트 맨 위 행에 표시 된 대로 전체 수용 체에 걸쳐 배포 됩니다. 전체 세포 lysates의 반대로 플래그 서쪽 오 점 표시 됩니다. 말라 β 제어 로드로 사용 되었다. (B) 어느 안티-CRF와 서쪽 오 점 조사 또는 안티-Ucn1 항 체 표시 됩니다. 매로 대체 하는 잔류물 위쪽 행에 표시 됩니다. 셀 오른쪽에 나열 하는 ligands와 incubated 했다 365 nm 및 세포에서 자외선 조사에 의해 따라. 샘플 10% 해결 했다 deglycosylated PNGase F를 사용 하 여 및 서쪽 blotting에 의해 분석 SDS 페이지. Deglycosylated ligand-CRF1R 복잡 한 ~ 40 kDa33의 명백한 MW에서 실행 됩니다. 비 가교 된 ligand 감지 (MW ~ 3-4 kDa) 되지 않습니다. 이 그림의 두 패널 Seidel, 살아있는 인간 세포에서 펩 티 드 호르몬에 의해 클래스 B G-단백질 결합 수용 체의 활성화로 L. 그 외 여러분 구조상 통찰력에서에서 수정 되었습니다. ㄷ. 6 10.7554/eLife.27711와 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 펩 티 드 촉진제 및 클래스 B GPCR CRF1R에 길 항 근의 발자국. CRF1R 막 횡단 도메인의 표면 표현입니다. CRF1R의 위치는 가교 된 ligand 매에 의해 대체 될 때 강조 표시 됩니다. 펩 티 드 agonists CRF와 Ucn1의 발자국, 자홍색으로 파란색에서 antagonists CRF (9-41) 및 Ucn1(8-40)의 발자국 강조 표시 됩니다. 적 dFXCRF(12-41)의 발자국은 오렌지에는 강조 표시 됩니다. 7 막 횡단 나선 나-7 세는 로마 숫자로 표시 됩니다. (A, B) 막 비행기에서 바인딩 주머니의 측면 전경. (C) extracellular 측에서 바인딩 주머니에 가기. 이 델, 살아있는 인간 세포에서 펩 티 드 호르몬에 의해 클래스 B G-단백질 결합 수용 체의 활성화로 L. 그 외 여러분 구조상 통찰력에서에서 증 쇄. ㄷ. 6 10.7554/eLife.27711와 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : SPIEDAC 라이브 셀에 CRF1R의 라벨. ( A) 스트레인 승진 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition (SPIEDAC)의 반응 계획: ncAA TCO의 트랜스-쿠-2-octene 그룹 * tetrazine 그룹으로 반작용 한다 K fluorophore Cy3에 연결. (B, C) HEK293T 셀 표현 CRF1R95TCO * K-EGFP. 녹색, 빨간색과 파란색 채널의 대표 이미지. 눈금 막대의 크기는 10 µ m. (B) 세포 tetrazine-Cy3 (1.5 µ M) 5 분로 치료 했다. (녹색) 수용 체를 표현 하는 셀만 표시 라벨의 발생 (빨간색). (C) 셀 200로 치료 했다 nM Ucn1 내 면된 수용 체에 해당 하는 15 분 세포내 소포 후 몇 군데 고. Serfling, 포유류 세포 핵 산 res. pyrrolysine 시스템에 의해 정식이 아닌 아미노산의 효율적인 통합 R. 외. 디자이너 tRNAs에서에서 B와 C 패널 수정 46 (1) 1-10 (2018) (옥스포드 대학 압박)와 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

프로토콜에는 포유류 세포에 표현 된 단백질으로 ncAAs의 설립에 대 한 직교 쌍의 효율성을 평가 하기 위해 간단 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과를 설명 합니다. FACS에 따라 널리 사용 되는 분석 실험에이 방법의 주요 장점은 동시 준비 및 샘플의 더 많은 수의 측정을 쉽게 일반 소프트웨어를 사용 하 여 분석 데이터를 제공 합니다. 포유류 세포에서 직교 쌍을 분석 하는 중간 처리 방법의 가용성은 새로운 직교 쌍의 개발과 기존의 것의 개선에 대 한 매우 중요 하다. 사실, 그건 큰 임의의 라이브러리와 죽은/살아 선택의 세대를 통해 직교 쌍의 감독된 진화 포유류 시스템에서 수행할 수 없습니다. 분석 결과 상대적으로 짧은 시간 내에 합리적인 실험적인 노력을 투자 하 여 상영 작은 크기의 라이브러리를 (회원의 수백) 수 있습니다. 이 분석 결과 통해 합리적으로 설계 된 tRNA 세트를 심사 하 여 우리 소설 tRNAs30pyrrolysine 시스템 효율성을 크게 향상을 생성할 수 있습니다. 고전적인 조합 EGFP/mCherry 형광 읽어, 그것에 의하여 EGFP 법인 효율성과 내부 통제로 mCherry의 기자 역할에 사용 됩니다. EGFP 기자와 mCherry 컨트롤 같은 플라스 미드에 숨겨 하지만 두 개의 별도 식 카세트 베어링 2 명의 독립적인 발기인에에서 포함 됩니다. 이 방법에서는, mCherry 식 transfection 효율 및 셀 수에 관한 하지만 EGFP 식의 독립적인 측정된 녹색 형광 빨간색 형광을 정규화 할 수 있습니다 있도록. 이것은 정확히 EGFP-태그-mCherry7 , iRFP-GFP (적외선 형광 단백질을 나타내는 iRFP)와Y39TAG 52등 두 가지 단백질의 협동으로 다른 기자 들의 경우. 이러한 구문에서 두 단백질은 동일한 mRNA 사본에. 진핵생물, mRNAs 조 정지 codons 베어링 난센스 중재 감퇴 (NMD) 메커니즘53감시 및 저하를 겪는 다. 따라서, 모두는 기자와 컨트롤의 순서는 동시에 저하 고 두 유전자의 표정은 엄격 하 게 독립적인. 형광 기자 대신 luciferase 기자에 따라 비슷한 분석 되었습니다54,55다른 사람에 의해 설명. 그러나 효소 발광 형광 측정 보다 더 높은 감도 제공 한다, 다른 셀 배치 사이 높은 재현성 후자 보였다.

포유류 세포에 있는 번의 전미 대학 설립에 대 한 강력한 시스템 같은 막 단백질과 낮은 풍부한 단백질 단백질 목표 요구 작업할 때 절대적으로 필요 합니다. 우리는 여기에 표시 된 사진 다시 ncAA의 강력한 설립에 대 한 최적화 된 직교 쌍 GPCRs에 매. 시스템 전체 GPCR 표면의 체계적인 사진 가교 매핑 및 ligand 바인딩 사이트의 식별을 허용 하는 전체 수용 체를 통해 균질 매 법인 요금을 제공 합니다. 방법의 힘의 두 가지 주요 포인트 동시에 동일한 수용 체에 다른 ligands를 분석할 수 있으며 데이터 생체 외에서 접근에서 얻은 정보를 보완 하는 라이브 세포에 수용 체에서 파생 됩니다. 메서드는 원칙적으로 어떤 단백질 대상에 적용 하 고 또한 단백질 단백질 상호 작용의 토폴로지 지도에 적합. 또한, 가교 된 위치의 식별 된 하위 핀 포인트 intermolecular 쌍 근 아미노산의 연결 된 복잡 한33,382D 가교와 추가로 분석할 수 있습니다. 이러한 아미노산 쌍 상호 작용33,38의 정확한 분자 모델을 만들려고 실리콘에 실험에 적용 되는 공간 제약 조건을 제공 합니다. 조직적 관점에서 가교 실험에서 유일 하 게 긍정적인 결과 고려 되어야 한다 remarking 가치가 있다. Crosslink 하지 않았다 위치는 ligand에서 중요 한 반경 내에서 여전히 수 있습니다. 틀린 네거티브는 crosslinker에 의해 도입 돌연변이 기본 상호 작용을 저해 하지만 가교 moiety ligand에서 점 또는 용 매에 의해 침묵 이다 또는 intramolecular 가교를 겪 습 경우에 발생할 수 있습니다 때 발생할 수 있습니다. 방법의 중요 한 부분 가교의 발생을 감지 하는 방법입니다. 처음에 전체 세포 lysates SDS-covalently 수용 체에 바인딩되지 않은 모든 ligand를 별도의 페이지에 해결 됩니다. 둘째, 화학식 리간드-수용 체 복잡 한 서쪽 blotting 안티 리간드 항 체를 사용 하 여 통해 검색 됩니다. 펩 티 드 ligands에 대 한 높은 선호도 polyclonal 항 체는 리간드에 대 한 제기는 최적의 선택입니다. 대신, 펩 티 드 ligands 장착할 수 있습니다 허용 위치에 플래그 태그와 함께 제공 태그 방지 플래그 항 체 적당 한 스페이서를 통해 액세스할 수 이루어집니다. 비록 결과 배경으로 인해 생 biotinylated 단백질에 의해 해석 하기 어려울 수 있습니다, biotin 태그 또한 사용할 수 있습니다. 작은 분자 ligands는 일반적으로 방사선 태그 라벨도 가능한56,57수 있지만. GPCRs로 매 관에 대 한 프로토콜 되었습니다 또한57,,5859다른 사람에 의해 출판. 그러나 이러한 프로토콜 우리는 비-코 돈-최적화에 대해 더 나은 결과 제공 하는 E2AziRS에 대 한 인간 답게 된 유전자를 포함 하 여 간단 하 게 2-플라스 미드 시스템을 사용 하는 반면 매 법인에 대 한 3 개의 플라스 미드를 사용 하 여를 포함 하는, 하나 (그림 2B).

현대 현미경 기법 같은 고전적인 EGFP 고급 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다 유전자 인코딩된 단백질 fluorophores, 관심사의 단백질에 매우 밝은 하 고 효율적 fluorophores 설치 필요 합니다. 따라서 인기 있는 스냅60 및 다른 사람 사이 헤일로61 태그의 개발을 주도하 고 있다, 단백질에 유기 fluorophores 설치 사용할 수 있는 방법의 지속적인 검색이 이다. 그러나, 이러한 태그는 여전히 대상 단백질의 기능을 교란 하 고는 fluorophore의 정확한 위치에 대 한 꽤 큰 불확실성을 남길 수 있습니다 여러 kDa의 크기가 있다. 몇 가지 아미노산의 최소한의 크기, tetracysteine 모티브 fluorescein 또는 resorufin (플래시, ReAsH) 비소 화합물62,63을 사용 하 여 더 정확한 라벨에 대 한 작은 대안을 나타냅니다. 비록이 방법은 적용 된 매우 성공적으로 또한 GPCR 연구64,,6566, thiols와 광범위 한 세척 단계 필요, 그것은 종종 높은 배경에서 고 어떤 경우에, 그것을 허용 하지 않습니다. 단일 잔류물 해상도 레이블 위치. 대신, ncAAs bioorthogonal 앵커를 갖춘 기본 구조와 대상 단백질의 기능 방해의 위험을 최소화 하는 단일 아미노산 위치에서 형광 라벨 설치의 가능성을 제공 합니다. 마지막 세대 ncAAs bioorthogonal 화학에 대 한 TCO 같은 * K13 여기, 고용 단백질 라이브 셀17,43에 직접 레이블을 사용 하는. 메서드를 제공 하는 적당 한 세포 투과성 염료 사용 가능한17,,6768세포내 표적에 뿐만 아니라 세포 표면에 단백질 대상에 적용 됩니다. 스트레인 승진 azido alkyne cycloaddition (SPAAC)에 SPIEDAC 화학은 몇 배나 더 빨리 그리고 Staudinger Bertozzi ligations 아 지 드에 앵커2,13. 사실, 여러 프로토콜 GPCR 유전자에 라벨 통합 매, 하지만 그들은 격리 GPCRs 생체 외에서37,,5969에 적용 되는 출판 되었습니다. 대신, 우리는 증명 하고있다 여기 bioorthogonal 라이브 셀에 기능 GPCRs의 라벨을 부드럽게. 우리의 프로토콜 같은 화학43,,4870를 사용 하 여 기존 프로토콜 비슷합니다 하지만 최적화 된 ncAA 법인 시스템 GPCR 연구 방법의 범위를 확장. 실험 절차의 중요 한 단계는 TCO와 교환할 위치의 선택 * K, 수용 체 내의 모든 위치는 대체에 대 한 허용 또는 형광 성 염료에 액세스할 수. 따라서, 가장 적합 한 하나를 찾아 초기 화면에서 여러 위치를 테스트 합니다.

결론적으로,이 작품 ncAAs, GPCRs 같은 도전 단백질 대상 응용 프로그램을 포함 하 여의 일반 응용 프로그램에 대 한 도구를 제공 합니다. 우리는 bioorthogonal 라벨, 요즘 GPCR 연구 ncAAs의 주요 응용 프로그램 및 사진-가교 매핑을 많은 미래의 응용 프로그램 두 ligands 또는 다른 단백질 상호 작용 GPCR의 토폴로지를 공개 하 고 GPCR 연구를 찾을 것입니다 예상 라이브 셀에서 구조 역학입니다.

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Disclosures

저자는 선언에 충돌이 있다.

Acknowledgments

이 작품에서 CO822/2-1 (에 미 뇌터 프로그램) 및 CO822/3-1 I.C. 보조금 도이치 가운데 (DFG)에 의해 설립 되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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