Optimera genetiska införlivandet av kemiska sonder till varandra för foto-crosslinking kartläggning och Bioorthogonal kemi i levande däggdjursceller

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En lättköpt fluorescens analysen presenteras för att bedöma effektiviteten av amino-acyl-tRNA-syntetas/tRNA par införliva icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Tillämpningen av ncAAs att studera G-protein kopplade receptorer (varandra) beskrivs, inklusive foto-crosslinking kartläggning av bindande platser och bioorthogonal GPCR märkning på levande celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Genetiska införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) via bärnsten stop kodon dämpning är en kraftfull teknik för att installera konstgjorda sonder och reaktiva delarna på proteiner direkt i den levande cellen. Varje ncAA införlivas genom en dedikerad ortogonala suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) par som importeras in i värd organismen. Inkorporering effektivitet av olika ncAAs kan skilja sig, och vara otillfredsställande i vissa fall. Ortogonala par kan förbättras genom att manipulera de årliga verksamhetsrapporterna eller tRNAen. Dock riktad evolution av tRNA eller AARS använder stora bibliotek och döda/levande urvalsmetoder inte är genomförbara i däggdjursceller. Här presenteras en lättköpt och robust fluorescens-baserad analys att utvärdera effektiviteten i ortogonala par i däggdjursceller. Analysen kan screening tiotals till hundratals AARS/tRNA varianter med en måttlig ansträngning och inom rimlig tid. Användning av denna analys att generera nya tRNAs att avsevärt förbättrar effektiviteten i pyrrolysine ortogonala systemet beskrivs, tillsammans med tillämpning av ncAAs på studiet av G-protein kopplade receptorer (varandra), vilket är en utmaning objekt för ncAA mutagenes. Först, genom att systematiskt införliva en foto-crosslinking ncAA i hela extracellulära ytan av en receptor, bindande platser av olika ligander på intakt receptorn mappas direkt i den levande cellen. Andra, genom att införliva senaste generationens ncAAs i en GPCR, ultrasnabb katalysator-fri receptor märkning med ett fluorescerande färgämne demonstreras, som utnyttjar bioorthogonal stam-främjade inverse Diels-Alder cykloadditionen (SPIEDAC) på den levande cellen. Som ncAAs kan tillämpas generellt på något protein självständigt på dess storlek, är metoden av allmänt intresse för ett antal applikationer. Dessutom ncAA inkorporering kräver inte någon särskild utrustning och utförs enkelt i standard biokemi labs.

Introduction

Genetiska införlivandet av kemiska sonder i proteiner är en kraftfull metod för att underlätta utredningen av strukturella och dynamiska aspekterna av proteinfunktion direkt i det inhemska sammanhanget i den levande cellen. Nuförtiden, kan hundratals icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) utrustade med de mest olikartade kemiska grupperna anläggningsvis införlivas i proteiner av biosyntes1,2,3,4. Mellan dem, en finner ljuskänsliga ncAAs som foto-bindemedel5, Foto-bur6,7,8,9 och foto-omkopplingsbar aminosyror10, 11, aminosyror med ansträngda alkener och alkyner för katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyror som transporterar dansyl18, kumarin9,19och prodan20,21 fluorophores och aminosyror som utrustade med övriga biofysiska sonder som väl som med post translationella modifieringar1,2,3,4,22,23,24,25.

Genetiska kodningen av en ncAA aktiveras som en dedikerad amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) ihopkopplade till en cognate suppressor-tRNA, vilken inlemmar ncAA som svar på en bärnstensfärgad stop kodon under regelbunden ribosomal syntesen. ncAARS/tRNA par är konstruerade så att de är ortogonala i värd organismen, dvs inte cross-talk med endogena paren. Tekniken är väl etablerade både i prokaryota och eukaryota värdar och enkelt tillämpas på däggdjurs celler. Par för ncAA inkorporering i däggdjursceller baseras på tre huvudsakliga ortogonalsystem: det tyrosyl systemet, som kombinerar TyrRS från E. coli26 med en tyrosyl bärnsten suppressor från B. stearothermophilus27 (EG TyrRS /BstYam par), i E. coli leucyl system (EGLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 och archaeal pyrrolysyl systemet (PylRS/tRNA Pyl par)3, whereby tRNAenPyl är en naturlig bärnsten suppressor. I allmänhet är varje ncAA erkänd av en specialiserad ncAARS. Beroende på ncAA struktur erhålls ncAARS genom riktad evolution av TyrRS, LeuRS eller PylRS, även om vissa synthetases kan acceptera mer än en ncAA.

Ortogonala paret importeras in i cellerna genom att bara använda en plasmid vektor. Mest gemensam och effektiv plasmider är bicistronic och koda både för kväveoxidsyntas och den tRNAen bildar den ortogonala par29. En andra plasmid kodning för proteinet av räntebärande en bärnstensfärgad kodon på den plats som utsetts för modifiering är samtidig transfekterade. NcAA är helt enkelt läggas till cell odlingsmedium. Dock använder olika specialiserade grupper ofta olika varianter av Plasmiden konstruktioner även för införlivandet av samma ncAA. Konstruktioner skiljer sig åt i arrangemanget av generna i vektor, typ av kväveoxidsyntas, kodon användning i kväveoxidsyntas genen, promotorn användning, variant av tRNA och antal tRNA uttryck kassetter. Dessutom kan införlivandet effektiviteten i olika ncAAs varierar drastiskt på grund av de olika synthetases, kvaliteten på tRNAen, och andra faktorer30olika katalytiska effektivitet. Därför är det viktigt att ha till hands en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma effektiviteten av en ortogonal par, både att välja det lämpligaste systemet för ett önskat program och utföra vissa optimering steg som förbättrar övergripande proteinuttryck avkastning.

Vi har etablerat en enkel och robust fluorescens-baserad analys för att bedöma effektiviteten av ortogonala par29 (figur 1). I analysen, cellerna är samtidig transfekterade med plasmid kodning för rätvinkliga par, tillsammans med en bicistronic reporter plasmid kodning både för grönt fluorescerande protein med en bärnstensfärgad stop kodon vid en tillåtande position (andraTAG) och den mCherry gen. Röd och grön fluorescens av hela-cell lysates läses i separata kanaler på en tallrik läsare i en plattan med 96 brunnar. Intensiteten på den gröna fluorescensen korrelerar direkt med effektiviteten i bärnsten dämpning, medan intensiteten i röd fluorescens ger en direkt uppskattning av storleken på uppmätta provet och transfection effektivitet. Med avseende på liknande analyser baserat på fluorescens läsa assisterad cell sortering (FACS) upp31,32, analysen ger en omedelbar och omfattande bedömning av proteinuttryck i hela cellen befolkningen, som är mer representativa för vanliga experimentella förhållanden, och erbjuder en lättare datainsamling och bearbetning med standardprogramvara. Övergripande, den största fördelen med analysen är att ett medium till ett stort antal prover kan analyseras parallellt. Med denna analys, har vi ett rationellt designade bibliotek med suppressor-tRNAs att förbättra effektiviteten av Pyl ortogonala systemet30. Detta arbete beskriver det experimentellt protokollet för att utföra denna analys och visar exempel på sin ansökan, inklusive optimering av det ortogonala paret för införlivandet av den foto-crosslinking ncAA p-azid-L-fenylalanin (Azi) och jämförelse av inkorporering effektivitet av olika aminosyror (figur 2).

De senaste åren, ncAA verktyg har visat mycket kraftfullt att undersöka strukturella och funktionella aspekter av G-protein kopplade receptorer (varandra)33,34,35,36,37 , 38. i människor, varandra bildar en stor familj med membranreceptorer (800 medlemmar) och representerar huvudsakliga mål för terapeutiska läkemedel. Direkta strukturell karaktärisering av varandra är fortfarande utmanande och kompletterande biokemiska metoder behövs mycket för deras utredning. Vi har börjat använda sig av foto-crosslinking ncAAs att kartlägga GPCR ytor och upptäck ligand bindande fickor34. Använda vårt optimerade system för Azi iblandning, införlivas vi systematiskt Azi i hela domänen hela juxtamembrane av en GPCR direkt i levande däggdjursceller. Vid UV-bestrålning bildar Azi en mycket reaktiva nitrene arter som kovalent fångar närliggande molekyler. När liganden läggs till systemet, fungerar Azi som en närhet sond att avslöja vilka positioner av receptorn komma nära den bundna liganden. På detta sätt avtäcktes först bindande funktionsläget av neuropeptid hormonet Urocortin I (Ucn1) på klass B GPCR corticotropin-släppa-factor receptor typ 1 (CRF1R)33 . Nyligen, har vi lämnat ut distinkta bindande mönster av agonister och antagonister på samma receptor38. En liknande metod har tillämpats av andra att avslöja orthosteric och Alloster bindningsställen andra peptider och småmolekylära ligander på andra varandra39,40,41,42. Detta manuskript beskriver den experimentellt protokoll tillämpas i vårt labb för foto-crosslinking kartläggning av GPCR ytor. Metoden är relativt snabb och enkel och kräver inte någon särskild utrustning, så att den är tillämplig i standard biokemi labs. Allt metoden erbjuder ett värdefullt verktyg inte bara att identifiera liganden bindande platser där 3D grunddata är knappa, men också att komplettera befintliga in vitro- data med information från fullt post-translationally modifierade receptorer i den fysiologiska miljön i den levande cellen.

Den senaste utvecklingen av Roman ncAAs bär på side chain kemiska grupperna lämplig för ultrasnabb katalysator-fri bioorthogonal kemi har öppnat upp möjligheten att installera senaste generationens fluorophores för super-upplösning imaging i proteiner direkt på levande celler2,43. Sådana kemiska ankare inkluderar ansträngda cyclooctyne SCOK14, etylbicyklo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, och trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 bland andra ncAAs hysa en norbornen16,17,44 eller Otillagade45,46 biexponentiellt. Skrymmande ncAAs för bioorthogonal kemi införlivas genom en variant av den PylRS som brukar betecknas som PylRSAF (som anger mutation Y271A och Y349F i M. barkeri PylRS), as well as vid andra ad hoc- utvecklats ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankare reagerar med tetrazine reagens47 via omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen att ge märkning kickavkastningar inom några minuter43,48. Dock tillämpningen av denna kraftfulla metod till etiketten varandra har varit en utmaning på grund av en låg övergripande effektivitet ortogonala ncAA inkorporering. Med vår förbättrade Pyl-systemet, har vi nyligen visat hög avkastning införlivandet av sådana aminosyror i varandra och ultrasnabb GPCR märkning på ytan av levande däggdjursceller30. Märkt receptorer var fortfarande funktionella, som de internaliserat fysiologiskt vid aktivering av receptorn med en agonist. Det experimentella protokollet för införlivandet av bioorthogonal ankare i varandra och följande märkning steg beskrivs här. Förse varandra med små ljusa fluorophores är det första grundläggande steget mot studiet av GPCR strukturell dynamik i den levande cellen via avancerad mikroskopi tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fluorescens-baserad Screening av inkorporering effektivitetsvinster (figur 1)

  1. Upprätthålla HEK293 celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM; hög glukos, 4 mM glutamin, pyruvat) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2.
  2. Utsäde cellerna dagen innan transfection.
    1. Lossa cellerna för 5 min vid 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS kompletteras med 0,5 mM EDTA. Använd 1 mL Trypsin/EDTA för en 10-cm maträtt. Släck med 10 volymer av komplett medium och resuspendera cellerna genom pipettering. Räkna antalet celler i avstängning med hjälp av en hemocytometer49.
    2. Utsäde 6.0 x 105 HEK293 celler per brunn av 6-väl plattor i 2 mL komplett odlingsmedium. Förbereda så många brunnar som antalet prover, och två ytterligare brunnar för de vildtyp andra och ett mock-transfekterade prov, respektive.
  3. Styra sammanflödet (område ockuperat av cellerna) under ett mikroskop. Transfect celler på ~ 70% sammanflödet med polyethyleneimine (PEI) reagens.
    1. 1h före transfection, Tillsätt lämplig mängd nylagade ncAA stamlösning till alla brunnar för ncAA koncentration på 0,25-0,5 mM. Lägga till ncAA i alla brunnar, inklusive vildtyp positiv kontroll och mock-transfekterade celler, att förhindra skillnader i fluorescens signaler som kan orsakas av effekterna av ncAA på cellulär tillväxt.
      Obs: För att bereda stamlösningar, lös ncAA till 0,1-0,5 M med 0,2-0,5 M NaOH. Vissa ncAAs kan dock kräva inledande lösbarhet i DMSO eller neutralisering av fyra volymer 1 m HEPES (pH 7,4) före användning. Tillverkaren rekommenderar vanligen, ett protokoll för att förbereda en stamlösning.
    2. I en mikrocentrifug rör, blanda 1 µg av plasmid DNA-kodning för ncAARS/tRNA paret att testas med 1 µg av reporter plasmid DNA (pcDNA3.0-andra183TAG- mCherry). I separata rör, förbereda en identisk transfection använder andra vildtyps-hänvisning och en mock transfection.
      Obs: Antal kopior av tRNA kassetten inbäddade i plasmiden kodning för ncAARS/tRNA paret beror på programmet. För att underlätta kloning, 1 tRNA kopia rekommenderas när screening olika tRNAs, medan 4 kopior rekommenderas (om än inte absolut nödvändigt) när antingen testa olika ncAARS eller införlivandet av olika ncAAs av samma ortogonala par.
    3. Varje tub innehåller DNA Tillsätt 100 µL laktat buffrad koksaltlösning (LBS) som innehåller 20 mM natrium laktat vid pH 4.0 och 150 mM NaCl. Blanda kort.
    4. Till varje tub som innehåller DNA i LBS lägga 6 µL av 1 µg/µL PEI LBS (baserat på PEI/DNA = 3/1 w/w) och vortex omedelbart. Inkubera vid RT i 10-15 min.
    5. Ta 400 µL cell medium från varje brunn och lägga till DNA-PEI blandningen att neutralisera pH-värdet. Dribbla DNA blandningen på cellerna.
      Obs: DMEM innehåller vanligtvis fenolrött som pH-indikator. Under neutralisering steg ändras färgen på blandningen i röret från gul (surt) till rött (neutral). Även om bildar DNA komplexen i LBS på sura pH ger den högsta transfection avkastning50, kan DNA-PEI komplex alternativt bildas direkt vid pH 7,4 (exempelvis i serumfritt DMEM). Om du använder DMEM till formuläret DNA komplex, hoppa över steget neutralisering 1.3.5. I alla fall, är det viktigt att det finns inget serum i blandningen när bildar komplexen.
  4. Skörda celler 48 h efter transfection.
    1. Aspirera på medellång och skölj cellerna en gång med 2 mL före värmde PBS (37 ° C). Tillsätt 800 µL av PBS kompletteras med 0,5 mM EDTA och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C. Lossa och avbryta cellerna genom pipettering upp och ner.
    2. Överföra cellsuspensionen i 1,5 mL rör som innehåller 200 µL PBS kompletteras med 5 mM MgCl2.
    3. Centrifugera i 2 min vid 800 x g och Kassera supernatanten.
      Obs: Protokollet kan pausas här. I det här fallet flash-frysa pellets i vätska N2 och förvaras vid-80 ° C i upp till en månad. Alltid skyddsglasögon öga skydd.
  5. Tillsätt 100 µL Tris lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton x-100, 1 mM EDTA och nyligen tillagda PMSF) till cell pellets och inkubera på is i 30 min. För att underlätta Lys, vortex var 5 minut.
  6. Snurra ner cell skräp under 10 minuter vid 4 ° C och 14 000 x g och överföra 90 µL av supernatanten i svart 96 brunnar. Mäta andra och mCherry fluorescens med en Plattläsare utrustad med en fluorescens-modul.
    Obs: Använda lämpliga excitation och utsläpp filter för andra (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) och mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). ANDRA mätvärden kommer att spänna över ett intervall mellan det lägsta värdet som erhålls från mock-transfekterade celler och ett högsta värde som hämtas vanligtvis från vildtyp andra. Ta hand om ställer in fönstret korrekt mätning i instrumentet.
  7. Effektiviteten i ncAA inkorporering beräknas som förhållandet mellan fluorescensen av provet och fluorescensen erhålls från uttrycket av vildtyp andra. Alla värden är normaliserad till mCherry fluorescens.
    Equation 1

2. genetiska införlivande av ncAAs i varandra för foto-crosslinking kartläggning av Ligand-GPCR interaktioner (figur 3)

  1. Upprätthålla HEK293T celler DMEM kompletteras med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2.
  2. Utsäde celler dagen innan transfection.
    1. Lossa cellerna för 5 min vid 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS kompletteras med 0,5 mM EDTA. Använd 1 mL Trypsin/EDTA för en 10-cm maträtt. Släck med 10 volymer av komplett medium och resuspendera cellerna genom pipettering upp och ner. Räkna antalet celler i avstängning med hjälp av en hemocytometer49.
    2. Utsäde 5.0 x 105 293T celler per brunn i 2 mL komplett odlingsmedium i 6 brunnar. För varje position som skall kontrolleras, att förbereda de bindande kontroll33,381 väl per ligand plus en brunn. En extra brunn att vara transfekterade med vildtyp (wt) receptorn kan ingå att kontrollera uttrycket muterade.
  3. Dagen efter, styra sammanflödet (område ockuperat av cellerna) under ett mikroskop. Transfect celler på ~ 70% sammanflödet med PEI.
    1. 1h före transfection, tillsätt Azi alla brunnar till en slutlig koncentration av 0,5 mM.
      1. Förbereda en 0,5 M stamlösning av Azi. Per 6-well platta, väger 1,2 mg Azi i ett rör och lös upp den i 15 µL 0,5 M NaOH. Späd stamlösningen i 1,2 mL komplett medium och tillsätt 200 µL av blandningen till varje brunn.
        Obs: Förbereda en färsk stamlösning av Azi för varje experiment. Det natriumazid biexponentiellt har en kort halveringstid i vattenlösningar, särskilt vid grundläggande pH, och AziRS innehåller intakt men också försämrade form.
    2. Transfect ett totalt belopp på 2 µg DNA per brunn: 1 µg av Plasmiden kodning för den flaggan-märkta GPCR bär en tagg codon på önskad position och 1 µg plasmid kodning för paret ortogonala tillägnad Azi (E2AziRS51 och 4 kopior av besläktat suppressor-tRNA BstYam)33,38.
      Obs: När du inkluderar en wt jämförelse för att kontrollera uttrycksnivåerna, transfect en lägre mängd av plasmid DNA för wt receptorn. Beroende på GPCR, 0,2-0,5 µg av Plasmiden kodning wt receptor avkastning liknande nivåer som 1,0 µg av muterade Plasmiden. Transfect samma mängd DNA i alla brunnar, fylla upp saknas DNA med en mock (till exempel en tom vektor).
    3. Fortsätt som beskrivet i 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 h efter transfection, fortsätta antingen med steg 2,4 för foto-crosslinking av liganderna eller gå till steg 2.5 för direkta skörd och analys för att kontrollera-receptoruttryck.
  4. Foto-crosslinking av liganden.
    1. Förbereda en 1000 x ligand stamlösning. Lös upp peptid liganden vid en koncentration på 100 µM i DMSO.
      Obs: Ligand koncentrationen beror på dissociationskonstant KD ligand-GPCR samspelet. En slutlig koncentration på 100 x KD är rekommendabelt. Om peptid liganden är ett salt av trifluorättiksyra (TFA), överväga vikten av TFA vid beräkning av den molekylära vikten (1 x TFA per grundläggande aminosyra i peptiden). Också överväga att Peptiderna är i allmänhet hygroskopiskt. Undvik upprepad frysning av peptid pulver och öppna aldrig en peptid behållare tills det inte har nått rumstemperatur.
    2. Späd den ligand stamlösning 1:1,000 i bindande buffert bestående av 0,1% BSA, 0,01% Triton-X 100, 5 mM MgCl2 i HEPES dissociation buffert (HDB) som innehåller 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM NaCl och 5 mM KCl. Förbered 1 mL per Azi-GPCR mutant. Ersätta det cell-mediet med 1 mL av liganden lösningen. Inkubera i 10 min vid RT.
      Obs: Justera inkubationstiden till den specifika GPCR, redovisning av liganden kinetik och receptor internalisering. Förlänga inkubationstiden förbättrar inte crosslinking avkastning.
    3. Bestråla proverna för 20 min i en UV crosslinker på 365 nm med 5 x 8 W rör och ~ 5 cm avstånd till cellerna. Lossa cellerna genom pipettering och överföra dem i en 1,5 mL reaktionsröret. Pellet cellerna för 3 min vid 800 x g och Kassera supernatanten.
    4. Lös upp en tablett av proteashämmare (PI) cocktail i 1 mL 25 mM EDTA/H2O göra en 50 x stamlösning. Alikvotens PI stamlösningen och lagra den på-20 ° C. Späd det 50 x lagret 1:25 i HDB och återsuspendera cell pellets i 50 µL av 2 x PI i HDB. Flash-frysa cellerna i vätska N2.
      Obs: Skyddsglasögon öga skydd. Vid denna punkt, kan proverna förvaras vid-80 ° C i upp till en månad. Fortsätt med steg 2,6.
  5. Direkta cellen skörd.
    1. Aspirera medium. Tillsätt 800 µL 0,5 mm EDTA i HDB. Inkubera i 10 min på RT eller på is.
    2. Lossa cellerna genom pipettering upp och ner och överföra dem i en 1,5 mL reaktionsröret. Tillsätt 200 µL av 5 mM MgCl2 i HDB. Pellet cellerna för 3 min vid 800 x g och Kassera supernatanten.
    3. Återsuspendera cell pellets i 50 µL av 2 x PI i HDB och flash frysa i vätska N2. Skyddsglasögon öga skydd.
      Obs: Vid denna punkt, kan proverna förvaras vid-80 ° C i upp till 1 månad.
  6. Cellys.
    1. Tina cellerna i ett vattenbad vid 37 ° C i 30-45 s och vortex kort. Hålla prover kall från nu på. Pellet membran på 2500 x g och 4 ° C i 10 min. avlägsna supernatanten, som innehåller huvuddelen av cytosoliska proteiner.
    2. Återsuspendera pellets i 50 µL HEPES lyseringsbuffert innehållande 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton x-100, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT och nyligen tillagda 2 x PI cocktail. Blanda noggrant. Lysera celler 30 min på is och vortex var 5 minut.
    3. Snurra ner cell skräp för 10 min vid 14 000 x g och 4 ° C. Omedelbart över supernatanten till en färsk reaktionsröret.
      Obs: Fortsätt med analysen direkt. Lysates kan förvaras vid-20 ° C, dock varje frysning-tining cykel försämrar kvaliteten på resultaten.
  7. Western blot analys.
    1. Att förbereda provet, ta 3-5 µL lysate och fylla den upp till 7 µL med H2O. Add 2 µL 1 M DTT och 3 µL 4 x provet buffert som innehåller 63 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol och 0,04% bromphenol blå. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
    2. När GPCR är glykosylerat och svag eller utsmetad band är ett problem, deglycosylate prover med PNGase F att öka signalintensitet och slipa banden. Använd 3-5 µL lysate och deglycosylate i en total volym av 10 µL efter leverantörens protokoll. Tillsätt 3 µL 4 x provet buffert.
      Obs: Membranproteiner är ofta glykosylerat i flera platser och stater, vilket försämrar kvaliteten på upplösning i SDS-PAGE analys. Dock gör inte deglycosylate proverna för analys av uttryck nivån av Azi-GPCR mutanter med anti-Flag antikroppar eftersom det är relevant att utvärdera portion av den fullt glykosylerat, Mogen receptor på cellytan.
    3. Lösa prover via standard SDS-PAGE och blot överföring proteiner till ett PVDF membran.
      Varning: Akrylamid är neurotoxiska. Använd skyddshandskar och ögonskydd.
    4. Blockera membranet för 1 h på RT eller övernattning på 4 ° C i 5% lättmjölk i TBS-T innehållande 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl och 0,1% Tween-20.
    5. Sond membranet med en anti ligand antikropp följt av den sekundära HRP-konjugerad antikroppen. Tvätta i mellan med TBS-T. För att upptäcka vilka uttryck den Azi-GPCR, sond membranet med en kommersiell HRP-antikropp (se Tabell för material).
    6. Utföra förbättrade chemiluminescence (ECL) reaktion med hemmagjord ECL reagens och upptäcka signaler för 5 min i mörker.

3. ultrasnabb Bioorthogonal märkning av varandra på levande däggdjursceller

Obs: Protokollet är optimerad för 4-väl kamrar coverslips (väl område = 2,2 cm2). För olika väl storlekar, måste protokollet skalas med detta.

  1. Ytbeläggning av objektglas. Genomföra hela förfarandet under en steril huv.
    1. Förbereda en poly-D-lysin hydrobromid (MW = 500-550 kDa) (PDL) stamlösning i en koncentration av 1 mg/mL i 50 mM Borat buffert (pH 8,5). Förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader. Får ej frysas.
    2. Späd PDL stamlösning 1:40 i Sterilt ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 25 µg/mL (fungerande lösning) och filtrera lösningen genom ett 0,22 µm sterila filter.
      Obs: Arbetslösning kan lagras vid 4 ° C i upp till 3 månader.
    3. Helt täcka botten av varje brunn av mikroskopi bilden med 500 µL av PDL fungerande lösning. Inkubera i 20 min på RT och aspirera PDL arbetslösning.
      Obs: PDL arbetslösning kan användas upp till tre gånger. Om lösningen måste återanvändas, överföra används lösningen från belagda bilderna till en färsk sterilt rör och Märk röret med detta. Blanda aldrig återvunnet lösningen med färsk lösning.
    4. Skölj varje väl 3 x med ~ 700 µl Sterilt ultrarent vatten och låt torka i minst 1 h.
      Obs: Det är mycket viktigt att skölja brunnarna exakt, som rester av PDL lösningen är giftiga för cellerna. Belagda bilderna kan användas direkt för mikroskopi eller förvaras i upp till en vecka vid 4 ° C.
  2. Upprätthålla HEK293T celler DMEM kompletteras med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2.
  3. Utsäde celler dagen innan transfection.
    1. Lossa cellerna för 5 min vid 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS kompletteras med 0,5 mM EDTA. Använd 1 mL Trypsin/EDTA för en 10-cm maträtt. Släck med 10 volymer av komplett medium och resuspendera cellerna genom pipettering. Räkna antalet celler i avstängning med hjälp av en hemocytometer49.
    2. Utsäde 1,0 x 105 HEK293T celler per brunn (område 2.2 cm²) i 600 µL dye fri komplett DMEM.
      Obs: För imaging ändamål, är det mycket bekvämt att arbeta från början i ett medium som inte innehåller något färgämne. Dye gratis DMEM formuleringar är kommersiellt tillgängliga.
  4. Styra sammanflödet (område ockuperat av cellerna) under ett mikroskop och transfect cellerna på ~ 70% sammanflödet med ett lipid-baserade transfection reagens.
    1. 1 h före transfection, förbereda en fräsch 100 mM stamlösning av TCO * K i 0.2 M NaOH och 15% (v/v) DMSO.
    2. Per brunn, blanda 3 µl av TCO * K stamlösning med 12 µL av 1 M HEPES pH 7,4. Försiktigt lägga till lösningen till brunnarna för en sista TCO * K koncentration av 0,5 mM.
    3. Förbereda ett totalt belopp på 500 ng DNA per brunn. I en mikrocentrifug rör, späd 200 ng av pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-andra, 200 ng av Plasmiden kodning för den MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonala par (fyra kassetter av tRNAM15) och 100 ng av pcDNA3.1_Arrestin3 plasmid i 50 µL medium (färgämne gratis, serum-fri, antibiotikum gratis).
      Obs: Samtidig transfection av Arrestin är i allmänhet inte nödvändigt att iaktta GPCR internalisering. Dock snabbar Co transfecting Arrestin3 upp internaliseringen av CRF1R, vilket är mycket praktiskt när man analyserar internalisering av många mutanter.
    4. Späd 1,25 µL av lipid-baserade transfection reagens (2,5 µL per 1 µg av DNA) i 50 µL medium (färgämne gratis, serum-fri, antibiotikum gratis) och tillsätt lösningen till DNA blandningen. Vortex omedelbart och inkubera 5-10 min på RT. Lägg till DNA-lipid komplex till cellerna.
      Obs: Vår erfarenhet transfekterade morfologi av celler med lipid-baserade transfection ser mer fysiologiska jämfört som celler transfekterade med PEI. Som PEI ger högre transfection effektivitet, att PEI föredra för nedströms tillämpningar som Western blot, lipid-baserade transfection är ett bättre val till transfect celler för imaging experiment.
  5. 24 h efter transfection, etikett receptorn med fluorescerande färgämnen.
    1. Förbereda en 0,5 mM dye-tetrazine stamlösning i DMSO och en 10 mg/mL av DNA färgning dye stamlösning i ultrarent H2O.
    2. Överföra 100 µL medium från varje brunn i en 1,5 mL reaktionsröret. Lägg till 1,8 µL dye-tetrazine stamlösning och 0,3 µL av DNA färgning dye stamlösning. Överföra det medium som innehåller färgerna tillbaka till brunnen och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
      Obs: Tetrazine-orange-fluorescerande färgämne har en slutlig koncentration på 1,5 µM.
    3. Aspirera på medellång och skölj försiktigt cellerna två gånger med PBS ta bort överflödig färg. Lägga till 600 µL av komplett dye gratis odlingsmedium förvärmd till 37 ° C.
  6. Fluorescence mikroskopi och receptor internalisering.
    1. Visualisera de märkta receptorerna under 63 x (eller liknande) förstoring med filter lämpliga för god Jordbrukarsed (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), orange fluorescerande färgämne (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) och DNA färgning färgämne (λ ABS: 350 nm. Λem: 461 nm). Ta en bild med varje filter innan aktivering av receptorn.
    2. Främja receptor internalisering med 200 nM Ucn1.
      1. Bered en 1000 x Ucn1 lager av 200 µM i DMSO.
        Obs: Beroende på lösligheten av peptiden, kan du att kunna förbereda beståndet i rent vatten eller buffert.
      2. Överföra 100 µL medium från en brunn i en 1,5 mL reaktionsröret och tillsätt 0.6 µL av peptid agonist stamlösning. Överföra de medelstora tillbaka i brunnen.
      3. Iaktta internalisering under mikroskopet. Ta bilder efter klart påvisbara förekomsten av internalisering (10-15 min till timmar, beroende på receptorn och överuttryck av Arrestins) med hjälp av filter som tidigare nämnts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skissera av fluorescens analysen avbildas i figur 1. Analysen är anställd i tre program. I första hand undersöks ett antal tRNA varianter för inkorporering av Lys(Boc) av Pyl ortogonala paret. Lys(BOC) är en aminosyra som är koalisera liknar Pyl. Eftersom Pyl inte är kommersiellt tillgängliga, används ofta Lys(Boc) som standard substrat för PylRS. De kontrollerade tRNAsna är baserade på tRNAenPyl. Varje tRNA-variant bär mutationer av enstaka baser eller bas-par i slingor och stjälkar rationellt för att förbättra tRNA stabilitet och kompatibilitet med eukaryota translationell maskiner. Alla detaljer om tRNA design beskrivs i vår senaste arbete30. Typiska resultat beskrivs i figur 2A: olika tRNAs ge olika dämpning effektivitet, vilket speglas tydligt av mängden uppmätt fluorescens. De små felstaplarna av biologiska exemplar visar att värdena är mycket reproducerbara. Tvåa utvärderas två genvarianter av den E2AziRS26,51, vilken inlemmar den foto-crosslinker p-azid-Phe (Azi). E2AziRS är härlett från det E. coli TyrRS. En Genvariant sysselsatt infödd E. coli kodon användning, medan andra var kodon-optimerad för användning i H. sapiens. Fluorescens analysen visar att den kodon-optimerade varianten ger högre protein avkastning (figur 2B). Slutligen iblandningen av olika aminosyror för bioorthogonal Klicka kemi är jämfört (figur 2 c). Alla de ncAAs som presenteras här (BCNK, TCO * K och SCOK) införlivas genom samma ortogonala MbPylRSAF/tRNAPyl par. Lys(Z) är också införlivat genom detta par och användes som positiv kontroll. För att illustrera fluorescens analysens tillförlitlighet, utfördes parallella ncAA inkorporering experimenten på en GPCR, CRF1R. Western blot analys genomfördes för att uppskatta GPCR uttryck (figur 2B, C). De samma trender som observerats med andra i fluorescens-analysen observerades med CRF1R. Särskilt, Azi införlivande i CRF1R var mycket bättre när du använder kodon-optimerade E2AziRS genen jämfört med infödda genen, visar att även en måttlig förbättring av 1,5-2-faldig för ett lösligt protein (andra) enligt fluorescens analysen kan ha en större påverkan på nivån uttryck av mer utmanande membranproteiner (figur 2B). Som allmän anmärkning, med avseende på antalet tRNA kassetter som ska användas för varje ansökan, rekommenderas endast en tRNA kassett när screening olika tRNAs syfte för att underlätta kloning. När screening antingen olika ncAARS eller inkorporering effektivitet av olika ncAAs av samma ortogonala par, repetitioner fyra tandem av den tRNA kassett är att föredra att uppnå den högsta möjliga avkastningen för ncAA inbyggnad.

Det optimerade systemet för Azi inkorporering inklusive humaniserad E2AziRS genen har distribuerats för att mappa bindande fickan på CRF1R och definiera bindningssökvägar av 5 olika ligander: de två peptid agonister Ucn1 och CRF och de tre peptid antagonister Ucn1(8-40), CRF (9-41) och dFXCRF(12-41) (figur 3). Medan effektiviteten av Azi inkorporeringen var tidigare visat att minska när du närmar dig den GPCR C-terminus33,34, gör vårt optimerade system för Azi iblandning jämförbara nivåer av Azi-mutanter med tagg-platser i olika delar av GPCR genen (figur 4A). Resultaten i figur 4B visar screening av extracellulära slingan 2 (ECL2) och helix V av CRF1R som en representativ del av ligand-bindande fickan. Ett band på rätt storlek av crosslinking produkten avslöjar att ståndpunkten ligger i närheten av liganden inom ligand-receptor komplex, dvs det är en del av bindande fickan. Flera crosslinking träffar hittades med alla ligander testade, avslöjar distinkta bindande mönster för de peptid-agonister och antagonister. Särskilt, ger mönstret av crosslinking träffar information om strukturella element av receptorn. Ett antal successiva träffar, som observerats i de ECL2 (positioner F260-R263 i kombination med antagonister) föreslår en flexibel loop region. Ett mönster av träffar varje tre till fyra rester som hittade i helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) tips mot en spiralformade struktur. Skärmen kan utvidgas till alla berörda områden av GPCR. Om en 3D-strukturen eller en molekylär modell av receptorn finns, kan ligand fotspår visualiseras genom att belysa crosslinking träffar för varje ligand (figur 5).

Både fluorescens och Western blot data (figur 2 c) tyder på att TCO * K är ncAA för bioorthogonal kemi som får införlivas med högsta möjliga effektivitet genom de MbPylRSAF. Olika PylRS mutanter kan ge högre inkorporering avkastning andra Klicka ncAAs17, men de testades inte i denna studie. TCO * K införlivades i ett CRF1R-andra fusionsprotein och aktiverad installation via SPIEDAC kemi (figur 6A) en liten ljusa fluorophore på receptorn (figur 6B). Som ett bevis för särskild märkning, fluorescensen av etiketten bör vara synlig endast i celler som uttrycker receptorn (gröna celler i figur 6B) och inte i mörka celler, som alltså ger en inre negativ kontroll i varje experiment. Receptorer som märkt med ultrasnabb SPIEDAC kemi är fortfarande funktionell. Efter tillägger en peptid-agonist, observerades fluorescerande fack i cytosolen, avslöjar den fysiologiska processen av GPCR internalisering (figur 6 c). Signalerar av den smält andra co lokaliserade med den fluorescerande färgämnen vid alla tillfällen, bekräftar selektiv biorthogonal märkning av GPCR.

Figure 1
Figur 1: fluorescens-baserad analys att utvärdera effektiviteten i stop kodon dämpning. HEK293 celler är samtidig transfekterade med två plasmider i närvaro av ncAA. En plasmid kodar för önskad ncAARS och suppressor-tRNA. Andra plasmiden kodar för den andra genen bär ett TAG stop kodon på en tillåtande plats tillsammans med en mCherry kontroll. Två dagar efter transfection, de gröna och röda fluorescensen av hela-cell lysates mäts i en spektrofotometer. Som andra N-segmentet uppströms den stop-kodon (grå) inte är fluorescerande, avkastningen av fullängds andra (grön) direkt korrelerar till effektiviteten i ncAA införlivande, medan mCherry (röd) ger en oberoende referens för normalisering. Effektiviteten i det ortogonala systemet ges av förhållandet mellan mängden andra erhålls via stop kodon dämpning och mängden vildtyp andra erhålls genom regelbundna översättning (ingen bärnsten dämpning). Figuren är modifierad från Serfling, R. & mynt, jag; Införlivande av onaturliga aminosyror i proteiner som uttrycks i däggdjursceller, metoder inom enzymologi, 2016, 580, 89-107. 29 reproduktion till5Ats av den Copyright Clearance Center av Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representativa tillämpningar av fluorescens analysen. (A) Screening av tRNAPyl varianter30. HEK293 celler var samtidig transfekterade med reporter plasmid och plasmider kodning för paret MbPylRS/tRNA (en kopiera tRNA). Staplarna representerar den relativa fluorescensen av andra erhållits från införlivandet av Lys(Boc) jämfört med vildtyp andra. (B) utvärdera påverkan av kodon-användning för ncAARS gener. (till vänster) Fluorescens haltbestämning av celler transfekterade med två olika genvarianter av E2AziRS. (1) kodon användning från E. coli och (2) humaniserad genen. (höger panel) Western blot analys av CRF1R95Azi-flagga. Fullängds receptorn detekteras av en anti-Flag antikropp. Aktin β användes som laddar kontroll. (C) utvärdera inkorporering effektiviteten i tre ncAAs avsedd för bioorthogonal kemi. (till vänster) Strukturer av ncAAs som används i detta experiment. (1) LysZ, som användes som positiv kontroll, (2) BCNK, (3) TCO * K och (4) SCOK. (central panel) Fluorescens haltbestämning av HEK293 celler transfekterade med en plasmid kodning för MbPylRSAF och fyra kopior av tRNA15 från (A) för att införliva (1), (2), (3) och (4). (höger panel) Western blot analys av en CRF1R-flaggan mutant försedd med en av de fyra ncAAs på position 95. Aktin β användes som laddar kontroll. Panel A anpassades från Serfling, R. et al. Designer tRNAs för effektiva införlivandet av icke-kanoniska aminosyror genom det pyrrolysine systemet i däggdjursceller nukleinsyror Res. 46 (1), 1-10 (2018) och återges enligt Creative Commons Attribution license. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Schematisk representation av Azi-medierad foto-crosslinking kartläggning. En foto-activatable azid funktion (gul stjärna) placeras i en definierad position inom receptorn (grå). När gruppen azid ligger proximalt till den bundna liganden (röd), en kovalent crosslinking produkt bildas vid UV-bestrålning (gul cirkel anger crosslinking webbplats). Införlivandet av gruppen azid i olika positioner av receptorn avslöjar bindande ytan (lila) av liganden, vilket utgör bindande fickan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Införlivandet av Azi i hela CRF1R för foto-crosslinking mappning av bindande fickan. (A) jämförelse av uttrycksnivåerna för Azi-CRF1R-flaggan mutanter mot vildtyps-receptorn. Azi inkorporering webbplatser distribueras i hela hela receptorn som anges i den översta raden. ANTI-Flags Western blotting av hela-cell lysates visas. Aktin β användes som laddar kontroll. (B) Western blotting utforskad med antingen anti-CRF eller anti-Ucn1 antikroppar visas. Restprodukterna ersättas med Azi indikeras i den övre raden. Cellerna inkuberades med de ligander som anges till höger, följt av UV-bestrålning på 365 nm och Lys. Proverna var löst på 10% SDS-PAGE, deglycosylated med PNGase F och analyseras av Western blotting. Deglycosylated ligand-CRF1R anläggningen körs på en uppenbar MW ~ 40 kDa33. Icke-tvärbunden liganden är inte upptäckta (MW ~ 3-4 kDa). Båda panelerna av denna siffra har ändrats från Seidel, L. et al. Structural inblick i aktiveringen av en klass B G-protein-kopplade receptor av peptidhormoner i levande mänskliga celler. Clivet. 6 10.7554/eLife.27711 och är återges enligt licensen Creative Commons Attribution. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Fotspår av peptid agonister och antagonister i klassen B GPCR CRF1R. Yta representation av CRF1R transmembrana domänen. Positioner CRF1R det tvärbundna liganden när ersättas av Azi är markerade. Fotspår av en peptid-agonister CRF och Ucn1 markeras i magenta, fotspår av antagonists CRF (9-41) och Ucn1(8-40) i blått. Fotavtryck av den antagonist dFXCRF(12-41) är markerad i orange. De sju transmembrana spiraler I-VII indikeras med romerska siffror. (A, B) Sidoutsikt över bindande fickan från membran planet. (C) Top view i bindande fickan från den extracellulära sidan. Särtryck ur Seidel, L. et al. Structural inblick i aktiveringen av en klass B G-protein-kopplade receptor av peptidhormoner i levande mänskliga celler. Clivet. 6 10.7554/eLife.27711 och är återges enligt licensen Creative Commons Attribution. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : SPIEDAC märkning av CRF1R på levande celler. (A) reaktionsformel av den stam-främjade inverse elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen (SPIEDAC): trans-cyclo-2-octene gruppen av ncAA TCO * K reagerar med gruppen tetrazine kopplade till fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T celler som uttrycker CRF1R95TCO * K- andra. Representativa bilder av den gröna, röda och blå kanalen. Storleken på skalstapeln är 10 µm. (B) celler behandlades med tetrazine-Cy3 (1,5 µM) för 5 min. Endast celler som uttrycker receptorn (grön) visar förekomst av märkning (röd). (C) celler behandlades med 200 nM Ucn1 och avbildas efter 15 min. intracellulära blåsor motsvarar internaliserade receptorn. Paneler B och C är modifierad från Serfling, R. et al. Designer tRNAs för effektiva införlivandet av icke-kanoniska aminosyror genom det pyrrolysine systemet i däggdjursceller Nukleinsyra Res. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) och är återges enligt licensen Creative Commons Attribution. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs ett enkelt och tillförlitligt test för att bedöma effektiviteten av ortogonala par för införlivandet av ncAAs i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Den största fördelen med denna metod i respekt till utbredda analyser baserat på FACS är att den tillåter samtidig beredning och mätning av större antal prover och ger data som analyseras enkelt med en vanlig programvara. Tillgången på en medium-genomströmning metod att analysera ortogonala par i däggdjursceller är mycket viktigt för utvecklingen av nya ortogonala par och förbättring av befintliga. Det är faktiskt inte möjligt att utföra riktad evolution av ortogonala par via generationen av stora slumpmässiga bibliotek och döda/levande urval i däggdjur system. Analysen kan screening liten storlek bibliotek (hundratals medlemmar) genom att investera en rimlig experimentella insats inom en relativt kort tid. Av screening rationellt designade tRNA uppsättningar via denna analys, kan vi generera roman tRNAs att avsevärt ökar effektiviteten av pyrrolysine system30. Den klassiska kombinationen andra/mCherry används för den fluorescerande avläsningssystem, whereby andra serverar som reporter inkorporering effektivitets-och mCherry som den interna kontrollen. ANDRA reportern och mCherry kontroll är hyste i samma plasmiden men är inbäddade i två separata uttryck kassetter med två oberoende främjare. På detta sätt mCherry uttryck avser transfection effektivitet och celltal, men är oberoende av andra uttryck, så att den uppmätta grön fluorescensen kan normaliseras mot den röd fluorescensen. Detta är inte exakt fallet med andra reportrar som byggdes som en tandem av de två proteinerna som andra-TAG-mCherry7 och iRFP-GFPY39TAG (med iRFP som betecknar det infraröda fluorescerande proteinet)52. I sådana konstruktioner är båda proteiner på samma mRNA avskriften. I Eukaryoter genomgår mRNA uthärda för tidig stop kodon övervakning och nedbrytning av nonsens-medierad sönderfall (NMD) mekanism53. Därför både sekvensen av reportern och kontroll är samtidigt degraderad och uttrycket av de två generna är inte strikt oberoende. Liknande analyser baserat på luciferas reporter istället för fluorescens reporter har varit beskrivs av andra54,55. Medan enzymatisk luminiscens erbjuder högre känslighet än fluorescens mätningar, visade den senare högre reproducerbarhet mellan olika cell batchar.

Robusta system för ncAA iblandning i däggdjursceller behövs absolut när man arbetar med krävande protein mål som membranproteiner och låg rikligt proteiner. Vi har visat här en optimerad ortogonala par för robust införlivandet av foto-activatable ncAA Azi in i varandra. Systemet ger homogen Azi inkorporering priser i hela hela receptorn som möjliggör systematiska foto-crosslinking kartläggning av hela GPCR ytor och identifiering av liganden bindningsställen. De två stora styrka i metoden är att olika ligander kan analyseras på samma receptor parallellt och att data härleds från receptorn i den levande cellen, som kompletterar information som erhållits från in vitro- metoder. Metoden är i princip tillämplig på alla protein mål, och lämpar sig också för att mappa topologier av protein-protein interaktioner. Dessutom kan den identifierade delmängden av tvärbunden positioner ytterligare analyseras med 2D crosslinking till pin-point intermolekylära par av proximala aminosyror i de associera komplexa33,38. Sådana aminosyra par tillhandahåller rumsliga begränsningar som tillämpas på i silico experiment att bygga exakta molekylära modeller av interaktion33,38. Från metodisk synpunkt är det värt att anmärka att endast positiva resultat från crosslinking experiment bör övervägas. En position som gjorde inte crosslink kan fortfarande vara inom den kritiska radien från liganden. Falska negativa kan uppstå när mutationen infördes genom crosslinker hämmar den infödda interaktionen, men kan också uppstå när den crosslinking biexponentiellt antingen pekar bort från liganden, är kylda av lösningsmedlet eller genomgår intramolekylära crosslinking. En viktig del av metoden är hur att upptäcka förekomsten av crosslinking. I första hand, är hela-cell lysates löst på SDS-PAGE att skilja någon ligand som inte är kovalent bunden till receptorn. För det andra upptäcks det kovalenta ligand-receptor komplexet via Western blotting använder en anti ligand antikropp. För peptid ligander är hög affinitet polyklonala antikroppar mot liganden det optimala valet. Som ett alternativ, kan peptid ligander utrustas med en flagga-tagg på en tillåtande position, förutsatt att etiketten görs tillgänglig för anti-Flag antikroppen genom en lämplig spacer. Biotin taggar kan också användas, även om resultaten kan vara svårtolkade på grund av bakgrunden av endogena biotinylerade proteiner. Liten molekyl ligander är vanligtvis märkt, även om tagg-märkning kan också vara möjligt56,57. Protokoll för Azi införlivande med varandra har varit publicerade också av andra57,58,59. Dock dessa protokoll innebär användning av tre plasmider för Azi införlivande, medan vi använder ett enklare system för två-plasmid, inklusive en humaniserad gen för E2AziRS, vilket ger bättre resultat med avseende på den icke-kodon-optimerade en (figur 2B).

Moderna mikroskopi tekniker kräver installation mycket ljusa och effektiva fluorophores till proteinet av intresse, som genetiskt kodade proteinet fluorophores såsom den klassiska andra inte lämpar sig för avancerade tillämpningar. Därför finns det en kontinuerlig sökning av metoder som möjliggör installation av organiska fluorophores på proteiner, vilket har lett till utvecklingen av den populära SNAPIN60 och Halo61 taggar, mellan andra. Märken har dock fortfarande en storlek på flera kDa, vilket kan störa funktionen i målproteinet och lämna ganska stor osäkerhet om den exakta positionen av fluorophore. Med en minimal storlek av några aminosyror representerar tetracysteine motivet ett mindre alternativ för exaktare märkning med fluorescein eller resorufin arsenical föreningar (FlAsH, ReAsH)62,63. Även om detta synsätt har tillämpats mycket framgångsrikt även GPCR studier64,65,66, det kräver omfattande tvätt steg med tioler, det lider ofta hög bakgrund och i alla fall, det tillåter inte Placera etiketten med enstaka rester upplösning. Istället, ncAAs utrustade med bioorthogonal ankare erbjuder möjligheten att installera fluorescerande etiketter på en enda aminosyra position, vilket minimerar risken att störa den infödda konformation och funktionalitet i målproteinet. Senaste generationens ncAAs för bioorthogonal kemi, tycker TCO * K13 anställd här, har aktiverat protein märkning direkt på levande celler17,43. Metoden är tillämplig på protein mål på cellytan, men också på intracellulära mål, förutsatt att lämplig cell-permeable färgämnen är tillgängliga17,67,68. SPIEDAC kemi är flera storleksordningar snabbare i förhållande till stam-främjade azid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) och Staudinger Bertozzi nering på natriumazid ankare2,13. I själva verket publicerats flera protokoll för GPCR märkning på genetiskt införlivas Azi, men de är tillämpliga endast på isolerade varandra in vitro-37,59,69. I stället har vi visat här jämna bioorthogonal märkning av funktionella varandra på den levande cellen. Våra protokoll är liknande till befintliga protokoll använder samma kemi43,48,70, men vårt optimerade ncAA inkorporering system utökar omfattningen av metoden GPCR studier. Ett avgörande steg i förfarandet för experimentell är valet av ståndpunkten att utbytas med TCO * K, som inte alla positioner inom receptorn är antingen tillåtande för byte eller tillgängliga för den fluorescerande färgen. Flera positioner bör därför testas i en inledande skärm för att hitta den lämpligaste en.

Avslutningsvis presenterar detta arbete verktyg för allmänt tillämpa ncAAs, inklusive ansökan till utmanande protein mål såsom varandra. Vi räknar med att foto-crosslinking kartläggning och bioorthogonal märkning, numera de viktigaste tillämpningarna av ncAAs GPCR studier, kommer att hitta många framtida tillämpningar både att avslöja topologier av GPCR interaktioner med ligander eller andra proteiner och studera GPCR strukturella dynamiken i den levande cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete har grundats av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under bidrag CO822/2-1 (Emmy-Noether program) och CO822/3-1 till I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844, (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38, (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7, (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126, (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132, (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134, (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136, (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128, (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13, (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4, (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134, (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128, (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135, (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131, (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4, (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131, (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13, (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136, (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30, (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3, (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10, (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155, (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117, (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7, (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292, (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289, (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10, (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32, (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49, (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5, (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136, (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283, (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19, (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3, (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2, (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531, (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531, (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137, (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22, (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics