Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Die genetische Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) über Bernstein Stopp-Codon Unterdrückung ist eine leistungsstarke Technik, künstliche Sonden und reaktive Moieties auf Proteine direkt in der live Zelle zu installieren. Jede ncAA ist durch eine spezielle orthogonale Suppressor-tRNA/amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) Paar aufgenommen, die in den Wirtsorganismus importiert wird. Die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs kann stark unterschiedlich und in einigen Fällen unbefriedigend sein. Orthogonale Paare können verbessert werden durch die Manipulation der AARS oder der tRNA. Gerichtete Evolution von tRNA oder AARS mit großen Bibliotheken und tot/lebendig Auswahlmethoden sind jedoch nicht machbar in Säugetierzellen. Hier ist eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu bewerten präsentiert. Der Test ermöglicht screening Dutzende bis Hunderte von AARS/tRNA-Varianten mit mäßigem Aufwand und innerhalb eines angemessenen Zeitraums. Verwendung des Assays neue tRNAs generieren, die deutlich die Effizienz der Pyrrolysin orthogonalen System beschrieben ist, zusammen mit der Anwendung von NcAAs zur Erforschung der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Objekte eine für ncAA Herausforderung sind Mutagenese. Erstens werden durch die systematische Integration eine Foto-Vernetzung ncAA in der extrazellulären Oberfläche eines Rezeptors, Bindungsstellen der verschiedenen Liganden auf den intakten Rezeptor direkt in der live Zelle zugeordnet. Zweite, durch den Einbau von NcAAs der letzten Generation in einem GPCR, ultraschnelle Katalysator-freie Rezeptor Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Farbstoff ist gezeigt hat, nutzt die Bioorthogonal Belastung gefördert inverse Diels Alder Cycloaddition (SPIEDAC) auf die live-Zelle. Wie NcAAs in der Regel auf jedem Protein unabhängig von dessen Größe angewendet werden kann, ist die Methode von allgemeinem Interesse für eine Reihe von Anwendungen. Darüber hinaus ncAA Einarbeitung erfordert keine spezielle Ausrüstung und erfolgt im standard Biochemie Labor.

Introduction

Die genetische Einbeziehung der chemischen Sonden in Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der strukturellen und dynamischen Aspekte der Proteinfunktion direkt im heimischen Kontext der live Zelle zu erleichtern. Heute können Hunderte von nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs), ausgestattet mit den verschiedensten chemischen Gruppen ortspezifisch Proteine durch Biosynthese1,2,3,4integriert werden. Dazwischen findet man lichtempfindliche NcAAs wie Foto-Vernetzer5, Foto-Käfig6,7,8,9 und Foto-schaltbare Aminosäuren10, 11, Aminosäuren mit angespannten Alkenen und Alkinen für Katalysator-freie Bioorthogonal Chemie2,12,13,14,15,16 ,17, Aminosäuren tragen Dansyl18, Cumarin9,19und21 Fluorophore prodan20,und Aminosäuren ausgestattet mit anderen biophysikalischen Sonden als sowie mit den Post translationale Modifikationen1,2,3,4,22,23,24,25.

Die genetische Codierung eine ncAA wird ermöglicht durch eine dedizierte amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) gekoppelt an ein cognate Suppressor-tRNA, die der ncAA in Reaktion auf eine bernsteinfarbene Stopcodon während der regelmäßige ribosomale Synthese enthält. NcAARS/tRNA-Paare sind so konstruiert, um im Wirtsorganismus, d. h. nicht mit den endogenen paar Übersprechen orthogonal sein. Die Technik ist gut etabliert, sowohl in prokaryotischen und eukaryotischen Gastgeber und leicht anwendbare, Säugetier-Zellen. Paare zum ncAA Einbau in Säugerzellen basieren auf drei orthogonalen Hauptsysteme: das Tyrosyl-System, das die TyrRS von E. Coli26 mit einem Tyrosyl Bernstein-Schalldämpfer von B. Stearothermophilus27 (EG kombiniert TyrRS /BstYam Paar), die E. Coli Leucyl System (EGLeuRS/tRNALeuCUA Paar)6,18,28 und die Archaeen Pyrrolysyl-System (PylRS/tRNA Pyl Paar)3, wobei die tRNAPyl ist ein natürlicher Bernstein Suppressor. Im Allgemeinen ist eine spezialisierte NcAARS jedes ncAA anerkannt. Abhängig von der Struktur der ncAA erhält man die NcAARS durch gerichtete Evolution von TyrRS, LeuRS oder PylRS, obwohl einige synthetasen mehrere ncAA akzeptieren können.

Das orthogonale Paar wird in die Zellen importiert, indem Sie einfach ein Plasmid-Vektor. Am meisten common und effiziente Plasmide sind Bicistronic und sowohl für die synthestase und die tRNA bilden die orthogonale Paar29zu kodieren. Eine zweite Plasmid-Codierung für das Protein des Interesses trägt eine gelbe Codon am Standort für die Änderung ist Co transfizierten. Die ncAA ist einfach das Wachstumsmedium Zelle hinzugefügt. Jedoch verwenden verschiedene Fachgruppen oft verschiedene Varianten von Plasmid Konstrukte auch für die Aufnahme der gleichen ncAA. Konstrukte unterscheiden sich in der Anordnung der Gene in den Vektor, der synthestase, Codon Usage synthestase gen, Projektträger Nutzung, Variante der tRNA und Anzahl der tRNA Expressionskassetten. Darüber hinaus kann die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs drastisch aufgrund der verschiedenen katalytische Effizienz der verschiedenen synthetasen, die Qualität der tRNA und anderen Faktoren30variieren. Daher ist es wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bewertung der Effizienz eines orthogonalen Pairs, die am besten geeignete System für eine gewünschte Anwendung auswählen und einige Optimierungsschritte durchführen, die Verbesserung der Gesamt-Protein-Expression zur hand zu haben Renditen.

Wir haben eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare29 (Abbildung 1) etabliert. Zellen sind in der Probe Co transfected mit der Plasmid-Codierung für das orthogonale Paar, zusammen mit einem Bicistronic Reporter Plasmid Codierung sowohl für das grün fluoreszierende Protein trägt eine gelbe Stopcodon an einer freizügigen Position (EGFP-TAG) und die mCherry gen. Rote und grüne Fluoreszenz der gesamten Zelle Lysates werden in getrennten Kanälen auf einem Teller-Leser in einer 96-Well-Platte gelesen. Die Intensität der grünen Fluoreszenz korreliert direkt mit der Effizienz der Bernstein Unterdrückung, während die Intensität der rote Fluoreszenz eine direkte Schätzung der Größe der gemessenen Probe und die Transfektion Effizienz gibt. In Bezug auf ähnliche Tests basierend auf Fluoreszenz assistierten Zelle Sortieren (FACS) ausgelesen31,32, Assays gibt eine sofortige und umfassende Bewertung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation, die mehr Vertreter der üblichen experimentellen Bedingungen, und bietet eine einfachere Datenerfassung und Verarbeitung mit standard-Software. Insgesamt ist der Hauptvorteil des Tests, dass ein Medium, um eine große Anzahl von Proben parallel analysiert werden kann. Mit Hilfe dieses Tests, haben wir eine rational konzipierte Bibliothek von Suppressor-tRNAs zur Verbesserung der Effizienz der Pyl orthogonalen System30gezeigt. Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Protokoll zum Durchführen dieser Assay und zeigen Beispiele für seine Anwendung, einschließlich der Optimierung des orthogonalen Paares für die Einbeziehung von der Foto-Vernetzung ncAA p-Azido-L-Phenylalanin (Azi) und den Vergleich der Einbindung Wirkungsgrade verschiedener Aminosäuren (Abbildung 2).

In den letzten Jahren ncAA Werkzeuge sind sehr mächtig, um strukturelle Untersuchung nachgewiesen worden und funktionalen Aspekte des G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. beim Menschen GPCRs bilden eine große Familie von Membranrezeptoren (800 Mitglieder) und Hauptziele für therapeutische Drogen darstellen. Direkte strukturelle Charakterisierung von GPCRs ist immer noch anspruchsvoll und ergänzende biochemische Methoden sind hoch für ihre Untersuchung erforderlich. Wir sind Pionier im Einsatz von Foto-Vernetzung NcAAs GPCR Oberflächen abbilden und Ligand verbindliche Taschen34zu entdecken. Mit unserem optimierten System Azi Aufnahme haben wir systematisch Azi in der ganzen Juxtamembrane Domäne von GPCR direkt in lebenden Säugetier-Zellen aufgenommen. Bei UV-Bestrahlung bildet Azi eine hochreaktive Nitrene Spezies, die benachbarten Moleküle kovalent erfasst. Wenn die Liganden zum System hinzugefügt wird, dient Azi als ein Näherungssensor zu offenbaren, welche Positionen des Rezeptors in der Nähe der gebundenen Liganden kommen. Auf diese Weise wurde der Bindungsmodus des Hormons Neuropeptid Urocortin ich (Ucn1) auf die Klasse B GPCR Corticotropin-freigeben-Faktor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R)33 erstmals vorgestellt. In letzter Zeit, haben wir unterschiedliche verbindliche Muster von Agonisten und Antagonisten auf die gleichen Rezeptor38offengelegt. Ein ähnlicher Ansatz wurde von anderen Orthosteric und allosterische Bindungsstellen anderer Peptide und niedermolekularen Liganden auf andere GPCRs39,40,41,42offenbaren angewendet. Dieses Manuskript beschreibt das experimentelle Protokoll in unserem Labor für Foto-Vernetzung Zuordnung von GPCR Oberflächen angewendet. Die Methode ist relativ schnell, unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es im standard Biochemie Labor anwendbar ist. Wichtig ist, der Ansatz bietet ein wertvolles Instrument, nicht nur um Ligand verbindliche Aufstellungsorte zu identifizieren, wo 3D Strukturdaten sind knapp, sondern auch zur Ergänzung der vorhandenen in-vitro- Daten mit Informationen aus voll posttranslational modifizierte Rezeptoren in der physiologische Umgebung der Zelle Leben.

Die jüngste Entwicklung von neuartigen NcAAs Lager auf der Seite Kette chemischen Gruppen geeignet für ultraschnelle Katalysator-freie Bioorthogonal-Chemie hat eröffnet die Möglichkeit, letzte Generation Fluorophore für super-Resolution Imaging in Proteine zu installieren direkt auf die Zellen2,43. Diese chemische Dübel sind gespannte Cyclooctyne in SCOK14, Bicyclo [6.1.0] Nonyne BCNK12,17und Trans-Cyclooctenes TCO * K13,15,17 unter anderen NcAAs beherbergen eine Norbornen16,17,44 oder Cyclopropen45,46 Glyko-. Sperrige NcAAs für Bioorthogonal Chemie fließen durch eine Variante des PylRS, die in der Regel als PylRSAF bezeichnet (Angabe Mutation Y271A und Y349F in M. Barkeri PylRS), sowie durch andere ad-hoc- entwickelt NcAARSs17 , 44. Bioorthogonal Anker mit kurz Reagenzien47 über inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition Kennzeichnung ertragreich innerhalb von wenigen Minuten43,48zu reagieren. Anwendung dieses leistungsstarken Konzepts Label GPCRs hat jedoch durch einen niedrigen Gesamtwirkungsgrad des orthogonalen ncAA Einbeziehung Systems streitig gemacht. Mit unserem erweiterten Pyl-System haben wir vor kurzem hochverzinsliche Berücksichtigung solcher Aminosäuren GPCRs und ultraschnelle GPCR Kennzeichnung auf der Oberfläche des lebenden Säugetier-Zellen30gezeigt. Beschriftete Rezeptoren waren noch funktionsfähig, da sie physiologisch, beim Aktivieren des Agonist-Rezeptors verinnerlicht. Das experimentelle Protokoll für die Einbeziehung von Bioorthogonal in GPCRs Anker und die folgende Kennzeichnung Schritte werden hier beschrieben. GPCRs mit kleinen hellen Fluorophore auszustatten, ist der erste grundlegende Schritt zur Studie von GPCR Strukturdynamik in der live-Zelle über erweiterte mikroskopiertechniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) Fluoreszenz-basierten Screening der Einbeziehung Wirkungsgrade (Abbildung 1)

  1. HEK293 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium zu erhalten (DMEM; hohe Glukose, 4 mM Glutamin, Pyruvat) mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  2. Samen der Zellen am Vortag Transfektion.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. Samen 6.0 x 105 HEK293 Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten in 2 mL komplette Wachstumsmedium. Bereiten Sie so viele Brunnen als die Anzahl der Proben, und zwei weitere Brunnen bzw. für Wildtyp EGFP und eine Mock-transfizierten Probe.
  3. Steuern Sie Confluence (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop. Transfizieren Sie Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit Polyethyleneimine (PEI) Reagenz.
    1. 1h vor Transfektion, die entsprechende Menge an frisch zubereiteten ncAA-Stammlösung hinzufügen alle Brunnen für eine ncAA-Endkonzentration von 0,25-0,5 mM. Hinzu kommt der ncAA alle Brunnen, einschließlich der Wildtyp Positivkontrolle und Mock-transfizierten Zellen, um Unterschiede in der Fluoreszenz-Signale zu verhindern, die durch Beeinflussung der ncAA Zellwachstum verursacht werden können.
      Hinweis: Zur Vorbereitung auf lagerlösungen Auflösen der ncAA 0,1-0,5 M mit 0,2-0,5 M NaOH. Jedoch erfordern einige NcAAs ersten Solubilisierung in DMSO und/oder Neutralisierung von vier Bänden von 1 M HEPES (pH 7,4) vor dem Gebrauch. Im Allgemeinen empfiehlt der Hersteller ein Protokoll eine Stammlösung vorbereiten.
    2. Mischen Sie in einem Microcentrifuge Schlauch 1 µg Plasmid DNA-Codierung für das NcAARS/tRNA-Paar mit 1 µg der Reporter Plasmid DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry) getestet werden. Bereiten Sie in getrennten Röhren eine identische Transfektion mit EGFP Wildtyp Referenz und ein mock Transfektion.
      Hinweis: Anzahl der Kopien der tRNA-Kassette, eingebettet in das Plasmid Codierung für das NcAARS/tRNA-paar von der Anwendung abhängt. Zur Erleichterung der Klonen 1 tRNA-Kopie wird empfohlen, wenn verschiedene tRNAs screening während 4 Kopien (wenn auch nicht unbedingt notwendig) empfohlen werden beim Test verschiedener NcAARS oder die Einbeziehung der verschiedenen NcAAs von der gleichen orthogonalen Paar.
    3. Jede Röhre enthält die DNA hinzufügen 100 µL Laktat gepufferter Kochsalzlösung (LBS) mit 20 mM Natrium Laktat bei pH 4.0 und 150 mM NaCl. Kurz mixen.
    4. Jedes Rohr mit der DNA in LBS hinzufügen 6 µL von 1 µg/µL PEI in LBS (Verhältnis PEI/DNA = 3/1 w/w) und Vortex sofort. 10-15 min bei RT inkubieren.
    5. Jedes gut entnehmen Sie 400 µL Zelle Medium und fügen Sie es in der DNA-PEI Mischung, den pH-Wert zu neutralisieren. Dribbeln Sie die DNA-Mischung auf die Zellen.
      Hinweis: DMEM enthält in der Regel Phenol rot als pH-Indikator. Während der Neutralisation Schritt ändert sich die Farbe der Mischung hinzugefügt in der Röhre von gelb (sauer) bis rot (neutral). Zwar bilden die DNA-komplexe in LBS bei sauren pH-Wert den höchsten Transfektion Erträge50gibt, können DNA-PEI komplexe alternativ direkt bei pH 7.4 (z. B. in serumfreien DMEM) gebildet. Wenn DMEM, DNA-komplexe Form verwenden, überspringen Sie die Neutralisation 1.3.5. In jedem Fall ist es wichtig, dass kein Serum in der Mischung vorhanden ist, wenn die komplexe zu bilden.
  4. Ernten Sie Zellen 48 h nach Transfektion.
    1. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit 2 mL vorgewärmten PBS (37 ° C). Fügen Sie 800 µL PBS ergänzt mit 0,5 mM EDTA und 20 min bei 37 ° c inkubieren Lösen und Aussetzen der Zellen durch pipettieren rauf und runter.
    2. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 mL Röhrchen mit 200 µL PBS mit 5 mM MgCl2ergänzt.
    3. Für 2 min bei 800 X g zentrifugieren und den überstand verwerfen.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. In diesem Fall Schockfrosten die Pellets in Flüssigkeit N2 und bei-80 ° C bis zu einem Monat lagern. Tragen Sie immer Auge Schutzbrillen.
  5. 100 µL Tris Lyse Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % Triton x-100, 1 mM EDTA und frisch hinzugefügten PMSF) um die Zelle Pellets und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Lyse, Wirbel alle 5 min zu erleichtern.
  6. Spin-down zellenrückstand für 10 min bei 4 ° C und 14.000 x g und 90 µL des Überstands in schwarz 96-Well-Platten übertragen. Messen Sie EGFP und mCherry Fluoreszenz mit einem Teller-Reader mit einem Fluoreszenz-Modul ausgestattet.
    Hinweis: Verwenden Sie entsprechende Anregung und Emission Filter für EGFP (λabs: 488 nm; λEm: 509 nm) und mCherry (λabs: 588 nm; λEm: 611 nm). EGFP Messwerte umfassen einen Bereich zwischen den Mindestwert Mock-transfizierten Zellen entnommen und ein Maximalwert, der in der Regel von Wildtyp EGFP vorliegt. Kümmern uns um die korrekte Messung Fenster im Gerät einrichten.
  7. Die Effizienz der ncAA Aufnahme errechnet sich das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz der Probe und die Fluoreszenz von Ausdruck der Wildtyp EGFP erhalten. Alle Werte sind auf mCherry Fluoreszenz normalisiert.
    Equation 1

2. genetische Einbindung der NcAAs in GPCRs für Foto-Vernetzung Mapping der Liganden-GPCR Interaktionen (Abbildung 3)

  1. Pflegen Sie HEK293T Zellen in DMEM mit 10 % (V/V) FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  2. Am Vortag Transfektion Samenzellen.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren rauf und runter. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. 5.0 x 105 293T Samenzellen pro Bohrloch in 2 mL komplette Wachstumsmedium in 6-Well Platten. Bereiten Sie für jede Position zu siebenden 1 gut pro Ligand plus einen Brunnen für die verbindliche Kontrolle33,38. Ein zusätzliche Brunnen mit dem Wildtyp (wt) Rezeptor transfiziert werden kann Ausdruck des mutierten zu überprüfen, das enthalten.
  3. Steuern Sie am nächsten Tag, Zusammenfluss (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop. Transfizieren Sie Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit PEI.
    1. 1h vor Transfektion, hinzufügen Azi alle Brunnen, eine Endkonzentration von 0,5 mM.
      1. Bereiten Sie eine 0,5 M-Stammlösung der Azi. Pro 6-Well-Platte, wiegen 1,2 mg Azi in ein Rohr und lösen Sie es in 15 µL 0,5 M NaOH. Verdünnen Sie der Stammlösung in 1,2 mL komplette Medium und jedes gut fügen Sie 200 µL der Mischung hinzu.
        Hinweis: Bereiten Sie eine frische Stammlösung der Azi für jedes Experiment. Natriumazid Glyko-hat eine kurze Halbwertszeit in wässrigen Lösungen, vor allem bei grundlegenden pH, und die AziRS beinhaltet die intakt, sondern auch die degradierten Form.
    2. Transfizieren einen Gesamtbetrag von 2 µg DNA pro Bohrloch: 1 µg Plasmid Codierung für die Flagge markiert GPCR, wobei ein TAG Codon an die gewünschte Position und 1 µg der Plasmid-Codierung für das orthogonale paar Azi (E2AziRS51 und 4 Kopien von den Cognate gewidmet Suppressor-tRNA BstYam)33,38.
      Hinweis: Wenn Sie einen wt-Vergleich, um Ausdruck zu kontrollieren, transfizieren Sie Plasmid DNA für den wt-Rezeptor in geringerem Umfang. Je nach GPCR, 0,2-0,5 µg Plasmid Codierung der wt-Rezeptor ähnliche Erträge als 1,0 µg des mutierten Plasmids. Transfizieren Sie die gleiche Menge an DNA in alle Wells, füllt sich die fehlenden DNA mit einem Mock (z. B. ein leerer Vektor).
    3. Gehen Sie wie in 1.3.3-1.3.5 beschrieben.
    4. 48 h nach Transfektion, fahren Sie fort mit Schritt 2.4 für Foto-Vernetzung der Liganden oder gehen Sie zu Schritt 2.5 für direkte Ernte und Analyse für die Überprüfung-Rezeptor-Expression.
  4. Foto-Vernetzung des Liganden.
    1. Bereiten Sie eine 1.000 X-Liganden-Stammlösung. Die Peptid-Liganden bei einer Konzentration von 100 µM in DMSO auflösen.
      Hinweis: Die Liganden-Konzentration hängt die Dissoziationskonstante KD der Liganden-GPCR-Interaktion. Eine Endkonzentration von 100 X KD ist empfehlenswert. Wenn der Peptid-Liganden ist ein Salz von Trifluoroacetic Säure (TFA), das Gewicht von TFA bei der Berechnung des Molekulargewichts berücksichtigen (1 X TFA pro grundlegenden Aminosäure in das Peptid). Überlegen Sie auch, dass Peptide im allgemeinen hygroskopisch sind. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren von Peptid-Pulver und öffnen Sie niemals einen Peptid-Container, bis es Raumtemperatur nicht erreicht hat.
    2. Verdünnen Sie die Liganden-Stammlösung 1:1,000 in Bindung Puffer bestehend aus 0,1 % BSA, 0,01 % Triton X 100, 5 mM MgCl2 in HEPES Dissoziation Puffer (HDB), 12,5 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl und 5 mM KCl. Prepare 1 mL pro Azi-GPCR Mutant. Ersetzen Sie die Zelle Medium mit 1 mL der Lösung Liganden. 10 min bei RT inkubieren
      Hinweis: Passen Sie die Inkubationszeit, die spezifische GPCR, Bilanzierung von Liganden Kinetik und Rezeptor Internalisierung an. Verlängerung der Inkubationszeit verbessert nicht die Vernetzung Erträge.
    3. Bestrahlen die Proben für 20 min in einem UV-Vernetzer bei 365 nm mit 5 x 8 W-Röhren und ~ 5 cm Abstand zu den Zellen. Lösen Sie die Zellen, indem pipettieren und in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß überführen. Pellet-Zellen für 3 min bei 800 X g und den überstand verwerfen.
    4. Lösen Sie eine Tablette der Protease-Inhibitor (PI) cocktail in 1 mL 25 mM EDTA/H2O, 50 X-Stammlösung zu machen. Aliquoten die PI Lösung auf Lager und bei-20 ° c Lagern Verdünnen Sie die Aktie 50 X 01:25 in HDB und Aufschwemmen der Zelle Pellets in 50 µL 2 x PI im HDB. Schockfrosten Sie Zellen in Flüssigkeit N2.
      Hinweis: Auge Schutzbrillen zu tragen. An dieser Stelle können die Proben bei-80 ° C bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Fahren Sie fort mit Schritt 2.6.
  5. Direkte Zellernte.
    1. Aspirieren Sie das Medium. Fügen Sie 800 µL 0,5 mM EDTA in HDB. Inkubieren Sie für 10 min bei RT oder auf Eis.
    2. Lösen Sie die Zellen, indem pipettieren rauf und runter und in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß überführen. Fügen Sie 200 µL 5 mM MgCl2 in HDB. Pellet-Zellen für 3 min bei 800 X g und den überstand verwerfen.
    3. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 50 µL 2 x PI in HDB und Flash-Einfrieren Flüssigkeit N2. Auge Schutzbrillen zu tragen.
      Hinweis: An dieser Stelle können die Proben bei-80 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
  6. Zell-Lyse.
    1. Die Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30-45 s und Wirbel kurz Auftauen. Von nun an halten Sie Proben kühl. Pellet-Membranen bei 2.500 x g und 4 ° C für 10 min. verwerfen den überstand, der den Großteil der cytosolischen Proteine enthält.
    2. Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 50 µL HEPES Lyse Puffer mit 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 % Glyzerin, 1 % Triton x-100, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT und frisch hinzugefügt 2 x PI Cocktail. Mischen Sie gründlich. Lösen Sie die Zellen 30 min auf Eis und Wirbel alle 5 Minuten.
    3. Spin-down zellenrückstand für 10 min bei 14.000 x g und 4 ° C. Sofort übertragen Sie den überstand auf eine frische Reaktionsgefäß.
      Hinweis: Fahren Sie sofort mit der Analyse fort. Die Lysates können bei-20 ° C gelagert werden, jedoch jedem Frost-Tau-Zyklus beeinträchtigt die Qualität der Ergebnisse.
  7. Western-Blot Analyse.
    1. Die Probe vorbereiten, nehmen 3 bis 5 µL lysate und füllen ihn bis zu blau 7 µL mit H2O. Add 2 µL 1 M DVB-t und 4 X 3 µL Probenpuffer mit 63 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, 10 % Glycerin und 0,04 % Bromphenol. 30 min bei 37 ° c inkubieren
    2. Wenn die GPCR glykosylierten und blass oder verschmierten Bands ist, sind ein Problem, Deglycosylate Proben mit PNGase F Signalintensität zu erhöhen und die Bands zu schärfen. Verwenden Sie 3-5 µL lysate und Deglycosylate in einem Gesamtvolumen von 10 µL nach der Lieferant Protokoll. 3 µL 4 x Probenpuffer hinzufügen.
      Hinweis: Membranproteine sind oft glykosylierten in mehreren Standorten und Staaten, die die Qualität der Auflösung in SDS-PAGE-Analyse beeinträchtigt. Allerdings tun nicht Deglycosylate der Proben für die Analyse der die Expression der Azi-GPCR Mutanten mit Anti-FLAG Antikörper, weil es für die Portion voll glykosylierten, Reife Rezeptor an der Zelloberfläche zu bewerten ist.
    3. Beheben Sie Proben über standard-SDS-PAGE zu und tupfen Sie Transfer-Proteine zu einer PVDF-Membran.
      Vorsicht: Acrylamid ist neurotoxisch. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
    4. Blockieren die Membran für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C in 5 % Magermilch in TBS-T mit 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0,15 M NaCl und 0,1 % Tween 20.
    5. Prüfen Sie die Membran mit einem Anti-Liganden-Antikörper, gefolgt von der HRP-konjugierten Sekundärantikörper. Waschen Sie zwischendurch mit TBS-T. Um die Expression von Azi-GPCR erkennen, untersuchen die Membran mit einem kommerziellen HRP Antikörper (siehe Tabelle der Materialien).
    6. Führen Sie verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Reaktion mit hausgemachten ECL-Reagenz und erkennen Sie Signale für 5 min in der Dunkelheit zu.

(3) ultraschnelle Bioorthogonal Kennzeichnung von GPCRs auf Live Säugerzellen

Hinweis: Das Protokoll ist optimiert für 4-Well gekammerten Deckgläsern (gut Bereich = 2,2 cm2). Für Größen gut muss das Protokoll entsprechend skaliert werden.

  1. Oberflächenbeschichtung der Objektträger. Führen Sie die ganze Prozedur unter einer sterilen Kapuze.
    1. Bereiten Sie eine Poly-D-Lysin-Hydrobromide (MW = 500-550 kDa) Stammlösung (PDL) in einer Konzentration von 1 mg/mL in 50 mM Borat Puffer (pH 8,5). Lagerung bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten. Nicht einfrieren.
    2. Verdünnen der PDL Stammlösung 01:40 in sterilen Ultrareines Wasser, eine Endkonzentration von 25 µg/mL (Arbeitslösung), dann die Lösung durch einen Sterilfilter 0,22 µm filtern.
      Hinweis: Die Arbeitslösung kann bis zu 3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
    3. Bedecken Sie vollständig den Boden des jede Vertiefung der Mikroskopie Folie mit 500 µL Arbeitslösung PDL. 20 min bei RT inkubieren und Aspirieren der PDL funktionierende Lösung.
      Hinweis: Die PDL-Arbeitslösung kann bis zu dreimal verwendet werden. Wenn die Lösung werden wiederverwendet muss, die verwendete Lösung von beschichteten Folien auf ein frisches steriles Röhrchen übertragen und das Rohr entsprechend zu kennzeichnen. Mischen Sie niemals die recycelte Lösung mit frischer Lösung.
    4. Spülen Sie je gut 3 X mit ~ 700 µl steriler Ultrareines Wasser und mindestens 1 Stunde trocknen lassen.
      Hinweis: Es ist sehr wichtig, die Brunnen genau, zu spülen, da Rückstände von der PDL-Lösung, die Zellen giftig sind. Die beschichteten Folien kann bis zu einer Woche bei 4 ° c gelagert oder sofort für die Mikroskopie verwendet werden
  2. Pflegen Sie HEK293T Zellen in DMEM mit 10 % (V/V) FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  3. Am Vortag Transfektion Samenzellen.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. 1.0 x 105 HEK293T Samenzellen pro Bohrloch (Bereich 2,2 cm ²) in 600 µL Farbstoff frei komplette DMEM.
      Hinweis: Für imaging-Zwecke, ist es sehr bequem, von Anfang an in einem Medium zu arbeiten, die keiner Farbstoff enthält. Farbstoff freie DMEM Formulierungen sind im Handel erhältlich.
  4. Steuern Sie Zusammenfluss (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop und transfizieren Sie die Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens.
    1. 1 h vor Transfektion, bereiten Sie eine frische 100 mM Stammlösung von TCO * K in 0,2 M NaOH und 15 % (V/V) DMSO.
    2. Pro Well, mix 3 µl der TCO * K-Stammlösung mit 12 µL 1 M HEPES pH 7.4. Sanft fügen Sie die Lösung in die Vertiefungen für eine endgültige TCO * K-Konzentration von 0,5 mM.
    3. Bereiten Sie einen Gesamtbetrag von 500 ng DNA pro Bohrloch. In einem Microcentrifuge Schlauch verdünnen 200 ng des PcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng des Plasmids Codierung für die MbPylRSAF/tRNAPyl orthogonal Paar (vier Kassetten der tRNAM15) und 100 ng PcDNA3.1_Arrestin3 Plasmid in 50 µL Medium (Farbstoff frei, Serum-frei, Antibiotikum frei).
      Hinweis: Im Allgemeinen ist Co-Transfektion von Arrestin nicht GPCR Verinnerlichung zu beachten. Jedoch beschleunigt Co transfecting Arrestin3 Internalisierung von CRF1R, das ist sehr praktisch bei der Analyse der Internalisierung von vielen Mutanten.
    4. Verdünnen Sie 1,25 µL des Lipid-basierte Transfection Reagens (2,5 µL pro 1 µg DNA) in 50 µL Medium (Farbstoff frei, Serum-frei, Antibiotikum frei) und fügen Sie die Lösung auf die DNA-Mischung. Vortex sofort und inkubieren Sie 5-10 min bei RT. Add DNA-Lipid-komplexe zu den Zellen.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung transfiziert die Morphologie der Zellen mit Lipid-basierte Transfektion Blicke mehr physiologische gegenüber, die von Zellen transfiziert mit PEI. Da PEI höhere Transfection Leistungsfähigkeit gibt, sollte PEI für downstream-Anwendungen wie Western-Blot, bevorzugt sein, während Lipid-basierte Transfektion eine bessere Wahl ist zu transfizieren Zellen für imaging-Experimente.
  5. 24 h nach Transfektion Label den Rezeptor mit Fluoreszenz-Farbstoffen.
    1. Bereiten Sie eine 0,5 mM Farbstoff-kurz Stammlösung in DMSO und eine 10 mg/mL DNA-Färbung Farbstoff Stammlösung in ultra-reinen H2O.
    2. Übertragen Sie 100 µL Medium aus jedem Brunnen in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß. Fügen Sie 1,8 µL der Stammlösung Farbstoff-kurz und 0,3 µL der Stammlösung Farbstoff Färbung DNA. Die Farbstoffe zurück zum Brunnen-haltigem Medium übertragen und 5 min bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Kurz-Orange-fluoreszierenden Farbstoff hat eine Endkonzentration von 1,5 µM.
    3. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie sanft die Zellen zweimal mit PBS, überschüssige Farbe zu entfernen. Fügen Sie 600 µL kompletten Farbstoff frei Wachstumsmedium vorgewärmt auf 37 ° C.
  6. Fluoreszenz-Mikroskopie und Rezeptor Internalisierung.
    1. Visualisieren der beschrifteten Rezeptoren unter 63 x (oder ähnlich) Vergrößerung mit Hilfe von Filtern für GFP (λabs: 488 nm; λEm: 509 nm), Orange-fluoreszierenden Farbstoff (λabs: 550 nm; λEm: 570 nm) und DNA-Farbstoff (λ Färbung ABS: 350 nm; Λ-Em: 461 nm). Nehmen Sie ein Bild mit jeder Filter vor der Aktivierung des Rezeptors.
    2. Förderung der Rezeptor Internalisierung mit 200 nM Ucn1.
      1. Bereiten Sie eine 1.000 x Ucn1-Stammlösung von 200 µM in DMSO.
        Hinweis: Abhängig von der Löslichkeit des Peptids möglicherweise Sie den Bestand in reinem Wasser oder Puffer vorzubereiten.
      2. Übertragen Sie 100 µL Medium aus einem Brunnen in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie 0,6 µL der Stammlösung der Peptid-Agonist. Übertragen Sie den mittleren Rücken in den Brunnen.
      3. Die Internalisierung unter dem Mikroskop zu beobachten. Nehmen Sie Bilder nach dem eindeutig nachweisbar auftreten der Internalisierung (10-15 Minuten bis Stunden, je nach Rezeptor und Überexpression des Arrestins) mit den zuvor genannten filtern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die Umrisse der Fluoreszenz-Test ist in Abbildung 1dargestellt. Der Test ist in drei Anwendungen eingesetzt. An erster Stelle werden eine Reihe von tRNA-Varianten für den Einbau des Lys(Boc) durch die Pyl orthogonal paar gezeigt. Lys(BOC) ist eine Aminosäure Pyl sterisch ähnlich. Pyl nicht kommerziell verfügbar ist, wird Lys(Boc) häufig als standard Substrat für die PylRS verwendet. Die abgeschirmten tRNAs basieren auf der tRNAPyl. Jede tRNA-Variante trägt Mutationen der einzelnen Basen oder Basenpaare in die Schlaufen und Stiele rational zur Verbesserung der tRNA Stabilität und Kompatibilität mit den eukaryotischen translationale Maschinen. Alle Details über tRNA-Design sind in unserer jüngsten Arbeiten30beschrieben. Typische Ergebnisse sind in Abbildung 2Abeschrieben: verschiedene tRNAs geben verschiedene Unterdrückung Effizienz, die in der Höhe von gemessenen Fluoreszenz deutlich widerspiegelt. Die kleine Fehlerbalken der biologischen Triplicates zeigen, dass die Werte sehr reproduzierbar sind. Auf dem zweiten Platz sind zwei Genvarianten des E2AziRS26,51, welches die Foto-Vernetzer p-Azido-Phe (Azi) beinhaltet, ausgewertet. E2AziRS wird von E. Coli TyrRS abgeleitet. Eine Genvariante beschäftigt native E. Coli Codon Usage, während der zweite Codon-optimiert für den Einsatz in H. sapienswar. Die Fluoreszenz-Test zeigt, dass die Codon-optimierte Variante Mehrertrag Protein (Abb. 2 b) gibt. Zu guter Letzt die Einbeziehung verschiedener Aminosäuren für Bioorthogonal Click-Chemie sind im Vergleich (Abbildung 2). Alle hier vorgestellten NcAAs (BCNK, TCO * K und SCOK) sind von der gleichen orthogonalen MbPylRSAF/tRNAPyl paar eingearbeitet. Lys(Z) ist ebenfalls von diesem Paar eingebaut und diente als Positivkontrolle. Um die Zuverlässigkeit der Fluoreszenz-Test zu veranschaulichen, wurden parallel ncAA Einbeziehung Experimente auf einem GPCR, die CRF1R durchgeführt. Western-Blot Analyse wurde durchgeführt, um GPCR Ausdruck (Abb. 2 b, C) zu schätzen. Die gleichen Trends beobachtet mit EGFP in der Fluoreszenz-Test wurden mit den CRF1R beobachtet. Azi Einbindung in CRF1R war vor allem sehr verbessert, wenn das Codon-optimierte E2AziRS-gen im Vergleich zum nativen gen, zeigen, dass selbst eine moderate Verbesserung von 1,5-2-fach für ein lösliches Protein (EGFP) nach der Fluoreszenz-Test kann mit einem größeren Einfluss auf die Expression von anspruchsvolleren Membranproteine (Abb. 2 b). Als allgemeiner Hinweis in Bezug auf die Anzahl der tRNA-Kassetten für jede Anwendung verwendet werden ist nur eine tRNA Kassette empfohlen, wenn verschiedene tRNAs screening um Klonen Verfahren zu erleichtern. Beim screening von verschiedenen NcAARS oder die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs von der gleichen orthogonalen paar Wiederholungen vier Tandem die tRNA Kassette werden bevorzugt, um die höchsten Erträge der ncAA Eingliederung zu erreichen.

Das optimierte System für Azi Aufnahme einschließlich der vermenschlichten E2AziRS Gens wurde eingesetzt, um Karte der bindungstasche von der CRF1R und Bindungspfade 5 verschiedene Liganden zu definieren: die zwei Peptid-Agonisten Ucn1 und CRF und die drei Peptid-Antagonisten Ucn1(8-40), CRF (9-41) und dFXCRF(12-41) (Abbildung 3). Während die Effizienz der Azi Gründung zu verringern, wenn die GPCR C-Terminus33,34nähert sich zuvor gezeigt wurde, ermöglicht unser optimierte System für den Einbau der Azi vergleichbaren Ausdruck Azi-Mutanten mit TAG-Seiten in verschiedenen Teilen des GPCR-Gens (Abb. 4A). Die Ergebnisse in Abbildung 4 b zeigen das Screening der extrazellulären Schleife 2 (ECL2) und Helix V CRF1R als ein repräsentativer Teil der Liganden-bindungstasche. Eine Band in der richtigen Größe des Messguts Vernetzung zeigt, dass die Position liegt in der Nähe des Liganden innerhalb der Ligand-Rezeptor-Komplex, d.h. es ist Bestandteil der bindungstasche. Mit allen Liganden getestet, enthüllt unterschiedliche verbindliche Muster für die Peptid-Agonisten und Antagonisten wurden mehrere Vernetzung Treffer gefunden. Insbesondere informiert das Muster der Vernetzungsgrad Treffer über strukturelle Elemente des Rezeptors. Eine Reihe von aufeinander folgenden Hits, wie in der ECL2 (Positionen F260-R263 in Kombination mit Antagonisten) schlägt eine flexible Loop-Region. Ein Muster von jeder drei bis vier Rückstände als in Helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) Hinweise auf eine spiralförmige Struktur gefundenen Treffer. Der Bildschirm kann auf alle relevanten Bereiche der GPCR erweitert werden. Existiert eine 3D-Struktur oder einem Molekülmodell des Rezeptors können Liganden Fußabdrücke visualisiert werden, durch die Hervorhebung der Vernetzungsgrad Treffer zu jeder Ligand (Abbildung 5).

Fluoreszenz und Western-Blot-Daten (Abbildung 2) vorschlagen, die TCO * K ist der ncAA für Bioorthogonal Chemie, die mit dem höchsten Wirkungsgrad von MbPylRSAFaufgenommen wird. Verschiedene PylRS Mutanten könnte Mehrertrag Einbeziehung von anderen Klick NcAAs17geben, aber sie wurden in dieser Studie nicht getestet. TCO * K war eine CRF1R-EGFP-Fusionsprotein eingearbeitet und Installation via SPIEDAC Chemie (Abb. 6A) eine kleine helle Fluorophor auf den Rezeptor (Abb. 6 b) aktiviert. Als Nachweis der spezifischen Kennzeichnung, die Fluoreszenz des Etiketts sollte sichtbar sein nur in Zellen, die mit dem Ausdruck des Rezeptors (grüne Zellen in Abbildung 6 b) und nicht in dunklen Zellen, die so eine interne negative Kontrolle in jedem Experiment. Rezeptoren mit ultraschnellen SPIEDAC Chemie gekennzeichnet sind weiterhin funktionsfähig. Nach dem Hinzufügen einer Peptid-Agonist, beobachtet fluoreszierende Fächer in das Zytosol, enthüllt den physiologischen Prozess der GPCR Internalisierung (Abbildung 6). Die Signale der verschmolzenen EGFP gemeinsam mit dem fluoreszierenden Farbstoff zu allen Zeiten, bestätigt die selektive Biorthogonal Kennzeichnung von der GPCR lokalisiert.

Figure 1
Abbildung 1: Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der Stopp-Codon Unterdrückung zu bewerten. HEK293 Zellen sind Co transfected mit zwei Plasmide in Anwesenheit der ncAA. Ein Plasmid kodiert für die gewünschte NcAARS und Suppressor-tRNA. Das zweite Plasmid kodiert für das EGFP-gen trägt ein Stopcodon TAG an einem freizügigen Standort zusammen mit einem mCherry-Steuerelement. Zwei Tage nach Transfektion, die grüne und rote Fluoreszenz der gesamten Zelle Lysates werden in einem Reader Platte gemessen. Als EGFP N-Segment stromaufwärts das Stopp-Codon (grau) nicht ist korreliert Fluoreszenz, die Ausbeute an Full-Length EGFP (grün) direkt zur Effizienz der ncAA Einarbeitung, mCherry (rot) bietet ein unabhängiges Nachschlagewerk für Normalisierung. Die Effizienz der orthogonalen System erhält durch das Verhältnis zwischen dem Betrag der EGFP per Stopp-Codon Unterdrückung und die Höhe der Wildtyp EGFP durch regelmäßige Übersetzung (keine Bernstein Unterdrückung) erhalten. Die Figur wird geändert von Serfling, R. & Münze, ich bin es; Einbeziehung der unnatürlichen Aminosäuren in Proteine in Säugerzellen, Methoden in der Enzymologie, 2016, 580, 89-107. 29 Reproduktion wurde durch das Copyright Clearance Center von Elsevier zugelassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Anwendungen den Fluoreszenz-Assay. (A) Screening der tRNAPyl Varianten30. HEK293 Zellen wurden gemeinsam mit dem Reporter Plasmid und Plasmide, die Codierung für das Mb-PylRS/tRNA-paar transfizierten (ein Exemplar tRNA). Balken stehen für die relative Fluoreszenz EGFP aus der Einbeziehung der Lys(Boc) im Vergleich zu Wildtyp EGFP gewonnen. (B) Bewertung des Einfluss der Codon-Nutzung für NcAARS Gene. (linken) Fluoreszenz-Assay von Zellen transfiziert mit zwei verschiedenen Genvarianten des E2AziRS. (1) Codon Nutzung von E. Coli und (2) humanisierten gen. (Rechte Abbildung) Western-Blot Analyse der CRF1R95Azi-FLAG. Der Full-Length-Rezeptor wird von einem Anti-FLAG Antikörper erkannt. Aktin β diente als Ladekontrolle. (C) Bewertung der Einbeziehung Effizienz der drei NcAAs für Bioorthogonal Chemie konzipiert. (linken) Strukturen der NcAAs in diesem Experiment verwendet. (1) LysZ, diente als positive Kontrolle, (2) BCNK, (3) TCO * K und (4) SCOK. (Mitteltafel) Fluoreszenz-Assay HEK293 Zellen transfiziert mit einem Plasmid Codierung für MbPylRSAF und vier Exemplare des tRNA15 von (A) um zu übernehmen (1), (2), (3) und (4). (Rechte Abbildung) Western-blot Analyse ein CRF1R-FLAG-Mutante mit eines der vier NcAAs an Position 95. Aktin β diente als Ladekontrolle. Zentrale A wurde von Serfling, R. Et Al. Designer tRNAs für effiziente Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren vom Pyrrolysin System in Säugerzellen Nukleinsäuren res 46 (1), 1-10 (2018) angepasst und werden gemäß der Creative Commons wiedergegeben Attribution-Lizenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Schematische Darstellung des Azi-vermittelten Foto-Vernetzung Mappings. Eine Foto-aktivierbare Azido-Funktion (gelber Stern) befindet sich in einer definierten Position innerhalb der Rezeptor (grau). Wenn die Azido-Gruppe proximal zu den gebundenen Liganden (rot) befindet, entsteht eine kovalente Vernetzung Produkt nach UV-Bestrahlung (gelber Kreis zeigt Vernetzung Website). Die Einbeziehung der Azido-Gruppe in verschiedenen Positionen des Rezeptors zeigt die Bindung (lila) Oberfläche des Liganden, der die bindungstasche darstellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Einbeziehung der Azi im gesamten CRF1R für die Foto-Vernetzung Zuordnung der bindungstasche. (A) Vergleich der Ausdruck von Azi-CRF1R-FLAG Mutanten zu Wildtyp Rezeptor. Azi Einbeziehung Websites sind über die ganze Rezeptor verteilt, wie in der obersten Zeile angezeigt. Anti-FLAG Western Blots der gesamten Zelle Lysates werden angezeigt. Aktin β diente als Ladekontrolle. (B) Western Blots sondiert mit entweder Anti-CRF oder Anti-Ucn1 Antikörper werden angezeigt. Die Rückstände von Azi ersetzt werden in der oberen Zeile angezeigt. Die Zellen inkubiert mit den Liganden auf der rechten Seite, gefolgt von UV-Bestrahlung bei 365 nm und Lyse. Die Proben wurden auf 10 % gelöst SDS-PAGE, Deglycosylated mit PNGase F und durch Western Blot analysiert. Der Deglycosylated-Liganden-CRF1R-Komplex führt eine scheinbare MW von ~ 40 kDa33. Die unvernetzten Liganden ist nicht erkannten (MW ~ 3-4 kDa). Seidel, L. Et Al. Structural Einblick in die Aktivierung eines Klasse-B-G-Protein-gekoppelten Rezeptors von Peptidhormonen im lebenden menschlichen Zellen haben beide Platten dieser Figur geändert wurde. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 und sind entsprechend der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Footprints von Peptid-Agonisten und Antagonisten in der Klasse B GPCR CRF1R. Oberfläche-Darstellung der CRF1R transmembrane Domäne. Positionen der CRF1R, vernetzt die Liganden als durch Azi ersetzt werden hervorgehoben. Spuren der Peptid-Agonisten CRF und Ucn1 werden in Magenta, Spuren der Gegenspieler CRF (9-41) und Ucn1(8-40) in blau hervorgehoben. Die Grundfläche des Antagonisten dFXCRF(12-41) ist Orange hervorgehoben. Die sieben transmembranen Helices I-VII sind mit römischen Ziffern gekennzeichnet. (A, B) Seitenansicht der bindungstasche von der Membran-Ebene. (C) Draufsicht in der bindungstasche von der extrazellulären Seite. Nachdruck aus Seidel, L. Et Al. Structural Einblick in die Aktivierung eines Klasse-B-G-Protein-gekoppelten Rezeptors von Peptidhormonen im lebenden menschlichen Zellen. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 und sind entsprechend der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : SPIEDAC Kennzeichnung von CRF1R auf lebende Zellen. (A) Reaktionsschema der Belastung gefördert inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition (SPIEDAC): die Trans-Cyclo-2-Octen-Gruppe von der ncAA TCO * K reagiert mit der kurz-Gruppe mit dem Fluorophor Cy3 verknüpft. (B, C) HEK293T Zellen mit dem Ausdruck CRF1R95TCO * K- EGFP. Repräsentative Bilder des grünen, roten und blauen Kanals. Die Größe des Maßstabs ist 10 µm. (B) Zellen mit kurz-Cy3 (1,5 µM) für 5 min behandelt wurden. Nur Zellen mit dem Ausdruck des Rezeptors (grün) zeigen Auftreten der Beschriftung (rot). (C) Zellen wurden behandelt mit 200 nM Ucn1 und nach 15 min. intrazellulären Vesikeln der verinnerlichten Rezeptor entsprechen. Platten B und C sind aus Serfling, R. Et Al. Designer tRNAs für effiziente Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren vom Pyrrolysin System in Säugerzellen Nukleinsäure-res geändert. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) und sind entsprechend der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare für die Einbindung der NcAAs in Proteine in Säugetierzellen. Der Hauptvorteil dieser Methode in Bezug auf weit verbreiteten Tests basierend auf FACS ist, dass es die gleichzeitige Zubereitung und Messung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht und liefert Daten, die leicht mit einem normalen Software analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer Medium-Durchsatz-Methode zur orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu analysieren ist sehr wichtig für die Entwicklung von neuen orthogonal Paaren und die Verbesserung bestehender. In der Tat ist es nicht möglich, gerichtete Evolution von orthogonalen Paaren über die Erzeugung von großen zufällige Bibliotheken und tot/lebendig Auswahl in Säugetier-Systeme durchzuführen. Der Test ermöglicht Screening kleine Größe Bibliotheken (Hunderte von Mitgliedern) durch experimentelle vertretbarem Aufwand innerhalb relativ kurzer Zeit zu investieren. Durch screening rational gestalteten tRNA-Sets über dieser Assay, könnten wir neuartige tRNAs generieren, die erheblich die Effizienz von Pyrrolysin System30 steigern. Die klassische Kombination EGFP/mCherry dient das fluoreszierende auslesen, wobei EGFP als Reporter Einbeziehung Effizienz-und mCherry als die interne Kontrolle dient. EGFP Reporter und die mCherry-Kontrolle sind in der gleichen Plasmid hegte aber in zwei separaten Expressionskassetten mit zwei unabhängigen Promotoren eingebettet sind. Auf diese Weise mCherry Ausdruck bezieht sich auf die Transfektion Effizienz und Zellzahl, sondern ist unabhängig von EGFP Ausdruck, so dass die gemessenen grüne Fluoreszenz auf die rote Fluoreszenz normalisiert werden kann. Dies ist nicht gerade der Fall anderer Reporter als ein Tandem der beiden Proteine wie EGFP-TAG-mCherry7 und iRFP-GFPY39TAG (mit iRFP bezeichnet das Infrarot-fluoreszierende Protein)52gebaut. In solche Konstrukte sind beide Proteine in der gleichen mRNA-Transkript. In den Eukaryotes unterziehen mRNAs mit vorzeitigen Stopp-Codons Überwachungs- und Abbau durch den Unsinn-vermittelten Decay (NMD) Mechanismus53. Daher sowohl die Abfolge von der Reporter und der Kontrolle sind gleichzeitig abgebaut und Ausdruck der beiden Gene ist nicht strikt unabhängig. Ähnliche Tests basierend auf einem Luciferase Reporter statt ein Fluoreszenz-Reporter wurden54,55von anderen beschrieben. Enzymatische Lumineszenz höheren Empfindlichkeit als Fluoreszenz-Messungen, bietet letztere zeigte höhere Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Zelle Chargen.

Robuste Systeme zum ncAA Einbau in Säugerzellen sind absolut notwendig, beim Arbeiten mit anspruchsvollen Protein-Targets wie Membranproteine und niedrigen reichlich Proteine. Wir haben hier gezeigt, eine optimierte orthogonal paar robuste Aufnahme der Foto-aktivierbare ncAA Azi in GPCRs. Das System liefert homogene Azi Einbeziehung Preise während der ganzen Rezeptor, der die systematische Foto-Vernetzung-Zuordnung des gesamten GPCR-Oberflächen und Identifizierung von Liganden Bindungsstellen ermöglicht. Die zwei wichtigsten Punkte der Stärke der Methode sind, dass verschiedene Liganden auf den gleichen Rezeptor parallel analysiert werden können und dass die Daten aus der Rezeptor in der live Zelle die Informationen abgeleitet sind, die von in-vitro- Ansätze ergänzt. Die Methode ist grundsätzlich für jedes Protein-Ziel und eignet sich auch für Topologien von Protein-Protein-Wechselwirkungen zuordnen. Darüber hinaus kann die identifizierten Teilmenge der querverbunden Positionen mit 2D Vernetzung zu Pin-Point intermolekulare Paare von proximalen Aminosäuren in die damit verbundenen komplexen33,38weiter analysiert werden. Diese Aminosäure Paare bieten räumliche Einschränkungen, die in Silico Experimenten genaue Molekulare Modelle der Interaktion33,38bauen angewendet werden. Aus methodischer Sicht ist es bemerkenswert, dass nur positive Ergebnisse aus Experimenten Vernetzung berücksichtigt werden sollten. Eine Position, die nicht Crosslink haben kann innerhalb der kritischen Radius von Liganden. Falsche Negative können auftreten, wenn die Mutation der Vernetzer eingeführten die native Interaktion behindert, sondern auch auftreten kann, wenn die Vernetzung Glyko-entweder Weg von den Liganden Punkte durch das Lösungsmittel abgeschreckt wird oder Intramolekulare Vernetzung erfährt. Ein wesentlicher Bestandteil der Methode ist, wie das Auftreten der Vernetzung zu erkennen. In erster Linie sind ganze Zelle Lysates gelöst auf SDS-PAGE, alle Liganden zu trennen, die nicht kovalent an den Rezeptor gebunden ist. Zweitens ist der kovalente Ligand-Rezeptor-Komplex über westliche Beflecken mit einem Anti-Liganden-Antikörper erkannt. Für Peptid-Liganden sind hohe Affinität polyclonal Antikörper gegen die Liganden die optimale Wahl. Als Alternative können Peptid Liganden mit einem FLAG-Tag an einer freizügigen Position ausgestattet werden, vorausgesetzt, der Tag der Anti-FLAG Antikörper durch eine geeignete Abstandhalter zugänglich gemacht wird. Biotin-Tags können auch verwendet werden, obwohl Ergebnisse möglicherweise schwierig, aufgrund des Hintergrundes durch endogene biotinylierte Proteine zu interpretieren. Kleines Molekül Liganden sind in der Regel radioaktiv, obwohl Tag-Kennzeichnung auch möglich56,57sein kann. Protokolle für Azi Einbindung in GPCRs wurden auch von anderen57,58,59veröffentlicht. Aber diese Protokolle beinhalten die Verwendung von drei Plasmide Azi Aufnahme, während wir ein einfacheres zwei-Plasmid-System verwenden, einschließlich ein humanisierter gen für E2AziRS, besseres Ergebnis in Bezug auf die nicht-Codon-optimierten verleiht ein (Abb. 2 b).

Moderne mikroskopiertechniken erfordern sehr hell und effizient Fluorophore in das Protein des Interesses, als genetisch codierte Protein Fluorophore zu installieren, wie z. B. die klassische EGFP eignen sich nicht für High-End-Anwendungen. Daher ist eine kontinuierliche Suche nach Methoden, die es ermöglichen, Installation von organischer Fluorophore auf Proteine, die für die Entwicklung des beliebten SNAP60 und Halo61 Tags, zwischen anderen geführt hat. Allerdings haben solche Tags noch eine Größe von mehreren kDa, die die Funktion des Zielproteins durcheinanderbringen und lassen eine große Unsicherheit über die genaue Position der Fluorophor. Mit einer minimalen Größe von wenigen Aminosäuren stellt das Tetracysteine-Motiv eine kleinere Alternative zur genaueren Kennzeichnung mit Fluorescein oder Resorufin arsenhaltige Verbindungen (FlAsH, ReAsH)62,63. Obwohl dieser Ansatz sehr erfolgreich auch auf GPCR Studien64,65,66angewendet wurde, es erfordert umfangreiche Waschschritten mit Thiole, es leidet oft unter hoher Hintergrund und in jedem Fall ist es nicht erlaubt Positionieren das Etikett mit einer einzigen Rückstand Auflösung. Stattdessen bieten NcAAs mit Bioorthogonal Anker ausgestattet die Möglichkeit der Installation Fluoreszenzmarkierungen an einer einzigen Aminosäure-Position, minimiert so das Risiko von störenden mit nativen Konformation und Funktionalität des Zielproteins. Letzte Generation NcAAs für Bioorthogonal Chemie, wie die TCO * K13 hier angestellt haben aktiviert Protein Kennzeichnung direkt auf lebende Zellen17,43. Die Methode ist anwendbar auf Protein-Targets auf der Zelloberfläche, sondern auch gegen intrazelluläre Ziele, sofern geeignete Zelle durchlässig Farbstoffe verfügbar17,67,68 sind. SPIEDAC Chemie ist mehrere Größenordnungen schneller in Bezug auf Belastung gefördert Azido-Alkinen Cycloaddition (SPAAC) und Staudinger Bertozzi grundsätzlich auf Natriumazid Anker2,13. In der Tat wurden mehrere Protokolle für GPCR Kennzeichnung genetisch Azi integriert, aber sie nur für isolierte GPCRs in-vitro-37,59,69 geltenveröffentlicht. Stattdessen haben wir bewiesen hier glatt Bioorthogonal Kennzeichnung von funktionalen GPCRs auf die live-Zelle. Unser Protokoll ähnelt der bestehenden Protokolle verwenden die gleiche Chemie43,48,70, aber unsere optimierte ncAA Aufnahme System erweitert den Anwendungsbereich des Verfahrens GPCR-Studien. Ein wichtiger Schritt bei der Versuchsdurchführung ist die Wahl der Position mit TCO auszutauschenden * K, als nicht alle Positionen innerhalb der Rezeptor sind permissive für einen Ersatz oder die Fluoreszenzfarbstoff zugänglich. Daher sollten mehrere Positionen in einem vorläufigen Bildschirm am besten geeignet die richtige getestet werden.

Zusammenfassend stellt diese Arbeit Werkzeuge für den allgemeinen Gebrauch von NcAAs, einschließlich der Anwendung an anspruchsvollen Protein-Targets wie GPCRs. Wir erwarten, dass Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal, etikettieren, heute die Hauptanwendungen von NcAAs GPCR Studien, viele zukünftige Anwendungen beide Topologien von GPCR Wechselwirkungen mit Liganden oder andere Proteine zu enthüllen und GPCR studieren finden Strukturdynamik in der live-Zelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Stipendien CO822/2-1 (Emmy-Noether-Programm) und CO822/3-1 bis I.C gegründet

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844, (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38, (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7, (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126, (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132, (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134, (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136, (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128, (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13, (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4, (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134, (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128, (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135, (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131, (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4, (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131, (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13, (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136, (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30, (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3, (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10, (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155, (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117, (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7, (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292, (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289, (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10, (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32, (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49, (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5, (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136, (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283, (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19, (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3, (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2, (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531, (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531, (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137, (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22, (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics