Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

Biology

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Summary

L’objectif global de cette méthodologie est de donner les conditions expérimentales optimales de préparation des échantillons pour l’acquisition d’images et de la reconstruction afin d’effectuer des images dSTORM 2D bicolore des microtubules et des filaments intermédiaires dans les cellules fixes

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Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

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Abstract

Le cytosquelette, composé de microfilaments d’actine et les microtubules filaments intermédiaires (si), joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la polarité et la motilité. L’Organisation des réseaux actine et les microtubules a été particulièrement étudiée, mais celui d’IFs n’est pas encore pleinement caractérisée. IFs ont un diamètre moyen de 10 nm et forme un réseau s’étendant dans tout le cytoplasme de la cellule. Ils sont physiquement associés d’actine et les microtubules grâce à des moteurs moléculaires et linkers du cytosquelette. Cette association étroite est au cœur des mécanismes de réglementation qui assurent la régulation coordonnée des trois réseaux du cytosquelette requis pour la plupart des fonctions cellulaires. Il est donc indispensable de visualiser IFs seuls et aussi avec chacun des autres réseaux du cytosquelette. Cependant, les réseaux de IF sont extrêmement denses dans la plupart des types de cellules, en particulier dans les cellules gliales, qui rend sa résolution très difficile à réaliser avec la microscopie en fluorescence standard (latéral résolution de ~ 250 nm). Microscopie de Reconstruction stochastique optique directe (dSTORM) est une technique qui permet un gain en résolution latérale d’un ordre de grandeur. Ici, nous montrons que la résolution latérale dSTORM est suffisante pour résoudre l’organisation dense des réseaux IF et, en particulier, des faisceaux de IF entourant les microtubules. Serré de ces associations sont susceptible de participer à la régulation coordonnée de ces deux réseaux et mai, expliquer comment modèle IFs vimentine et stabiliser l’Organisation des microtubules ainsi que pourraient influencer microtubule dépendant du trafic vésiculaire. Plus généralement, nous montrons comment l’observation des deux composants du cytosquelette avec bicolores dSTORM technique apporte nouvel aperçu de leur interaction mutuelle.

Introduction

Les filaments intermédiaires cytoplasmiques (IFs) sont 10 nm de diamètre homo - ou hétéropolymères d’un sous-ensemble spécifique de type cellulaire des protéines de l’IF. IFs participent dans une large gamme de fonctions cellulaires telles que les réponses de stress, la prolifération et la motilité cellulaire. Leur rôle essentiel est souligné par le fait que plus de 90 maladies humaines sont directement causées par des mutations dans les protéines de l’IF ; par exemple, les changements dans la composition de l’IF accompagne la croissance tumorale et la diffusion de1,2,3. Il est plus en plus évident que les trois systèmes de cytosquelette travaillent en collaboration pour contrôler les fonctions cellulaires tels que la polarisation de la cellule, division et migration2,3. Étant donné qu’un couplage étroit entre l’architecture spatiale et fonctions, il est crucial d’obtenir des aperçus de la structure de l’organisation de la fi avec les autres filaments et mieux comprendre la diaphonie du cytosquelette. Cet article fournit un protocole pour effectuer la Super-résolution technique dSTORM bicolores (stochastique optique Reconstruction examen microscopique direct)4 et comment il est utilisé pour étudier l’interaction entre le si et les microtubules en fixe, cultivés cellules en 2 dimensions (2D).

Plusieurs techniques de Super-résolution ont été développées au cours de la dernière décennie et là-bas découvertes furent à l’origine du prix Nobel de chimie en 20145. Parmi toutes ces techniques se trouve les seule molécule axées sur la localisation des méthodes comme PALM6 (microscopie de localisation Photo-Activated) qui utilise des protéines fluorescentes ayant, tempête de7 paires de fluorophores ou dSTORM4 avec des fluorophores classiques. Toutes ces méthodes sont basées sur le même principe qui consiste en (i) l’interrupteur de la plupart des journalistes fluorescentes dans un état « off » » l’état de (non fluorescent), (ii) l’activation stochastique d’une partie d'entre eux dans un fluorescent afin de localiser leurs position spatiale avec précision nanométrique et (iii) la répétition de ce processus afin d’activer autant de sous-ensembles de fluorophores que possible. Une image finale est reconstruite à l’aide de toutes les localisations des molécules activées, offrant une résolution latérale vers le bas pour ~ 20 à 40 nm. Plusieurs systèmes optiques commercialisés permettant PALM/STORM sont maintenant disponibles pour les biologistes pour expériences de routine. Ici, un tel système a été utilisé pour étudier l’association structurelle des microtubules et IFs. Parmi toutes les molécules simples axées sur la localisation méthodes, la technique de double-couleur dSTORM a été choisie, parce qu’il est bien adapté pour l’observation des régions lamellaires très minces (< 1 µm) des cellules adhérentes et peut apporter une amélioration significative de la résolution de l’image avec investissement minimal de temps et d’argent. En effet, dSTORM est une technique très pratique et polyvalente qui est compatible avec les colorants organiques standards couramment utilisées pour la coloration cellulaire et immunofluorescence.

Alors qu’une seule couleur dSTORM images sont relativement simples à obtenir en utilisant le fluorophore Alexa6478, dSTORM bicolore nécessite d’optimiser les conditions expérimentales afin que deux colorants peuvent clignoter correctement dans le tampon choisi, surtout si il est limité puissance du laser. Excellentes communications sont déjà disponibles sur les méthodes à mettre en place l’imagerie multicolore avec dSTORM9,10,11,12,13, et ces documents expliquent en détail les sources possibles de artefacts et la résolution de l’image dégradée ainsi que la façon de les surmonter. Dans cet article, les conditions expérimentales optimales en ce qui concerne la fixation des cellules, immunomarquage, préparation des échantillons, acquisition d’imagerie et la reconstruction de l’image sont décrits afin d’acquérir des images des réseaux denses de IF cytoplasmiques et microtubules dans cellules gliales avec dSTORM bicolores. En bref, la méthode d’extraction/fixation décrite à Chazeau et al.12 a été adaptée aux cellules gliales et utilisé avec une étape après fixation, concentration d’anticorps optimisée, un tampon de tempête avec 10 mM MEA décrit dans Dempsey9 et coll., qui a été jugées optimales pour l’expérimental mis en place et le type d’échantillon.

Les cellules gliales expriment principalement trois types de protéines IF : vimentine, nestin et GFAP (glial protéine fibrillaire acide). Ces trois protéines ont été montrés à polymériser conjointement dans les astrocytes14. Nous avons montré précédemment à l’aide de la microscopie d’illumination de Super-résolution structurée (SR SIM) que ces trois protéines IF se trouve dans le même filament unique de IF et qu’ils affichent semblables de distribution et de la dynamique dans les cellules gliales 15. En raison des similitudes entre les trois protéines IF, vimentine coloration a été utilisée comme reporter pour l’ensemble du réseau IF. À l’aide de dSTORM, nous avons réussi à résoudre Comment former des faisceaux IF le long des microtubules, qui n’était pas possible avec la diffraction limitée des techniques de microscopie15. Ces observations peuvent aider à comprendre comment la vimentine IFs peuvent microtubules modèle et réglementer leur trajectoire de croissance, favorisant le maintien d’un axe de polarité au cours de la migration de cellules16. Images de Super-résolution fourni des informations clées sur l’interaction mutuelle des deux sous-systèmes du cytosquelette et amené à mieux comprendre le lien entre l’association spatiale et la fonction locale qui pourrait être de type cellulaire spécifique17. En général, bicolores dSTORM peut servir à étudier la diaphonie entre les éléments du cytosquelette ou autres types d’organites, pourvu que l’immunomarquage bonnes conditions sont atteintes en termes de densité et de la spécificité. Cette technique sera utile pour mieux caractériser les cytosquelette des changements observés au cours de l’astrogliosis et dans le glioblastome, la tumeur plus malins et les plus courants du système nerveux central, où l’expression des protéines de l’IF est modifié 18 ,19,20,21.

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Protocol

1. couvre-objet en préparation (1 jour, 30 min)

  1. Placez les lamelles de verre de 18 mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) sur une grille en plastique.
  2. Mettre le panier dans un bécher de 100 mL rempli d’acétone et laisser tremper pendant 5 min.
  3. Transférer la crémaillère dans un bécher de 100 mL rempli d’éthanol absolu et laisser tremper pendant 5 min.
  4. Transférer la crémaillère dans un bécher de 100 mL nouveau rempli avec de l’éthanol absolu et placer le bécher dans un dispositif de nettoyeur à ultrasons (voir Table des matières) à température ambiante. Appuyez sur « on » et attendez pendant 10 min.
  5. Le panier sous une hotte à flux laminaire et laisser les lamelles sécher ou séchez les lamelles couvre-objet avec flux d’air filtré.
  6. Mettre le panier avec les lamelles dans un dispositif plus propre au plasma. Mettre en marche la pompe à vide, fermez la porte, attendez 3 min faire le vide et allumez le plasma pendant 1 min. utilisation du couvre-objet en peu de temps après le nettoyage. Ne pas les entreposer.

2. cellule électrodéposition (1 jour, 20 min)

  1. Cultiver la lignée de cellules gliales U373 dans le moyen essentiel Minimum (MEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % la pénicilline-streptomycine et 1 % non essentiels acides aminés en Pétri en plastique de 10 cm de diamètre.
  2. Placez les lamelles de verre propre en plaques de 12 puits sous la hotte à flux laminaire et ajouter 1 mL de milieu préchauffé cellules par puits.
  3. Prendre un plat contenant des cellules de l’incubateur de cellules (37 ° C, 5 % de CO2).
  4. Enlever le milieu et ajouter 10 mL de PBS.
  5. Retirez le PBS et ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA.
  6. Remettre le plat dans l’incubateur pendant 2-3 min.
  7. Ajouter 10 mL de milieu chaud préalablement chauffé à 37 ° C sur le plat et remettre les cellules en suspension.
  8. Semences environ 100 000 cellules / puits (~ 150 µL de cellules) dans les plaques de 12 puits contenant les lamelles couvre-objet.
  9. Attendre au moins 6 h (ou toute une nuit) permettre la propagation de la cellule.

3. fixation cellules (jour 2, 2h)

  1. Préparer le tampon du cytosquelette avec tuyaux de 80 mM, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl et ajuster le pH à 6,9.
  2. Laver les cellules une fois avec du PBS.
  3. Retirez le PBS et doucement ajouter 1 mL par puits de solution d’extraction/fixation (glutaraldéhyde à 0,25 %, 0,3 % Triton X-100 dans le tampon du cytosquelette) préalablement chauffé à 37 ° C.
  4. Incuber pendant 60 s à température ambiante.
  5. Enlever la solution et ajouter doucement 1 mL par puits de préchauffé et fraîchement préparée 4 % solution PFA (paraformaldéhyde) diluée dans le tampon du cytosquelette.
    Mise en garde : Utilisez des gants et travailler sous la hotte chimique.
  6. Replacez la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37° C pendant 10 min.
  7. Retirez la PFA et ajouter 3 mL de PBS / puits.
    Remarque : Travailler sous la hotte chimique avec des gants et mettre la PFA recyclé dans un bac spécifique.
  8. Laver deux fois avec du PBS.
  9. Supprimez les PBS et solution fraîchement préparée de 10 mM NaBH4 diluée dans du PBS pour étancher l’autofluorescence venant de glutaraldéhyde.
  10. Incuber pendant 7 min à température ambiante.
  11. Mettre le recyclé NaBH4 dans un bac spécifique.
  12. Laver trois fois 5 min avec du PBS.
  13. Retirer le PBS et ajouter la solution de saturation (solution à 5 % de BSA dans du PBS).
  14. Incuber pendant 1 heure à température ambiante (ou toute la nuit à 4 ° C).
    Remarque : Le tampon du cytosquelette peut être stocké à température ambiante pendant quelques mois. PFA, NaBH4 et glutaraldéhyde doivent être manipulés avec soin (cagoule, des gants et des bacs de recyclage spécifiques). Des solutions doivent être ajoutées et supprimées doucement afin de préserver l’intégrité des cellules. Il est important de ne pas laisser les cellules sèches.

4. Immunostaining (jour 2, 5h)

  1. Préparer la solution d’anticorps primaires avec une dilution de 1/500 dans la solution de blocage anti-vimentine et anti-tubuline.
  2. Mettez 100 gouttes µL d’anticorps primaires dilués sur une couche de film de paraffine et placez les lamelles au-dessus d’eux avec des cellules vers le bas.
  3. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant 2 h. Mettez les lamelles dans une assiette de 12 puits remplis avec du PBS. Rincer trois fois pendant 5 min chaque fois dans du PBS à température ambiante dans un agitateur orbital.
  4. Pendant ce temps, préparer la solution d’anticorps secondaires à l’aide de anti-souris Alexa647 et anti-rat Alexa555 à une dilution d’un 1:1, 000 dans la solution de blocage. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Procéder comme 4.2. protéger les cellules contre la lumière.
  5. Remettre le couvre-objet dans une plaque de 12 puits remplie de PBS. Rincer trois fois pendant 5 min chaque fois dans du PBS à température ambiante dans un agitateur orbital. Retirer le PBS et ajouter 0,5 mL de PBS mélangés avec 1 µL de 0,1 µm tetraspeck perles.
  6. Mettre les puits dans un agitateur orbital pendant 30 min. rincer avec du PBS. Retirez le PBS et incuber les cellules pendant 5 min avec une solution PFA de 4 % dans du PBS. Rincer trois fois dans du PBS.
    Remarque : Les cellules fixes peuvent être conservés pendant quelques semaines dans du PBS à 4° C. Immunomarquage doit être effectué à la dernière minute.

5. préparation (jour 3, 5 min)

  1. Mettre des parties aliquotes de MEA (cystéamine, 1 M, pH 8.3), la glucose oxydase (100 x, 50 mg/mL), catalase (500 x, 20 mg/mL) dans un panier de glace.
  2. Préparer 50 mL de tampon Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) additionné de 10 % de glucose (100 mg/mL).
  3. Préparer 1,2 mL d’imagerie tampon juste avant l’imagerie avec 10 mM MEA, glucose oxydase de 0,5 mg/mL (75 U/mL), 40 catalase µg/mL (80-200 U/mL) dans du tampon Tris-NaCl avec 10 % de glucose.
  4. Monter la lamelle contenant les cellules marquées sur le porte-échantillon magnétique (par exemple chamlide chambre) et ajouter le tampon d’imagerie pour remplir entièrement la chambre. Mettre le couvercle et assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air entre le tampon de l’imagerie et le couvercle.
  5. Nettoyer le fond de l’échantillon avec de l’éthanol absolu et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite. Utiliser de graisse pour sceller le porte-échantillon correctement si nécessaire.
    Remarque : Préparation 1 M stock de solution MEA (pH 8,3 ajusté à l’aide de HCl), stock de glucose oxydase à 50 mg/mL et stock de catalase à 20 mg/mL dans l’eau, faire aliquotes et stockez-les à-20 ° C pour environ un mois pour MEA et un an pour la glucose-oxydase et catalase. Ne recongelez pas les parties aliquotes. Préparer le tampon Tris-NaCl à l’avance et les conserver à température ambiante pendant plusieurs mois. Ajouter le glucose sur le jour de l’expérience (étape 5.3).

6. l’acquisition (jour 3, ~ 1h par cellule)

  1. Allumez le microscope. Mettre en marche le logiciel d’acquisition et appuyez sur Start système.
  2. Sélectionnez l’Acquisition Tab. Expand l’outil d’Installation d’imagerie dans le groupe d’outils de gestion d’installation. Sélectionnez le mode laser WF (grand champ) d’acquisition. Sélectionner l’objectif 100 X NA 1,46 . Sélectionner le mode de La FRBR u-HP qui utilise un collimateur pour réduire le champ de vision étant illuminé et concentrer l’énergie du laser dans une zone plus petite. Utilisez l’optovar objectif 1.6 × qui donne une taille de pixel de 100nm.
  3. Sélectionnez l’outil de séries temporelles et mis en place le laps de temps de 50 000 cadres et 0.0 ms entre les cadres. Développez l’outil de canaux dans le groupe d’outils Acquisition paramètre et sélectionnez « Afficher tout ».
  4. La voie Alexa647 : Vérifiez le 642 et 405 lignes pour excitation au laser et accepter de les allumer. Sélectionnez le filtre d’émission « 655 LP » dans le Setup d’imagerie. Renommez « 647 ».
  5. Cliquez sur « + » dans l’outil de canaux pour ajouter une autre lumière passe, puis choisissez le mode « commutateur piste chaque : cadre » dans l’outil D’installation d’imagerie . Vérifiez 561, 488 et lignes laser 405 et accepter de les allumer. Sélectionnez le « BP 570-650 + LP750 » émission filtrer et utiliser optovar lentille 1,6 x. Vérifiez que le mode de la FRBR-uHP est sélectionné. Renommez la piste « 555 ».
  6. Sélectionnez l’outil mode d’Acquisition et la taille de l’image de 200 x 200 pixels. Sélectionnez l’outil de stratégie et dispositifs de mise au point , puis affectez-lui la mise au point définitive de 1 000 images (s’il y a un système de verrouillage de la mise).
  7. Mettre l’huile sur l’objectif et mettre l’échantillon sur. Sélectionnez l’onglet Rechercher et ouvrir l’obturateur de la lampe à fluorescence. Recherchez la mise au point et la cellule d’image à l’aide de l’oculaire. Mettez-le dans le centre du champ de vision à l’aide de la manette.
  8. Sélectionnez l’onglet Acquisition pour revenir au mode d’acquisition. Sélectionner la piste « 647 », sélectionner la puissance de 642-laser à 0,2 %, régler la puissance de 405-laser à 0, définissez la durée d’exposition à 50 ms et le gain de 50. Choisissez le mode d’acquisition continue d’observer la cellule sur l’écran. Ajuster la mise au point. Assurez-vous qu’il y a au moins une bille de tetraspeck dans le champ de vision, augmenter le contraste pour voir si nécessaire. Utiliser un mode d’échelle automatique pour l’affichage. Prendre une image grand champ épifluorescence du réseau vimentine en cliquant sur Aligner , puis enregistrez-le. Pour vérifier l’éclairement de la FRBR, cliquez sur FRBR, régler l’angle d’éclairage et/ou de collimateur si nécessaire d’avoir un champ homogène de l’éclairement et enregistrez-le.
    Remarque : Il est important que les images de la FRBR et épifluorescente sont de haute qualité avant de commencer l’acquisition de données brutes. Filaments discontinus et non uniformément marqués donnera lieu aux images de qualité médiocre dSTORM.
  9. Décochez la piste « 647 » et sélectionnez Vérifier la piste « 555 ». Prendre une image de fluorescence incidente du réseau de microtubules et enregistrez-le. Prendre une image de la FRBR et enregistrez-le trop.
  10. Décochez la piste « 555 », sélectionnez et vérifier la piste « 647 », puis appuyez sur continu. Mettre le gain à 0 et durée d’exposition à Mme 10 régler la puissance de laser 642 nm à 100 % pour la plupart des colorants Alexa647 de pompe à l’État foncé (~ 2 kW/cm2). Une fois les fluorophores commence à clignoter, Enfilez l’exposition à 15 ms et gagner à 300. Sélectionnez le mode de la FRBR d’illumination. Utilisez le mode indicateur de gamme sans échelle automatique afin de vérifier que les signaux seule molécule ne pas saturent la caméra (indiquée par la couleur rouge). Dans ce cas, diminuer le gain jusqu'à ce que disparaisse la saturation. Tetraspeck perles resteront saturées au début de l’acquisition. Appuyez sur arrêter pour arrêter l’observation continue de la cellule.
  11. Développer l’outil en ligne de traitement et vérifier en ligne traitement PALM pour visualiser l’image de tempête au cours de l’acquisition. Utilisez les paramètres suivants : 9 pour la taille de masque Peak (diamètre de 9 pixels) et 6 pour le pic d’intensité au bruit. Paramètres de thèses définira les molécules qui sont pris en compte dans le traitement (assez lumineux et non superposition). Dans l’outil PAL-statistiques , sélectionnez le type de tracé : histogrammeet histogramme Source : précision. Appuyez sur Start acquisition.
  12. Lors de l’acquisition, recentrer si nécessaire (si il n’y a aucun dispositif de verrouillage de la mise). Ajuster les paramètres (exposition, puissances de laser) et finalement passer la ligne 405 nm laser (commençant à 0,001 %) maintenir une densité moyenne de fluorophores avec une distance minimale de 1 µm entre molécules simples (> 9 pixels de 100 nm, la taille du masque Peak) ( Figure 1 a-B). Si la densité de la molécule est un peu trop élevée, utilisez le mode de HILO (feuille très incliné et stratifié optique) d’illumination au lieu de la FRBR. Cela augmentera la puissance de laser de 20 %. S’assurer que la pointe de la précision de localisation sur l’histogramme ci-dessous l’image reconstituée est centrée autour ou inférieure à 10 nm.
    Remarque : Le nombre de molécules diminue habituellement avec le temps, et la puissance de 405 nm laser est augmentée lentement en conséquence. Le but est de diminuer la précision de localisation (histogramme affichée sous l’image de Super-résolution) autant que possible avec un pic inférieur à 10 nm (Figure 1). Augmenter le contraste de l’image PALM, le cas échéant, si trop de perles brillantes sont présentes sur le terrain.
  13. Appuyez sur arrêter pour arrêter le film lorsque plus de 106 localisations ont été atteints (généralement après de 40 000 images). Mettre les lasers à 0,2 % (642 nm) et 0 (405 nm). Enregistrer les données brutes de l’acquisition de tempête avec le format .czi. Décochez la case piste « 647 » dans l’outil de canaux et sélectionnez Vérifier la piste « 555 ».
  14. Définir la durée d’exposition à 25 ms et gagner à 0. Appuyez sur le bouton continue et régler les lasers 488 et 561 à 100 % aux colorants Alexa555 pompe à l’État foncé (~ 2 kW/cm2 chacun). Une fois les fluorophores commence à clignoter, mettre le gain à 250, utilisez le mode d’éclairage de HILO et vérifiez que les molécules simples ne pas saturent la caméra avec le mode indicateur de portée. Si tel est le cas, diminuer le gain. Appuyez sur arrêter. Diminuer la puissance de 488-laser à 50 %.
  15. Appuyez sur Start acquisition. Lors de l’acquisition, augmenter progressivement le gain pour toujours être à la limite de saturation. Augmenter progressivement la puissance du laser de 405 nm pour garder une densité moyenne de la molécule unique dans le champ de vision (Voir l’étape 6.18). Diminuer la puissance de 488 laser à 20-30 % quand le laser 405 est supérieure à 15 %. Puis diminuer progressivement les 488 tout en augmentant la ligne 405 laser afin de garder le clignotement des molécules aussi vite que possible. La ligne 488 laser couplée avec le laser de 561 excitation à intensité maximale augmente la sur piste et sur les tarifs des fluorophores, alors que la ligne 405 laser ne fait qu’accroître le taux sur.
  16. Arrêter l’acquisition lorsque plus de 500 000 localisations ont été atteints (après environ 20 000 cadres) ou plus lorsque aucun plus de molécules ne clignotent. Enregistrer les données brutes de l’acquisition de tempête avec le format .czi.
    Remarque : Commencez toujours par la longueur d’onde plus élevée afin d’éviter le blanchiment (ou activation) des autres couleurs. Étant donné que la chambre de chamlide n’est pas étanche, il est possible de changer le tampon d’imagerie régulièrement, par exemple pour tester des conditions différentes de tampon. À l’aide de la ligne 488 laser pour épuiser les colorants Alexa 555 est nécessaire uniquement lorsque la puissance du 561 laser est limitée (avec lasers à 100 mW).

7. image reconstruction (5 min)

  1. Dans l’outil PAL-Drift , utilisez le type de correction basée sur des modèles avec des segments automatiques avec une taille maximale de 8. Appuyez sur appliquer plusieurs fois de suite jusqu'à ce que la dérive est corrigée. Cette correction basée sur des modèles s’applique un algorithme basé sur l’analyse de corrélation croisée qui corrige la dérive.
  2. Grâce aux outils PAL-filtre , améliorer l’apparence de l’image de tempête en sélectionnant seulement les molécules qui ont été mieux localisées. Par exemple, limitent la précision de localisation à 30 nm et les fibres discontinues de polyesters à 120-180 nm.
  3. Utilisez une résolution de pixels de 5 ou 10 nm dans l’outil PAL-rendu , mais aussi un mode d’affichage gaussienne, avec un facteur d’expansion de 1 polyesters. Sélectionnez rendre auto gamme dynamique HR avec une valeur de 95 % et rendu automatique dynamique SWF avec une valeur de 90 %. Sélectionnez la meilleure qualité de rendu.
  4. Sélectionnez convertir les palmiers, dans le menu de la palme de l’onglet transformation (mode post-traitement). Appuyez sur Sélectionner , puis appliquer. Enregistrez l’image créée avec un format. LSM (et pas .czi, très important).
    Remarque : La reconstruction de l’image peut être réalisée immédiatement après l’acquisition ou au plus tard en utilisant le mode de traitement d’image du logiciel acquisition. Dans la hors ligne mode de post-traitement, il est possible d’analyser à nouveau les piles avec différentes valeurs de paramètres (taille de masque de pic, pic d’intensité au bruit). Toujours choisir de « jeter des molécules qui se chevauchent » et pas « moyenne avant la localisation ».

8. estimation de la précision de la localisation d’une image de tempête (10 min)

  1. Ouvrez vos données brutes de la tempête et utilisez le traitement d’Image onglet sélectionner la méthode PALM et puis PALM à nouveau. Appuyez sur Select.
  2. Appuyez sur Apply pour commencer la reconstruction à l’aide d’une taille de masque de pic de 9 et un pic d’intensité au bruit de 6 (ou les paramètres que vous choisissez pour l’image).
  3. Sélectionnez l’outil graphique de rectangle et dessinez un rectangle sur l’image raw autour d’une seule molécule présente à la surface du verre. Il y a habituellement quelques molécules simples là.
  4. Appuyez sur appliquer à nouveau et seulement les molécules présentes à l’intérieur de la région de rectangle seront analysé.
  5. Dans l’outil PAL-statistiques , sélectionnez le type de tracé : histogramme et la Source de l’histogramme : X position ou Y, de visualiser les histogrammes de position.
  6. Enregistrez la table avec la liste des localisations sur la gauche sous les images.
  7. À l’aide d’un logiciel d’analyse de données, créer des histogrammes de X et Y des positions (Figure 1).
  8. Monter les distributions par une gaussienne et sauver le σX et σ des valeursY . Le σ de précision de localisationSMLM est estimé par (σX *σY) ^ 0.5.
  9. Répétez l’étape 8.3-8,8 sur des molécules autant que possible et en moyenne le σSMLM

9. canal enregistrement (5 min)

  1. Ouvrez l’image de tempête de chaque couleur en utilisant le logiciel de Fidji (Image J).
  2. Sélectionnez l’outil baguette magique pour mesurer les positions de chaque tetraspeck des perles.
  3. Calculer les décalages X et Y pour chaque perle et leur moyenne.
  4. Utilisez la commande « Traduire » pour traduire la deuxième image avec le calculé les décalages X et Y.
  5. Fusionner les deux images à l’aide de la commande Merge canaux.

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Representative Results

Un microscope équipé de caméra de 512 x 512, un alpha Plan Apo 100 X 50 mW 405 nm et les 100 mW 488, 561 et 642 nm à semi-conducteurs lasers, une EMCCD / 1,46 objectif et Band passent 570-650 / passent longtemps 655 filtres d’émission a été utilisé pour les résultats représentatifs présentés ci-dessous.

Figure 1 a donne un exemple de la densité de la molécule et de signal / bruit qui doit être utilisé lors de l’acquisition de l’image raw. Images de bonne qualité sont obtenues avec un minimum d’environ 1 µm entre molécules voisines. Dans de bonnes conditions de clignotantes, fluorophores devrait être présents dans un seul cadre. Bon clignotement requiert pour ajuster les conditions d’imagerie de tampon (pH, agent réducteur, oxygène nettoyage système) et des puissances de laser, qui influencent les sur - et hors-taux des fluorophores et par conséquent le devoir cycle (la fraction de temps dans qu'un fluorophore passe l’État sur)9,11. Figure 1 b, au contraire, donne un exemple d’image raw où la densité de la molécule est trop élevée et seule molécule ne peut pas être résolu.

La figure 1 montre un histogramme typique des précisions de localisation pour toutes les molécules détectées et analysées par le logiciel de fabricant d’une pile de 20 000 images. Cet histogramme correspond à l’image de dSTORM du réseau microtubulaire illustré à la Figure 3 b. Les valeurs des précisions de localisation fournies par le logiciel de fabricant sont en bon accord avec les valeurs estimées suivant étape 8, à l’aide de la précision de pointage d’une molécule unique, localisée à des temps différents points22 (Figure 1).

Figure 2 a montre un exemple typique de dSTORM image de vimentine filaments immunomarquées avec Alexa647. L’augmentation de résolution s’observe clairement sur la comparaison avec l’image acquise avec un microscope à champ large standard (Figure 2 b-C). Les profils d’intensité de fluorescence représentées en Figure 2D montrent que Super-résolution microscopie imagerie permet de résoudre les faisceaux de la vimentine. La résolution de dSTORM suffit de compter le nombre de présents dans les faisceaux de filaments.

La figure 3 montre un exemple typique de bicolores dSTORM image de la vimentine et la tubuline immunomarquées de réseaux avec Alexa647 et Alexa555 respectivement. La superposition des deux réseaux montre que les faisceaux de vimentine sont souvent localisées le long des microtubules, fournissant des informations structurelles clées sur le couplage entre les deux sous-systèmes de cytosquelette.

La figure 4 illustre les divers exemples d’images de dSTORM de microtubules obtenues dans des conditions non optimale. Tout d’abord, à l’aide de Alexa488 et un tampon avec 143 mM bêta-mercaptoéthanol (un autre agent réducteur utilisé à la place de10,9,MEA11) et un système de nettoyage de l’oxygène (composé de glucose oxydase de 0,5 mg/mL et 40 µg/mL catalase), les fluorophores étaient clignoter mais n’étaient pas assez brillantes pour être précisément localisé (nombre trop faible de photons) (Figure 4 a). Deuxièmement, utilisez Alexa555 avec bêta-mercaptoéthanol 143 mM, 50 mM MEA et un oxygène nettoyage système, les fluorophores ne pourrait pas être pompées à leur état sombre et donc ne pas bien spatialement séparés (cycle d’utilisation trop élevée, c'est-à-dire la fraction du temps dans l’État « on » est trop long) (Figure 4 b). Enfin, à l’aide de Alexa568, avec bêta-mercaptoéthanol 143 mM, 50 mM MEA et un oxygène nettoyage système, les fluorophores n’ont pas été brillants et ont été clignotant lentement avec très longtemps « on » et « off » États (photon faible nombre et trop haut facteur de marche) (Figure 4). Dans toutes ces conditions non optimales, le réseau de microtubules était mal rendu dans les images de Super-résolution. En conclusion, les conditions optimales exigent des fluorophores avec nombre de photons de haute et faible facteur de marche9,10 dans le tampon d’imagerie correspondant. Notez que l’optimisation de densité d’étiquetage et d’imagerie conditions de tampon pour obtenir de bonnes conditions de clignotantes est une procédure normale pour les bicolores dSTORM et ne sont pas spécifique à l’imagerie de l’IF-microtubule.

Selon le théorème de Nyquist-Shannon, il est nécessaire d’avoir des fluorophores au moins tous les 10 nm d’avoir une résolution de 20 nm. Étendu aux structures 2D, Dempsey et coll. a estimé qu’un marquage des fluorophores4 ~ 10 par µm2 est nécessaire. Le réseau s’est plus dense et ses filaments sont plus mince (10 nm vs 25 nm de diamètre sans les anticorps primaires et secondaires) comparer au réseau de microtubules, nous avons observé que deux fois plus de localisations sont nécessaires pour décrire le réseau IF. Nous avons obtenu de bonnes images de 5 000 localisations/µm2 car si et localisations/µm² 2500 pour les microtubules, obtenus avec des trames de 40 000 et 20 000 respectivement. L’image avec la résolution la plus élevée a été obtenue avec une précision de localisation de σSMLM ~ 8-12 nm a estimé après l’étape 8 du protocole (pointage de précision d’une molécule unique, localisée à différents temps de22points). Cette estimation de la précision de localisation est en bon accord avec les valeurs fournies par le logiciel de fabricant montré un histogramme des précisions de localisation extrait toutes les molécules détectées dans les données brutes (exemple illustré à la Figure 1). Cette précision de localisation pourrait fournir une image avec une résolution d’environ 30 nm (2,35 * précision) si l’étiquetage de la densité est assez élevée. Nous avons observé systématiquement vimentine filaments avec une pleine largeur à moitié Maximum (FWMH) de ~ 40 nm et les microtubules avec une largeur FWMH de ~ 55 nm. Étant donné que la résolution de l’image dépend à la fois la précision de la localisation et la densité de localisation, nous fournissons les conditions expérimentales qui permettent les meilleurs résultats en tenant compte de ces deux critères.

Figure 1
Figure 1 : Densité optimale de molécules uniques au cours de l’acquisition et localisation estimation de précision.
(A-B)
Gauche : Images raw représentatives d’une seule image avec une densité optimale de molécules uniques à l’État vif (A) et d’une densité trop élevée (B) lors de l’acquisition de tempête (étape 6.12.) de fixe U373 cellules colorées avec anti-vimentine et anti-souris Alexa647. Droit : Images RAW où les molécules simples avec niveau de fluorescence plus haut le pic d’intensité au seuil de bruit (chiffre 6) sont entourés de cercles (blanc ou rouge). Le diamètre du cercle est défini par la taille de masque Peak (défini à 9 pixels) et la couleur détermine si les molécules chevauchent (rouge) ou non (blanc). Notez que la densité élevée de molécules simples (en B) conduisent à une grande quantité de chevauchement des molécules qui ne sont pas pris en compte pour la reconstruction d’image de tempête. A en médaillon : graphique montrant un profil d’intensité de fluorescence typique d’une molécule unique en rouge et son gaussien s’adapter en noir. Dans cet exemple, la précision de localisation est σx = 6,7 nm. Echelle, 1 µm. histogramme typique (C) des précisions de localisation pour toutes les molécules détectées et analysées par le logiciel du fabricant. Elle peut être visualisée et est mis à jour régulièrement au cours de l’acquisition des données brutes grâce à la transformation en ligne. Cet histogramme correspond à l’image de dSTORM du réseau microtubulaire illustré à la Figure 3 b. (D) Gauche : Image de tempête d’une seule molécule présente sur la surface du verre après reconstruction. Droit : Histogrammes des positions X et Y obtenues après ajustement gaussien. Gaussienne montage les distributions de X et Y donne une estimation de la précision de localisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Image représentant dSTORM d’un réseau de vimentine. dSTORM image (A), correspondant standard grand champ image (B) et (C) montrant le bord d’attaque d’une cellule gliale U373 fixe tel que décrit dans le protocole et colorés pour la vimentine avec Alexa647 de superposition. En bas : zoom de la zone sélectionnée. Profils d’intensité transversale (D) le long de la ligne jaune sur les images avec zoom à A et B. échelle bar, 2 µm et 500 nm dans le zoom. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Image dSTORM bicolore représentant des réseaux vimentine et les microtubules. (A) réseau de vimentine colorées avec Alexa647 (même comme dans la Figure 2 a). (B) réseau de microtubules marqué avec Alexa555. (C) superposition de la vimentine (rouge) et les réseaux de microtubules (cyan) avec une région de zoom sur la droite. L’image dSTORM de la vimentine est obtenu avec ~1.5 million de localisations hors de 40 000 cadres. L’image de dSTORM de microtubules a été obtenue avec localisations ~ 850 000 hors 20 000 cadres. Balance bar, 2 µm et 500 nm dans le zoom. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemples des conditions d’imagerie non optimale des microtubules. Quand les fluorophores clignote mais ne sont pas assez brillantes avec un étiquetage Alexa488 de tubuline dans les cellules gliales U373 et 143 mM BetaMercaptoethanol et désoxygénant dans le tampon d’imagerie (A), lorsque les fluorophores sont assez brillantes, mais ne peut pas être correctement appauvri en l’État foncé (à la puissance du laser maximale disponible) et clignotent lentement avec Alexa555 marqués de tubuline dans 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA et tampon de charognard d’oxygène (B) et lorsque les fluorophores clignotent lentement et ne sont pas lumineuses à l’aide de Alexa568 marqués de tubuline dans un tampon de tempête qui contient 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA et désoxygénant (C). Dans tous ces cas, les images dSTORM ont dégradé la résolution. Balance bar, 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Image représentative bicolores dSTORM de vimentine et microtubules réseaux d’une cellule U373 fixe avec du méthanol froid pendant 5 min. (A) réseaux de microtubules vimentine et (B) marquée à Alexa647 et Alexa555 respectivement avec des zooms en surbrillance. Noter la présence de molécules simples à l’avant des cellules localisées dans le cytoplasme, réduction de la résolution globale des réseaux de filaments. Balance bar, 2 µm et 500 nm dans le zoom. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison des dSTORM reconstruit des images
DSTORM reconstituées image par le logiciel de fabricant (A) et orage (plugin de Fidji) (B). (C) superposition de (A) en magenta et (B) en vert. Balance bar, 2 µm et 500 nm dans le zoom. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Étapes cruciales dans le protocole

Nous présentons ici un protocole qui minimise les artefacts dans les images dSTORM des microtubules et IFs dans les cellules gliales. Artefacts peuvent être créées à chaque étape de la préparation de l’échantillon et l’imagerie : fixation, blocage, immunomarquage, dérive pendant l’acquisition, non-optimale clignotant conditions23. Nous énumérons ci-dessous les étapes plus critiques.

Les lamelles de nettoyage est une étape importante pour limiter la liaison non spécifique des fluorophores sur la surface et donc de limiter le bruit de fond à l’image de dSTORM.

Nous suggérons de fixation de l’échantillon avec une étape d’extraction et la fixation des solutions utilisant un mélange de glutaraldéhyde et triton, puis fixation avec PFA (paraformaldéhyde) (étape n ° 3). Le protocole de fixation est une adaptation de Chazeau et al.12: nous avons réduit la durée de l’extraction/fixation étape d’incubation à 60 s (étape 3.4), retirer le glucose de la mémoire tampon de cytosquelette et sauté l’étape-extra de perméabilisation. L’avantage de cette méthode est que les sous-unités du cytosquelette librement mobiles sont drainées, ce qui permet l’imagerie Super-résolution avec moins de fond12. Plus généralement, l’étape de fixation est critique car plomb mauvaise fixation (à l’aide de vieux PFA, les solutions de froides, les étapes d’incubation trop long/court) à une destruction partielle des réseaux de filaments (microtubules brisés, les microtubules qui ne parviennent pas à l’avant de la cellule et/ou en une faible densité). Notez qu’il est également possible d’utiliser la fixation de méthanol, surtout si seulement le réseau de la vimentine est imagé comme décrit dans Leduc et al.,15. Cependant, le bruit de fond peut être observée à l’intérieur de la cellule (Figure 5). Bien que dSTORM images obtenues avec du méthanol fixée les cellules sont de moins bonne qualité, elles continuent de fournir d’informations sur ce que les deux si et réseaux microtubulaires doivent se présenter comme par exemple en terme de densité de filament. Fixation avec seulement glutaraldéhyde a donné des résultats très médiocres pour IFs, bien qu’il soit le meilleur protocole pour microtubule fixation23.

Dans la partie de l’immunohistochimie, il est important d’utiliser des anticorps anti-souris qui minimisent la réaction croisée avec les anticorps développés chez le rat. Nous ne pouvions pas utiliser les fragments Fab (anti-souris) pour cette raison, parce qu’ils ont une réaction croisée non spécifique avec la anti-tubuline rat en plus de la souris anti-vimentine.

En raison de la puissance du laser limités disponible, il est nécessaire d’utiliser les 488 561 nm laser lignes et pour pomper les colorants Alexa555 à l’État foncé. Haute puissance de laser 488 (~ 50 %) est également nécessaire lors de l’acquisition d’observer bon clignote et le faible rapport cyclique (la fraction de temps un fluorophore passe dans l’État sur), même si elle augmente ainsi le bruit de fond. Le mode d’éclairage FRBR limite l’excitation des fluorophores en couche mince (~ 200 nm au-dessus de la lamelle de verre). Il augmente le rapport signal sur bruit en diminuant le rétroéclairage, mais diminue également la puissance d’excitation. Le mode de HILO permet des coupes axiales et peut s’avérer efficace pour optimiser le rapport signal-bruit. C’est donc un bon intermédiaire entre l’epi et de la FRBR. Le mode de HILO est essentiel pour exciter efficacement les fluorophores Alexa555, qui nécessitent une puissance laser haute à clignoter correctement.

Une autre étape critique est l’acquisition des données brutes (étape 6). Il est nécessaire d’ajuster les paramètres d’acquisition (exposition, gain, FRBR et accent même lorsqu’aucun périphérique de bloc de mise au point n’est disponible) tandis que le film est acquis. Garder une densité optimale des fluorophores lumineux est important (Figure 1 a) : il doit être suffisamment basse pour spatialement séparer chaque colorant, mais assez haut pour visualiser l’ensemble de la structure après de 40 000 cadres. Si le nombre de molécules activées est trop faible, plus longues cheminées devraient être acquis. Nous avons obtenu de bonnes images avec ~ 5000 localisations par µm² pour IFs et 2 500 localisations par cm² pour les microtubules.

Modifications et dépannage de la méthode

Il est important de travailler avec des échantillons frais et optimisé d’imagerie tampons. pH doit être ajustée avec précision, en particulier de l’AEM.

Microtubules et la vimentine devraient ressembler uniformément marqués lorsqu’imagée avec la technique standard de microscopie à champ large (WF). Si filaments ponctués/anéantis avec la microscopie classique, cela sera amplifié lors de l’utilisation de super résolution. Dans ce cas, il est préférable de préparer de nouveaux échantillons. Conditions de fixation non-optimisée (vieux PFA etc.) peuvent entraîner dans les microtubules recherche fragmenté. Ambiants sur la surface du verre peuvent découler d’un blocage inefficace. Dans ce cas, BSA (albumine sérique bovine) peut être remplacé par FBS (sérum de veau fœtal) et utilisé dans chaque étapes de l’incubation.

Si la densité de l’étiquetage est trop élevée (Figure 1 b) et ne peut pas être suffisamment poussé dans le sombre-État, même avec la plus haute puissance de laser, la quantité d’études secondaires anticorps devraient être abaissés (mieux que diminuer la quantité d’anticorps primaires). Cependant, cette technique nécessite la préparation de nouveaux échantillons. En général, il est nécessaire d’évaluer empiriquement la quantité d’anticorps secondaires à utiliser.

Si les fluorophores ne pas cligner des yeux normalement (ils devraient être dans l’état lumineux au cours de la seule image), vérifier que le pH du tampon d’imagerie est correcte (pH 8,3). Préparer les nouvelles solutions si le problème persiste (surtout MEA). Vérifiez toujours que le collimateur FRBR est sur (FRBR u_HP). Avec la puissance du laser limité, obtention de clignotement correcte peut s’avérer difficile (la marche et d’arrêt tarifs ainsis que le colorant luminosité dépendent de la puissance du laser, comme décrit dans van de Linde et al.11). Autres colorants comme Alexa488 ou Atto488 peuvent être explorées si plus de puissance du laser excitation est disponible14.

Si les fluorophores cesse de clignoter avant la fin des de 40 000 images, modifier la mémoire tampon d’imagerie qui peut avoir été oxydée. Vérifiez qu’il n’y ait aucune bulle d’air entre le tampon et le couvercle après le changement de tampon. Échantillons scellés pourraient être photographiés pendant quelques heures dans un raw.

Si les films de tempête sont acquis sur un microscope TIRF régulière avec une EMCCD, il est possible d’utiliser orage24 pour reconstituer les images. Des options similaires sont disponibles pour la correction de la dérive, le filtrage d’images et le rendu d’image. Orage est un plugin utilisé avec le logiciel Fidji/imageJ. Des résultats similaires ont été obtenus avec le logiciel de fabricant et orage (Figure 6).

COT (cyclooctatétraène) peut être ajouté au tampon d’imagerie afin d’améliorer la précision de la localisation des molécules simples. Il augmente le nombre de photons émis par cycle pour Alexa64725. Nous observons en effet une meilleure précision de localisation (jusqu'à 6 nm) lors de l’ajout de 2 mM COT au tampon de tempête décrite dans l’étape 5 ou avec 100 mM MEA comme décrit dans référence25. Toutefois, dans ces conditions, le nombre de molécules lumineuses lors de l’acquisition diminue beaucoup plus rapidement que sans COT, limitant le nombre de localisations de la molécule à la fin de l’acquisition et pouvant déboucher sur une insuffisance d’échantillonnage du réseau IF. Autres tampons d’imagerie ont été signalés à bien travailler avec Alexa teint, par exemple à l’aide de lactase et oxyrase comme oxygène nettoyage système26. Dans ce protocole, nous rapportons la composition du tampon qui a donné les meilleurs résultats en terme de résolution pour notre type d’échantillons et d’imagerie mis en place, mais chaque type d’échantillon nécessite l’optimisation de la mémoire tampon, en plus de l’étiquetage et l’optimisation des conditions de fixation.

Limites de la méthode et améliorations possibles

La méthode présentée ici est limitée aux cellules fixes et images 2D. En utilisant une norme d’imagerie ensemble vers le haut avec un microscope TIRF et une EMCCD, le facteur le plus limitant a les pouvoirs de laser (100 mW pour le laser nm 561 n’était pas suffisante pour faire les colorants Alexa555 clignoter). Une ligne de 532 nm laser peut s’avérer plus efficace pour exciter ces colorants. Une amélioration possible de la méthode consisterait à effectuer dSTORM 3D à l’aide d’astigmatisme optique27. Cela nécessiterait des modifications minimales du protocole, à l’exception d’une densité inférieure à étiquetage et un numéro d’image accrue. 3D couleur double image de tempête fournirait une meilleure vision des IFs enroulé autour de microtubules, surtout en faisceaux. Notez que filaments d’actine pourraient également être observés en utilisant la même méthode de fixation et un montant optimisé de phalloïdine fluorescente8. 3 couleur tempête pourrait servir à observer l’Organisation des trois sous-systèmes du cytosquelette.

En utilisant des anticorps primaires et secondaires augmente la taille de l’objet d’intérêt puisque l’anticorps secondaire est localisés jusqu'à 20 nm de la cible. En règle générale, un microtubule 25 nm de diamètre aura une largeur de ~ 50 nm après marquage. Une possibilité d’améliorer la distance entre la cible et le colorant est d’étiqueter directement les anticorps primaires avec les colorants appropriés. Idéalement nanocorps étiquetés avec les colorants organiques devrait être utilisé28.

Nous fournissons ici juste une méthode simple pour estimer la précision de localisation moyenne d’une molécule unique suite Endesfelder et al.22. La résolution globale des images qui prend en compte les deux précision de localisation et de densité, l’étiquetage peut également être mesurée à l’aide de la transformée de Fourier anneau corrélation approche29.

Au sujet de l’enregistrement de canal, il est difficile de recouvrir parfaitement toutes les perles présentes dans le champ de vision. Une correction plus complexe se trouvent dans Chazeau et al. 12.

Limites découlant du clignotement des fluorophores et blanchiment des sondes peuvent être surmontés à l’aide de l’ADN-peinture (Accumulation de Points d’ADN pour l’imagerie en relief échelle nanométrique)30. Dans cette méthode, le clignotement, nécessaire pour la localisation de la molécule unique est créé par la liaison transitoire des oligonucléotides court-colorant-étiquetés à leurs cibles complémentaires.

Conclusion

Cet article présente un protocole robuste pour effectuer l’imagerie bicolores dSTORM en 2 dimensions de filaments du cytosquelette dans les cellules fixes. Les conditions expérimentales qui ont été trouvées optimales en termes de tampon de fixation, immunomarquage et imagerie pour notre type d’échantillon sont décrits en détails. Ensuite, le processus d’acquisition de données brutes et le type d’images clignotantes qui doivent être enregistrées (densité de molécule, rapport signal sur bruit, fluorophore duty cycle etc) est présenté ainsi que la façon de reconstruire des images dSTORM, corriger la dérive et filtre les données. Ces étapes sont génériques pour l’imagerie dSTORM bicolores et déguster pas spécifiques au type. Enfin, on montre comment cette technique aide à résoudre l’organisation dense des deux réseaux du cytosquelette couplés.

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

Nous remercions Mickael Lelek, Orestis Faklaris et Nicolas Bourg de discussions fructueuses, Andrey Aristov et Elena Rensen pour aider avec la technique de Super-résolution et Shailaja Seetharaman pour une lecture attentive du manuscrit. Nous tenons à souligner le Citech UtechS BioImaging photoniques (Imagopole) d’Institut Pasteur (Paris, France) ainsi que le réseau d’infrastructures de France-BioImaging pris en charge par l’Office National Français des recherches (ANR-10-INSB-04 ; Investissements d’avenir) et la Région Ile-de-France (programme Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) pour l’utilisation du microscope Elyra. Ce travail a été soutenu par la la Ligue Contre le Cancer et le Français National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

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