Author Produced

В естественных условиях оценки разрушения гематоэнцефалический барьер в мышиной модели ишемического инсульта

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Общая цель этой процедуры заключается в том, обеспечить высокую воспроизводимость технику в естественных условиях оценки разрушения гематоэнцефалический барьер в моделях крыса ишемического инсульта.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ишемического инсульта приводит к vasogenic церебрального отека и последующих первичного мозга травмы, который опосредовано через разрушение гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Крыс с индуцированных ишемического инсульта были созданы и используются как в естественных условиях модели для изучения функциональной целостности BBB. Спектрофотометрические обнаружение Эванс синий (EB) в образцах с ишемического повреждения мозга может обеспечить надежные основания для исследований и разработок новых терапевтических методов. Этот метод генерирует воспроизводимость результатов и применим в любой лаборатории без необходимости специального оборудования. Здесь мы представляем визуализировать и технического руководства по обнаружению кровоподтек EB после индукции ишемического инсульта в крыс.

Introduction

Vasogenic отек мозга вследствие нарушения гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) остается важным осложнение ишемического инсульта и важным фактором, определяющим выживаемость в инсульт пациентов1,2. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который формируется капиллярных эндотелиальных клеток головного мозга (BCECs) и состоит из отдельных нервно-сосудистых компонентов (например, плотные соединения между BCECs, pericytes, астроглиальных и нейрональные клетки3), обеспечивает специализированные и динамический интерфейс между центральной нервной системы (ЦНС) и периферического кровообращения4,5. Оскорбления как ишемии реперфузии травмы может подорвать функциональную целостность BBB и привести к последующего проникновения циркулирующих лейкоцитов в паренхимы мозга, которая в конечном счете вызвать воспаление головного мозга и первичного мозга травмы 6 , 7. Животные модели необходимы для точного выявления дисфункции BBB, после возникновения инсульта. Такие модели имеют большое значение для изучения основные патофизиологические механизмы и внедрения новых нейропротекторной стратегии. В пробирке клеток на основе культуры модели BBB высоко разработаны и используются для исследования молекулярной BBB физиопатологические8,9,10. Тем не менее в естественных условиях Животные модели, которые производят ишемического повреждения BBB похож на человека клинических условиях, также очень полезной в этом отношении. Количественные обнаружение кровоподтек Эванс синий (EB) является широко признанным и чувствительной технику, которая была использована для оценки целостности BBB и функции нейродегенеративных заболеваний, в том числе ишемического инсульта11, 12 , 13 , 14. Этот метод является экономически эффективным, возможно, воспроизводимые и полностью применимы в любой экспериментальной лаборатории. Его осуществление не требует современного оборудования, таких, как радиоактивные Трейсеры15 или магнитно-резонансная томография (МРТ)16, которые являются предпосылками для других методов. В этой статье мы всесторонне продемонстрировать основные технические процессы оценки BBB, используя EB кровоподтек в моделях крыса ишемического инсульта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Ардебиль университета медицинских наук исследовательский совет для проведения исследований на животных (этические ID номер: IR. ARUMS. REC.1394.08). В этом исследовании визуализировать, мы использовали взрослых самцов Sprague-Dawley крысы (300-350 г), полученные от пастбищ института (Тегеран, Иран).

1. анестезия и флоуметрия

  1. Вызвать обезболивание с помощью 4% изофлюрановая и поддерживать его с изофлюрановая (1-1,5%) в смесь закиси (70% v/v) и кислорода (30% v/v) для продолжительности операции.
  2. Анестезированные животного в подверженных позы на обратной управляемой электроодеяло и поддержания температуры тела при 37±0.5 ° C с помощью ректального зонда, подключенных к этой нагревательный элемент.
  3. Применять небольшое количество глазная мазь на оба глаза, чтобы избежать сухости.
  4. Бритье с электрические Ножницы хирургические региона на левой стороне черепа. Использование Бетадин-раствор с марлевой для дезинфекции кожи. Промойте этот регион с стерильных площадку, содержащие 70% этанол и повторите Оба шага для трех циклов17.
  5. Для обезболивания inject 0,2 мл 0,5% бупивакаин подкожно в области хирургии17.
  6. Сделать разрез кожи длиной 1 см на черепе (простирается от бокового угла глазной щели левого глаза в основание левого уха) и рассечения левой височной мышцы подвергать черепа. Затем создайте небольшой Берр отверстие сбоку 5 мм и 1 мм, задняя bregma18 легкость размещения кончик зонда карандаш доплеровского расходомера.
  7. Поверните крысу из подверженных в лежачем положении, а затем поместить лазерный излучатель карандаш в ранее пробуренных череп слепых отверстие для мониторинга регионарного мозгового кровотока (rCBF).
  8. Запись каждого животного базовой rCBF и рассматривать это как 100%. В частности средней мозговой артерии окклюзии (СМАо) запускается всякий раз, когда уменьшение rCBF более чем на 80% обнаруженных19,20.

2. индукция фокуса церебрально ишемии

  1. Бритье области шеи и дезинфекции кожи с Бетадин-раствор и 70% этанола. Придать 0,2 мл 0,5% бупивакаин подкожно в хирургии сайт для анальгезии17.
  2. Сделайте 2 см длиной хирургический разрез в брюшной поверхности шеи для доступа к левой общей сонной артерии (LCCA). Изолируйте LCCA из соседней фасции и блуждающего нерва для доступа к бифуркации наружной сонной артерии (ЭКА) и внутренней сонной артерии (МКА).
  3. Перевязать постоянно LCCA или ЭКА, используя 5-0 Шелковый шов и вскрыть ICA бесплатно на уровень крылонебный артерии.
  4. Свободно место галстук 5-0 Шелкового шва вокруг LCCA, а затем временно ICA зажим с сосудистой микро клип.
  5. Сделать небольшой надрез на LCCA до ранее размещенных потерять галстук и затем вставьте швом нейлона покрытием кремния 4-0 в пространство Люминал ICA и завинтите швом вокруг LCCA для обеспечения швом нейлона и предотвращения утечки крови.
  6. Удаление сосудистых микро клип из ЗКИ. Затем заранее накаливания с покрытием внутрипросветная кремния до наблюдения за заметное снижение rCBF, указывающее окклюзии MCA происхождения. В конце периода ишемического (90 мин) запустите реперфузии, снятие швов внутрипросветная21.

3. яремной катетеризации и Эванс синий инъекции (EB)

  1. Сделать продольный разрез 1 см в шею в левой части средней линии и затем тупо вскрыть прочь поверхностные фасции для доступа к внешней ветви левой яремной (LGV). Затем постоянно перевязать краниального конца LGV с Шелковый шов 5-0. Свободно место два связей вокруг Вены, а затем временно зажим сердца конце LGV с сосудистой микро зажим.
  2. Сделать небольшой надрез на LGV между двумя швами и затем вставить катетер гепаринизированным сыворотки заполнены в пространство Люминал LGV и заранее его примерно 10 мм. потом, затяните лигатуры вокруг Вены, чтобы обеспечить катетер и предотвратить кровотечение. Вдохнуть небольшое количество сыворотки, чтобы избежать коллапса Вену.
  3. В начале периода реперфузии, медленно вводить EB краска (1 мл/кг 2% раствора EB в солевой раствор) в течение 5 мин. Впоследствии мыть канюлю путем инъекции по 0,5 мл физиологическим и снять канюлю инъекции из вен12,22.
  4. Наконец, шовные шеи и головы разрезов и придать бупренорфин 0,05 мг/кг внутрибрюшинно (IP) и повторять инъекции каждые 6-8 ч в течение периода реперфузии для послеоперационного обезболивания17.
  5. Придать 5 мл подогретым saline(IP) предоставлять гидратации в клетке восстановления17.
  6. Место животное в клетке специального восстановления оснащены температуры и управления кондиционером и контролировать восстановление животного от анестезии.

4. Оценка проницаемости барьер мозга крови

  1. Через 24 часа реперфузии глубоко анестезировать животное с тиопентал натрия. Затем откройте грудной полости, сделав небольшое отверстие под грудины.
  2. Сделать небольшое отверстие в правое предсердие и залить 250 мл подогретым 0,9% физиологического раствора (37 ° c) при давлении, составляющем 110 мм рт.ст, через 15 мин мыть EB от циркуляции до нормальной солевой выходы из атриума становится бесцветным23левого желудочка.
  3. Немедленно удалите мозг от черепа и поместите его в матрице мозга. Вскрыть обонятельные луковицы и мозжечка, и затем с помощью чистой лезвия бритвы, отдельные правого полушария головного мозга от левого (Lesioned) вдоль средней линии.
  4. Взвешивать каждое полушарие и гомогенизации их отдельно в 2,5 мл фосфатный буфер и смешивать это с 2,5 мл трихлоруксусной кислоты (60%), за 2 мин, с помощью машины вихря.
  5. Центрифугуйте образцы мозга для 30 мин при 1 322 x g и позволяют образцы остыть в холодильнике 4 ° C на 10 мин.
  6. Для оценки EB поглощения на спектрофотометре 610 Нм23используйте supernatants.
  7. Вычислить EB концентрациях против калибровочной кривой и Экспресс результаты как мкг/г ткани мозга.

5. производство EB калибровочной кривой

  1. Подготовка 10 пример решения EB с концентрацией 1-10 мкг EB в 5 мл фосфатный буфер.
  2. Измерение оптической плотности значений каждого образца в 610 Нм, используя спектрофотометр.
  3. Сделайте на точечной диаграмме, с помощью таблицы и настоящем EB концентрации на оси X и значения поглощения на оси Y (рис. 1).
  4. Определите линейный тренд для кривой с ее уравнение. Затем используйте его для получения образцами концентрации EB.
  5. Доклад окончательные результаты EB кровоподтек как мкг/г массы ткани мозга.

6. Шам операции

  1. Выполните процесс же хирургические с крысами в Шам действовали группы (включая делая надрез в области шеи и EB инъекции), но исключает СМАо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Не было никакого существенного различия в уровнях EB в правом полушарии против левого полушария Шам действовали крыс (1,06 ± 0,1 мкг/г и 1.1 ± 0,09 мкг/г, соответственно). Как показано в цифры 2А 2Б, индукция временной ишемии (90 мин ишемии / реперфузии 24 h) вызвало существенное различие в уровнях EB (10.41 ± 0,84 мкг/г, p < 0,001) в левом полушарии ишемического крыс, по сравнению с соответствующими полушария в Шам действовали крыс. Вместе эти результаты показывают, что при нормальных условиях, EB не могут легко пересекать BBB в мозговой паренхимы и церебрального ишемического оскорбления побудить кровоподтек EB через повышение проницаемости BBB (рисунки 2A и 2B).

Figure 1
Рисунок 1 : Калибровочной кривой используется для определения концентрации EB от значения поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Оценка разрушения BBB, EB кровоподтек 24 часа после ишемического инсульта. Фотография мозги в Шам действовали и ишемических животных (A). Интенсивность EB кровоподтек в ткани мозга (синий цвет) возникает от степени разрушения BBB пораженного полушария. EB концентрации в пробах, подготовленных (пораженного) слева и правой полушарий мозга в Шам действовали и ишемических животных (B) (n = 6, *p< 0,001, по сравнению с левого полушария в Шам группы, p< 0,001 по сравнению с ипсилатеральные полушария же группы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

До настоящего времени различные методы, такие как авторадиографии и обнаружения радиоактивных трассеров24,25,26,микроскопии иммунофлуоресценции27и EB кровоподтек техника20, 23 были использованы для оценки повреждения гематоэнцефалический барьер. EB краска сильно возможность связывания сывороточного альбумина и используется как трассировщик для обнаружения сосудистые утечки и количественного определения BBB разбивка11,,2829. Как высоко признанными и надежный метод метод кровоподтек EB обеспечивает прямой оценки на целостность BBB, которая зависит от различных мозговой травмы, включая ишемического инсульта.

В естественных условиях оценки BBB позволяет исследователям изучить возможные патофизиологические механизмы отека мозга vasogenic индуцированной ишемии и найти новых терапевтических вмешательств. Эта модель не требует специальных средств и может производить достоверные результаты с высокий уровень успеха в13,эксперименты (более 80%)20. С прямым доступом к мозговой ткани эта модель дает очень точные оценки целостности BBB, но ограничивается долгосрочных исследований.

Патологические изменения в BBB, вызванные ишемического инсульта развиваются в три этапа: острый (в течение часа), подостром (часов до суток) и хронические (дней до месяца)30,31. Очевидно ранние терапевтические вмешательства производят ценные защитные эффекты в острой фазе патологических. Два важнейших параметров для получения надежных результатов из-за динамической природы BBB, после ишемического оскорбления EB дозы и времени точки инъекции. Следовательно инъекции EB краситель медленно через Вену канюля, используя соответствующие дозы (1 мг/кг 2% раствора EB в солевых) после начала периода реперфузии является важным фактором и позволяет изучения патофизиологических изменений на ранних стадиях инсульта .

Были введены несколько экспериментальных методов изучения ишемического инсульта. В этой экспериментальной модели мы использовали СМАо внутрипросветная накаливания метод, который создает условия для человека инсульта21,32. Этот метод является простым и надежным; Однако его выполнения необходимо принимать во внимание некоторые технические моменты для дальнейшего повышения производительности техники и обеспечения ее точности. Температура тела должны храниться в физиологических пределах во время операции, в то время как кровяное давление и газов крови должен быть контроль33,34,35. Постоянная запись rCBF с лазерной доплеровского расходомера и с использованием подходящих подготовлен силиконовым покрытием накаливания может не только увеличить СМАо успеха, но также снизить уровень смертности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарны вице-канцлера исследований Ардебиль университета медицинских наук (Ардебиль, Иран) для финансовой поддержки (Грант No: 9607).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39, (9), 2538-2543 (2008).
  2. Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 399-415 (2003).
  3. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 33, 379-408 (2010).
  4. Zhang, C., et al. The potential use of H102 peptide-loaded dual-functional nanoparticles in the treatment of Alzheimer's disease. J Control Release. (2014).
  5. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19, (12), 1584-1596 (2013).
  6. Fang, W., et al. Attenuated Blood-Brain Barrier Dysfunction by XQ-1H Following Ischemic Stroke in Hyperlipidemic Rats. Mol Neurobiol. 52, (1), 162-175 (2015).
  7. Huang, J., et al. CXCR4 antagonist AMD3100 protects blood-brain barrier integrity and reduces inflammatory response after focal ischemia in mice. Stroke. 44, (1), 190-197 (2013).
  8. Omidi, Y., Barar, J. Impacts of blood-brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors. Bioimpacts. 2, (1), 5-22 (2012).
  9. Cho, H., et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 5, (2015).
  10. Barar, J., Rafi, M. A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Blood-brain barrier transport machineries and targeted therapy of brain diseases. Bioimpacts. 6, (4), 225-248 (2016).
  11. Kaya, M., et al. Magnesium sulfate attenuates increased blood-brain barrier permeability during insulin-induced hypoglycemia in rats. Can J Physiol Pharmacol. 79, (9), 793-798 (2001).
  12. Pasban, E., Panahpour, H., Vahdati, A. Early oxygen therapy does not protect the brain from vasogenic edema following acute ischemic stroke in adult male rats. Sci Rep. 7, (1), 3221 (2017).
  13. Haghnejad Azar, A., Oryan, S., Bohlooli, S., Panahpour, H. Alpha-Tocopherol Reduces Brain Edema and Protects Blood-Brain Barrier Integrity following Focal Cerebral Ischemia in Rats. Med Princ Pract. 26, (1), 17-22 (2017).
  14. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739, (1-2), 88-96 (1996).
  15. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-antibody autoradiography and peptide fragments of albumin in cerebral edema. J Neurochem. 41, (1), 239-243 (1983).
  16. Jiang, Q., et al. Quantitative evaluation of BBB permeability after embolic stroke in rat using MRI. J Cereb Blood FlowMetab. 25, (5), 583-592 (2005).
  17. Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J Vis Exp. (48), (2011).
  18. Hungerhuber, E., Zausinger, S., Westermaier, T., Plesnila, N., Schmid-Elsaesser, R. Simultaneous bilateral laser Doppler fluxmetry and electrophysiological recording during middle cerebral artery occlusion in rats. J Neurosci Methods. 154, (1-2), 109-115 (2006).
  19. Panahpour, H., Nouri, M. Post-Ischemic Treatment with candesartan protect from cerebral ischemic/reperfusioninjury in normotensive rats. Int J Pharm Pharm Sci. 4, (4), 286-289 (2012).
  20. Panahpour, H., Dehghani, G. A., Bohlooli, S. Enalapril attenuates ischaemic brain oedema and protects the blood-brain barrier in rats via an anti-oxidant action. Clin Exp Pharmacol Physiol. 41, (3), 220-226 (2014).
  21. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Blockade of Central Angiotensin II AT1 Receptor Protects the Brain from Ischemia/Reperfusion Injury in Normotensive Rats. Iran J Med Sci. 39, (6), 536-542 (2014).
  22. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Candesartan attenuates ischemic brain edema and protects the blood-brain barrier integrity from ischemia/reperfusion injury in rats. Iran Biomed J. 18, (4), 232-238 (2014).
  23. Kaya, M., et al. The effects of magnesium sulfate on blood-brain barrier disruption caused by intracarotid injection of hyperosmolar mannitol in rats. Life sci. 76, (2), 201-212 (2004).
  24. Schöller, K., et al. Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats. Brain Res. 1142, 237-246 (2007).
  25. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-Antibody Autoradiography and Peptide Fragments of Albumin in Cerebral Edema. J Neurochem. 41, (1), 239-243 (1983).
  26. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32, (2), 200-219 (2008).
  27. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141, (2), 714-720 (2012).
  28. Kucuk, M., et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 71, (8), 937-946 (2002).
  29. Uyama, O., et al. Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence. J Cereb Blood Flow Metab. 8, (2), 282-284 (1988).
  30. Kleinig, T. J., Vink, R. Suppression of inflammation in ischemic and hemorrhagic stroke: therapeutic options. Curr Opin Neurol. 22, (3), 294-301 (2009).
  31. Del Zoppo, G. J., Mabuchi, T. Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23, (8), 879-894 (2003).
  32. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  33. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349, (2), 130-132 (2003).
  34. Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39, (5), 1548-1555 (2008).
  35. Bottiger, B. W., et al. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65, (2), 135-142 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics