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Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Neuroscience

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Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

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Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

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Abstract

Ischämischen Schlaganfall führt zu Vasogenic zerebrales Ödem und anschließende primäre Hirnverletzung, die durch Zerstörung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) vermittelt wird. Ratten mit induzierter ischämischen Schlaganfall wurden gegründet und als in Vivo Modellen verwendet, um die Funktionsfähigkeit der BBB zu untersuchen. Photometrische Erkennung von Evans blau (EB) in den Gehirn-Proben mit ischämischen Verletzungen konnte die Forschung und Entwicklung von neuartigen therapeutischen Modalitäten zuverlässig begründet. Diese Methode liefert reproduzierbare Ergebnisse und gilt in jedem Labor ohne spezielle Ausrüstung. Hier präsentieren wir Ihnen eine visualisierte und technische Leitlinie zur Detektion der Extravasation von EB nach Induktion der ischämische Schlaganfall bei Ratten.

Introduction

Vasogenic Hirnödem wegen Störung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) bleibt eine wichtige Komplikation des ischämischen Schlaganfalls und eine wichtige Determinante für die Überlebensrate in der Schlaganfall-Patienten1,2. Die Blut - Hirn-Schranke (BBB), die durch Kapillare endothelial Zellen im Gehirn (BCECs) gebildet und besteht aus verschiedenen neurovaskuläre Komponenten (z. B. enge Kreuzungen unter Perizyten, BCECs, Astroglial und neuronalen Zellen3), bietet eine spezialisierte und dynamische Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und peripheren Durchblutung4,5. Beleidigungen wie Ischämie-Reperfusion Verletzungen könnte stören die funktionelle Integrität der BBB und führen nachträgliche Eindringen von zirkulierenden Leukozyten in das Gehirn Parenchym, die letztlich zerebrale Entzündung und primäre Hirnverletzungen auslösen 6 , 7. Tiermodelle für die genaue Erfassung der Dysfunktion des BBB nach Auftreten eines Schlaganfalls erforderlich sind. Solche Modelle sind von großer Bedeutung für die Untersuchung zugrunde liegenden pathophysiologische Mechanismen und Einführung von neuen neuroprotektive Strategien. In-vitro- Kultur-basierte Zellmodelle der BBB hoch entwickelt und verwendet für molekulare Studie der BBB Physiopathologie8,9,10. In Vivo Tiermodellen, die ischämische Schaden der BBB analog zu menschlichen klinischen Bedingungen zu produzieren, sind jedoch auch in dieser Hinsicht sehr lohnenswert. Quantitativen Nachweis der Extravasation von Evans blau (EB) ist eine gut angenommen und empfindliche Technik, die für die Beurteilung der BBB Integrität und Funktion bei neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der ischämischen Schlaganfall11, verwendet worden ist 12 , 13 , 14. diese Methode ist kostengünstig, machbar, reproduzierbare und völlig zutreffend in einem experimentellen Labor. Ihre Umsetzung erfordert keine vorgerückte Ausrüstung, wie radioaktive Tracer15 oder Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)16, die Voraussetzung für andere Methoden sind. In diesem Artikel zeigen wir umfassend grundlegende technische Prozesse der BBB Bewertung mit EB Extravasation in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls.

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Protocol

Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien der Ardabil University of Medical Sciences Research Council für die Durchführung von Untersuchungen an Tieren durchgeführt (ethische ID-Nummer: IR. ARACEAE. REC.1394.08). In dieser visualisierte Studie verwendeten wir Erwachsene männlichen Sprague-Dawley Ratten (300-350 g) aus Weide Institut (Teheran, Iran) gewonnen.

1. Anästhesie und Flowmetry

  1. Induzieren Sie Anästhesie mit 4 % Isofluran und pflegen Sie es mit Isofluran (1-1,5 %) in einer Mischung von Lachgas (70 % V/V) und Sauerstoff (30 % V/V) für die Dauer der Operation.
  2. Ein narkotisierter Tier in die anfällig Haltung auf ein Feed-Back kontrollierter Wärme-Unterbett und halten Sie die Körpertemperatur bei 37±0.5 ° C durch eine rektale Sonde an dieser Heizung angeschlossen.
  3. Wenden Sie eine kleine Menge des ophthalmologischen Salbe auf beiden Augen, Trockenheit zu verhindern.
  4. Rasieren Sie die chirurgische Region auf der linken Seite des Schädels mit elektrischen Haarschneider. Verwenden Sie Betadine Lösung mit einem Tupfer, um die Haut zu desinfizieren. Spülen Sie dieser Region mit einem sterilen Pad mit 70 % igem Ethanol und wiederholen Sie die beiden Schritte für drei Zyklen17.
  5. Injizieren Sie für Analgesie 0,2 mL 0,5 % Bupivacain subkutan in die Chirurgie Region17.
  6. Machen Sie einen 1 cm langen Hautschnitt am Schädel (Verlängerung von den seitlichen Augenwinkel des linken Auges auf der Basis des linken Ohr) und sezieren des linken Temporalis Muskels um den Schädel zu entlarven. Erstellen Sie nach der Bregma18 einfache Platzierung der Doppler Durchflussmesser Bleistift Sondenspitze dann einen kleinen Grat Loch 5 mm seitlich, und 1 mm.
  7. Drehen Sie die Ratte aus der Rückenlage anfällig, und dann die Lasersonde Bleistift in die zuvor gebohrten Schädel Blind-Bohrung, die regionalen zerebralen Blutflusses (rCBF) zu überwachen.
  8. Zeichnen Sie jedes Tier Grundlinie rCBF auf und betrachten Sie dies als 100 %. Insbesondere ist mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) gestartet, wenn eine Abnahme der rCBF von mehr als 80 % erkannten19,20ist.

(2) Induktion von fokalen Cerebra Ischämie

  1. Rasieren Sie Halsbereiches zu und desinfizieren Sie die Haut mit Betadine Lösung und 70 % Ethanol. 0,2 mL 0,5 % Bupivacain subkutan in Chirurgie Website für Analgesie17zu injizieren.
  2. Machen Sie eine 2 cm langen chirurgischen Inzision in der ventralen Oberfläche des Halses auf die linke gemeinsame Halsschlagader (LCCA) zugreifen. Isolieren Sie die LCCA aus der benachbarten Faszie und den Nervus Vagus zur Bifurkation der äußeren Halsschlagader (ECA) und der inneren Halsschlagader (ICA) zugreifen.
  3. Dauerhaft verbinden Sie, entweder die LCCA oder ECA mit einer 5-0 Seide Naht und sezieren Sie ICA frei auf das Niveau der Pterygopalatine Arterie zu.
  4. Lose stellen eine Krawatte Seide Naht 5-0 rund um LCCA, und dann vorübergehend ICA Klemmen mit einem vaskulären Mikro-Clip.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der LCCA vor der zuvor platzierte lose Krawatte und dann legen Sie eine 4-0-Silikon beschichteten Nylon-Naht in der luminalen Raum von ICA und ziehen Sie den Faden um die LCCA, die Nylon-Naht zu sichern und zu verhindern, dass Blut austritt.
  6. Entfernen Sie den vaskulären Mikro-Clip von der ICA. Dann vorab ein Silikon beschichteten Intraluminal Filament bis beobachten einen deutlichen Rückgang der rCBF, die Okklusion der MCA Herkunft angibt. Am Ende der ischämischen Periode (90 min) starten Sie Reperfusion durch den Rückzug der Intraluminal Naht21.

(3) Halsschlagader Kanülierung und Evans blau (EB) Injektion

  1. Machen Sie einen 1 cm längs-Schnitt in den Hals auf der linken Seite der Mittellinie und dann unverblümt sezieren Sie entfernt oberflächliche Faszie um externe Ortsverbandes der linken Halsschlagader (LGV) zuzugreifen. Dann dauerhaft verbinden Sie kraniale Ende der LGV mit 5: 0 Seide Naht. Legen Sie locker zwei Verbindungen rund um die Vene, und dann vorübergehend Klemmen Sie kardiale Ende der LGV mit einer vaskulären Mikro-Klemme.
  2. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der LGV zwischen zwei Nähte, und legen Sie heparinisierten Serum gefüllt Katheter in den luminalen Raum von der LGV und Kanüle ca. 10 mm. danach, ziehen Sie die Ligaturen um die Vene zur Sicherung des Katheters und Vorbeugung von Blutungen. Kleine Mengen von Serum zu vermeiden, reduzieren die Vene zu injizieren.
  3. Zu Beginn der Reperfusion Periode injizieren Sie langsam EB Farbstoff (1 mL/kg 2 % EB Lösung in Kochsalzlösung) über einen Zeitraum von 5 Minuten. Anschließend waschen Sie die Kanüle durch Injektion von 0,5 mL normale Kochsalzlösung und entziehen Sie die Vene12,22der Injektionskanüle.
  4. Schließlich Naht der Hals und Kopf Einschnitte und 0,05 mg/kg Buprenorphin intraperitoneale Injektion (IP) und wiederholen Sie der Injektion alle 6-8 Std. Reperfusion Zeitraum für postoperative Analgesie17.
  5. 5 mL vorgewärmten saline(IP) Flüssigkeitszufuhr in der Wiederherstellung Käfig17zu injizieren.
  6. Ort das Tier in einem Käfig spezielle Recovery ausgestattet mit Temperatur und Klimaregelung und die Erholung des Tieres aus der Narkose zu überwachen.

4. Bewertung der Blut Hirn-Schranke Durchlässigkeit

  1. Nach 24 Stunden der Reperfusion tief betäuben des Tieres mit Natrium Thiopental. Öffnen Sie dann die Brusthöhle durch ein kleines Loch unter dem Brustbein.
  2. Machen Sie eine kleine Öffnung in den rechten Vorhof und injizieren Sie 250 mL vorgewärmten 0,9 % Kochsalzlösung (37 ° c) bei einem Druck von 110 MmHg durch die linke Herzkammer für 15 min, EB von der Zirkulation zu waschen, bis die normale Kochsalzlösung Exits vom Atrium wird farblos23zu.
  3. Sofort entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel zu und legen Sie es in der Gehirn-Matrix. Die Riechkolben und Kleinhirn zu sezieren, und dann mit einer sauberen Rasierklinge trennen die rechte Hemisphäre des Gehirns von der linken Seite (Lesioned) entlang der Mittellinie.
  4. Wiegen Sie jede Hemisphäre separat in 2,5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung zu homogenisieren Sie und mischen Sie diese mit 2,5 mL Trichloressigsäure Säure (60 %) für 2 min mit einem Vortex-Maschine.
  5. Zentrifugieren Sie Gehirn Proben für 30 min bei 1.322 x g und lassen Sie die Proben im Kühlschrank 4 ° C für 10 min. abkühlen lassen.
  6. Verwenden Sie die Überstände die EB-Extinktion von einem Spektrophotometer 610 nm23schätzen.
  7. Berechnen Sie EB Konzentrationen gegen eine Standardkurve und ausdrückliche Ergebnisse als µg/g des Hirngewebes.

5. Herstellung von der EB-Standardkurve

  1. Bereiten Sie 10 Beispiellösungen von EB mit Konzentrationen von 1 bis 10 µg von EB in 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung.
  2. Messen Sie die Absorption Werte jeder einzelnen Probe bei 610 nm mit einem Spektralphotometer.
  3. Machen Sie ein Punktdiagramm mit einer Tabellenkalkulation und vorliegenden EB-Konzentrationen auf der x-Achse und die Extinktion Werte auf der y-Achse (Abbildung 1).
  4. Definieren Sie eine lineare Trendlinie für die Kurve mit der Gleichung. Dann können sie um die EB-Konzentration der Proben zu erhalten.
  5. Melden Sie die endgültigen Ergebnisse der EB Extravasation als µg/g Gehirn Gewebe Gewicht.

6. Sham-Betrieb

  1. Durchführen Sie der gleichen chirurgischen Verfahren mit Ratten in Sham betriebene Gruppe (einschließlich macht einen Einschnitt in der Halsregion und EB-Injektion), aber schließen Sie die MCAO aus.

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Representative Results

Es gab keinen signifikanten Unterschied in EB Ebenen in der rechten Hemisphäre im Vergleich zu der linken Hemisphäre der Schein betrieben Ratten (1,06 ± 0,1 µg/g und 1,1 ± 0,09 µg/g, beziehungsweise). Siehe Figuren 2A-2 b, Induktion von transienten Ischämie (90 min Ischämie / Reperfusion 24 h) verursacht einen signifikanten Unterschied in EB Ebenen (10,41 ± 0,84 µg/g, p < 0,001) in der linken Hemisphäre von ischämischen Ratten, im Vergleich zu den jeweiligen Hemisphäre in der Sham-betrieben Ratten. Kollektiv, diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass unter normalen Bedingungen, EB nicht ohne weiteres die BBB in zerebralen Parenchym überqueren kann und zerebrale ischämische Beleidigungen die Extravasation von EB durch eine erhöhte Durchlässigkeit der BBB (Figuren 2A und 2 b induzieren).

Figure 1
Abbildung 1 : Die Standardkurve wird zur Bestimmung der EB-Konzentration von den Werten der Extinktion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Bewertung der BBB Störung durch EB Extravasation 24 Stunden nach einem ischämischen Schlaganfall. Das Foto der Köpfe in der Sham-betrieben und ischämischen Tiere (A). Die Intensität der EB Extravasation in das Hirngewebe (blaue Farbe) ergibt sich aus Umfang der BBB-Störung in der lesioned Hemisphäre. EB-Konzentration in Proben aus der linken Seite (lesioned) vorbereitet und rechten Hemisphären des Gehirns in der Sham-betrieben und ischämischen Tiere (B) (n = 6, *p< 0,001 im Vergleich zu der linken Hemisphäre in Sham-Gruppe, p< 0,001 im Vergleich zu ipsilateralen Hemisphäre der gleichen Gruppe). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

So weit, verschiedene Methoden wie Autoradiographie und Erkennung der radioaktiven Tracern24,25, Immunfluoreszenz-Mikroskopie26,27und EB Extravasation Technik20, 23 wurden verwendet, um die Blut - Hirn-Schranke Schaden zu bewerten. EB-Farbstoff kann sich stark an der Serum-Albumin gebunden und dient als Tracer für vaskuläre Leckagen Erkennung und Quantifizierung der BBB Aufschlüsselung11,28,29. Als eine sehr anerkannte und zuverlässige Methode bietet die EB Extravasation Technik eine direkte Abschätzung auf die Unversehrtheit der BBB, die von verschiedenen zerebralen Verletzungen einschließlich ischämischen Schlaganfall betroffen ist.

In Vivo Beurteilung der BBB erlaubt Forschern, mögliche pathophysiologische Mechanismen der Ischämie-induzierte Vasogenic Hirnödem zu studieren und neue therapeutische Interventionen zu finden. Dieses Modell erfordert keine spezielle Einrichtungen und kann zu glaubwürdigen Ergebnissen mit einer hohen Erfolgsquote in Experimenten (mehr als 80 %)13,20. Mit Direktzugriff auf das Hirngewebe dieses Modell ermöglicht sehr genaue Einschätzungen der BBB Integrität aber beschränkt sich auf Langzeitstudien.

Krankhafte Veränderungen in der BBB verursacht durch ischämischen Schlaganfall zu entwickeln, in drei Phasen: akut (innerhalb von Stunden), subakut (Stunden bis Tage) und chronischen (Tage bis Monate)30,31. Natürlich produzieren die frühesten therapeutischen Interventionen wertvolle schützende Wirkung in der Akutphase pathologische. EB-Dosierung und der Zeitpunkt der Injektion sind zwei entscheidende Parameter für zuverlässige Ergebnisse aufgrund der dynamischen Natur der BBB nach ischämischen Beleidigungen. Daher, Injektion von der EB-Farbstoff langsam über eine Vene Kanüle mit der entsprechenden Dosis (1 mg/kg 2 % EB Lösung in Kochsalzlösung) nach dem Beginn der Reperfusion-Periode ist ein wichtiger Faktor und ermöglicht die Erforschung der pathophysiologischen Veränderungen in den frühen Stadien eines Schlaganfalls .

Verschiedene experimentelle Methoden wurden eingeführt, um ischämischen Schlaganfall zu studieren. In diesem experimentellen Modell verwendeten wir MCAO mit der Intraluminal Filament-Methode, die Bedingungen ähnlich wie menschliche Schlaganfall21,32erstellt. Diese Technik ist einfach und zuverlässig; die Ausführung muss jedoch berücksichtigt werden einige technische Punkte weiter steigern Sie die Leistung der Technik und seine Genauigkeit zu gewährleisten. Körpertemperatur, sollten während der Operation im physiologischen Bereich gehalten, während Blutdruck und Blutgase überwachten33,34,35sein müssen. Ständige Aufzeichnung von rCBF mit einem Laser-Doppler-Durchflussmesser und unter Verwendung eines geeigneten vorbereitet silikonbeschichteten Glühfaden kann nicht nur die MCAO Erfolgsquote zu erhöhen, sondern reduzieren auch die Sterblichkeit.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für den Vizekanzler für Forschung der Ardabil Universität der medizinischen Wissenschaften (Ardabil, Iran) für die finanzielle Unterstützung (No zu gewähren: 9607).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

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