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虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

Neuroscience

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Summary

この手順の全体的な目標は、虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊の生体内評価の再現性の高い技術を提供することです。

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Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

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Abstract

虚血性脳卒中は、分子病態脳浮腫、血液脳関門 (BBB) の破壊を介するその後原発性脳損傷につながります。誘発虚血性脳卒中ラットは確立され、BBB の機能の整合性を調査するため生体内でモデルとして使用されます。エバンス ブルー (EB) の虚血性損傷脳のサンプルの吸光光度検出は研究と新規治療戦略の開発のための信頼性の高い正当化を提供すること。このメソッドは、再現性のある結果を生成し、特別な装置を必要としない任意の研究室では、適用。ラットにおける虚血性脳卒中の誘導 EB の血管外漏出の検出に関する可視化および技術的なガイドラインを紹介します。

Introduction

血液脳関門 (BBB) 破壊による分子病態脳浮腫には、虚血性脳卒中の重要な合併症と脳卒中患者1,2の生存率の主要な決定要因が残っています。脳毛細血管内皮細胞 (BCECs) によって形成される、異なる神経血管コンポーネント (BCECs、ペリサイト、グリア、および神経細胞3間タイトジャンクショなど) で構成される、血液-脳関門 (BBB) を提供します、中枢神経系 (CNS)、末梢血循環4,5間の専門的かつ動的なインタ フェース。虚血再灌流傷害など侮辱でした BBB の機能の整合性を混乱させるし、最終的に原発性脳腫瘍の怪我や脳の炎症を引き起こす脳実質に白血球の循環のそれに続く侵入につながる6,7. 脳卒中の発生に続く BBB の機能不全の正確な検出には動物モデルが必要です。このようなモデルは、非常に重要な病態生理学的メカニズムの基礎となる、新しい神経保護戦略を導入することを勉強するためです。BBB の細胞培養技術を用いたモデル体外は高い開発し、BBB 生理病理学8,9,10の分子生物学研究に使用されます。それにもかかわらず、生体内で動物モデル、人間の臨床条件に類似の BBB の虚血性損傷を作り出す、この点で非常に価値があるも。エバンス ブルー (EB) の血管外漏出の定量的検出は BBB の整合性と神経変性疾患、虚血性脳卒中11,を含む機能の評価のために使用されているよく受け入れられ、敏感な技術12,13,14します。 この方法は、実験室でコスト効果の高い、可能、再現性のある、完全に該当します。その実装では、放射性トレーサー15や磁気共鳴画像 (MRI)16、他の方法のための前提条件となるなど、高度な機器は必要ありません。この記事で包括的に虚血性脳卒中のモデルラットによる EB 血管外漏出 bbb ランク評価の基本的な技術的なプロセスを示しています。

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Protocol

動物実験を行い、アルダビール大学医療科学研究評議会のガイドラインに従ってすべてのプロシージャを行った (倫理的な ID 番号: 赤外線ARUMS。REC.1394.08). この可視化の研究で牧草研究所 (イラン ・ テヘラン) から得られる男性の大人の Sprague-dawley ラット (300-350 g) を使用しています。

1. 麻酔および血流計

  1. 4% イソフルランを使用して麻酔し、手術の間に亜酸化窒素 (70 %v/v) と酸素 (30 %v/v) の混合物にイソフルラン (1 1.5%) とそれを維持します。
  2. フィードバック制御暖房毛布にうつ伏せで麻酔動物を置き、この加熱装置に接続された直腸プローブによる 37±0.5 ° C の体温を維持します。
  3. 乾燥を防ぐために両方の目に眼軟膏の少量を適用します。
  4. 頭蓋骨の左側にある外科の領域を電気バリカンで剃る。ガーゼのパッドと肌の消毒に betadine ソリューションを使用します。この地域の 70% のエタノールを含む滅菌パッドを洗い流し、3 サイクル17の両方の手順を繰り返します。
  5. 鎮痛の外科領域17に 0.5% ブピバカイン 0.2 mL を皮下注入します。
  6. (左耳のベースに左目の眼から延びる) 頭蓋骨 1 cm 長い皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開する左の側頭筋を解剖します。作成小さなバリ穴 5 mm 外側 1 mm 後方前18レーザードップラー血流計ペンシル プローブの先端の配置を容易にします。
  7. 仰臥位になりやすいからラットを切り、局所脳血流量 (rCBF) を監視するこれまでにドリル頭蓋骨ブラインド穴にレーザー ペンシル プローブを配置します。
  8. それぞれの動物のベースライン rCBF を記録し、これを 100% として考慮します。特に、80% 以上の脳血流量の低下が検出された1920中大脳動脈閉塞 (MCAO) が開始されます。

2. 焦点煎じつめて虚血の誘導

  1. 頸部領域を剃る、betadine ソリューションと 70% エタノールで皮膚を消毒してください。鎮痛17外科サイトで皮下 0.5% ブピバカイン 0.2 mL を注入します。
  2. 左の総頸動脈 (LCCA) にアクセスする首の腹側表面で 2 cm 長い切開を行います。(ECA) 外頚動脈と内頸動脈 (ICA) の分岐にアクセスする近隣の筋膜や迷走神経から LCCA を分離します。
  3. LCCA または 5-0 絹糸を用いた ECA のいずれか完全に結紮そして翼口蓋動脈のレベルは無料 ICA を解剖します。
  4. 緩く LCCA、周り 5-0 絹糸のネクタイを配置、その後一時的に ICA を血管のマイクロ クリップをクランプします。
  5. 小切開は、以前に配置した緩いネクタイ前 LCCA と ICA の内腔の空間に 4-0 シリコン コーティング ナイロン縫合糸を挿入し、ナイロン縫合糸を保護し、血液の漏れを防ぎます LCCA 周り縫合糸を締めます。
  6. ICA から血管のマイクロ クリップを削除します。その後、MCA 起源の閉塞を示す rCBF の顕著な減少を観察までシリコン被覆管腔内のフィラメントを進めます。虚血期間 (90 分) の終わりに、腔内縫合21を撤回することによって再灌流を開始します。

3. 頚静脈穿刺とエバンス ブルー (EB) 注射

  1. 正中線の左側に首で 1 cm の縦切開を行うそして、にべもなく左頸静脈 (LGV) の外の枝にアクセスする距離浅筋膜を解剖します。その後、5-0 絹糸と LGV の頭蓋の終わり完全に縛る。緩く、静脈周囲の関係を 2 つを配置し、心臓血管のマイクロ クランプと LGV 末一時的に。
  2. 小切開は、2 つの縫合線の間の LGV と LGV の内腔の容量に満ちてヘパリン血清カテーテルを挿入し事前にそれ約 10 mm。 その後、カテーテルをセキュリティで保護し、出血を防ぐために静脈周囲の合字を締めます。少量の静脈の崩壊を避けるために血清を注入します。
  3. 再灌流期間の初めに、ゆっくりと 5 分にわたって EB 色素 (生理食塩水で 2 %eb 液の 1 mL/kg) を挿入します。その後、0.5 mL 通常生理食塩水の注入カニューレを洗浄し、静脈12,22から注入カニューレを撤回します。
  4. 最後に、首と頭の切開を縫合し、ブプレノルフィン 0.05 mg/kg を腹腔内注入 (IP) 鎮痛手術17再灌流期間中にすべての 6-8 h 注射を繰り返します。
  5. 回復ケージ17水和を提供するために予め温めておいた saline(IP) の 5 mL を注入します。
  6. 温度と空調制御場所特別な回復ケージ内の動物、動物の麻酔からの回復を監視します。

4. 血液脳関門の透過性の評価

  1. 再灌流の 24 h 後深くチオペン タール ナトリウムと動物を麻酔します。胸骨の下に小さな穴を開けることで、胸腔内を開きます。
  2. 右房内の小さな開口部を作るし、生理食塩水 0.9% に予め温めておいた (37 ° C) 左心室心房から普通の生理食塩水の出口になる無色23まで循環から EB を洗って 15 分間を通じて 110 mmHg の圧の 250 mL を注入します。
  3. すぐに頭蓋骨から脳を取り除くし、脳行列に配置。嗅球や小脳の解剖し、きれいなかみそりの刃を使用して別の脳の右半球正中線に沿って左 (Lesioned) から。
  4. 各半球の重量を量るとリン酸緩衝生理食塩水 2.5 mL で個別にそれらを均質化し、渦のマシンを使用して 2 分の 2.5 ml のトリクロロ酸 (60%) のこれをミックスします。
  5. 1,322 × g で 30 分間脳サンプルを遠心し、10 分の 4 ° C 冷蔵庫でクールダウンしてサンプルを許可します。
  6. 培養上清を使用して、610 nm23で、分光光度計による EB 吸光度を推定します。
  7. 脳組織の μ g/g として標準曲線と結果を表現に対する EB 濃度を計算します。

5. 理事会の標準曲線の生産

  1. リン酸緩衝生理食塩水 5 mL に EB の 1-10 μ g の濃度と理事会の 10 のサンプル ソリューションを準備します。
  2. 610 の各サンプルの吸光度を測定分光光度計を用いた nm。
  3. Y 軸 (図 1) のスプレッドシートと X 軸上の現在の EB 濃度と吸光度の値を使用して散布図を作成します。
  4. その方程式と曲線の線形トレンド ラインを定義します。それを使用し、EB サンプル濃度を取得します。
  5. 脳組織重量の μ g/g として EB 血管外漏出の最終結果を報告します。

6. 偽操作

  1. Sham のグループ (含む作り切開頸部に EB 注入) のラットと同じ手術のプロセスを実行しますが、MCAO を除外します。

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Representative Results

Sham ラットの左半球と右半球の EB レベルに差はありませんでした (1.06 ± 0.1 μ g/g と 1.1 ± 0.09 μ g/g、それぞれ)。図 2A 2B、一過性虚血の誘導に示すように (90 分虚血/24 h 再灌流) 理事会レベルの差の原因 (10.41 ± 0.84 μ g/g, p < 0.001) と比較して、それぞれの虚血ラットの左半球のsham ラットの半球。総称して、これらの調査結果を示し通常の条件下で EB が脳実質内に BBB を容易に越えることはできません、脳虚血性の侮辱 (2A および 2B の数字) BBB の高められた透磁率による EB の血管外漏出を誘発します。

Figure 1
図 1: 標準曲線を使用して吸光度値から EB 濃度を決定しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: EB 血管外漏出虚血性脳卒中後 24 時間で BBB の中断の評価します。偽手術および虚血性動物 (A) の脳の写真。脳組織 (青色) の EB を血管外漏出の強度は破壊の半球の BBB の中断の範囲から発生します。EB (破壊) の左から調製した試料中濃度と sham と虚血性動物 (B) では、脳の半球を右 (n = 6、*p< pシャム群左半球に比べて 0.001 < 0.001 と比較すると同じグループの同側半球)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

これまで、放射線と放射性トレーサー24,25, 蛍光顕微鏡26,27, EB 血管外漏出テクニック20,の検出などのさまざまな方法23血液脳関門の損傷を評価するために使用されています。EB 色素が強く血清アルブミンと結合することができると血管漏出を検出し、BBB 内訳11,28,29の定量化のトレーサーとして使用されます。承認済みで信頼性の高い方法としては、EB 血管外漏出手法は、虚血性脳卒中を含む脳の別の傷害によって影響を受ける BBB の整合性に直接推定を提供します。

BBB のin vivo評価には、虚血による分子病態脳浮腫の病態生理学的メカニズムを研究し、新しい治療上の介在を見つけるには研究者ことができます。このモデルは、特別な設備を必要としない、実験 (80% 以上)13,20で高い成功率と信頼できる結果を生成することができます。脳組織へ直接アクセスでき、このモデルは BBB の整合性の高精度な評価を有効に、長期的な研究に制限されています。

虚血性脳卒中による BBB の病理学的変化を 3 段階に分けて開発: (時間) 以内に急性の日に亜急性 (時間)、および慢性 (ヶ月日)30,31。明らかに、初期の治療は急性病態期に貴重な保護効果を生成します。EB 投与量と注入の時点は、虚血性の侮辱の後 BBB の動的な性質から信頼性の高い結果を得るための 2 つの重要なパラメーターです。したがって、ゆっくりと再灌流期間の初めの後の適切な投与量 (生理食塩水で 2 %eb 液 1 mg/kg) を使用して静脈カニューレを介して EB 色素の注入の重要な要因は、でき、病態生理学的変化に関する研究ストロークの初期の段階で.

いくつかの実験的方法は、虚血性脳卒中を研究に導入されています。この実験で、人間ストローク21,32と同様の条件を作成する腔内フィラメント法による MCAO を使いました。このテクニックはシンプルで信頼性の高いです。しかし、その実行は、さらに技術のパフォーマンスを向上し、その精度を保証するいくつかの技術的なポイントを考慮する必要があります。体温は、血圧と血液ガス監視対象33,34,35必要がありますしながら、手術中に生理的範囲内で保つ必要があります。レーザーのドップラー流量計と脳血流量の記録と適切な準備を使用して定数シリコーン コーティング フィラメントだけでなく MCAO 成功率を高める、また死亡率を減らします。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者らは、財政支援のアルダビール大学医療科学 (アイルランド) の研究のための副首相に感謝している (許可 No: 9607)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

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