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Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Neuroscience

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Summary

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

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Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

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Abstract

Acidente vascular cerebral isquêmico leva a edema cerebral vasogénico e lesões cerebrais primários posteriores, que é mediada através da destruição da barreira hemato - encefálica (BBB). Ratos com isquemia induzida foram estabelecidos e usados como modelos na vivo para investigar a integridade funcional do BBB. Detecção espectrofotométrica de azul de Evans (EB) em amostras de cérebro com lesão isquêmica poderia fornecer uma justificação confiável para pesquisa e desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas. Esse método gera resultados reprodutíveis e é aplicável em qualquer laboratório sem a necessidade de equipamento especial. Aqui, apresentamos uma orientação técnica e visualizada na detecção do extravasamento de EB após indução de acidente vascular cerebral isquêmico em ratos.

Introduction

Edema cerebral de vasogénico devido ao rompimento da barreira hemato - encefálica (BBB) continua a ser uma complicação importante do acidente vascular cerebral isquêmico e um importante determinante da taxa de sobrevivência no curso pacientes1,2. A barreira hemato - encefálica (BBB), que é formada por células endoteliais capilares do cérebro (BCECs) e composta por componentes neurovascular distintas (por exemplo, apertado junções entre células neuronais3, pericitos, Ralevic e BCECs), fornece uma especializados e dinâmica interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação do sangue periférico-4,5. Insultos, tais como lesões de isquémia-reperfusão poderiam perturbar a integridade funcional do BBB e conduzir a penetração posterior de leucócitos em circulação para o parênquima cerebral que em última análise, provocam inflamação cerebral e lesões cerebrais primários 6 , 7. modelos animais são necessários para a detecção exata da disfunção do BBB após ocorrência de um acidente vascular cerebral. Tais modelos são de grande importância para o estudo subjacente mecanismos fisiopatológicos e introdução de novas estratégias de neuroprotetor. Em vitro celular cultura baseado em modelos do BBB foram altamente desenvolvidos e utilizados para o estudo molecular do BBB fisiopatologia8,9,10. No entanto, na vivo modelos animais, que produzem danos isquêmicos do BBB semelhante ao humanas condições clínicas, também são muito interessante a este respeito. A detecção quantitativa do extravasamento de azul de Evans (EB) é uma técnica bem aceita e sensível que tem sido utilizada para avaliação da integridade do BBB e função em doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral isquêmico11, 12 , 13 , 14. este método é cost-effective, viável, reprodutível e totalmente aplicável em qualquer laboratório experimental. Sua implementação não requer equipamentos avançados, tais como traçadores radioativos15 ou ressonância magnética (MRI)16, que são pré-requisitos para outros métodos. Neste artigo, demonstramos exaustivamente processos básicos de técnicos de avaliação de BBB usando o extravasamento de EB em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Ardabil University of Medical Sciences Research Council, para a realização de estudos com animais (número de identificação ética: ir JARROS. REC.1394.08). neste estudo visualizado, usamos ratos macho adulto Sprague-Dawley (300-350 g) obtidos de pastagem Institute (Teerã, Irã).

1. anestesia e Flowmetry

  1. Induzir a anestesia usando 4% de isoflurano e mantê-lo com isoflurano (1-1,5%) em uma mistura de óxido nitroso (70% v/v) e oxigênio (30% v/v) para a duração da cirurgia.
  2. Coloque o animal anestesiado na postura inclinada sobre uma manta de aquecimento controlado de feed-back e manter a temperatura do corpo 37±0.5 ° C por meio de uma sonda retal conectada a esta unidade de aquecimento.
  3. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar ressecamento.
  4. Raspe a região cirúrgica no lado esquerdo do crânio com tosquiadeiras elétricas. Use betadine solução com uma gaze para desinfectar a pele. Enxágue desta região com uma almofada estéril contendo 70% de etanol e repita as duas etapas para três ciclos17.
  5. Para analgesia, injete 0,2 mL de bupivacaína a 0,5% por via subcutânea a cirurgia região17.
  6. Faça uma incisão de pele longa de 1 cm no crânio (estendendo-se desde o canto lateral do olho esquerdo até a base da orelha esquerda) e dissecar o músculo temporalis esquerdo para expor o crânio. Em seguida, crie uma rebarba pequeno furo 5 mm lateralmente e 1 mm posterior para o bregma18 a facilidade de colocação da ponta da sonda lápis fluxômetro Doppler.
  7. Vire o rato dos propensos a posição supina e coloque a sonda de lápis do laser o crânio previamente perfurados furos cegos para monitorar o fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF).
  8. Gravar rCBF de linha de base de cada animal e considerando isto como 100%. Notavelmente, oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é iniciado sempre que uma diminuição na rCBF de mais de 80% é detectados19,20.

2. indução da isquemia Focal Cerebra

  1. Raspar a região do pescoço e desinfectar a pele com betadine solução e 70% de etanol. Injete 0,2 mL de bupivacaína a 0,5% por via subcutânea no local da cirurgia para analgesia17.
  2. Fazer uma incisão de 2 cm tempo cirúrgico na superfície ventral do pescoço para acessar a artéria carótida comum esquerda (LCCA). Isole o LCCA do nervo vago e a fáscia vizinha para acessar a bifurcação da artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ACI).
  3. Ligate permanentemente o LCCA ou ECA empregando uma sutura de seda 5-0 e dissecar ICA gratuito ao nível da artéria pterigopalatina.
  4. Vagamente, coloque um laço de sutura de seda 5-0 ao redor LCCA, e então temporariamente ICA prenda com um clipe de micro vascular.
  5. Faça uma pequena incisão sobre o LCCA antes a gravata solta previamente colocada e depois insira uma sutura de silicone revestido de nylon 4-0 no espaço luminal do ICA e aperte a sutura ao redor da LCCA para proteger a sutura de nylon e evitar vazamento de sangue.
  6. Retire o microgrampo vascular do ICA. Em seguida, avança um filamento intraluminal revestido de silicone até observar um declínio marcado na rCBF que indica oclusão de origem MCA. No final do período isquêmico (90 min), começa a reperfusão retirando o intraluminal sutura21.

3. Veia Jugular canulação e Evans Blue injeção (EB)

  1. Fazer uma incisão longitudinal de 1 cm no pescoço para o lado esquerdo da linha média e em seguida sem rodeios dissecar afastada fáscia superficial para acessar o ramo externo da veia jugular esquerda (LGV). Então, permanentemente ligate extremidade cranial do LGV com sutura seda 5-0. Vagamente, coloque dois laços em torno da veia e então temporariamente braçadeira cardíaca final do LGV com um micropinça vascular.
  2. Faça uma pequena incisão sobre o LGV entre duas suturas e depois introduza o cateter de soro heparinizado preenchido no espaço luminal do LGV e avançá-lo aproximadamente 10 mm... depois, aperte as ligaduras em torno da veia para fixar o cateter e prevenir hemorragias. Injete pequenas quantidades de soro para evitar o colapso da veia.
  3. No início do período de reperfusão, lentamente injete tintura EB (1 mL/kg de solução EB 2% em solução salina) durante um período de 5 min. Posteriormente, lavar a cânula por injeção de solução salina de 0,5 mL e retirar a cânula de injeção a veia12,22.
  4. Finalmente, suturar as incisões de pescoço e cabeça e injetar 0,05 mg/kg de buprenorfina intraperitonealmente (IP) e repita a injeção a cada 6-8 h durante o período de reperfusão para analgesia pós-operatória17.
  5. Injete 5 mL de saline(IP) previamente aquecido para fornecer hidratação na gaiola de recuperação17.
  6. Lugar do animal em uma gaiola de recuperação especial equipado com temperatura e controle de ar condicionado e acompanhar a recuperação do animal da anestesia.

4. avaliação da permeabilidade de barreira sangue cérebro

  1. Após 24h de reperfusão, profundamente anestesia o animal com tiopental sódico. Em seguida, abra a cavidade torácica, fazendo um pequeno furo abaixo do esterno.
  2. Faça uma pequena abertura no átrio direito e injetar 250 mL de solução salina 0,9% previamente aquecido (37 ˚ c) a uma pressão de 110 mmHg através do ventrículo esquerdo durante 15 minutos lavar EB longe a circulação até as saídas de Salinas normais da aurícula torna-se incolor23.
  3. Imediatamente remover o cérebro do crânio e colocá-lo na matriz do cérebro. Dissecar o bulbo olfatório e cerebelo, e em seguida, usando uma lâmina de barbear limpa, separe o hemisfério direito do cérebro do lado esquerdo (Lesioned) ao longo da linha mediana.
  4. Pesar cada hemisfério e homogeneizá-los separadamente em 2,5 mL de solução salina tamponada fosfato e misture isto com 2,5 mL de ácido tricloroacético (60%) por 2 min usando uma máquina de vórtice.
  5. Centrifugar as amostras de cérebro por 30 min a 1.322 x g e permitir que as amostras arrefecer no frigorífico 4 ° C durante 10 min.
  6. Use os sobrenadantes para estimar a absorvância EB por um espectrofotômetro em 610 nm23.
  7. Calcule as concentrações EB contra uma curva padrão e resultados expressos em µ g/g de tecido cerebral.

5. produção da curva padrão EB

  1. Prepare soluções de amostra 10 do EB com concentrações de 1-10 µ g de EB em 5 mL de solução salina tampão fosfato.
  2. Medir os valores de absorvância de cada amostra em 610 nm, utilizando um espectrofotômetro.
  3. Fazer um gráfico de dispersão, usando uma folha de cálculo e concentrações de EB presentes no eixo X e os valores de absorvância no eixo Y (Figura 1).
  4. Defina uma linha de tendência linear para a curva com sua equação. Em seguida, usá-lo para obter a concentração do EB de amostras.
  5. Relate os resultados finais do extravasamento de EB como µ g/g de peso de tecido do cérebro.

6. operação sham

  1. Realizar o mesmo processo cirúrgico com ratos no grupo de operação (incluindo fazendo uma incisão na região do pescoço e injeção de EB) mas excluir o MCAO.

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Representative Results

Não houve diferença significativa nos níveis EB no hemisfério direito vs hemisfério esquerdo dos ratos operação (1,06 ± 0,1 µ g/g e 1,1 ± 0,09 µ g/g, respectivamente). Conforme mostrado nas figuras 2A-2B, indução de isquemia transitória (90 min isquemia / reperfusão 24h) causou uma diferença significativa nos níveis de EB (10,41 ± 0,84 µ g/g, p < 0,001) no hemisfério esquerdo de ratos isquêmicos, em comparação com os respectivos Hemisfério nos ratos de operação. Coletivamente, estes resultados indicam que em condições normais, EB não pode facilmente cruzar o BBB parênquima cerebral e insultos isquêmicos cerebrais induzem o extravasamento de EB, através de uma maior permeabilidade do BBB (figuras 2A e 2B).

Figure 1
Figura 1 : A curva padrão é usada para determinar a concentração de EB aos valores de absorvância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Avaliação de ruptura de BBB por extravasamento EB 24 horas após o acidente vascular cerebral isquêmico. A fotografia dos cérebros da operação e isquêmicos animais (A). A intensidade de extravasamento do EB no tecido cerebral (cor azul) surge da extensão do rompimento do BBB no hemisfério lesado. Concentração de EB em amostras preparadas a partir da esquerda (lesionada) e direito hemisférios do cérebro em animais isquêmicos e operação (B) (n = 6, *p< 0,001 comparado ao hemisfério esquerdo no grupo sham, p< 0,001 em comparação com Hemisfério ipsilateral do mesmo grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Até agora, vários métodos como autoradiografia e detecção dos traçadores radioativos24,25, microscopia de imunofluorescência26,27, EB extravasamento técnica20, e 23 têm sido utilizados para avaliar o dano da barreira hemato - encefálica. Tintura EB é fortemente podem ligar para a albumina e é usada como um marcador para detectar vazamento vascular e quantificar o BBB avaria11,28,29. Como um método altamente aceito e confiável, a técnica de extravasamento de EB fornece uma estimativa direta sobre a integridade do BBB que é afetado por lesões cerebrais diferentes, incluindo acidente vascular cerebral isquêmico.

Avaliação in vivo do BBB permite que os pesquisadores para estudar possíveis mecanismos fisiopatológicos da isquemia induzida vasogénico cérebro edema e encontrar novas intervenções terapêuticas. Este modelo não requer equipamentos especiais e pode produzir resultados credíveis com uma elevada taxa de sucesso em experimentos (mais de 80%)13,20. Com acesso directo para o tecido cerebral, este modelo permite avaliações altamente precisas da integridade BBB mas é restrita a estudos de longo prazo.

As alterações patológicas no BBB causada por acidente vascular cerebral isquêmico desenvolvem em três fases: aguda (em horas), subagudas (horas, dias) e crônica (dias a meses)30,31. Obviamente, as primeiras intervenções terapêuticas produzem efeitos protectores valiosos na fase aguda do patológica. Dosagem EB e o ponto de tempo de injeção são dois parâmetros cruciais para a obtenção de resultados fiáveis devido a natureza dinâmica do BBB após insultos isquêmicos. Daí, injeção do corante EB lentamente através de uma cânula de veia usando a dose adequada (1 mg/kg de solução EB 2% em solução salina) após o início do período de reperfusão é um fator importante e permite o estudo das alterações fisiopatológicas nos estágios iniciais de AVC .

Vários métodos experimentais foram introduzidos para estudar o acidente vascular cerebral isquêmico. Neste modelo experimental, nós usamos MCAO com o método de filamento intraluminal que cria condições semelhantes a acidente vascular cerebral humano21,32. Esta técnica é simples e confiável; no entanto, sua execução precisa levar em consideração alguns pontos técnicos de melhorar o desempenho da técnica e garantir a sua precisão. A temperatura corporal deve ser mantida dentro da faixa fisiológica durante a cirurgia, enquanto a pressão arterial e os gáses de sangue devem ser monitorado33,34,35. Constante de gravação do rCBF com um fluxômetro Doppler laser e usando um adequado preparado filamento do silicone revestido pode não só aumentar a taxa de sucesso MCAO, mas também reduzir a taxa de mortalidade.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Chanceler Vice de investigação das Ciências da Universidade de Ardabil médica (Ardabil, Irã) para o apoio financeiro (conceder n: 9607).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

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