एक आणविक विप्रिंटिंग आधारित समाई हुई संवेदी का उपयोग करके Ultrasensitive के निशान का पता लगाने

Immunology and Infection
 

Summary

यहां, हम पता लगाने और जटिल समाधान में कम प्रचुर मात्रा में अणुओं की ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक संधारित्र के साथ संयोजन में आणविक मुद्रण का उपयोग कर ।

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Ertürk, G., Lood, R. Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e57208, doi:10.3791/57208 (2018).

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Abstract

का पता लगाने और जटिल समाधान में quantitate करने की क्षमता हमेशा अत्यधिक की मांग की गई है-के बाद प्राकृतिक विज्ञान के भीतर; के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, जो मार्क्स, संदूषणों का पता लगाने और ब्याज के अंय अणुओं । इस प्रयोजन के लिए एक सामांय तकनीक का इस्तेमाल किया एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख (एलिसा), जहां अक्सर एक एंटीबॉडी एक विशिष्ट लक्ष्य अणु की ओर निर्देशित है, और एक दूसरे लेबल एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, के लिए अनुमति अध्ययन के तहत परमाणु ठहराव के निरपेक्ष । हालांकि, मांयता तत्वों के रूप में एंटीबॉडी का उपयोग विधि की मजबूती को सीमित करता है; के रूप में लेबल अणुओं का उपयोग करने की आवश्यकता है । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, आणविक मुद्रीकरण लागू किया गया है, कृत्रिम मांयता टेम्पलेट अणु के पूरक साइटों का निर्माण, और प्रारंभिक बंधन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करने की आवश्यकता obsoleting. इसके अलावा, भी उच्च संवेदनशीलता के लिए, माध्यमिक लेबल एंटीबॉडी ठहराव लक्ष्य अणु के लिए समाई पर निर्भर संवेदी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम तेजी से और लेबल से मुक्त पता लगाने और जटिल नमूनों में कम प्रचुर मात्रा में quantitate (प्रोटीन और वायरस) के लिए एक विधि का वर्णन है, एक संवेदनशीलता है कि आमतौर पर उपयोग किया जाता है जैसे एलिसा के रूप में इस्तेमाल की तुलना में बेहतर है । यह सब एक समाई के साथ संयोजन में आणविक मुद्रण द्वारा मध्यस्थता है ।

Introduction

ठहराव के कई विभिंन अनुसंधान क्षेत्रों में विज्ञान के भीतर प्रयोग किया जाता है, radioimmunoassay (रिया) या एलिसा1जैसे तरीकों को रोजगार । इन पद्धतियों में से कुछ एक रेडियो आइसोटोप या एंजाइम लेबल एंटीबॉडी/प्रतिजन, जो उंहें जटिल प्रक्रियाओं के साथ श्रम-गहन और समय लेने वाली बनाता है की तरह एक लेबल एजेंट की आवश्यकता होती है 2 । इसके अलावा, मजबूती, selectivity, और इन तरीकों की संवेदनशीलता सभी विश्लेषण के लिए पर्याप्त नहीं हैं; विशेष रूप से वे पर्याप्त नहीं है जब attogram मात्रा का विश्लेषण करने की जरूरत है, बजाय pictogram मात्रा3। इस प्रयोजन के लिए, एक वृद्धि की मजबूती के लिए आणविक मुद्रीकरण के साथ संयोजन में विशेष रूप से,4,5, एक बहुत ब्याज प्राप्त किया है ।

आणविक मुद्रण6के आसपास polymerizing कार्यात्मक मोनोमर द्वारा गुहाओं बनाने पर निर्भर करता है, कृत्रिम मान्यता साइटों है कि पूरी तरह से7टेम्पलेट सदृश बनाने. इस तकनीक के कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, दवा वितरण प्रणालियों और विश्लेषणात्मक जुदाई सहित, लेकिन यह भी रूप में,9,10. हालांकि, प्रोटीन्स और सेल11,12जैसे macromolecular टेम्पलेट्स के लिए अभी भी आणविक रूप से प्रिंट किए गए पॉलिमर (MIPs) के डिजाइन में कुछ कठिनाइयां हैं । इस के कारण, कई शोधकर्ताओं ने एक सब्सट्रेट पर सीधे प्रोटीन टेम्पलेट प्रिंटिंग पर ध्यान केंद्रित किया है, इस प्रकार एक सतह है कि लक्ष्य प्रोटीन द्वारा मान्यता प्राप्त हो जाएगा बनाने12. इस सतह कोटिंग तकनीक बड़े अणु और प्रोटीन सहित विधानसभाओं के लिए मांयता गुहाओं को रोजगार के लिए इस्तेमाल microcontact13,14प्रिंटिंग कहा जाता है । विधि की सामान्य प्रक्रिया दो सतहों के बीच बहुलकीकरण पर निर्भर करता है-एक टेम्पलेट स्टांप और एक बहुलक समर्थन-जिस पर टेम्पलेट एक सतह पर adsorbed है15,16, और के साथ संपर्क में लाया मोनोमर-इलाज सतह । इस तरह से, एक पतली बहुलक फिल्म यूवी-बहुलकीकरण के माध्यम से समर्थन पर बना है । अंत में, टेम्पलेट हटा दिया जाता है, प्रिंट इलेक्ट्रोड की सतह पर विशिष्ट गुहाओं टेम्पलेट के पीछे छोड़ रहा है. इस विधि के एक सीमित अणु का एक कम गतिविधि हानि सहित कुछ फायदे हैं, साथ ही साथ मुद्रण प्रक्रिया16,17के लिए अणु के अणुओं की बहुत छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, इन लागत प्रभावी, स्थिर, संवेदनशील, और चुनिंदा सतहों संवेदक सतहों पर बनाया जा सकता है, उपयोगकर्ता की पसंद के किसी भी टेंपलेट को लक्षित ।

यह एक प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बहुत बड़ा biomacromolecules, वायरस सहित । हाल ही में ब्याज प्राप्त वायरस का एक विशिष्ट समूह भोजी है, जो एक वायरस है कि बैक्टीरिया को संक्रमित है । bacteriophages के त्वरित और संवेदनशील का पता लगाने के क्रम में bacteriophages के साथ बैक्टीरियल संस्कृतियों के संक्रमण का निर्धारण करने के लिए18, प्रौद्योगिकी और दवाओं के दौरान महत्वपूर्ण है । भोजी डिटेक्शन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जैविक परख है डबल परत आगर विधि19, जो श्रमसाध्य और समय लगता है । वायरस (bacteriophages सहित) के लिए उपंयास नैदानिक उपकरण विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए है जैसे कि परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM)20, interferometry21, electrochemistry22, और सेंसर प्रणाली23, 24. काम का एक बहुत अपने लाभ के कारण करने के लिए संचालित करने के लिए आसान है, अति संवेदनशील है, और वास्तविक समय माप15,25में सक्षम के रूप में अपने फायदे के लिए पर ध्यान केंद्रित किया गया है । एक विशिष्ट प्रकार के सेंसर समाई में परिवर्तन पर आधारित है । ये संधारित्र विद्युत सेंसर है कि अचालक गुणों में परिवर्तन को मापने जब एक analyte सेंसर सतह पर एक मान्यता तत्व के साथ इंटरैक्ट करता है, समाई में कमी के कारण2,4 . एंटीजन, एंटीबॉडी, प्रोटीन, और भारी धातु आयनों6,26,27,28जैसे विभिन्न analytes का पता लगाने के लिए संधारित्र के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन प्रकार के संवेदीकरण में अंतर्निहित तेजी, उच्च संवेदनशीलता, सरलता, कम लागत, आसान हेरफेर, और29लेबलिंग के बिना वास्तविक समय मापन जैसे कई फायदे हैं ।

यहां वर्णित विधि का उद्देश्य है कि किसी भी लेबलिंग का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना, अत्यधिक जटिल नमूनों में कम प्रचुर मात्रा में ठहराव का पता लगाना और उसे सक्षम करना । विशेष रूप से, तकनीक एटो-picogram रेंज में सबसे अधिक उपयोगी है, जहां अन्य वाणिज्यिक रूप से मौजूदा उपकरणों को सही ढंग से अपने लक्ष्य quantitate करने के लिए असफल ।

Protocol

1. ग्लास कवर स्लिप्स (टेंपलेट टिकटों) का संशोधन

  1. कांच कवर फिसल साफ करने के लिए, उन्हें क्रमिक रूप से १.० मीटर एचसीएल के 10 मिलीलीटर में विसर्जित, जल, और NaOH के १.० मीटर, क्रमशः, कमरे के तापमान पर एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में प्रत्येक चरण में 10 मिनट के लिए ।
    1. नाइट्रोजन गैस के साथ ग्लास कवर स्लिप्स ड्राई ।
      नोट: आवरण फिसल जाता है गैसीय नाइट्रोजन की एक धारा के तहत वाष्पीकरण से सूख रहे हैं ।
  2. 10% में साफ और सूखे कवर फिसल जाता है (v/v), 3 के 10 मिलीलीटर समाधान-अमीनो-propyl-triethoxysilane (APTES) 1 ज के लिए इथेनॉल में कवर कांच की सतह पर अमीनो समूहों का परिचय, कमरे के तापमान पर ।
    1. कुल्ला पानी के साथ कवर फिसल जाता है ।
    2. कवर को नाइट्रोजन गैस के साथ स्लिप में सुखा लें ।
  3. APTES-संशोधित कवर 5% (v/v) में फिसल जाता है, 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) में glutaraldehyde के 2 ज के लिए समाधान सतह पर अमीनो समूहों को सक्रिय करने के लिए, कमरे के तापमान6,15में ।
    1. कवर कुल्ला 10 mM फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) के साथ फिसल जाता है ताकि सतह से अतिरिक्त glutaraldehyde को दूर करने के लिए ।
    2. कवर को नाइट्रोजन गैस के साथ स्लिप में सुखा लें ।
  4. 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) में ०.१ मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता में १.० एमएल के टेंपलेट (प्रोटीन/भोजी) समाधान तैयार करें ।
    नोट: को भंग ०.१ फॉस्फेट बफर की १.० मिलीलीटर में प्रोटीन की मिलीग्राम (10 मिमी, पीएच ७.४). यदि आवश्यक हो, एक spectrophotometer (२८० एनएम) प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. ड्रॉप २०० µ इस पर समाधान के एल संशोधित कवर फिसल जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      नोट: अतिरिक्त टेंपलेट समाधान 1-2 अधिक टेंपलेट टिकटों के लिए तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लक्षणीय अध्ययन में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    2. कवर कुल्ला 10 mM फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) के साथ फिसल जाता है ताकि सतह से असीम टेम्पलेट को दूर करने के लिए ।
      नोट: इलेक्ट्रोड कुल्ला करने के लिए, उन्हें फॉस्फेट बफर के साथ धोने (10 मिमी, पीएच ७.४) के लिए 30 एस.
    3. कवर को नाइट्रोजन गैस के साथ स्लिप में सुखा लें ।
      नोट: कवर स्लिप्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए जब तक वे बहुलकीकरण कदम में उपयोग किया जाता है ।

2. समाई सोने इलेक्ट्रोड का संशोधन

  1. इलेक्ट्रोड को साफ करने के लिए, एक छोटे से चोंच में इलेक्ट्रोड विसर्जित, क्रमिक रूप से, जिसमें इथेनॉल के 5 मिलीलीटर (७०%), जल, एसीटोन, जल, अंलीय पिरांहा समाधान (3:1, h2तो4: h2O2, v/v), और/ पानी, प्रत्येक चरण में 10 मिनट के लिए, कमरे के तापमान पर एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में क्रमशः ।
    1. इलेक्ट्रोड को नाइट्रोजन गैस से सुखा लें ।
  2. टायरामाइन के electropolymerization प्रदर्शन करने के लिए, 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) इथेनॉल युक्त (2 एमएल)15में 10 मिमी टायरामाइन समाधान के 8 मिलीलीटर तैयार.
    नोट: टायरामाइन समाधान की कुल मात्रा 2 मिलीलीटर इथेनॉल के सहित कुल में 8 मिलीलीटर होना आवश्यक है ।
    1. इस समाधान में चक्रीय voltammetric स्कैन (15 चक्र) का उपयोग कर एक potentiostat 0-१.५ वी (एजी/AgCl) और ५० mV/एस के एक स्कैन दर की एक संभावित सीमा को कवर करने के लिए30
    2. पानी के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला ।
    3. इलेक्ट्रोड को नाइट्रोजन गैस से सुखा लें ।
  3. एक समाधान में इलेक्ट्रोड विसर्जित 30 मिमी acryloyl क्लोराइड और टोल्यूनि में 30 मिमी trimethylamine (Vकुल = 5 एमएल) कमरे के तापमान पर रातोंरात6,15,30.
    1. पानी के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला ।
      नोट: unacryloyl क्लोराइड और trimethylamine अवशेषों की एक बेहतर हटाने सुनिश्चित करने के लिए, यह भी पानी के बाद NaOH के साथ सतह धोने के लिए संभव है ।
    2. इलेक्ट्रोड को नाइट्रोजन गैस से सुखा लें ।

3. खाका विमुद्रित समाई सोने इलेक्ट्रोड की तैयारी

  1. भोजी विमुद्रित समाई सोने इलेक्ट्रोड की तैयारी
    1. बहुलकीकरण करने से पहले, 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) की 1 मिलीलीटर में 1:5 (मॉल/मॉल) के अनुपात में मोनोमर (एन hydroxymethyl acrylamide) और पार से लिंकर (पॉलीथीन ग्लाइकोल-४००-dimethacrylate) युक्त एक मोनोमर समाधान तैयार करें ।
      नोट: मोनोमर मोनोमर और पार से लिंक युक्त समाधान विभिंन अनुपात में इस्तेमाल किया जा सकता है, या मोनोमर और पार से लिंक के प्रकार विशिष्ट बातचीत के अनुकूलन के लिए टेंपलेट के अनुसार बदला जा सकता है ।
    2. इस समाधान में फोटो-सर्जक के 1 मिलीग्राम जोड़ें ।
      नोट: यदि बहुलकीकरण यूवी प्रकाश के तहत किया जाता है, तो फोटो-सर्जक बहुलकीकरण शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यदि बहुलकीकरण को नि: शुल्क कट्टरपंथी बहुलकीकरण द्वारा निष्पादित किया जाता है, तो सर्जक के प्रकार को बदलना होगा ।
    3. पिपेट १.५ संशोधित गोल्ड इलेक्ट्रोड के सोने की सतह पर इस समाधान के µ एल ।
      नोट: इलेक्ट्रोड के सोने की सतह में योजनाबद्ध रूप से दिखाया गया है चित्रा 1.
    4. सोने इलेक्ट्रोड सतह के शीर्ष पर मोनोमर समाधान के साथ संपर्क में टेंपलेट स्टांप लाओ ।
    5. शुरू यूवी बहुलकीकरण (३६५ एनएम, ४०० डब्ल्यू) और 15 मिनट के लिए जारी रखें31
      नोट: यूवी बहुलकीकरण बहुलकीकरण शुरू करने से पहले-25 ° c करने के लिए सेट है जो एक ठंडा कैबिनेट के अंदर किया जाता है । फिर, यूवी प्रकाश इलाज प्रणाली चालू है और बहुलकीकरण यूवी प्रकाश इलाज प्रणाली को चालू करने से पहले 15 मिनट के लिए जारी रखा है ।
    6. संदंश का उपयोग कर सतह से टेंपलेट स्टांप निकालें ।
      नोट: सतह से टेंपलेट स्टांप हटाने के दौरान, सतह पर बहुलक फिल्म क्षतिग्रस्त हो सकती है । इसलिए, स्टांप बहुत सावधानी से सतह से हटाया जाना चाहिए और बल का उपयोग कर के बिना धीरे से ।
    7. पानी के साथ इलेक्ट्रोड सतह कुल्ला और यह नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी ।
    8. इलेक्ट्रोड सतह पर pinholes को कवर करने के लिए 20 मिनट के लिए इथेनॉल में तैयार 10 मिमी 1-dodecanethiol के 1 मिलीलीटर में इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया.
    9. कुल्ला पानी के साथ इलेक्ट्रोड और सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ इलेक्ट्रोड ।
  2. प्रोटीन विमुद्रित समाई सोने इलेक्ट्रोड की तैयारी
    1. बहुलकीकरण से पहले, एक मोनोमर मोनोमर युक्त समाधान तैयार (acrylamide: ५४ मिलीग्राम; N-hydroxymethylacrylamide: १४० µ l; N-isopropylacrylamide: ८५.६ mg) और क्रॉस-लिंकर (methylenebisacrylamide: ९.५ mg) में ८२० µ l का अल्ट्रा-शुद्ध पानी30,३२.
    2. अल्ट्रा-शुद्ध जल में 5% (v/v) n, n, n ', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) तैयार करें ।
    3. मोनोमर समाधान में TEMED समाधान के 20 µ l जोड़ें और 5 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस से शुद्ध करें ।
    4. अल्ट्रा-प्योर वॉटर में 10% (w/v) अमोनियम persulphate (एपीएस) तैयार करें ।
    5. मोनोमर समाधान में अनुप समाधान के 20 µ l को जोड़ें ।
    6. पिपेट १.५ संशोधित गोल्ड इलेक्ट्रोड सतह पर मोनोमर समाधान के µ एल ।
    7. मोनोमर-इलाज सतह के साथ संपर्क में टेंपलेट स्टांप लाओ ।
    8. कमरे के तापमान पर बहुलकीकरण शुरू करें और 5 एच के लिए जारी रखें ।
      नोट: प्रोटीन-प्रतिमुद्रित सोने इलेक्ट्रोड की तैयारी के लिए, के बजाय यूवी-बहुलकीकरण, मुक्त-कट्टरपंथी बहुलकीकरण कमरे के तापमान पर (25 डिग्री सेल्सियस) अनुप-TEMED का उपयोग करके प्रारंभकर्ता उत्प्रेरक के रूप में किया जाता है ।
    9. संदंश का उपयोग कर ध्यान से सतह से टेंपलेट स्टांप निकालें ।
    10. पानी के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी ।
    11. इलेक्ट्रोड सतह पर pinholes को कवर करने के लिए 20 मिनट के लिए इथेनॉल में तैयार 10 मिमी 1-dodecanethiol के 1 मिलीलीटर में इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया.
    12. कुल्ला पानी के साथ इलेक्ट्रोड और सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ इलेक्ट्रोड ।

4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के साथ इलेक्ट्रोड सतह का लक्षण वर्णन

  1. माउंट चिपकने वाला कार्बन टेप के साथ एल्यूमीनियम धारकों पर नमूनों ।
  2. कोट 10 एनएम पैलेडियम के साथ इलेक्ट्रोड/
  3. SEM के साथ इलेक्ट्रोड की जांच करें ।

5. टेंपलेट के साथ वास्तविक समय समाई माप समाई सोने इलेक्ट्रोड अंकित

  1. विद्युत प्रवाह सेल में एक संधारित्र के लिए एकीकृत विघटित समाई सोने इलेक्ट्रोड संमिलित करें ।
  2. १०० मिलीलीटर के उत्थान बफर तैयार (25 mM glycine-HCl, ५० मिमी के बीच-20 सहित पीएच २.५,) और 1 एल चल बफर (भोजी के लिए अंकित प्रणाली: 10 mm फॉस्फेट, पीएच ७.४; के लिए प्रोटीन-प्रिंटेड सिस्टम: ५० mm Tris-HCl, ph ७.४) ।
  3. विश्लेषण सिस्टम पुन: जनरेट करने के लिए और 25 मिनट के लिए सिस्टम re-equilibrate करने के लिए बफ़र चलाने के लिए पुनर्जनन के इंजेक्शन बफ़र के साथ प्रारंभ करें ।
  4. मानक टेम्पलेट समाधानों को चल रहे बफ़र में इच्छित एकाग्रता श्रेणी में तैयार करें ।
    नोट: पहले ०.१ मिलीग्राम प्रोटीन भंग, या लगभग 108 pfu bacteriophages, में १.० मिलीलीटर फॉस्फेट बफर (10 मिमी फॉस्फेट, पीएच ७.४) द्वारा समाधान टेम्पलेट का एक शेयर तैयार करते हैं । फिर, स्टॉक समाधान से दस अनुक्रमिक 10 गुना कमजोर पड़ने से बनाने के द्वारा अंशांकन वक्र के लिए मानक समाधान तैयार करते हैं । इन समाधानों के साथ ५.५ चरण में संधारित्र संवेदी का विश्लेषण किया जाएगा । प्रोटीन एकाग्रता एक spectrophotometer (२८० एनएम) का उपयोग करके मापा जा सकता है । आदेश में भोजी एकाग्रता को मापने के लिए, एक डबल परत आगर विधि इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विवरण में वर्णित है पहले19
  5. इन मानक समाधान के २५० µ एल इंजेक्शन क्रमिक रूप से इष्टतम स्थितियों में प्रणाली के लिए (प्रवाह दर: १०० µ l/मिनट, तापमान: 25 ° c) ।
    नोट: इस आवेदन में, मानक प्रोटीन समाधान १.० x 10-4 -१.० x 10-14की एकाग्रता रेंज में तैयार किया गया था, जबकि भोजी सांद्रता रेंज में थे १.० x 101 -१.० x 105 pfu/एमएल । समाधान इंजेक्शन वाल्व में रखा गया था, और क्रमिक रूप से प्रणाली में इंजेक्शन, एक सिरिंज पंप और मल्टीपोर्ट वाल्व के माध्यम से triplicates में नमूनों इंजेक्शन । विमुद्रित गुहाओं के लिए टेम्पलेट की बाइंडिंग से उत्पन्न होने वाले मानक समाधानों को इंजेक्ट करने के बाद समाई में कमी स्वचालित रूप से साधन के सॉफ्टवेयर के द्वारा निगरानी की जाती है ।

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करके, चित्रा 1में योजनाबद्ध के अनुसार, एक नंगे सोने इलेक्ट्रोड एक टेम्पलेट के साथ अंकित किया जाएगा, एक biomacromolecule की संरचना का प्रतिनिधित्व. इस इलेक्ट्रोड एक संधारित्र में लागू किया जा सकता है (चित्रा 2), इलेक्ट्रोड पर एक टेम्पलेट के स्थिर आवेदन की अनुमति है, और टेम्पलेट की बाइंडिंग पर समाई में परिवर्तन की माप.

संधारित्र के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के चित्र 2में दिखाया गया है । centris पंप, जो चल बफर के सतत इंजेक्शन के लिए जिंमेदार है (10 मिमी फॉस्फेट, पीएच ७.४), और पुनर्जनन बफर (25 मिमी glycine-एचसीएल, पीएच २.५) प्रवाह सेल में पुनर्जनन के दौरान, आंकड़ा में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है । फ्लो सेल काम कर रहे हैं, संदर्भ, और काउंटर इलेक्ट्रोड । इंजेक्शन वाल्व मानक प्रोटीन से बना है/भोजी समाधान है, जो पहले degasser के माध्यम से गुजर रहे है और फिर प्रणाली में अनुक्रमिक इंजेक्शन । जैसे ही समाधान प्रवाह कक्ष में डाले गए कार्य इलेक्ट्रोड तक पहुँचते हैं, तो परिणाम रीयल-टाइम में नजर आता है. समाई मूल्यों कंप्यूटर स्क्रीन पर sensorgrams का पालन करके पंजीकृत किया जा सकता है ।

चित्रा 3 और चित्रा 4 नंगे और अंकित सोने इलेक्ट्रोड की सतह के बीच मतभेदों को दर्शाती है । इस लक्षणात्मक कदम यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि वहां बहुलक गुहाओं, unprinting के बाद इलेक्ट्रोड की सतह पर किसी न किसी के रूप में देखा जाता है । SEM के अलावा, वहां भी AFM सहित अंय लक्षण वर्णन तरीके, संपर्क कोण माप, ellipsometry आदि, कि मुद्रण के बाद सतह विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह से, यह सुनिश्चित किया जा सकता है कि प्रिंटिंग प्रक्रिया सफल है और उस टेम्पलेट गुहाओं सतह पर बनते हैं । इन गुहाओं के भीतर, टेम्पलेट उच्च विशिष्टता और अपनत्व के साथ बाँध सकते हैं ।

समाई प्रणाली में मानक समाधान इंजेक्शन के बाद, पिछले पांच रीडिंग के एक औसत सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से गणना की गई थी, और अंशांकन रेखांकन की एकाग्रता बनाम समाई में परिवर्तन की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त किया गया analyte । पंजीकृत समाई में कमी टेंपलेट के बंधन से उठी । अधिक अणुओं है कि सोने इलेक्ट्रोड सतह को बांध, उच्च कुल समाई में कमी, समाई माप के सामान्य सिद्धांत के अनुसार. चित्रा 5 और चित्रा 6 बताते हैं कि analyte की एकाग्रता बढ़ाने के साथ, उम्मीद के रूप में ΔC बढ़ जाती है. गतिशील रेंज (जो बीच एकाग्रता रेंज जहां प्रणाली एक विशिष्ट लक्ष्य का पता लगाने के लिए उपयोगी है) और पता लगाने की सीमा (लोद) इन रेखांकन का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 6के अनुसार, इस अध्ययन में 10 pfu/एमएल के एक लोद मूल्य के साथ 101 -105 pfu/एमएल की एकाग्रता रेंज में bacteriophages का पता लगा सकते है भोजी समाई संवेदी । दोनों चित्रा 5 और चित्रा 6 भी एक ही अंतराल में अंशांकन के लिए आवश्यक माप की आवश्यकता पर प्रकाश डाला एकाग्रता के बाद से माना जाता है, हीनता की रैखिकता सांद्रता पर भिन्न हो सकते हैं ( चित्रा 5), या अलग ढलान (चित्रा 6) है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम इस्तेमाल किया सांद्रता के कारण, प्रणाली के उतार चढ़ाव के लिए काफी संवेदनशील है (नमूना में turbidity, एयर ड्राफ्ट, आदि.), और इसलिए, यह कम से triplicates outliers सहित की क्षमता को कम करने के लिए चलाने के लिए सिफारिश की है . एक ही कारण के लिए, मानक विचलन बहुत पतला नमूनों के लिए काफी महत्वपूर्ण हो सकता है, के रूप में चित्रा 6में देखा ।

Figure 1
चित्र 1 . microcontact मुद्रण पद्धति का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । () कांच के आवरण की तैयारी (टेंपलेट टिकटों), () समाई सोने इलेक्ट्रोड की तैयारी, () microcontact यूवी के माध्यम से सोने इलेक्ट्रोड सतह पर टेम्पलेट का मुद्रण-बहुलकीकरण, और (D) इलेक्ट्रोड सतह से टेंपलेट को हटाना (Ertürk एट अलसे reproduced., जैव प्रौद्योगिकी रिपोर्ट २०१४ (3): ६५-७२ अनुमति के साथ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2। समाई संवेदी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । इस अध्ययन में प्रयुक्त संधारित्र के सामान्य लेआउट (Ertürk एट अलसे reproduced., जैव प्रौद्योगिकी रिपोर्ट २०१४ (3): ६५-७२ अनुमति के साथ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3। प्रोटीन प्रिंटेड इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग. SEM छवियां (a) एक नंगे सोने इलेक्ट्रोड (स्केल बार = 20 µm), और (B) एक प्रोटीन विचित्रित समाई सोने इलेक्ट्रोड (स्केल बार = 10 µm). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4। भोजी प्रिंटेड इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग. एक नंगे सोने इलेक्ट्रोड की SEM छवियां (स्केल बार = 20 µm) (a), और एक भोजी अलग आवर्धन में समाई सोने इलेक्ट्रोड (6600x, स्केल बार = 10 µm) (B), और 11, 500X, स्केल बार = 5 µm) (C); तीरों का पालन bacteriophages) निरूपित किया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5। अंशांकन रेखांकन के लिए बफ़र संरचना का प्रभाव. अंशांकन इष्टतम स्थितियों में एक प्रोटीन एकाग्रता बनाम समाई में परिवर्तन दिखा ग्राफ (चल बफर: ५० mM Tris-एचसीएल, पीएच ७.४; पुनर्जनन बफर: 25 मिमी glycine-एचसीएल, पीएच २.५ सहित ५० mm के बीच-20; प्रवाह दर: १०० µ l/मिनट, नमूना मात्रा: २५० µ l; टी: 25 डिग्री सेल्सियस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6। बड़े biomacromolecules के लिए प्रतिनिधि अंशांकन वक्र । अंशांकन ग्राफ कि इष्टतम परिस्थितियों में समाई बनाम भोजी एकाग्रता में परिवर्तन से पता चलता है (बफर चल रहा है: 10 mM फॉस्फेट, पीएच ७.४; पुनर्जनन बफर: 25 मिमी glycine-एचसीएल, पीएच २.५ सहित ५० mm के बीच-20; प्रवाह दर: १०० µ l/मिनट, नमूना मात्रा: २५० µ l; टी: 25 डिग्री सेल्सियस) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

जब इस विधि से बाहर किया जाता है, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि प्रोटोकॉल का पालन करते समय माना जाना चाहिए रहे हैं । एक महत्वपूर्ण कदम अंलीय पिरांहा समाधान के साथ सफाई कदम है । चरण २.१ 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए । चरण १.४ के लिए टेंपलेट समाधान से अधिक नहीं होना चाहिए ०.१ mg/एमएल, क्योंकि ये मान पहले ऑप्टिमाइज़ किया गया है । चक्रीय voltametric स्कैन 15 चक्र से अधिक नहीं होना चाहिए ताकि इष्टतम मोटाई प्राप्त करने के लिए । कदम 3.1.3 के लिए, १.५ µ एल एक अनुकूलित मूल्य है । यह मान इलेक्ट्रोड के इस विशिष्ट प्रकार के लिए उच्च नहीं होना चाहिए । यदि यूवी इलाज प्रणाली ४०० डब्ल्यू की एक शक्ति है, तो बहुलकीकरण 10-15 मिनट की एक अधिकतम के लिए किया जाना चाहिए । TEMED के बाद समाधान के लिए अनुप (प्रारंभकर्ता) जोड़ा जाता है जैसे ही, क्रमिक चरण तुरंत बहुलकीकरण (step 3.2.5) से बचने के लिए बहुत जल्दी किया जाना चाहिए ।

सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक यूवी बहुलकीकरण के बाद सतह से टेंपलेट स्टांप को हटाने है । यदि यह कदम ठीक से नहीं किया जाता है, वहां एक जोखिम है कि इलेक्ट्रोड की सतह पर बहुलक फिल्म स्टांप के साथ हटाया जा सकता है । इसलिए, यह इलेक्ट्रोड और बहुलकीकरण के बाद पानी के एक समाधान में शीर्ष पर प्रोटीन स्टांप विसर्जित करने के लिए सिफारिश की है, तो स्टांप बहुत धीरे और ध्यान से सतह (चरण 3.1.6) से हटा दें ।

इस्तेमाल किया टेम्पलेट के आधार पर, प्रकार और मोनोमर के अनुपात में संशोधनों का इस्तेमाल किया (कार्यात्मक मोनोमर और पार-linker) उच्च संवेदनशीलता पैदा करने के मामले में मूल्यांकन किया जा सकता है. यह empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, टेंपलेट अणु के संबध बाध्यकारी आमतौर पर एक साथ कई विभिंन बातचीत शामिल है । इसलिए, यह उत्थान चरणों के दौरान समस्याओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । बाउंड टेम्पलेट सतह से ठीक से जारी नहीं है, तो यह आगे विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रोड के पुनर्प्रयोज्य को प्रभावित कर सकता है । इन बहु समानताएं भी कमजोर बातचीत के माध्यम से बाध्यकारी परिणाम हो सकता है । ऐसी प्रणालियों में, गैर-विशिष्ट बाइंडिंग जगह ले सकती है, जो सिस्टम16के selectivity को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है । ये आम है, और सामांय, विधि की सीमाएं हैं ।

इन विशिष्ट सीमाओं के अलावा, वहां मौजूदा तरीकों पर चर्चा की विधि के कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं । जबकि RIAs, एलिसा, और fluorometric माप बहुत संवेदनशील होते हैं, वे लेबल सामग्री (या तो टेंपलेट या डिटेक्टर) के उपयोग की आवश्यकता है, जबकि इस तरह से है, जबकि अधिक संवेदी है लेबल मुक्त । ये तरीके भी अधिक खर्चीले और समय लेने वाले होते हैं. एक एक प्रकार का संवेदी दृष्टिकोण एक ही समय में विभिन्न रचनाओं में तेजी से, MIPs के समानांतर संश्लेषण के लिए अनुमति देता है16. केवल कुछ microliters मोनोमर समाधान की तैयारी के लिए आवश्यक है के बाद से, विधि सुविधाजनक है जब महंगा या अंयथा सीमित मोनोमर का उपयोग कर । इसके अलावा, एकल MIP इलेक्ट्रोड प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कमी के बिना लगभग ८० विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में काफी अधिक है30. मौजूदा तरीकों को भी, कम संवेदनशीलता और selectivity की डिग्री बदलती में, पीड़ित हैं, जबकि वर्णित विधि का पता लगाने और प्रधानमंत्री रेंज में उच्च selectivity के साथ अणुओं की ठहराव के लिए अनुमति देता है ।

लागत प्रभावशीलता के कारण, साधन के संचालन की आसानी, और मौजूदा तरीकों की तुलना में एक कम समय में वास्तविक समय संवेदनशील का पता लगाने, इस क्षेत्र की स्थितियों के तहत, बहुत आशाजनक देखभाल का पता लगाने प्रणालियों के बहुत होनहार हैं । उदा, पर्यावरणीय निगरानी के लिए और विकासशील देशों में अनुप्रयोगों के लिए । रोग के निदान के भीतर कई अनुप्रयोगों में, वास्तविक समय, संवेदनशील, चयनात्मक, और सीरम के रूप में एक जटिल मिश्रण में एक उपमार्की के तेजी से पता लगाने के लिए आवश्यक है15,25. यहां, विशेष रूप से, उनकी मजबूती और संवेदनशीलता के कारण में, अपने मौजूदा तरीकों के लिए बेहतर है । विशेष रूप से संक्रामक एजेंटों का पता लगाने के लिए, bacteriophages हाल ही में उनके मेजबान बैक्टीरिया विशिष्टता३३,३४,३५के कारण के लिए वैकल्पिक के रूप में अपने को मांयता तत्व है । bacteriophages के साथ एंटीबॉडी के प्रतिस्थापन बहुत क्रम में लागत को कम करने और स्थिरता भी आगे३६बढ़ाने का वादा है । इस तरह की प्रणाली का पता लगाने और पर्यावरण में विशिष्ट phages और नैदानिक नमूनों से ठहराव के लिए भी अनुमति देगा । bacteriophages की व्यापकता के कारण, और उनके एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ बैक्टीरिया को transduce करने की क्षमता३७,३८, इस तरह के एक विधि प्रतिरोधी बैक्टीरियल के प्रसार का अध्ययन मूल्यवान हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मारिया Baumgarten (बुद्धि जैव प्रौद्योगिकी मंच, संक्रमण चिकित्सा, Lund विश्वविद्यालय) प्रदर्शन और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रदान करने के लिए स्वीकार किया है । यह काम स्वीडिश अनुसंधान परिषद के प्रपत्र (2017-00100) से अनुदान द्वारा रोगाणुरोधी प्रतिरोध पर यूरोपीय तीसरे संयुक्त प्रोग्रामिंग पहल के भाग के रूप में समर्थित किया गया था (JPIAMR) कॉल "संचरण गतिशीलता." निधियों में अध्ययन अभिकल्प, व्याख्या, लेखन, पांडुलिपि की तैयारी, प्रस्तुत करने का निर्णय, या कार्य प्रकाशित करने का निर्णय लेने में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Cover slips ThermoFisher 102222 protein stamp
HCl Sigma-Aldrich H1758-500ML cleaning
NaOH Sigma-Aldrich 72068-100ML cleaning
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonic BRANSONIC M1800- E cleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648-100ML modification
EtOH Sigma-Aldrich 1009836010 rinsing/cleaning
glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882-100ML cross-linker
acetone Sigma-Aldrich 34850-1L-M cleaning
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741-100ML piranha solution
H2O2 Sigma-Aldrich H1009-500ML piranha solution
tyramine Sigma-Aldrich T90344-5G modification
CompactStat Ivium Technologies CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz potentiostat
Platinum Counter Electrode Kit Equilabrium AFCTR5 potentiostat
Reference Electrode Equilabrium RREF0021 potentiostat
acryloyl chloride EMD Millipore 8.00826.0100 modification
triethylamine EMD Millipore 8.08352.0100 modification
toluene Sigma-Aldrich 244511-100ML modification
N-hydroxymethyl acrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate Sigma-Aldrich 409510-250ML cross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma-Aldrich 410896-50G functional monomer
UV polymerizator Dymax Dymax 5000ECE UV-polymerization
forceps Sigma-Aldrich Z168777-1EA consumable
1-dodecanethiol Sigma-Aldrich 471364-100ML blocking agent
acrylamide Sigma-Aldrich A3553-100G functional monomer
N-hydroxymethylacrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
N-isopropylacrylamide Sigma-Aldrich 415324-50G functional monomer
methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich 146072-500G cross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-25ML catalyst
ammonium persulphate Sigma-Aldrich A3678-25G initiator
Capacitive biosensor CapSenze Equipment
Glycine Merck 1042011000 regeneration buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML regeneration buffer
Trizma base Sigma-Aldrich 93352-1KG running buffer
Na2HPO4 • 2H2O Calbiochem 567547-1KG running buffer
NaH2PO4 • 2H2O Calbiochem 567549-1KG running buffer
DELPHI correlative light and electron microscope Phenom-World equipment
Capacitive gold electrodes CapSenze Biosystems consumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) Sigma-Aldrich 441090-25G photo-initiator
CapSenze Smart Software CapSenze Biosystems software program

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