नमूना रणनीतियों और सुअर का बायोमेडिकल मॉडल से जैव बैंक ऊतक नमूनों की प्रोसेसिंग

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Summary

व्यावहारिक आवेदन और एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए सुअर का पशु मॉडलों के प्रतिनिधि ऊतक नमूनों के उत्पादन के लिए तरीकों के प्रदर्शन के प्रवाह का विश्लेषण के लिए एक बैंक परियोजनाओं में volumetry, व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना सहित, प्रदर्शन कर रहे हैं, और गुणात्मक और मात्रात्मक सुघड़ और आणविक विश्लेषण प्रकारों के लिए ऊतक नमूनों के विभेदक प्रसंस्करण.

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

शोधों में चिकित्सा अनुसंधान में सुअर का मॉडल तेजी से अधिक लोकप्रिय हो गए हैं । व्यक्तिगत पशुओं के उच्च मूल्य, विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर मॉडल, और इन मॉडलों के उपलब्ध पशुओं की अक्सर सीमित संख्या को ध्यान में रखते हुए, पर्याप्त संसाधित ऊतक नमूनों की स्थापना (बैंक) के संग्रह के लिए उपयुक्त एक नमूना के समय बिंदु पर निर्दिष्ट नहीं विश्लेषण सहित अनुवर्ती विश्लेषण विधियों, के व्यापक स्पेक्ट्रम, मॉडल के शोधों के मूल्य का पूरा लाभ लेने के लिए सार्थक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं । सुअर का एनाटॉमी की ख़ासियत के संबंध में, व्यापक दिशा-निर्देश हाल ही में विभिन्न सुअर का अंगों और ऊतकों से प्रतिनिधि, उच्च गुणवत्ता के नमूनों की मानकीकृत पीढ़ी के लिए स्थापित किया गया है. ये दिशानिर्देश परिणामों के reproducibility और विभिंन अध्ययनों और जांचकर्ताओं के बीच उनकी तुलना के लिए आवश्यक पूर्वापेक्षाएं हैं । इस तरह के अंग वजन और मात्रा के रूप में बुनियादी डेटा की रिकॉर्डिंग, नमूना स्थानों के निर्धारण और ऊतक के नमूनों की संख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके अभिविन्यास, आकार, प्रसंस्करण और छंटनी दिशाओं, प्रासंगिक कारक हैं उत्पन्न किया जा करने के लिए आणविक, गुणात्मक, और मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण के लिए सामांयीकरण और नमूना के प्रयोज्य का निर्धारण । यहां, एक उदाहरण के लिए, व्यावहारिक, प्रतिनिधि की पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण तकनीक का कदम दर कदम प्रदर्शन, बहुउद्देश्यीय सुअर का ऊतकों से बैंक नमूना प्रस्तुत की है । यहां वर्णित तरीके अंग/ऊतक की मात्रा और घनत्व का निर्धारण, बिंदु गिनती द्वारा parenchymal अंगों के लिए एक मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना प्रक्रिया के आवेदन, ऊतक संकोचन की हद तक का निर्धारण शामिल नमूनों की ऊतकवैज्ञानिक एंबेडिंग, और मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए बेतरतीब ढंग से उन्मुख नमूनों की पीढ़ी, जैसे आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों द्वारा उत्पंन "Orientator" और "Isector" तरीकों, और ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों ।

Introduction

अनुवाद चिकित्सा में, सूअरों बड़े पशु मॉडल1,2,3,4,5के रूप में उपयोग के लिए तेजी से आम हैं, सुअर का और के बीच कई लाभप्रद समानताएं के कारण मानव शरीर रचना विज्ञान और फिजियोलॉजी, और स्थापित आणविक जैविक रोग की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सिलवाया, आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर मॉडल की पीढ़ी के लिए अनुमति देने के तरीकों की उपलब्धता1,4

हालांकि, कुतर मॉडलों की तुलना में, किसी भी समय प्रयोगों के लिए प्रदान किया जा सकता है कि एक संबंधित सुअर मॉडल के पशुओं की संख्या सीमित है । यह लगभग एक वर्ष की सुअर का पीढ़ी के अंतराल के कारण है, और सुअर का मॉडल और पशुपालन की पीढ़ी के लिए आवश्यक वित्तीय और समय गहन प्रयास । इसलिए, एक सुअर का मॉडल के व्यक्तिगत पशुओं, साथ ही नमूनों कि इन सूअरों से उत्पंन किया जा सकता है, बहुत मूल्यवान हैं, विशेष रूप से अगर आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर का मॉडल और/या दीर्घकालिक प्रयोगात्मक मुद्दों(उदा, की देर जटिलताओं जीर्ण रोग) आयु वर्ग के व्यक्तियों2,6,7में जांच की जाती है ।

किसी भी अध्ययन के पाठ्यक्रम में, अतिरिक्त विश्लेषण जो अध्ययन के प्रारंभिक प्रयोगात्मक डिजाइन में निर्धारित नहीं किया गया था के प्रदर्शन बाद में बाहर बारी के लिए प्रासंगिक हो सकता है, उदा, अलग से उत्पंन होने वाले प्रश्नों का पता पहले से पता चला अप्रत्याशित निष्कर्षों । यदि ऐसे अतिरिक्त प्रयोगों के लिए उपयुक्त नमूने उपलब्ध नहीं हैं, पैस उच्च लागत और समय पर गहन व्यय अतिरिक्त सूअरों और ऊतक के नमूने उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इस तरह की हालात के लिए तैयार रहने के लिए, विभिन्न अंगों, ऊतकों, या जैव-तरल पदार्थ, मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से अनुवर्ती विश्लेषणों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त के नमूने, संरक्षित बैक-अप के बायो बैंक संग्रह की पीढ़ी, एक महत्वपूर्ण माना जाता है एप्रोच2,6,7. एक सुअर का पशु मॉडल से इष्टतम लाभ प्राप्त करना, पर्याप्त जैव बैंक नमूनों की उपलब्धता भी बहुत ही में एक बहु अंग स्तर पर समान नमूना सामग्री पर विभिन्न विश्लेषण विधियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शन करने के लिए अद्वितीय संभावना प्रदान करता है व्यक्तिगत जानवरों, उदा, विभिंन काम कर रहे समूहों के वैज्ञानिकों को नमूनों के वितरण से एक अनुसंधान नेटवर्क2,6,7में आयोजित किया । इसके अतिरिक्त, एक अध्ययन में जरूरत पशुओं की संख्या में कमी करने के लिए भी ' ' आगे दिखने ' ' की सैंपलिंग की रणनीति में एक बैंकर का योगदान है । सुअर का मॉडल के लाभ में हाल ही में एक बहु अंग, multiomics अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है, दीर्घकालिक मधुमेह के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर का मॉडल में अंग पार बात की जांच, ंयूनिख MIDY सुअर से नमूनों का उपयोग कर बैंक 2.

वहां कुछ अनिवार्य आवश्यकताओं को आम तौर पर प्रदर्शन विश्लेषण के परिणामों की विश्वसनीयता और व्याख्याता स्थापित करने के साथ अनुपालन करना चाहिए । नमूने reproducibly उत्पन्न किया जाना चाहिए, और वे प्रतिनिधि होना चाहिए, यानी, पर्याप्त रूप से रुचि रूपात्मक और ऊतक के आणविक सुविधाओं को प्रतिबिंबित/नमूने7से लिए गए थे । अनुप्रवाह विश्लेषण प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त होने के लिए, नमूनों को पर्याप्त मात्रा में लिया जाना चाहिए और विभिन्न विश्लेषणात्मक विधियों के (समय और तापमान की स्थिति सहित) मांगों के अनुसार संसाधित किया जाना चाहिए, जिसमें वर्णनात्मक histopathological िरा, जैसे cryohistology, आयल और प्लास्टिक प्रोटोकॉल, immunohistochemistry, में सीटू संकरण, ultrastructural इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण, और नैदानिक प्रयोगशाला नैदानिक विश्लेषण, साथ ही आणविक डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, और चयापचयों का विश्लेषण ।

इस तरह की संख्या, मात्रा, लंबाई, या मात्रात्मक stereological विश्लेषण द्वारा अलग ऊतक संरचनाओं की सतह क्षेत्रों के रूप में अलग मात्रात्मक रूपात्मक मानकों की एक विस्तृत श्रृंखला के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए, यादृच्छिक धारा विमानों की संबंधित अंगों/ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक नमूने7,8,9,10,11के लिए तैयार किए जाने की जरूरत है । मात्रात्मक रूपात्मक अध्ययनों में, ऊतक, अंग, या अंग डिब्बे की कुल मात्रा का सटीक निर्धारण, नमूनों (यानी, संदर्भ अंतरिक्ष) से लिया गया है महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण है7,9 , 12 संबंधित अंग, ऊतक, या जीव के भीतर रुचि मानकों की पूर्ण मात्रा की गणना करने के लिए । अंततः, ऊतकवैज्ञानिक अनुभागों को तैयार करने के दौरान एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन का प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है और13खाते में लिया जाता है । इसलिए, मात्रात्मक stereological विश्लेषण, विशेष रूप से संग्रहीत नमूनों की (निश्चित ऊतक के नमूने, एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक, ऊतकवैज्ञानिक वर्गों, आदि) पिछले अध्ययनों से कभी भी गंभीर रूप से सीमित हैं या असंभव12, विशेष रूप से यदि संबंधित अंगों की volumetry/ऊतकों का प्रदर्शन नहीं किया गया, यदि कोई पर्याप्त नमूना डिजाइन के प्रतिनिधि नमूने वारंट के लिए लागू किया गया, संख्या और उपलब्ध व्यक्तिगत नमूनों की मात्रा अपर्याप्त हैं, या यदि के प्रसंस्करण नमूने के ब्याज मात्रात्मक रूपात्मक पैरामीटर (s) के अनुमान के साथ असंगत है । कई गुना संभव कारकों को प्रभावित करने के कारण, संग्रह की उपयुक्तता-अलग मात्रात्मक रूपात्मक मापदंडों के विश्लेषण के लिए नमूना सामग्री स्पष्ट जवाब नहीं किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक व्यक्ति के मामले के सावधान आकलन पर निर्भर करता है ।

इस प्रकार, स्थान के रूप में, आकार, संख्या, प्रसंस्करण, छंटनी की दिशा, और नमूनों का उन्मुखीकरण संभवतः बाद के विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित करेगा, इन कारकों काफी महत्व के हैं और किसी भी अध्ययन के प्रायोगिक डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए. इन पहलुओं और सुअर का एनाटॉमी की विशेष सुविधाओं के संबंध में, व्यापक, विस्तृत, सुअर का पशु मॉडल के लिए अनुकूलित बड़े पैमाने पर नमूना दिशा निर्देशों हाल ही में स्थापित किया गया है, मानकीकृत, reproducible के लिए एक मजबूत संदर्भ प्रदान , और निरर्थक, पर्याप्त रूप से संसाधित, 50 से अधिक विभिंन सुअर का अंगों और ऊतकों 6, 7 से उच्च गुणवत्ता के नमूनों की कुशल पीढ़ी ।

methodological विवरण और वीडियो ट्यूटोरियल वर्तमान लेख में दिखाया विस्तृत, उदाहरण के लिए, सुबोध, volumetry के लिए तकनीक की एक किस्म के व्यावहारिक प्रदर्शन के लिए कदम से कदम निर्देश, सुअर का ऊतकों के नमूने और अंगों, और अलग बहाव विश्लेषण विधियों के लिए ऊतक के नमूनों की प्रोसेसिंग । विशेष रुप से प्रदर्शित तकनीकों में अंग के निर्धारण के लिए तरीके/ऊतक की मात्रा और आर्किमिडीज और Cavalieri9के सिद्धांतों के आधार पर घनत्व, जिनमें से संबंधित ऊतक के तीन आयामी संकोचन के आयामों का निर्धारण शामिल है ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के लिए प्रसंस्करण के दौरान विभिन्न embedding मीडिया में14 embedding, व्यवहार्य मात्रा के आवेदन-भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना दृष्टिकोण, अलग अनुवर्ती के लिए नमूना ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण विश्लेषण7,8,9,15, और संभावित मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए उचित उंमुख और संसाधित नमूनों की पीढ़ी7,8, 9,10,11. सुअर का में उनके आवेदन के लिए अगले बैंक परियोजनाओं, प्रदर्शन तरीके आम तौर पर सभी अध्ययन मात्रात्मक histo-अंगों के रूपात्मक गुणों/ऊतकों की जांच के लिए उपयुक्त हैं । इसके अलावा, व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना डिजाइन आणविक विश्लेषण तरीकों का उपयोग कर के बहुतायत परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रयोग में प्रतिनिधि नमूने की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं, जैसे, RNAs, प्रोटीन, या चयापचयों में विभिंन अंगों और ऊतकों ।

अगले पैराग्राफ इन पद्धतियों के लिए एक संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं, जबकि उनके व्यावहारिक प्रदर्शन प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है ।

अंग/ऊतक की मात्रा का निर्धारण
अंग वजन और मात्रा का निर्धारण कई प्रयोगात्मक सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है, के रूप में इन कारकों परिवर्तन का संकेत हो सकता है, संभावित रूप से प्रयोग के लिए ब्याज की जांच कारकों से संबंधित । एक अंग/ऊतक की कुल मात्रा भी सामांयतः पूर्ण मात्रात्मक मापदंडों की गणना करने के लिए आवश्यक है, (उदा., कुल सेल संख्या), stereologically से अनुमानित संख्यात्मक मात्रा घनत्व (यानी, प्रति वॉल्यूम कोशिकाओं की संख्या इकाई ऊतक के)7,12। इसके अलावा तकनीक से जटिल तकनीकी उपकरण का उपयोग कर, कंप्यूटर टोमोग्राफी के रूप में, वहां मूलतः तीन व्यावहारिक सामांयतः एक अंग या ऊतक की पूर्ण मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । किसी अंग की मात्रा को "प्रत्यक्ष volumetric माप" द्वारा आर्किमिडीज के सिद्धांत के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है, अर्थात, पूरी तरह जलमग्न होने पर संरचना द्वारा पानी या खारा विस्थापित की मात्रा को मापने । हालांकि, तुलना बड़े सुअर का अंगों के लिए, इन दृष्टिकोण अव्यावहारिक और अस्पष्टता से ग्रस्त हैं, क्योंकि वे बहुत बड़ी volumetric की आवश्यकता/ अधिक आसानी से, एक अंग की मात्रा/ऊतक अपने वजन और घनत्व7,12,16, जो कुशलतापूर्वक "डुबकी विधि"7का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है से गणना की जा सकती है12 ,16 (प्रोटोकॉल चरण 1.1.) । अंग/ऊतक की मात्रा भी Cavalieri के "सिद्धांत" (1598-1647) के आधार पर volumetry दृष्टिकोण का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । सरल शब्दों में, Cavalieri सिद्धांत राज्यों, कि अगर दो वस्तुओं एक जमीन विमान के समानांतर विमानों में खोदी गई हैं, और वर्गों की प्रोफाइल जमीन विमान से इसी दूरी पर दो वस्तुओं के माध्यम से कटौती एक ही क्षेत्रों है, दो वस्तुओं एक ही मात्रा है । इस प्रकार, मनमाने ढंग से आकार की वस्तुओं की मात्रा समानांतर, समान रूप से दूर अनुभाग विमानों और खंड विमानों के बीच की दूरी में उनके अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों के उत्पाद के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है । यह निम्नलिखित सादृश्य के साथ सुबोध है: दो समान सिक्के की एक ही संख्या से मिलकर ढेर पर विचार पक्ष द्वारा पक्ष रखा जाता है, एक सिक्के अर्दली एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी के साथ ढेर सिक्के के ढेर के एक बेलनाकार आकार उपज, और अंय ऑफ सेंटर तैनात सिक्कों के साथ सिक्कों के ढेर (आंकड़ा 3ए) । हालांकि दोनों सिक्के के ढेर की आकृतियाँ अलग हैं, उनके वॉल्यूम एक ही हैं, दोनों स्टैक के अनुरूप स्तरों पर सिक्के के क्षेत्रों (यानी, समानांतर वर्गों की प्रोफाइल के क्षेत्रों से बराबर दूरी में दोनों सिक्का ढेर के माध्यम से कटौती जमीन) समान हैं । सुअर का अंगों और Cavalieri सिद्धांत का उपयोग कर ऊतकों की मात्रा का आकलन 7, 12, 15 चरण 1.2 में वर्णित है ।

ऊतकवैज्ञानिक embedding से संबंधित ऊतक संकोचन की सीमा का निर्धारण
ऊतकवैज्ञानिक ऊतक वर्गों में मापा कई मात्रात्मक रूपात्मक मापदंडों के विश्लेषण में, प्रोटोकॉल के लिए ऊतक प्रसंस्करण के दौरान होने वाली embedding संबंधित ऊतक संकोचन के प्रभाव को निर्धारित किया है और खाते में लिया जाना है । एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक चर सकता है, और ऊतक, इसके प्रसंस्करण, और embedding मध्यम8,13,17,18,19पर निर्भर करता है । आम तौर पर, एक ऊतक नमूने की मात्रा के embedding से संबंधित परिवर्तन (यानी, ज्यादातर संकोचन) अंतरिक्ष के सभी तीन आयामों में होते हैं, और, इसलिए, मात्रात्मक stereological विश्लेषण द्वारा अनुमानित सभी आयामी मापदंडों को प्रभावित करताहै8 . मूलतः, embedding से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक, रैखिक ऊतक संकोचन कारक के रूप में व्यक्त (एफएस), के रूप में कदम 1.3 में दिखाया अनुमान लगाया जा सकता है. और के सुधार के लिए इस्तेमाल किया (सिकुड़ना-संवेदनशील) मात्रात्मक रूपात्मक पैरामीटर14.

अंगों/ऊतकों की मात्रा-भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना
सुअर का अंग के एक बैंक के संग्रह की स्थापना के लिए/ऊतक के नमूने, इस तरह के चरण 2 में वर्णित के रूप में वजन व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना दृष्टिकोण साबित किया है व्यावहारिक, समय की बचत, और प्रतिनिधि की पीढ़ी के लिए कुशल तकनीक, बहुउद्देश्यीय ऊतक के नमूने7,8,9,15.

आइसोट्रोपिक वर्दी की पीढ़ी यादृच्छिक वर्गों और ऊर्ध्वाधर वर्दी मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए यादृच्छिक वर्गों
एक पर्याप्त रूप से तैयार नमूना के बिना निर्धारित नहीं किया जा सकता है कि मानकों की एक अधिकतम के आकलन के लिए विभिन्न मात्रात्मक stereological विश्लेषण विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त होने की जरूरत है. लगभग सभी मात्रात्मक stereological मापदंडों "आइसोट्रोपिक (स्वतंत्र) वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों"8,9का उपयोग कर, निर्धारित किया जा सकता है । IUR वर्गों में, ऊतक नमूने की धारा विमान के तीन आयामी अभिविन्यास यादृच्छिक है. इस खंड विमान की स्थिति के सापेक्ष ऊतक नमूने की स्थिति के यादृच्छिकीकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में लागू "Isector" विधि11 (प्रोटोकॉल कदम 3.1), या खंड विमान के उंमुखीकरण के सापेक्ष यादृच्छिकीकरण द्वारा ऊतक नमूना, के रूप में "Orientator" विधि10 (प्रोटोकॉल चरण 3.2) । ऊतक के नमूनों में, जैसे त्वचा या म्यूकोसा एक स्वाभाविक रूप से मौजूद है, या परिभाषित और ठीक से पहचाने जाने योग्य ऊर्ध्वाधर धुरी प्रदर्शित नमूना, "ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की तैयारी" (प्रोटोकॉल कदम 3.3.) कड़ाई से विमान के भीतर खोदी उनकी अनुलंब अक्ष लाभप्रद8,20है । IUR की सैद्धांतिक नींव की एक पूरी बहस के लिए/VUR नमूना और संभावित बहाव मात्रात्मक stereological विश्लेषण की एक व्यापक चर्चा, रुचि पाठक जीवन में मात्रात्मक stereology की पाठ्यपुस्तकों के लिए भेजा जाता है विज्ञान8,9.

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Protocol

सभी तरीके वर्णित मृत पशुओं से व्युत्पंन ऊतक नमूनों का उपयोग करें और पूरी तरह से पशु कल्याण के जर्मन कानूनी नियमों का पालन ।

1. Volumetry

  1. ऊतक/अंग घनत्व के निर्धारण के लिए डुबकी तकनीक (चित्रा 1 और चित्रा 2) 7 , 12 , 16
    1. सामग्री तैयार: स्केलपेल ब्लेड, कागज तौलिए, ठीक संदंश, मानक प्रयोगशाला तराजू, कांच या प्लास्टिक यूरिन, 0.9% खारा, और स्वयं का निर्माण नमूना धारकों (चित्रा 2a) ।
    2. उत्पाद का एक टुकड़ा ऊतक (अधिकतम आकार: 2 x 2 x 2 cm3) से अंग/विशेष रूप से ब्याज की अंग डिब्बे से । छोटे अंगों, जैसे पिट्यूटरी, या चीटीदार ग्रंथि, टोटो मेंमापा जाता है ।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि नमूना का आकार विशेष रूप से चोंच के भीतरी व्यास (step 1.1.5 et seq.) से छोटा है, और इसके भरने के स्तर के लिए कदम 1.1.7 में चोंच की भीतरी दीवारों से संपर्क किए बिना नमूने की पूरी डुबकी की अनुमति देने के लिए ।
    3. ध्यान से एक कागज तौलिया के साथ नमूना झाड़ू अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए/
    4. नमूना एक सटीक पैमाने पर तौलना और नमूना (एमएस) का वजन रिकॉर्ड. निकटतम मिलीग्राम (चित्र 1a) के लिए छोटे ऊतक के नमूनों का वजन निर्धारित करें ।
    5. स्केल पर कमरे-तापमान 0.9% खारा से भरा एक चोंच रखें । यूरिन को पूरी तरह से न भरें, बाद में बिना किसी डुबकी के ऊतक के नमूने की अनुमति दें ।
      सावधानी: एक चोंच आकार और ऊतक के नमूने के वजन के लिए उपयुक्त का उपयोग करें (ओं) मापा जा करने के लिए और पैमाने की प्रभावी माप रेंज. बड़े नमूनों के लिए अप करने के लिए 2 एक्स 2 एक्स 2 सेमी3, एक चोंच आकार 50 – 100 मिलीलीटर से एक पैमाने मापने के साथ संयोजन में उपयुक्त है लगभग 100 मिलीग्राम 500 जी, छोटे नमूनों के लिए जबकि, का उपयोग यूरिन 5 – 10 मिलीलीटर मात्रा के साथ सटीक तराजू के साथ संयोजन में लगभग 0.1 मिलीग्राम और 20 जी के बीच पर्वतमाला माप
    6. नमूना धारक को जलमग्न (यानी, पतले तार या कुछ समान, चित्रा 2a) के लिए खारा में एक चिह्नित स्थिति ( चित्रा 1b, चित्रा 2 बी, और चित्रा 2c) में तीर के पर्याप्त रूप से कठोर पाश । उसके बाद, (धड़ा) स्केल का प्रदर्शन शूंय करने के लिए रीसेट करें ।
    7. नमूना धारक को ध्यान से ऊतक के नमूने संलग्न करें और पूरी तरह से नमूना होल्डर पर चिह्नित स्थिति तक पहुंच जाता है जब तक खारा में नमूना विलय ( चित्रा 1b, चित्रा बी2, और चित्रा 2c) में तीर ।
      चेतावनी: जलमग्न नमूना और नमूना धारक के भीतरी दीवारों या चोंच के नीचे या खारा की सतह के साथ संपर्क नहीं होना चाहिए था ।
    8. जबकि नमूना धारक और उस स्थिति में जलमग्न नमूना पकड़े, पैमाने पर प्रदर्शित वजन रिकॉर्ड (एमएल), ऊतक नमूने (चित्रा 1C, चित्रा बीएम द्वारा विस्थापित खारा के वजन की चर्चा करते हुए, और चित्र 2c) ।
    9. नमूना की मात्रा की गणना करें (VS) से mL, और कमरे के तापमान पर खारा का घनत्व (20 ° c) (दर्षायाखारा = १.००४८ g/cm³) के रूप में VS = mL/ दर्षायाखारा [g/g/cm³] (चित्र 1) ।
    10. (जैसेनमूना (एमएस) के वजन से ऊतक नमूना (दर्षायानमूना)) और इसकी मात्रा (Vs) के घनत्व की गणना: दर्षायानमूना = ms VS[g/cm³] (चित्र 1) ।
    11. पूर्ण मेंमापा अंगों के लिए, माप तीन बार दोहराने और एकल माप मूल्यों से औसत अंग घनत्व की गणना. बड़े अंगों/ऊतकों के लिए, एक ही अंग के विभिन्न नमूनों के साथ दोहराया माप प्रदर्शन/ऊतक/अंग डिब्बे, और एक माप से औसत घनत्व की गणना, तदनुसार.
    12. अपने वजन और घनत्व (चित्रा 1) से अंग/ऊतक/अंग डिब्बे की कुल मात्रा की गणना ।
  2. Cavalieri के आवेदन-सुअर का अंग संस्करणों के निर्धारण के लिए विधि 7
    1. सामग्री तैयार: शासक, कैलिपर, चाकू, कैंची, संदंश, निविड़ अंधकार कलम, प्लास्टिक transparencies, स्कैनर, फोटो कैमरा, और पार ग्रिड प्लास्टिक transparencies पर मुद्रित ।
    2. एक सादे सतह पर पूरे अंग/ऊतक प्लेस (काटने के आधार) और अपने अनुदैर्ध्य अक्ष (चित्र बी, आंकड़ा 5) के साथ अंग की लंबाई (l) को मापने.
    3. अनुदैर्ध्य अंग अक्ष (चित्रा 3सी, चित्रा 5B) को equidistant समानांतर स्लाइस ओर्थोगोनल में पूरा अंग/ दो वर्गों के बीच दूरी d चुनें (यानी, सेक्शनिंग अंतराल/अनुभाग मोटाई, आम तौर पर लगभग 1 सेमी) ऊतक के पर्याप्त संख्या/अंग स्लैब प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से छोटे । यादृच्छिक रूप से 0 के बीच की दूरी के भीतर पहले खंड और अंग के मार्जिन से अनुभागीय अंतराल की स्थिति । टुकड़ा करने की क्रिया करते हुए, नेत्रहीन स्थिति और प्रत्येक खंड विमान के उन्मुखीकरण ंयायाधीश, लगभग समान मोटाई के समानांतर अंग/
      नोट: ऊतक की आवश्यक संख्या/अंग स्लैब आकार पर निर्भर करता है और जांच अंग के आकार/ यदि छोटे अंगों या नमूनों ≤ 5 मिमी की पतली स्लैब में खोदी जा करने के लिए है, तो (चरण 1.3.3 देखें.) से पहले आगर में नमूने एंबेड और एक तकनीकी उपकरण का उपयोग करें आगर-एंबेडेड नमूना की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए । सबसे सुअर का अंगों और ऊतकों, टुकड़ा करने की क्रिया उपकरणों के लिए के रूप में अच्छी तरह से उदाहरण के लिए Empirically की सिफारिश की धारा अंतराल, "ऊतक नमूना गाइड सुअर का बायोमेडिकल मॉडल के लिए" के पूरक सामग्री में संकेत कर रहेहैं7.
    4. काटने के आधार पर नीचे का सामना कर रहे एक ही सतह पर सभी अंग/ऊतक स्लैब प्लेस (यानी, लगातार या तो एक अंग स्लैब, चित्रा 3 डी, चित्रा 5C) और स्लैब (एन) की गिनती के दाईं या बाईं धारा के विमान पर ।
    5. ऊतक स्लैब के अनुभाग प्रोफाइल निंन तरीकों में से एक से प्राप्त करें:
      1. ध्यान से ऊतक स्लैब उचित लेबल प्लास्टिक transparencies पर जगह है, जबकि उनके ऊपरी और निचले खंड सतहों के उन्मुखीकरण को बनाए रखने. एक निविड़ अंधकार पेन (चित्रा 3E1-2) का उपयोग कर प्लास्टिक transparencies पर ऊतक स्लैब की रूपरेखा का पता लगाएँ.
      2. ऊतक स्लैब के फोटो छवियों को ले लो, अनुभाग सतहों (चित्रा 3F) के ऊपर खड़ी कैमरा पकड़. अंशांकन के लिए, ऊतक स्लैब के बगल में एक आकार शासक रखें ।
      3. एक flatbed स्कैनर पर ऊतक स्लैब स्कैन जबकि उनके ऊपरी और निचले खंड सतहों के उंमुखीकरण को बनाए रखने (चित्रा 3 जी). अंशांकन के लिए, ऊतक स्लैब के बगल में एक आकार शासक रखें ।
    6. निम्न में से किसी एक दृष्टिकोण से सभी ऊतक स्लैबों की धारा प्रोफाइल (traced, फोटो खिंचवाने, या स्कैन) के क्षेत्रों को मापने:
      1. ओवरले या मिलाना एक उचित आकार के साथ पता लगाया अंग स्लैब प्रोफाइल, समान रूप से अंतरिक्ष में एक प्लास्टिक की पारदर्शिता पर छपी पार की जांच की ग्रिड और गणना सभी प्रोफ़ाइल क्षेत्र से टकराने पार (चित्रा 3E3-4; तुलना करें चित्र 5d) । एक पार करने के लिए इसी क्षेत्र द्वारा प्रोफ़ाइल क्षेत्र मार पार की संख्या गुणा करके प्रत्येक अंग स्लैब के अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्र की गणना ।
        नोट: पर्याप्त सटीक मात्रा का अनुमान प्राप्त करने के लिए, सन्निकट क्रॉसिंगों के बीच पर्याप्त छोटी दूरी के साथ एक क्रॉस ग्रिड का चयन करें, ताकि एक औसत से कम 100 पार के अध्ययन के प्रत्येक मामले में एक अंग के स्लैब की धारा सतहों मारा जाएगा . सबसे सुअर का अंगों और ऊतकों के लिए Empirically सिफारिश की क्रॉस ग्रिड आकार "सुअर का बायोमेडिकल मॉडल के लिए ऊतक नमूना गाइड" के पूरक सामग्री में संकेत कर रहेहैं7.
      2. इस तरह के एक वाणिज्यिक छवि विश्लेषण प्रणाली21के रूप में उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या फ्रीवेयर morphometry नरम और हार्डवेयर अनुप्रयोगों (चित्रा 3H), का उपयोग कर तस्वीरों की डिजिटल छवियों में ऊतक स्लैब के क्षेत्रों को मापने, या ImageJ२२.
        चेतावनी: ध्यान दें कि एक ऊतक स्लैब (या तो पहले या पिछले) अपनी प्राकृतिक सतह पर आराम कर स्कैनर पर रखा गया है, क्रमशः, अपनी प्राकृतिक सतह के साथ कैमरे के चेहरे । इसलिए, स्कैन की गई छवि, इस स्लैब की तस्वीर छवि, एक अनुभाग सतह नहीं दिखा देंगे । इसलिए, इस ऊतक स्लैब (चित्रा 3I) की स्कैन छवि/फोटो छवि में कोई अनुभाग क्षेत्र प्रोफ़ाइल मापा जाता है । इसके अलावा स्कैन छवियों और अंग/ऊतक स्लैब की तस्वीरों में वर्तमान पर प्रक्षेपण नोट, यानी, केवल वास्तविक अनुभाग प्रोफाइल के क्षेत्रों को मापने, लेकिन स्लैब अनुभाग सतह के पीछे झूठ बोल छवि में ऊतक के नहीं (चित्रा 12 जी एच).
    7. मामले प्रति सभी ऊतक स्लैब के सभी संबंधित अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों की राशि के उत्पाद के रूप में अनुमानित अंग मात्रा की गणना (यानी, लगातार या तो सही या बाईं ओर, क्रमशः, प्रत्येक अंग स्लैब के ऊपरी या निचले खंड सतह और स्लैब की मतलब मोटाई (यानी, ऊर्ध्वाधर अंग धुरी (एल) और स्लैब की संख्या की मापा लंबाई के गुणांक)15.
  3. प्रोटोकॉल के लिए ऊतक के नमूनों के प्रसंस्करण के दौरान तीन आयामी embedding-संबंधित ऊतक संकोचन की सीमा का निर्धारण
    1. सामग्री तैयार: Microtome ब्लेड, संदंश, आगर, धातु कास्टिंग मोल्ड, डिजिटल स्कैनर, और आकार शासक (उदा., ग्राफ़ पेपर) ।
    2. एक निश्चित ऊतक नमूने से एक ताजा, विमान अनुभाग सतह में कटौती ।
      नोट: यदि आसानी से विकृत (नरम) ऊतकों (वसा ऊतक, चिपचिपा ऊतकों) के नमूनों का उपयोग कर, (चित्र 4a) अनुभाग से पहले आगर में तय ऊतक नमूने एंबेड ।
    3. आगार में नमूना एंबेड करने के लिए:
      1. एक गिलास चोंच में पानी की एक उपयुक्त मात्रा (लगभग 0.5-1 ग्राम आगर/10 मिलीलीटर पानी) के साथ माइक्रोबायोलॉजी संस्कृति माध्यम के लिए इस्तेमाल के रूप में मानक आगार पाउडर मिश्रण । मिश्रण हिलाओ और यह एक माइक्रोवेव ओवन में 700 डब्ल्यू में गर्मी 3 के लिए उबलते तक-5 एस मिश्रण हलचल और एक फोड़ा लाने के लिए फिर से 3 के लिए-5 एस ।
      2. वैकल्पिक रूप से, ऊतक नमूने को आगर के विपरीत बढ़ाने के लिए, तरल आगर डाई, उदा., काली स्याही के साथ (गर्म तरल आगार के 10 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीलीटर स्याही जोड़ें और जोरदार हलचल) ।
      3. एक कास्टिंग मोल्ड में गर्म आगार डालो (जैसे, एक धातु तेल embedding, चित्रा 10A-डी) के लिए इस्तेमाल किया मोल्ड और गर्म आगर में तय ऊतक नमूने जलमग्न । solidification जब तक शांत आगार चलो, मोल्ड को हटा दें, और एक microtome या उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर एंबेडेड ऊतक के साथ आगर ब्लॉक में कटौती ।
        चेतावनी: गर्म तरल आगार हैंडलिंग करते समय, सुरक्षात्मक चश्मे और दस्ताने पहनते हैं । प्रक्रिया ऊतक एक निकास हुड के तहत formaldehyde समाधान में तय की नमूनों और सुरक्षात्मक चश्मे और प्रयोगशाला दस्ताने पहनते हैं ।
    4. एक flatbed स्कैनर पर नीचे का सामना करना पड़ अपनी धारा सतह के साथ नमूना प्लेस, एक आकार शासक के साथ साथ और खंड सतह (चित्रा 4a, बी) स्कैन ।
    5. (चित्रा 4B) चरण 1.2.6 में वर्णित तकनीकों में से एक का उपयोग कर, डिजिटल स्कैन में निश्चित ऊतक नमूना (एकएफ) की धारा सतह के क्षेत्र का निर्धारण.
    6. ऐसे epoxy के रूप में प्लास्टिक embedding मध्यम, में नमूना एंबेड (उदा, ऐपण) या glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/एमएमए)23, निंनलिखित मानक प्रोटोकॉल23,24,25 ( चित्र 4c) । सुनिश्चित करें कि पिछले चरण (1.3.4) में स्कैन किए गए निश्चित नमूने की धारा सतह प्लास्टिक-एंबेडेड नमूने में बनाए रखा है ।
      नोट: नमूना के प्रसंस्करण के दौरान नमूने की धारा सतह के उन्मुखीकरण को बनाए रखने के लिए, लगातार embedding कैसेट या कास्टिंग मोल्ड में नीचे की दिशा में अपने इच्छित अनुभाग सतह के साथ नमूना जगह है, या लक्षित अनुभाग चिह्नित सतह (या नमूने के विपरीत पक्ष) स्याही के साथ ।
    7. प्लास्टिक ब्लॉक से एक ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग फिक्स्ड ऊतक नमूना (कदम 1.3.2) एक microtome (चित्रा 4d) का उपयोग कर के मूल धारा की सतह के लिए इसी कट, एक ग्लास स्लाइड (चित्रा 4d) पर खंड माउंट और यह दाग नियमित रूप से ( उदा, Hematoxylin आणि eosin दाग, एच एंड ई)२४,२५.
      चेतावनी: एक ही विमान में तय ऊतक नमूने के मूल खंड सतह के रूप में लगभग एक ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग प्राप्त करने के लिए, ध्यान से खंड से पहले microtome के माउंट में प्लास्टिक ब्लॉक की स्थिति को समायोजित करें ।
    8. स्लाइड को किसी आकार मापनी के साथ flatbed स्कैनर पर नीचे की ओर फ़ेसिंग अनुभाग के साथ रखें और अनुभाग (आरेख 4E) को स्कैन करें ।
    9. डिजिटल स्कैन में प्लास्टिक-एंबेडेड ऊतक नमूने (एक) के खंड के क्षेत्र का निर्धारण, चरण 1.2.6 (चित्रा 4F) में वर्णित तकनीकों में से एक का उपयोग कर ।
    10. प्लास्टिक embedding माध्यम में एंबेड करने से पहले और बाद में ऊतक नमूनों की इसी धारा प्रोफाइल के मापा क्षेत्रों से (संबंधित ऊतक और embedding माध्यम के लिए) औसत embedding-संबंधित ऊतक संकोचन की गणना । रेखीय सिकुड़न कारक fs प्लास्टिक embedding मध्यम (Ae) और क्षेत्रों में एंबेडिंग के बाद n ऊतक नमूनों की अनुभाग प्रोफ़ाइल के क्षेत्रों के गुणांक के वर्ग रूट के रूप में परिकलित की जाती है । प्लास्टिक embedding मध्यम (एक) (फिगर 4g)14में एंबेडिंग से पहले ही ऊतक नमूनों की इसी धारा प्रोफाइल ।

2. मात्रा-भारित व्यवस्थित द्वारा यादृच्छिक नमूना बिंदु गिनती और विभिन्न बहाव विश्लेषण के लिए ऊतक उपनमूना के प्रसंस्करण-प्रकार7

  1. सामग्री तैयार: शासक, कैलिपर, चाकू, कैंची, संदंश, निविड़ अंधकार कलम, बिंदु/पार ग्रिड प्लास्टिक transparencies पर मुद्रित, और यादृच्छिक संख्या टेबल ।
    नोट: क्रॉस ग्रिड (5-60 मिमी) के लिए कॉपी टेम्पलेट्स "सुअर का बायोमेडिकल मॉडल" 7 के लिए ऊतक नमूना गाइड के पूरक सामग्री में प्रदान की जाती हैं ।
  2. एक सादे सतह पर अंग/ऊतक प्लेस (काटने के आधार) और माप की लंबाई (l) इसके अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ अंग (चित्रा 5 ए, चित्रा 6A).
  3. equidistant समानांतर स्लाइस ओर्थोगोनल अपने अनुदैर्ध्य अक्ष (चित्रा 5B) में पूरा अंग/ दो वर्गों के बीच एक दूरी d चुनें (यानी, अनुभाग के अंतराल/अनुभाग मोटाई, आमतौर पर लगभग 1 सेमी) ऊतक की पर्याप्त संख्या/ यादृच्छिक रूप से 0 के बीच की दूरी के भीतर पहले खंड और अंग के मार्जिन से अनुभागीय अंतराल की स्थिति । टुकड़ा करने की क्रिया करते हुए, नेत्रहीन की स्थिति और प्रत्येक खंड विमान के उन्मुखीकरण लगभग वर्दी मोटाई के समानांतर अंग/ऊतक स्लैब प्राप्त करने के लिए ंयायाधीश ।
    नोट: ऊतक/अंग स्लैब की आवश्यक संख्या की जांच की अंग के आकार पर निर्भर करता है/ऊतक और नमूना ऊतक स्थानों की संख्या । यदि छोटे अंगों या नमूनों ≤ 5 मिमी की पतली स्लैब में खोदी जा करने के लिए है, तो (चरण 1.3.3 देखें.) और आगर-एम्बेडेड नमूना की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तकनीकी उपकरणों का उपयोग करने से पहले आगर में नमूनों एंबेड । सबसे सुअर का अंगों और ऊतकों, साथ ही टुकड़ा करने की क्रिया उपकरणों के लिए उदाहरण के लिए Empirically की सिफारिश की धारा के अंतराल "सुअर का बायोमेडिकल मॉडल के लिए ऊतक नमूना गाइड"7 के पूरक सामग्री में संकेत कर रहे हैं ।
  4. काटने के आधार (फिगर घमण्ड) पर नीचे की ओर एक ही सतह पर सभी अंग/
  5. टिशू स्लैब को एक उचित आकार के क्रॉस ग्रिड के साथ ओवरले करें सबसे बाहरी को टिशू (फिगर5C-डी, फिगरघमण्ड) के बाहर एक यादृच्छिक बिंदु पर ग्रिड के ऊपरी पार छोड़ दिया द्वारा एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर मुद्रित ।
    नोट: आसंन पार के बीच एक पर्याप्त छोटी दूरी के साथ एक क्रॉस ग्रिड का चयन करें, ताकि अध्ययन के प्रत्येक मामले में, के रूप में कई पार से दो बार के रूप में ऊतक डिब्बे के खंड सतह (ओं) मारा जाएगा नमूने है कि नमूनों की संख्या के रूप में उस टिशू कम्पार्टमेंट से लिया जाए । सबसे सुअर का अंगों और ऊतकों के लिए Empirically सिफारिश की क्रॉस ग्रिड आकार "सुअर का बायोमेडिकल मॉडल के लिए ऊतक नमूना गाइड" के पूरक सामग्री में संकेत कर रहेहैं7.
  6. मार्क और गिनती के सभी ऊतक मार पार (क्रमशः, ऊतक उप डिब्बे का नमूना लिया जा करने के लिए). लगातार, सभी ऊतक स्लैब में नमूना किया जा करने के लिए ऊतक डिब्बे से टकराने की गिनती और पार के एक समान मोड लागू होते हैं, उदा., पंक्ति द्वारा प्रत्येक पंक्ति में संबंधित काटता है की लगातार क्रमांकन के द्वारा, बाएं से दाएं और ऊपर से नीचे, या, जैसे, दक्षिणावर्त दिशा में एक के बाद एक ऊतक स्लैब में काटता है, पार से बारह बजे की स्थिति के लिए निकटतम के साथ शुरू, के रूप में exemplarily चित्रा 5Eमें प्रदर्शन किया ।
  7. ऊतक डिब्बे को मारने के पार की संख्या को विभाजित (एन) नमूनों की संख्या से व्यवस्थित नमूना अंतराल (मैं) प्राप्त करने के लिए उत्पन्न किया जा करने के लिए.
  8. 1 और iके बीच के अंतराल में एक यादृच्छिक संख्या x चुनकर पहली नमूना स्थिति निर्धारित करें । इसके लिए, एक यादृच्छिक संख्या तालिका का उपयोग करें । मार्क पहले नमूना स्थिति (x) और हर अगले x + मैं, x + 2मैं, x + 3मैं, आदि, ऊतक/ऊतक डिब्बे मार पार प्लास्टिक पारदर्शिता पर नमूना हो एक निविड़ अंधकार पेन (चित्रा 5F) का उपयोग करना ।
    नोट: यादृच्छिक संख्या टेबल आसानी से और जल्दी से एक ऑनलाइन यादृच्छिक संख्या जनरेटर का उपयोग कर उत्पंन किया जा सकता है ।
  9. चिह्नित ऊतक के लिए इसी स्थानों टैग थोड़ा प्लास्टिक पारदर्शिता को बढ़ाने और ऊतक स्लैब की सतह पर साफ, खाली कंफ़ेद्दी कागज का एक छोटा सा टुकड़ा रखने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके (चित्र संख्या, चित्रा 6E ).
  10. नमूना स्थानों से ऊतक के उत्पाद का नमूना (चित्रा 5H, चित्रा 6F, चित्रा 7A) और आगे के विश्लेषण के विभिन्न प्रकारों के लिए उन्हें प्रतिभाग (चित्रा 6G, चित्रा 7A-बी), के रूप में निर्दिष्ट में तालिका 1
  11. नमूना लेने के बाद, गर्म पानी और साबुन के साथ प्लास्टिक transparencies साफ, सूखी, और उंहें पुनः प्रयोग ।

3. आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों और मात्रात्मक Stereological विश्लेषण के लिए ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की पीढ़ी

  1. "Isector" तकनीक
    1. सामग्री तैयार: उस्तरा या microtome ब्लेड, आगर, गोलाकार कास्टिंग मोल्ड (उदा., pralines के लिए कास्टिंग मोल्ड, जो confectioner आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है), foldback clamps, और संदंश ।
    2. एक पर्याप्त रूप से आकार का टुकड़ा (1 x 1 x 1 cm3) के फिक्स्ड, व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना ऊतक एक गोलाकार कास्टिंग मोल्ड में, foldback clamps द्वारा एक साथ पकड़, और गर्म तरल आगार (चित्रा 8A-E) के साथ मोल्ड भरें ।
    3. आगर के solidification के बाद ढलाई मोल्ड से आगर क्षेत्रः (figure 8F) निकालें ।
    4. एक यादृच्छिक स्थिति में तालिका, बंद, और अनुभाग में एंबेडेड ऊतक नमूने के साथ आगर क्षेत्र रोल ।
      नोट: परिणामी अनुभाग विमान एक IUR खंड (चित्रा 8F-G) है ।
    5. इस तरह GMA/एमएमए के रूप में प्लास्टिक राल में ऊतक के नमूने एंबेड करने के लिए आगे बढ़ें, IUR अनुभाग विमान के उंमुखीकरण को बनाए रखने (1.3.5 देखें) ।
  2. "Orientator" तकनीक
    1. सामग्री तैयार: उस्तरा या microtome ब्लेड, आगर, संदंश, यादृच्छिक संख्या तालिका (ओं), equiangular के प्रिंट, और कोज्या-भारित हलकों ।
      नोट: हलकों की प्रतिलिपि टेंपलेट्स पिछले प्रकाशन8,26में प्रदान की जाती हैं ।
    2. एक equiangular सर्कल के एक प्रिंट पर निर्धारित ऊतक (या के आगर-एंबेडेड निश्चित ऊतक) के नमूने को एक किनारे समानांतर 0 – 180 ° दिशा (चित्रा 9A, चित्रा 10E) के साथ रखें ।
    3. रैंडम संख्या तालिका का उपयोग करके एक यादृच्छिक कोण निर्धारित करें । equiangular सर्कल, जो नमूना पर टिकी हुई है के पैमाने पर इसी निशान का पता लगाएं । इन चिह्नों का उपयोग करना, नमूना के माध्यम से एक अनुभाग में कटौती (या एंबेडेड ऊतक नमूने आसपास के आगर के माध्यम से), अनुभाग विमान के साथ यादृच्छिक कोण की दिशा के समानांतर उंमुख जा रहा है equiangular सर्कल के पैमाने पर संकेत दिया, और ऊर्ध्वाधर नमूना (चित्रा 9B-सी, चित्रा 10F) की सतह आराम.
    4. खंड के साथ एक कोज्या पर नकारात्मक पक्ष का सामना करना पड़ पिछले कदम में उत्पन्न सतह के साथ ऊतक ब्लॉक प्लेस-1-1 दिशा के समानांतर रखा शेष सतह के किनारे के साथ भारित सर्कल (चित्रा 9D, चित्रा 10H).
    5. दोहराएँ चरण 3.2.3 और यादृच्छिक संख्या तालिका का उपयोग कर निर्धारित एक यादृच्छिक कोण पर नमूना के माध्यम से एक नया अनुभाग में कटौती (चित्रा 9E-एफ, चित्रा 10I-जम्मू).
      नोट: परिणामी अनुभाग विमान एक IUR अनुभाग है ।
    6. यदि उपयुक्त हो, तो एंबेडिंग संबंधित ऊतक सिकुड़ना (चित्रा 9G-जे) के निर्धारण के लिए निश्चित ऊतक नमूने के IUR अनुभाग प्रोफ़ाइल के क्षेत्र का निर्धारण के रूप में चरण 1.3 में वर्णित है, और प्लास्टिक में ऊतक के नमूने एंबेड करने के लिए आगे बढ़ना ऐसे GMA के रूप में राल/
  3. ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की पीढ़ी
    1. सामग्री तैयार: उस्तरा या microtome ब्लेड, आगर, संदंश, यादृच्छिक संख्या तालिका (ओं), और equiangular हलकों के प्रिंट ।
      नोट: हलकों की प्रतिलिपि टेंपलेट्स पिछले प्रकाशन8,26में प्रदान की जाती हैं ।
    2. क्रमिक चरणों के दौरान नमूना/अनुभागों में हमेशा पहचानने योग्य है जो निश्चित ऊतक नमूने के भीतर एक अनुलंब अक्ष निर्धारित करें ।
      नोट: सामान्यतया, अक्ष अनुलंब ऊतक नमूने की प्राकृतिक सतह के लिए अनुलंब अक्ष के रूप में चुना जाता है ।
    3. यदि उपयुक्त हो, तो नमूने को आगर (चित्र 11B) में एंबेड करें ।
      नोट:-VUR से पहले embedding-या निश्चित नमूने के IUR-अनुभाग है आम तौर पर छोटे, पतले, नाजुक, या नरम नमूनों के लिए सिफारिश की है । भी उपयोग आगर-प्लास्टिक राल माध्यम में नमूने के बाद embedding के दौरान VUR खोदी नमूना की स्थिति की सुविधा के लिए नमूनों की embedding.
    4. एक equiangular सर्कल के एक प्रिंट पर नमूना प्लेस, ऊर्ध्वाधर धुरी जा रहा है orthogonally तालिका के विमान के लिए उंमुख/कागज की मेज (चित्रा 11C) ।
    5. एक यादृच्छिक कोण पर नमूना काट (एक यादृच्छिक संख्या तालिका का उपयोग कर निर्धारित) धारा विमान ओर्थोगोनल के साथ तालिका और ऊर्ध्वाधर अक्ष के समानांतर एक VUR अनुभाग विमान (चित्रा 11D) प्राप्त करने के लिए.
    6. यदि उपयुक्त हो, तो चरण 1.3 में वर्णित के रूप में embedding-संबंधित ऊतक संकोचन के निर्धारण के लिए निश्चित ऊतक नमूने के IUR अनुभाग प्रोफ़ाइल के क्षेत्र का निर्धारण ( चित्र 9G-J) से तुलना करें और ऊतक नमूने को एंबेड करने के लिए आगे बढ़ें ऐसे GMA/एमएमए के रूप में प्लास्टिक राल ।

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Representative Results

ऊतक/अंग घनत्व के निर्धारण के लिए डुबकी तकनीक

चित्रा 12A -बी डुबकी तकनीक का उपयोग कर घनत्व और एक सुअर का गुर्दे की मात्रा के प्रतिनिधि निर्धारण से पता चलता है 1.1 कदम (चित्रा1, चित्रा2) में वर्णित है । अतिरिक्त सुअर का अंगों और ऊतकों के घनत्व माप के अधिक प्रतिनिधि परिणाम 2तालिका में प्रस्तुत कर रहे हैं । विविध सुअर का ऊतकों और अंगों के संदर्भ घनत्व की एक अधिक व्यापक सूची में दिखाया गया है "ऊतक नमूना गाइड सुअर का बायोमेडिकल मॉडल के लिए"7. डुबकी विधि का उपयोग कर प्राप्त ऊतक घनत्व माप मूल्यों की वैधता एक ही नमूना और स्वतंत्र नमूनों की दोहराया माप द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है । सबसे सुअर का ऊतकों प्रदर्शन घनत्व थोड़ा पानी (दर्षाया पानी ≈ 1.0) से अधिक मूल्यों, जबकि ऊतकों खारा (वसा ऊतक, फेफड़े के ऊतकों) में तैराकी प्रदर्शन घनत्व < 1.0.

अंग खंड के निर्धारण के लिए Cavalieri विधि

चित्रा 12C -एफ सुअर का गुर्दे की मात्रा का प्रतिनिधि निर्धारण दिखाता है (एक ही अंग के रूप में चित्रा12A-बी) में दिखाया गया है । अंग स्लैबों की धारा सतहों के क्षेत्रों बिंदु गिनती द्वारा निर्धारित किया गया, एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर छपी एक आरोपित क्रॉस ग्रिड का उपयोग कर, साथ ही स्लैब की एक स्कैन छवि में अंग स्लैब के खंड क्षेत्रों की planimetric माप द्वारा (भुगतान स्लैब अनुभाग सतहों के पीछे स्थित ऊतक के अधिक प्रक्षेपण के लिए ध्यान, चित्रा 12 जी-एच) । Cavalieri दृष्टिकोण के प्रदर्शन द्वारा प्राप्त अंग/ऊतक मात्रा डेटा की सटीकता (चरण 1.2, चित्र 3) का अनुमान संबंधित मात्रा से तुलना करके अनुमानित किया जा सकता है जो वजन और अंग के घनत्व/ डुबकी-विधि और Cavalieri विधि (ओं) द्वारा निर्धारित चित्रा 12 में गुर्दा की मात्रा एक दूसरे से कम 1% से भिंन । Cavalieri वॉल्यूम अनुमानों की शुद्धता के एक माप के रूप में, इसके गुणांक त्रुटि (CE) की गणना की जा सकती, जैसा कि पहले15बताया गया है ।

प्रोटोकॉल के लिए ऊतक के नमूनों के प्रसंस्करण के दौरान तीन आयामी embedding-संबंधित ऊतक संकोचन का निर्धारण

मात्रात्मक histomorphological परीक्षा के लिए प्लास्टिक रेजिन (GMA/एमएमए या epoxy) में सुअर का ऊतक नमूनों की embedding (cortical गुर्दे ऊतक) से संबंधित ऊतक संकोचन की सीमा के प्रतिनिधि परिणाम तालिका 2 में दिखाए जाते हैं (पहले अप्रकाशित डेटा) । तालिका 2 में इंगित रेखीय सिकोड़ने कारक चरण 1.3 (आरेख 4) में वर्णित के रूप में निर्धारित किए गए थे । वे GMA/एमएमए एंबेडिंग के लिए 29% की तीन आयामी मात्रा में कमी, और सुअर का cortical गुर्दे ऊतक के epoxy embedding के लिए 22% करने के लिए देखें । चित्र 13 , प्लास्टिक-embedding से पहले नमूना अनुभाग सतह क्षेत्र की माप के लिए आगर-एम्बेडेड, formalin-फिक्स्ड वसा ऊतक के पर्याप्त और अपर्याप्त रूप से तैयार नमूनों के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है ।

बिंदु गिनती और विभिन्न बहाव विश्लेषण प्रकार के लिए ऊतक उपनमूना के प्रसंस्करण द्वारा मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना

खंड के लिए "अनुभाग और बिंदु गिनती" तकनीक parenchymal अंगों के भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना (चरण 2, चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7) प्रतिनिधि की पीढ़ी के लिए एक स्थापित, मजबूत विधि का प्रतिनिधित्व करता है विश्लेषण के कई बाद के प्रकार के लिए नमूने2,7। कई अलग बहाव के लिए उत्पादेड ऊतक नमूनों के बाद के विभेदक प्रसंस्करण के साथ, विभिन्न सुअर का अंगों और ऊतकों के अत्यधिक निरर्थक अंधाधुंध बैंक नमूना, व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना की पीढ़ी के प्रतिनिधि परिणाम नमूना तकनीक का उपयोग कर चरण 2 में वर्णित विश्लेषण विधियों (चित्र 5, चित्र 7, और exemplarily चित्रा 6में प्रदर्शित) पहले2प्रकाशित किया गया है । एक पिछले सुअर का में जिगर ऊतक के बैंक नमूने के उत्पादन के लिए 2, उदाहरण के लिए, सुअर का जिगर पूरी तरह से 2-3 सेमी मोटाई के लगभग 20 स्लैब में खोदी गई, आरोपित के साथ एक 3 सेमी क्रॉस ग्रिड के साथ, कदम में वर्णित के रूप में 2, और लगभग 2 x 2 x 2 cm3 के 16 ऊतक स्थानों व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना और प्रत्येक मामले में उत्पाद का था । प्रत्येक उत्पाद के नमूनों में से पांच उपनमूना बाद में आणविक विश्लेषण के लिए उत्पन्न किए गए (-80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए) नमूना स्थानों, cryohistology के लिए एक उपनमूना, एक उपनमूना Methacarn समाधान में तय किया गया था, और formaldehyde समाधान में एक के लिए बाद में तेल embedding और ऊतकवैज्ञानिक-और immunohistochemical परीक्षा । 74 मामले प्रति (ठंड या निर्धारण समाधान में नमूनों के हस्तांतरण तक) के अनुसार लगभग 20 मिनट के भीतर हासिल किया गया था, औसत के लिए अलग नमूनों की पीढ़ी2। वर्णित नमूना और उपनमूना दृष्टिकोण की साध् य/सफलता उत्पन्न नमूनों की गुणवत्ता के आकलन द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है (यानी, आरएनए की गुणवत्ता-या प्रोटीन अलग, histomorphological के संरक्षण और ऊतक नमूनों के ultrastructural गुण, immunohistological विश्लेषण के लिए उनकी उपयुक्तता, आदि)2

मात्रात्मक Stereological विश्लेषण के लिए आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों और ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की पीढ़ी

तकनीक आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों और सुअर का से VUR वर्गों (बैंक) ऊतक नमूनों (प्रोटोकॉल चरण 3, चित्रा8, चित्रा9, चित्रा10, चित्रा के एक आगे उंमुख पीढ़ी के लिए प्रदर्शन किया 11), सबसे मात्रात्मक stereological मापदंडों की परीक्षा के लिए अनुमति, जल्दी से कुछ अभ्यास के साथ पूरा किया जा सकता है, और उचित कठिनाइयों या त्रुटि के स्रोतों के बिना. इसलिए, IUR-नमूनों की जनरेशन चित्रा 9 (isector तकनीक) और चित्रा 10 (orientator तकनीक) में दिखाए गए इन विधि (ओं) के लिए पूरी तरह से प्रतिनिधि है ।

Figure 1
चित्रा 1: "डुबकी तकनीक" ऊतक के निर्धारण के लिए के योजनाबद्ध चित्रण/अंग घनत्व. () नमूना भार का मापन (अर्थात्, मास, एमएस). () स्केल 20 ° c के 0.9% खारा और एक नमूना धारक को खारा में एक परिभाषित, चिह्नित स्थिति को जलमग्न के साथ भरा चोंच के वजन के लिए बारदाना । (C) नमूना धारक की चिन्हित स्थिति के लिए भीतरी दीवारों या चोंच के नीचे के हिस्से को बिना किसी संपर्क के पूरा डुबकी । संतुलन में प्रदर्शित वजन खारा के नमूने द्वारा विस्थापित की मात्रा का वजन है) । नमूने के घनत्व के रूप में संकेत दिया गणना की है (यहां: दर्षायानमूना = ms/वीएस = एमएस/(mL/१.००४८) = 5.153/(4.538/1.0048) = १.१४१ g/cm³) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: "डुबकी तकनीक" ऊतक के निर्धारण के लिए/अंग घनत्व । () विभिन्न नमूना धारकों पतले तार से निर्माण. बाएं से दाएं: एक पतली इंजेक्शन प्रवेशनी, तार की एक पेचदार टोकरी के माध्यम से पतले तार धागे के एक पाश के लिए छोटे और नाजुक नमूनों पकड़, और पतले तार के एक सरल गोफन । सी में तीर स्थिति है जो नमूना धारकों खारा में जलमग्न है संकेत मिलता है । (,) नमूना धारक की स्थिति खारा में नमूने के डुबकी के दौरान ( चित्रा 1 सी) की तुलना करें । (B) पूर्ण सुअर का पिट्यूटरी ग्रंथि एक टोकरी के आकार का नमूना धारक में रखा गया है । () सुअर का मायोकार्डियम का नमूना । बिना दीवारों से संपर्क किए या यूरिन के नीचे खारा में नमूनों का पूरा डुबकी नोट करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सुअर का अंग संस्करणों के निर्धारण के लिए Cavalieri विधि के आवेदन के योजनाबद्ध चित्रण . (A) Cavalieri सिद्धांत की समझ के लिए सिक्का ढेर उदाहरण । विवरण के लिए परिचय देखें । (B-H) एक छिड़काव-फिक्स्ड गुर्दे की मात्रा आकलन के योजनाबद्ध प्रदर्शन. () अपनी अनुदैर्ध्य धुरी के साथ गुर्दे की लंबाई (एल) की माप । () पूर्ण अंग के काटने में n समान रूप से मोटी () समानांतर स्लाइसें ओर्थोगोनल अनुदैर्ध्य अंग धुरी के लिए । (D) समान सतह पर रखे गए अंग स्लैब नीचे का सामना कर रहे हैं । ध्यान दें कि पहले (दाएं) टिशू स्लैब को उसकी प्राकृतिक सतह पर रखा जाता है, यानी, इसमें सेक्शन सरफेस नहीं है । (-एच) ऊतक स्लैब की धारा सतह क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण. () एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर मुद्रित एक प्लास्टिक ट्रांसपेरेंसी ओवरले पर एक पनरोक पेन के साथ एक निविड़ अंधकार कलम के साथ हर अंग स्लैब की रूपरेखा अनुरेखण, नपेed क्रॉस ग्रिड, से टकराने की गिनती पार प्रोफ़ाइल क्षेत्र । अंग स्लैब अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्र अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्र और एक क्रॉस करने के लिए इसी क्षेत्र से टकराने के पार की संख्या से गणना की है । (,) अनुभाग सतहों (F), या ऊतक स्लैब (G) की स्कैन की गई छवियों में, अंशांकन के लिए मापनियों के साथ, अनुलंब ओरिएंटेशन में ली गई फ़ोटो छवियों में अंग स्लैबों के अनुभाग क्षेत्रों का निर्धारण । (H) उपयुक्त morphometry सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों का उपयोग करके फ़ोटो के डिजिटल चित्रों में ऊतक स्लैबों के अनुभाग क्षेत्रों का निर्धारण/ (I) अंग स्लैब की अनुमानित मात्रा की गणना अंग के संचयी क्षेत्र के उत्पाद के रूप में सभी अंग स्लैब का मतलब मोटाई से गुणा15अंगों की सतह. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटोकॉल के लिए ऊतक के नमूनों की प्रोसेसिंग के दौरान तीन आयामी embedding-संबंधित ऊतक संकोचन के निर्धारण का योजनाबद्ध चित्रण । (एक) एक निश्चित ऊतक नमूने से एक ताजा, विमान अनुभाग सतह के काटने (आसानी से विकृत (मुलायम) ऊतकों के आकार के स्थिरीकरण जैसे वसा या फेफड़ों के ऊतकों के रूप में अनुभागीकरण करने से पहले आगर में embedding द्वारा). एक आकार शासक के साथ नमूना की धारा सतह की स्कैनिंग । (B) निश्चित ऊतक नमूने की धारा सतह के क्षेत्र का Planimetric निर्धारण (Af) । (C) प्लास्टिक एंबेडिंग मध्यम में नमूने की नियमित एंबेडिंग । (D) नमूना की धारा विमान के संरक्षण के साथ प्लास्टिक ब्लॉक के एक ऊतकवैज्ञानिक अनुभाग की तैयारी । एक गिलास स्लाइड पर अनुभाग के बढ़ते और स्लाइड की दिनचर्या धुंधला । (E) किसी आकार मापनी के साथ एक साथ स्लाइड की स्कैनिंग । () प्लास्टिक-एंबेडेड नमूना (Ae) के खंड के क्षेत्र का Planimetric निर्धारण । (G) प्लास्टिक embedding मध्यम14में एंबेड करने से पहले और बाद में ऊतक नमूनों की संबंधित अनुभाग प्रोफ़ाइल के मापा क्षेत्रों के गुणांक के रूप में embedding-संबंधित ऊतक संकोचन की सीमा की गणना । दाईं ओर छवियाँ एक formaldehyde की धारा सतह दिखाने-वसा ऊतक स्याही में एम्बेडेड-काला आगर से पहले प्लास्टिक राल में एंबेडिंग (ऊपर) और इसी अनुभाग प्रोफ़ाइल (वह धुंधला) GMA/एमएमए-एंबेडेड नमूना (नीचे) के निर्धारित नमूना । स्केल सलाखों = 2 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मात्रा के योजनाबद्ध चित्रण-भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना. प्रस्तुत उदाहरण के एक छिड़काव-फिक्स्ड गुर्दे की गुर्दे प्रांतस्था के भीतर छह ऊतक स्थानों की व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना दिखाता है । () अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ गुर्दे की लम्बाई (l) का मापन. () संपूर्ण अंग को समान रूप से मोटी (d) समानांतर स्लाइस ओर्थोगोनल को अनुदैर्ध्य अंग अक्ष पर पूरा करना । () अंग/एक ही (यानी, या तो सही या बाएं) सतह नीचे का सामना करना पड़ पर रखा । एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर मुद्रित एक उचित आकार पार ग्रिड के साथ ऊतक स्लैब के ओवरले () । सबसे बाहरी ग्रिड के ऊपरी पार छोड़ दिया ऊतक के बाहर एक यादृच्छिक बिंदु पर रखा जाता है (एक नीले रंग की बिंदी, •) । () गिनती और सभी की क्रमांकन गुर्दे प्रांतस्था मार पार । वर्तमान उदाहरण में, गुर्दे प्रांतस्था मार पार एक गुर्दा स्लैब में लगातार एक के बाद गिने जाते है (दाएं से बाएं), दक्षिणावर्त दिशा में प्रत्येक स्लैब कार्यवाही में, बारह बजे की स्थिति के निकटतम पार से शुरू । यहां, 36 पार गुर्दे प्रांतस्था मारा । छह नमूने लेकर स्थिति का नमूना लिया जाना है । इसलिए, हर छठे स्थान पर जहां एक क्रॉस हिट ऊतक नमूना है (36/6 = 6). () वर्तमान उदाहरण में, चौथे पार (N ° 4) गुर्दे प्रांतस्था मार की स्थिति बेतरतीब ढंग से पहली नमूना स्थिति के रूप में चुना है । हर निंनलिखित छठी गुर्दे प्रांतस्था मार क्रॉस एक पनरोक कलम का उपयोग कर प्लास्टिक पारदर्शिता पर चिह्नित है । वर्तमान उदाहरण में, ये स्थितियां 4, 10, 16, 22, 28, और 34 हैं । (G) ऊतक की सतह पर रखे साफ, खाली कंफ़ेद्दी कागज के छोटे टुकड़ों द्वारा इसी ऊतक स्थानों की टैगिंग । (H) अनियमित व्यवस्थित रूप से नमूने लिए गए स्थानों से ऊतक नमूनों का उत्पादीकरण और आगे के विश्लेषण के लिए अनुवर्ती प्रक्रिया । यह आंकड़ा Albl एट अल से संशोधित किया गया है. (2016), आंकड़े S236 और S237, पृष्ठ 186 (पूरक)7. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक सुअर का गुर्दे की गुर्दे प्रांतस्था की मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना (चित्रा 5 को देखें) और बिंदु गिनती के लिए नियम . () ताजी पिग किडनी. (बी) गुर्दे अनुदैर्ध्य अंग धुरी के लिए समान रूप से मोटी समानांतर स्लाइस ओर्थोगोनल में खोदी, क्रॉस ग्रिड एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर मुद्रित के साथ मढ़ा । लाल चक्र क्रॉस ग्रिड की स्थिति को यादृच्छिक करने के लिए इस्तेमाल यादृच्छिक बिंदु की स्थिति को इंगित करता है. (C) पॉइंट-काउंटिंग नियमों का चित्रण: क्रॉस/बिंदु को ऊतक के डिब्बे से टकराने के रूप में गिना जाता है (संदर्भ डिब्बा), यदि क्रॉस (तीर) के अनुलंब और क्षैतिज पट्टी का सही ऊपरी भीतरी कोना ऊतक को कवर करता है । () गुर्दे प्रांतस्था और ऊतक स्थानों की व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना मार पार के अंकन (यहां, 119 पार गुर्दे प्रांतस्था मारा और 17 स्थानों व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से एक नमूना अंतराल का उपयोग कर रहे है मैं = 7) का नमूना । () बेतरतीब ढंग से व्यवस्थित गुर्दे प्रांतस्था के स्थानों का नमूना कंफ़ेद्दी कागज द्वारा चिह्नित । () आबकारी नमूने । (G) भिंन बहाव विश्लेषण प्रकारों के लिए उपक्रमों के अनुवर्ती प्रक्रिया के लिए उत्पाद के नमूनों के आगे उपखंड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: सुव्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना ऊतक स्थानों और अलग बहाव विश्लेषण प्रकार के लिए उपनमूना के प्रसंस्करण से उत्पाद के ऊतकों नमूनों की उपखंड । (A) विभिंन विश्लेषणों (उदा., एफएफ-पीई: Formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड नमूना, और MTC-पीई के लिए गुर्दे की प्रांतस्था (मूल ऊतक) के एक व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना स्थान से ऊतक उपनमूने की पीढ़ी के योजनाबद्ध चित्रण: Methacarn-स्थिर, आयल-एंबेडेड नमूना प्रकाश सूक्ष्म प्रोटोकॉल के लिए; क्रायो: जमे हुए धारा प्रोटोकॉल के लिए नमूना; -80 ° c: शुष्क बर्फ आणविक विश्लेषण के लिए जमे हुए ऊतक के नमूने) । () एक छिड़काव-फिक्स्ड गुर्दा के गुर्दे प्रांतस्था के व्यवस्थित रूप से बेतरतीब ढंग से नमूना स्थानों के उत्पाद शुल्क, और उत्पादिक ऊतक नमूनों के आगे उपखंड, और गुणात्मक और मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण के लिए उपनमूने के प्रसंस्करण । छिड़काव के स्लैब-फिक्स्ड सुअर का गुर्दे (1), क्रॉस-ग्रिड (2), यादृच्छिक संख्या तालिका (3), equiangular और कोज्या-तौल हलकों (4) IUR वर्गों की पीढ़ी के लिए (देखें चित्र 9, चित्र 10), भिंन निर्धारण समाधान (5, 6, 7), और नमूना इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म नमूनों (8) के लिए कंटेनर । यह आंकड़ा Albl एट अल से संशोधित किया गया है । (2016), चित्रा S239, पृष्ठ 186 (पूरक)7कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: "Isector" अनुभाग तैयारी से formalin-फिक्स्ड सुअर का ऊतक . () छिड़काव का नमूना-फिक्स्ड सुअर का गुर्दे प्रांतस्था. () गोलाकार ढलाई मोल्ड । () तरल आगार । (डी-ई) आगर-गोलाकार कास्टिंग मोल्ड में नमूनों की embedding । () एंबेडेड ऊतक नमूने के साथ क्षेत्र आगर । (G) एक यादृच्छिक स्थिति (IUR धारा विमान) में खोदी गई एंबेडेड ऊतक के साथ क्षेत्र आगर । यह आंकड़ा Albl एट अल से संशोधित किया गया है । (2016), चित्रा S6, पृष्ठ 14 (पूरक)7कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: IUR वर्गों की तैयारी के लिए "Orientator" तकनीक का योजनाबद्ध चित्रण । () एक equiangular सर्कल (ci1) पर रखा फिक्स्ड ऊतक का नमूना (ओं) 0 – 180 ° दिशा के समानांतर एक किनारे के साथ (एक लाल रेखा से संकेत) । (B) किसी यादृच्छिक कोण (ग्रीन लाइन) पर नमूने का अनुभाग । (B, C) ऊतक नमूने के नव उत्पंन खंड सतह (हरे रंग में संकेत दिया) । (D) नमूना कोज्या-तौल चक्र (ci2) पर रखा गया है जो पिछले चरण में उत्पंन होने वाले नकारात्मक पक्ष और 1-1 दिशा के समानांतर शेष सतह के एक किनारे (लाल रेखा द्वारा दर्शाया गया) के साथ है । () एक यादृच्छिक कोण पर नमूना के माध्यम से दूसरे खंड के काटने । () नमूना के बेतरतीब ढंग से आइसोट्रोपिक धारा विमान के परिणामस्वरूप (नीले रंग में संकेत) । (G) एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन के आकलन के लिए निश्चित ऊतक नमूने के IUR खंड के क्षेत्र के निर्धारण के रूप में चरण 1.3 में वर्णित है । (H) प्लास्टिक राल में ऊतक के नमूने की embedding । (I) प्लास्टिक ब्लॉक की धारा एक microtome पर (IUR विमान के समानांतर) खोदी है । (J) कांच की स्लाइड्स पर IUR प्लास्टिक के बढ़ते-सेक्शन । यह आंकड़ा Albl एट अल से संशोधित किया गया है । (2016), चित्र S8, पृष्ठ 15 (पूरक)7. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10: आगर-एम्बेडेड ऊतक नमूनों के IUR वर्गों की तैयारी के लिए "Orientator" तकनीक । (A-D) वैकल्पिक रूप से, एक हो सकता है-एक व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से निर्धारित ऊतक के नमूने नमूना एंबेड (आगर-embedding छोटे ऊतक के नमूनों के लिए उपयोगी है, ताकि पहले या दोनों यादृच्छिक वर्गों के भीतर तैनात किया जा सकता है आगर ऊतक काटने के बिना) । () एक equiangular सर्कल (ci1) पर आगर ब्लॉक की स्थिति 1-1 दिशा के समानांतर एक किनारे के साथ (एक लाल रेखा से संकेत) । (F, G) एक यादृच्छिक कोण पर ब्लॉक के अनुभाग (यहां: 15-15, ग्रीन लाइन) एक यादृच्छिक संख्या तालिका (rnt, हरा तीर) का उपयोग कर निर्धारित किया है । () खंड सतह पर एफ में कटौती पर आगर ब्लॉक की स्थिति के बाद आराम सतह के किनारे के साथ एक कोज्या भारित सर्कल (ci2) पर रखा 1-1 दिशा के समानांतर (एक लाल रेखा से संकेत) । (I) एक यादृच्छिक कोण पर नमूना के माध्यम से दूसरा खंड में कटौती (यहां: 20-20, एक नीली रेखा से संकेत), एक यादृच्छिक संख्या तालिका (rnt, नीला तीर) का उपयोग करके निर्धारित किया है । (J) ऊतक नमूने के परिणामस्वरूप IUR धारा विमान । यह आंकड़ा Albl एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६), चित्रा S9, पृष्ठ १६ (सप्लीमेंट्स). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: VUR अनुभाग तैयारी का योजनाबद्ध चित्रण । () एक परिभाषित (पहचान योग्य) ऊर्ध्वाधर अक्ष (जैसे, अपनी प्राकृतिक सतह के लिए ऊर्ध्वाधर) के साथ निर्धारित ऊतक नमूना । (B) निश्चित ऊतक नमूने को आगर में एंबेड किया गया । () एक equiangular सर्कल (ci1) के एक प्रिंट पर (आगर-एंबेडेड) ऊतक नमूने की स्थिति । VA: अनुलंब अक्ष । (D) नमूने की धारा एक यादृच्छिक कोण (यादृच्छिक संख्या तालिका; यहां: 30-30 दिशा, एक नीली रेखा द्वारा इंगित) के साथ खंड विमान orthogonally जा रहा है और नमूना के ऊर्ध्वाधर अक्ष के समानांतर तालिका के लिए उंमुख । ऊतक नमूने के परिणामस्वरूप VUR धारा विमान (नीले रंग में संकेत दिया). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12: एक सुअर का गुर्दे के प्रतिनिधि volumetry । (A-B) डुबकी तकनीक । () गुर्दे के वजन का निर्धारण (एमकिड). () गुर्दा (mप्रदर्शि. खारा) द्वारा खारा विस्थापित की मात्रा के वजन का निर्धारण । गुर्दा एक तार पर लटका हुआ है और पूरी तरह खारा में नीचे या चोंच की दीवारों को छूने के बिना जलमग्न । गुर्दे की गणना की मात्रा ९२.६ cm³ है । (सी-डी) Cavalieri तकनीक, planimetry द्वारा प्वाइंट-काउंटिंग । (C) इसकी अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ गुर्दे की लंबाई (l) का मापन । (D) एक प्लास्टिक पारदर्शिता पर मुद्रित समान रूप से रिक्ति के एक ग्रिड के ओवरले के बाद पॉइंट काउंटिंग द्वारा गुर्दा स्लैब के अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों का निर्धारण । यहां, गुर्दे की अनुमानित मात्रा ९३.३ cm³ है । (E-F) Cavalieri तकनीक, गुर्दा स्लैब () के अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों की स्कैन की गई छवियों का planimetry । यहां, गुर्दे की अनुमानित मात्रा ९२.८ cm³ है । C-Eमें, स्कैनर या क्रॉस ग्रिड पारदर्शिता द्वारा मढ़ा पर रखा गुर्दे के पहले या अंतिम स्लैब के प्राकृतिक दौर की सतह एक अनुभाग सतह नहीं है और इसलिए, कोई अनुभाग सतह क्षेत्र इस ऊतक स्लैब में मापा जाता है । (-) एक क्रॉस ग्रिड पारदर्शिता (एच) के साथ मढ़ा अंग/ऊतक स्लैब (जी) और अंग/ऊतक स्लैब में स्कैन छवियों में अधिक से अधिक अनुमानों का प्रदर्शन । अंग स्लैब के ऊतकों के कुछ हिस्सों को चिन्हांकित सफेद और काली रेखाओं द्वारा दर्शाया गया है । केवल वास्तविक अनुभाग प्रोफाइल के क्षेत्रों (यानी, आंशिक रूप से संकेत सफेद बिंदीदार रेखा से घिरा ऊतक) निर्धारित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13: पर्याप्त के प्रतिनिधि चित्रण (क) और इष्टतम (ख) ऊतकवैज्ञानिक प्लास्टिक embedding मीडिया में नमूनों की embedding से संबंधित ऊतक संकोचन के निर्धारण के लिए आगर-एम्बेडेड ऊतक नमूनों की तैयारी. () प्लास्टिक राल में embedding करने से पहले सुअर का चमड़े के नीचे वसा ऊतक के एक निश्चित नमूना की धारा सतह के स्कैन छवि । नमूना और खंड सतह आकृति की स्पष्ट पहचान नमूना के आकार के स्थिरीकरण के लिए इंक-काला आगार में एंबेडेड है । () खंड की सतह और फंस हवा बुलबुला (तीर) के भीतर की अलग रूपरेखा आगर । स्केल बार्स = 5 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

विश्लेषण नमूना प्रसंस्करण
प्रकार विधि (ओं)
आणविक विश्लेषण आरएनए प्रतिलिपि, प्रोटीन, metabolite, और लिपिड profiling,
metabolomics विश्लेषण, डीएनए विश्लेषण
ताजा (देशी) ऊतक के छोटे टुकड़े * सूखी बर्फ पर या तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । पर स्टोर-80 ° c ।
गुणात्मक रूपात्मक िरा प्रोटोकॉल
[प्रकाश माइक्रोस्कोपी, immunohistochemistry (आइएचसी) एवं सीटू संकरण में]
ताजा (देशी)-या में सीटू -फिक्स्ड * ऊतक के नमूने विभिंन fixatives का प्रयोग करें (उदा, 4% formaldehyde समाधान) और एंबेडिंग मीडिया (आयल, GMA/एमएमए, epoxy), के रूप में उपयुक्त ।
Cryohistology
(जमे हुए वर्गों, आइएचसी)
ताजा (देशी) ऊतक के नमूने मध्यम अवरुद्ध में नमूना एंबेड और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज-कूल्ड isopentane ।
Ultrastructural विश्लेषण
[इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, भंडार. ट्रांसमिशन-(उनि) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी]
ताजा (देशी) के छोटे टुकड़े-या सीटू में-फिक्स्ड * ऊतक के नमूने 2.5 में ठीक नमूना-6.25% glutaraldehyde समाधान और epoxy प्लास्टिक राल में एंबेड ।
मात्रात्मक रूपात्मक िरा प्रकाश माइक्रोस्कोपी ताजा (देशी)-या में सीटू -फिक्स्ड * ऊतक के नमूने IUR-वर्गों (orientator-, isector-वर्गों) और प्लास्टिक एंबेडेड ऊतक के नमूनों के VUR-वर्गों तैयार करते हैं ।
उनि ताजा (देशी) के छोटे टुकड़े-या सीटू में से-फिक्स्ड * ऊतक IUR तैयार (orientator-, isector-वर्गों) epoxy-एंबेडेड ऊतक नमूनों की धारा ।

तालिका 1: अलग बहाव विश्लेषण प्रकारों के लिए व्यवस्थित रूप से बेतरतीब ढंग से नमूना स्थानों से उत्पाद के ऊतकों के नमूने के प्रसंस्करण. एक अध्ययन के प्रायोगिक डिजाइन और अंग/जांच के अंतर्गत, उपनमूना के विभिंन नंबरों प्रत्येक व्यवस्थित बेतरतीब ढंग से नमूना ऊतक स्थान से उत्पाद और बहाव विश्लेषण के विभिंन प्रकार के लिए संसाधित किया जाना चाहिए के आधार पर । सबसे सुअर का अंगों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल/ऊतकों और अध्ययन के प्रकार "सुअर का बायोमेडिकल मॉडल"7 के लिए ऊतक नमूना गाइड में प्रदान की जाती हैं । GMA/एमएमए: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक । VUR: ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक । अधिकतम. 2 x 2 x 2 मिमी3। * * उदा, छिड़काव निश्चित ऊतक या फेफड़ों के फेफड़े के ऊतकों को निर्धारण समाधान के साथ जगाकर ।

विधि प्रतिनिधि परिणाम
ऊतक के निर्धारण के लिए डुबकी तकनीक/अंग घनत्व (कदम 1.1, चित्रा 1, चित्रा 2) सुअर का अंग ऊतक/ दर्षाया (g/cm³)
जिगर १.०७१ ± ०.००७
अग्न्याशय १.०६२ ± ०.०१६
निलय मायोकार्डियम १.०३६ ± ०.०१४
किडनी १.०४४ ± ०.००६
उदर आंत वसा ऊतक * ०.९२१ ± ०.०३२
थायराइड ग्रंथि १.०६१ ± ०.००७
मस्तिष्क १.०५१ ± ०.००७
अधिवृक्क ग्रंथि १.०६३ ± ०.०२५
कंकाल की मांसपेशी * * १.०७४ ± ०.००३
डेटा मतलब है ± एसडी । विशिष्ट अंग/n = 18 सूअरों में निर्धारित किया गया था (14 महिला और 4 पुरुष सूअरों; आयु 60 दिन से 2 वर्ष; शरीर का वजन 30 – 250 किग्रा) । * jejunal अन्त्रपेशी से वसा ऊतक । * * मतलब मान के लिए एम. longissimus डोरसी, एम. tibialis cranialis, एम. triceps brachii, और एम. gluteobiceps.
प्रोटोकॉल के लिए ऊतक के नमूनों के प्रसंस्करण के दौरान तीन आयामी embedding-संबंधित ऊतक संकोचन का निर्धारण (चरण 1.3, चित्रा 4) अंग ऊतक/ मध्यम एंबेडिंग       एफएस
गुर्दे प्रांतस्था (सुअर) GMA/एमएमए ०.८९ ± 0.02
epoxy ०.९२ ± 0.02
डेटा 12 सूअरों के 24 नमूनों की माप के ± एसडी मतलब कर रहे हैं । fS: रेखीय संकोचन सुधार कारक ।

तालिका 2: चयनित सुअर का अंगों और ऊतकों के घनत्व के प्रतिनिधि परिणाम 7, और विभिंन प्लास्टिक एंबेडिंग मीडिया में सुअर का cortical गुर्दे के ऊतकों के embedding-संबंधित ऊतक संकोचन के लिए रैखिक संकोचन सुधार कारक ।

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Discussion

सुअर का पशु मॉडल से बैंक नमूना संग्रह की पीढ़ी के अंग के निर्धारण के लिए मजबूत तकनीक और प्रोटोकॉल की आवश्यकता है/ऊतक की मात्रा, प्रतिनिधि की reproducible पीढ़ी, निरर्थक ऊतक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त विभिन्न विश्लेषण विधियों, और मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए नमूना वर्गों के अभिविन्यास के यादृच्छिकीकरण के लिए. वर्तमान लेख में वर्णित विधियों सुअर का अंगों और ऊतकों के आकार के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, और प्रभावी ढंग से इन मांगों को पूरा करने के लिए विकसित किया गया है 2, 7. वे अच्छी तरह से मांयता प्राप्त methodological सिद्धांतों पर आधारित हैं, और पहले अलग प्रकाशित अध्ययन में अपनी साध् य सिद्ध है2,7,12,21। विशेष रुप से वे प्रतिनिधि नमूने की पीढ़ी के लिए एक आधार प्रदान करते हैं, और मानकों की एक किस्म है जो अंयथा नहीं निर्धारित किया जा सकता है के अधिग्रहण के लिए, ऊतक की जांच के अध्ययन के विभिंन प्रकार के लिए महत्वपूर्ण हैं । इन तरीकों को जल्दी से थोड़ा प्रयास के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और बहाव के विश्लेषण के लगभग सभी प्रकार के साथ संगत कर रहे हैं । इसलिए, वे न केवल सुअर का पशु मॉडल के लिए उपयुक्त माना जाता है, लेकिन यह भी है कि अंय बड़े पशु मॉडल प्रजातियों के ऊतक के नमूनों की मात्रात्मक histomorphological विश्लेषण को शामिल अध्ययन में उपयोगी होते है (जैसे, भेड़), के रूप में अच्छी तरह से पशु चिकित्सा अध्ययन में । खाते में विभिंन तरीकों के तकनीकी पहलुओं को लेकर, कुछ महत्वपूर्ण कदम और सीमाओं को संबंधित तकनीकों के प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के दौरान विचार किया जाना है ।

ऊतक/अंग घनत्व के निर्धारण के लिए डुबकी तकनीक

ऊतक घनत्व के संकल्प के दौरान डुबकी विधि (चरण 1.1, चित्रा 1, चित्रा 2) का उपयोग करना, देखभाल भीतरी दीवारों या ऊतक नमूना या नमूना धारक के साथ चोंच के नीचे छूने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए जबकि ऊतक नमूना है खारा में जलमग्न हो गया । अन्यथा, पैमाने नमूना के वजन के बजाय नमूना द्वारा खारा विस्थापित की मात्रा के भार को प्रदर्शित करेगा. बहुत छोटे/हल्के ऊतक के नमूनों के लिए (कुछ मिलीग्राम), ऊतक घनत्व के निर्धारण के लिए डुबकी विधि सीमित है, खारा की सतह तनाव और चोंच में डुबकी तरल की मात्रा के लिए नमूना मात्रा के प्रतिकूल उच्च गुणांक के कारण, जो माप की सटीकता में बाधा. यहां, नमूना के वजन के बजाय घनत्व की गणना की मात्रा आगे की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । डुबकी द्वारा ऊतक घनत्व का निर्धारण भी ताजा (स्थिर) फेफड़ों के ऊतकों, ऊतक में हवा की असंगत सामग्री के कारण के लिए प्रभावी नहीं है, और कुछ मामलों में, जहां अंगों को प्रयोग कर रहे हैं perfused/fixatives के साथ जगाकर ।

अंग खंड के निर्धारण के लिए Cavalieri विधि

अंग भार और घनत्व से अंग मात्रा के निर्धारण की तुलना में सुअर का अंगों और ऊतकों के Cavalieri volumetry की विधि अधिक बोझिल होती है. हालांकि, यह अंगों है कि उचित रूप से उनके प्रयोगात्मक प्रसंस्करण के कारण तौला नहीं जा सकता के लिए उपयुक्त है (उदा., छिड़काव-तय अंगों, या फेफड़ों निर्धारण समाधान के साथ जगाकर) । यहां, Cavalieri volumetry विधि आदर्श मात्रा के साथ जोड़ा जा सकता है भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना तकनीक चरण 2 में वर्णित (चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 12). समानांतर की धारा प्रोफाइल के क्षेत्रों से अंग/ऊतक की मात्रा के आकलन के दौरान, अंग के equidistant स्लाइस/ऊतक (Cavalieri दृष्टिकोण, 1.2 कदम, चित्रा 3), ऊतक स्लैब के उंमुखीकरण के रखरखाव (ऊपरी और निचले अनुभाग विमान ), और साथ ही सभी अनुभाग प्रोफाइल के क्षेत्र का सटीक निर्धारण बहुत महत्व के हैं । विशेष रूप से, यदि डिजिटल छवियों या अंग स्लैब के स्कैन planimetrically का विश्लेषण कर रहे हैं, ऊतक के (खोदी ऊतक विमान के बाहर) ऊतक स्लैब (चित्रा 12जी-एच) की अधिकता ध्यान से विश्वसनीय मात्रा प्रदान करने के लिए विचार किया जाना चाहिए अनुमान.

प्रोटोकॉल के लिए ऊतक के नमूनों के प्रसंस्करण के दौरान तीन आयामी embedding-संबंधित ऊतक संकोचन का निर्धारण

एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक एंबेडिंग मध्यम और ऊतकों के प्रकार पर निर्भर करता है, और भी एक ही ऊतक के अंतर से संसाधित नमूनों के बीच भिंन हो सकते हैं ।

जबकि जमे हुए वर्गों के लिए एक्स-वाई विमान में वस्तुतः कोई दबाव प्रदर्शित करने के लिए माना जाता है, और प्लास्टिक embedding आम तौर पर ऊतक के छोटे सिकुड़ना का कारण बनता है, embedding-संबंधित ऊतक संकोचन तेल में विशेष रूप से व्यापक है-एंबेडेड ऊतक के नमूने , और आमतौर पर काफी मात्रा में इन नमूनों के ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में आयामी मापदंडों के रूपात्मक विश्लेषण ख़राब होगा । कुल मिलाकर तीन आयामी सिकुड़न की बड़ी सीमा के अलावा, आयल-embedding भी एक गैर वर्दी, अंतर, अनिसोट्रोपिक, और नमूने के चर सिकुड़ना और विभिंन संरचनात्मक संरचनाओं, ऊतक प्रकार और कोशिका प्रकार के भीतर का कारण बनता है टिशू सैंपल8,13. इसके अलावा, विशेष रूप से आयल-एंबेडेड ऊतक के नमूनों के मोटा ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में, ऊतक संकोचन की हद तक भी काफी X-Y और जेड-दिशा अनुभाग में अलग हो सकता है । यह खंड क्षेत्र (एक्स-वाई-दिशा में) और खंड की ऊंचाई (यानी, ऊर्ध्वाधर अनुभाग मोटाई) अनुभाग के गर्म ऊतक प्लवनशीलता पानी में स्नान के दौरान खंड के ऊतकों से काट रहा है के दौरान खींच के दौरान एक अंतर हटना करने के लिए कारण हो सकता है ब्लॉक, और बाद में प्रसंस्करण, धुंधला, और खंड के coverslipping प्रक्रियाओं के दौरान एक ग्लास स्लाइड पर घुड़सवार (यानी, वर्गों के एक समरूप पतन ' जेड धुरी)8. इसके अतिरिक्त, मोटी वर्गों में, अनुभाग के भीतर ऊतक क्षेत्रों के पास खंड विमान के एक तुलनात्मक मजबूत संपीड़न हो सकता है, जबकि अनुभाग ऊतक ब्लॉक से काट रहा है (वर्गों ' जेड धुरी के एक अंतर विकृति के लिए अग्रणी)19 . ये प्रभाव तब भी खंड के भीतर ऊतक संरचनाओं की संख्या के अनुमानों को विकृत कर सकता है विशिष्ट मात्रात्मक stereological विश्लेषण विधियों, जैसे ऑप्टिकल disector । इसलिए, पूर्वानुमान, निगरानी, और embedding-संबंधित ऊतक संकोचन के सुधार आयल-एंबेडेड ऊतक नमूनों के लिए8व्यवहार्य नहीं है ।

इसके विपरीत, इस तरह के GMA/एमएमए या epoxy के रूप में प्लास्टिक रेजिन में एम्बेडेड ऊतक नमूनों की मात्रा सिकुड़न की हद तक, काफी कम है और, महत्वपूर्ण बात, अधिक वर्दी. इसलिए, एक ग्रहण समरूप, आइसोट्रोपिक, और ऊतक के वैश्विक संकोच के साथ प्लास्टिक राल में embedding विभिंन मात्रात्मक रूपात्मक मानकों के कई विश्लेषण विधियों के लिए लाभप्रद है17,18। ऊतक सिकुड़ना प्लास्टिक राल में embedding से संबंधित के आकलन के दौरान, निश्चित ऊतक के आकार के साथ ही एंबेडिंग प्रक्रिया के दौरान विकृत नहीं होना चाहिए, निश्चित और एंबेडेड के संगत अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए नमूने. इस तरह के वसा या फेफड़ों के ऊतकों, या एक उच्च द्रव सामग्री के साथ ऊतक के नमूनों के रूप में नरम या आसानी से compressible ऊतक के नमूनों में मुश्किल हो सकता है । यहां, ऊतक के खंड से पहले आगर में निश्चित नमूना की embedding बाद में प्लास्टिक embedding प्रक्रिया के दौरान ऊतक के नमूने के आकार को स्थिर करने में सहायक है (प्रोटोकॉल कदम 1.3., चित्रा 4) । विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, embedding-संबंधित ऊतक संकोचन की दोहराया माप किया जाना चाहिए, एक ही ऊतक के विभिन्न नमूनों का उपयोग. embedding से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक रैखिक ऊतक संकोचन कारक fs (प्रोटोकॉल चरण 1.3.9., चित्रा 4g) के रूप में व्यक्त किया जाता है. विभिंन लंबाई, सतह क्षेत्र, और विभिंन ऊतक संरचनाओं की मात्रा मानकों के सिकुड़ना सुधार के लिए एफएस का उपयोग कर समीकरणों के लिए उदाहरण कई मात्रात्मक stereological अध्ययन में प्रदान की जाती है14, 21,27.

बिंदु गिनती और विभिन्न बहाव विश्लेषण प्रकार के लिए ऊतक उपनमूना के प्रसंस्करण द्वारा मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना

सुअर का अंगों के लिए प्रस्तुत मात्रा भारित नमूना तकनीक ऊतक के भीतर यादृच्छिक नमूना स्थानों एक बार निर्धारित करता है, और बाद में ऊतक नमूनों से उत्पाद का नमूना द्वारा आगे अलग विश्लेषण के लिए सभी आवश्यक नमूने उत्पन्न करता है ये स्थान7. मात्रा में भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना सरकारों, परीक्षण के तहत अंग/ऊतक की कुल मात्रा के भीतर प्रत्येक संभव नमूना स्थान नमूना लिया जा करने के लिए बिल्कुल एक ही यादृच्छिक मौका है, और सामांयीकरण एक के संग्रह द्वारा सुनिश्चित किया जाता है नमूनों की पर्याप्त संख्या । parenchymal अंगों से नमूनों के उत्पादन के लिए मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना डिजाइन का उपयोग करना, इसलिए, प्रभावी ढंग से (संभावित अप्रत्याशित और अपरिचित) विशिष्ट के असमान वितरण से पक्षपातपूर्ण विश्लेषण परिणाम रोकता है कार्यात्मक या एक अंग है, जो प्रदर्शन किया गया है के विभिंन स्थानों के भीतर रूपात्मक ऊतक गुण, उदा, मतलब मात्रा और जिगर के विभिंन क्षेत्रों में सुअर का हेपैटोसाइट्स के संख्यात्मक मात्रा घनत्व के लिए पैरेन्काइमा 28 . विशेष रुप से प्रदर्शित "ऊतक-slabbing और नमूना" सुअर का अंगों के लिए रणनीति आसानी से सुबोध है, बहाव विश्लेषण विधियों की तकनीकी आवश्यकताओं के साथ अनुपालन, और जल्दी से बाहर किया जा सकता है और एक विशिष्ट अध्ययन की मांगों के लिए अनुकूलित, जिससे व्यवस्थित नमूना पूर्वाग्रह से बचने, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने, और समग्र प्रयोग की शुद्धता में वृद्धि, जबकि नमूना रणनीतियों जिसमें हर एक नमूना स्थान बेतरतीब ढंग से निर्धारित किया जाता है की तुलना में अधिक कुशल जा रहा है9 ,15. नमूनों की संख्या है कि उत्पंन किया जाना है, जाहिर है जांच की पैरामीटर पर निर्भर करता है और नमूना अंग के विभिंन स्थानों से नमूनों के भीतर अपनी परिवर्तनशीलता/ विभिंन विश्लेषणात्मक तरीकों की एक किस्म द्वारा (नमूना के समय पर निर्दिष्ट नहीं) विभिन्न मापदंडों की एक अधिकतम की परीक्षा के लिए अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया के लिए बैंक नमूना संग्रह की पीढ़ी के लिए, इस तरह के एक आगे दिखने नमूना रणनीति आमतौर पर कार्यक्रम अंग प्रति निरर्थक नमूनों की अपेक्षाकृत उच्च संख्या की पीढ़ी/

मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों और ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की पीढ़ी

मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए IUR और VUR वर्गों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल तकनीक के कुछ कुछ जटिल सैद्धांतिक आधार है, और स्पष्टीकरण इसलिए अक्सर कर रहे है (अनावश्यक) कई वैज्ञानिकों ने eschewed, हालांकि उनके व्यावहारिक कार्यांवयन यथोचित आसान है । VUR वर्गों विशेष रूप से उत्पंन करने के लिए आसान कर रहे हैं, और सतह घनत्व/cycloid टेस्ट सिस्टम8,9,20के साथ संयोजन में क्षेत्र के आकलन के लिए इष्टतम हैं । वे अक्सर अनुभाग विमान के परिचित उंमुखीकरण के कारण पसंद कर रहे हैं । हालांकि, IUR वर्गों के विपरीत, VUR वर्गों लंबाई के आकलन के लिए उपयुक्त नहीं हैं-पैरामीटर्स8,9.

IUR और VUR वर्गों की तैयारी के दौरान, महत्वपूर्ण कदम है, मूल रूप से, प्लास्टिक राल में embedding के दौरान IUR या निश्चित नमूने के VUR अनुभाग सतह को बनाए रखने के लिए, और यह सुनिश्चित करें कि VUR वर्गों के ऊर्ध्वाधर अक्ष हमेशा पहचाना जा सकता है (चरण 3, चित्र 9, चित्र 10, चित्र 11) ।

भविष्य में, ऊपर वर्णित तरीकों के व्यापक आवेदन काफी हद तक तुलनीय, बहुउद्देश्यीय सुअर का और अंय बड़े जानवर मॉडल से बैंक के नमूनों की पीढ़ी के लिए लगातार उच्च गुणवत्ता मानकों को स्थापित करने में योगदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए लिसा Pichl का शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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