Стратегий выборки и обработки образцов ткани биобанка из свинины биомедицинской модели

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Демонстрируются практического применения и производительности методов для генерации образцы представительной ткани свинину животных моделей для широкого спектра течению анализов в биобанке проектов, включая volumetry, систематического случайной выборки, и дифференциальный обработка образцов ткани для качественных и количественных анализов молекулярных и морфологических типов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В трансляционного медицинских исследований свинину модели постепенно становятся более популярными. Учитывая высокую ценность отдельных животных, особенно генетически модифицированных свиней, модели и часто ограниченное количество доступных животных этих моделей, создание коллекций (биобанке) образцов должным образом обработанной ткани подходит для широкий спектр последующий анализ методов, включая анализ, не указанный на этапе отбора проб, представляют собой значимые подходы в полной мере воспользоваться трансляционная значения модели. Отношении особенности свинину анатомии недавно были установлены всеобъемлющие руководящие принципы для стандартизированных поколения представителя, высокое качество образцов из разных свинину органов и тканей. Эти руководящие принципы являются необходимыми условиями для воспроизводимости результатов и их сопоставимости между различными исследованиями и следователей. Запись основных данных, таких как орган весов и томов, определение мест отбора проб и количество образцов ткани будет создан, а также их ориентацию, размер, обработки и направления обрезки, являются соответствующие факторы определение обобщения и удобство образца для молекулярной, качественные и количественные морфологического анализа. Здесь наглядные, практические, шаг за шагом демонстрация самых важных методов для поколения представителя, представлен многоцелевой биобанке образца от свиного тканей. Описанные здесь методы включают в себя определение органа/ткани томов и плотности, применение процедуры средневзвешенная по объему систематического выборочного Паренхиматозный органов путем подсчета точки, определение степени усадки ткани связанные с гистологическим внедрение образцов, и поколения произвольно ориентированный образцов для количественных стереологических анализов, например изотропной единообразных случайных (IUR) секции, создаваемые методы «Ориентатор» и «Isector» и вертикальная форма случайные (VUR) секций.

Introduction

В трансляционной медицины, свиньи чаще для использования крупных животных моделей1,2,3,4,5, благодаря несколько выгодных сходство между свинину и человеческой анатомии и физиологии и наличие установленных молекулярно-биологических методов, позволяя для поколения с учетом, генетически модифицированных свиней модели для широкого спектра болезней условия1,4.

Однако по сравнению с моделями грызунов, количество животных соответствующих свинья модель, которая может быть предоставлена для экспериментов в любое время ограничено. Это обусловлено свинину поколения интервал примерно один год, и финансовых и время интенсивных усилиях, необходимых для генерации свинину моделей и животноводства. Таким образом отдельные животные модель свинину, а также образцы, которые могут быть сгенерированы из этих свиней, являются очень ценным, особенно если генетически модифицированных свиней модели и/или долгосрочных экспериментальных вопросов (например, поздних осложнений хронические заболевания) рассматриваются в возрасте лица2,6,7.

В ходе любого исследования, проведения дополнительных анализов, которые не были запланированы в первоначальный экспериментальный дизайн исследования позднее может оказаться актуальными, например, адрес, различные вопросы, возникающие в связи с ранее обнаружил неожиданные результаты. Если подходящие образцы для таких дополнительных экспериментов не доступны, непропорционально высокой стоимости и расходов много времени может потребоваться для создания дополнительных свиней и образцы тканей. Быть готовы к таким событиям, генерации биобанке коллекции сохраняется резервные образцов различных органов, тканей или био жидкости, количественно и качественно подходит для широкого круга последующих анализов, считается важным подход2,6,7. Получения оптимальных выгод от свиней животные модели, наличие адекватных биобанке образцов также предлагает уникальную возможность выполнить широкий спектр методов анализа различных на идентичных образцов материалов на уровне нескольких орган в тот же отдельных животных, например, путем распространения образцов для ученых различных рабочих групп, организованных в исследовательской сети2,6,7. Кроме того '' перспективных '' выборки стратегия в biobanking также способствует уменьшению числа животных, нуждается в исследовании. Преимущества свинину модель biobanking недавно были продемонстрированы в нескольких орган, multiomics исследование, изучение орган кросс talk в генетически модифицированных свинину модели долгосрочного сахарный диабет, с использованием образцов из Мюнхена MIDY свинья биобанке 2.

Есть некоторые обязательные требования, которые биобанке образцы обычно должны соответствовать для установления надежности и интерпретируемость результаты впоследствии проведенных анализов. Образцы должны быть сгенерированы можно воспроизвести, и они должны быть представитель, т.е., адекватно отражающий заинтересованных молекулярных и морфологических особенностей ткани/органа образцы были взяты из7. Чтобы быть пригодным для широкого круга вниз по течению анализ типов, образцы должны в достаточных количествах и обработаны согласно требованиям (включая время и температурных условий) различных аналитических методов, включая описательный гистопатологические анализов, например cryohistology, парафин и пластиковые гистологии, иммуногистохимия, в situ гибридизация, микроскопические анализы ультраструктурных электрона и клинических лабораторных диагностических анализов, а также как молекулярные анализ ДНК, РНК, белков и метаболитов.

Чтобы для оценки широкого круга различных количественных морфологических параметров, таких как числа, томов, длины или площади поверхности различных тканевых структур путем количественного анализа стереологических, рандомизированных раздел самолетов Гистологические образцы соответствующих органов/тканей должны быть подготовлены7,8,9,10,11. В количественных морфологических исследований, точное определение общего объема ткани, органа или органа отсека, образцы были взяты из (т.е., ссылка пространства) является критически важным7,9 , 12 для вычисления абсолютного количества заинтересованных параметров в пределах соответствующего органа, ткани или организма. В конце концов эффект встраивания связанных ткани усадки при подготовке Гистологические срезы должен быть определены и приняты во внимание13. Таким образом количественные стереологических анализ, особенно архивных образцов (фиксированная образцов тканей, блоков встроенного ткани, Гистологические срезы и т.д.) от предыдущих исследований, иногда серьезно ограничены или даже невозможным12, особенно если volumetry соответствующих органов/тканей не выполняется, если не адекватные выборки были применены для репрезентативных выборок, если цифры и количества доступных отдельных примеров являются недостаточными или если обработка образцы несовместима с оценки количественных морфологических параметров, представляющих интерес. Из-за многочисленных возможных факторов пригодность архива образцы материалов для анализа различных количественных морфологических параметров нельзя однозначно ответить, но зависит от тщательной оценки каждого отдельного случая.

Таким образом как расположение, размер, номер, обработки, обрезки направления и ориентации образцов потенциально повлияет на результаты последующего анализа, эти факторы имеют большое значение и должны рассматриваться в экспериментальный дизайн любого исследования. Эти аспекты и особенности анатомии свинину, всеобъемлющий, подробный, крупномасштабные выборки руководящие принципы были созданы недавно адаптированы к свинине Животные модели, предоставляя надежные ссылки на стандартизированных, воспроизводимые и эффективное создание избыточных, адекватно обработанные, высокое качество образцов из более чем 50 различных свинину органов и тканей6,7.

Методологические описания и видео учебник, показано в настоящей статье предоставляют подробные, иллюстративный, понятной, шаг за шагом инструкции для практического выполнения различных методов для volumetry, отбор проб свинину тканей и органы и обработка образцов ткани для различных течению анализа методов. Рекомендуемые методы включают в себя методы определения объемов ткани органов и плотности, основанные на принципах Архимеда и Кавальери9, включая определение размеров трехмерной усадка ткани, связанные с Встраивание в разных внедрения мультимедиа14 во время обработки для гистологического исследования, применение практически систематического случайной выборки, средневзвешенная по объему подходов, обработка образцов пробы ткани для различных последующих анализ7,8,9,15и поколение надлежащим образом и обработанных образцов для потенциальных количественных анализов стереологических7,8, 9,10,11. Рядом с их применения в проектах свинину биобанке продемонстрировали методы обычно подходят для всех исследований, изучения количественных гисто Морфологические свойства органов/тканей. Кроме того систематическое случайных выборок особенно полезно для создания репрезентативных выборок в эксперименте с использованием методов молекулярного анализа для обнаружения изменения в изобилии, например, РНК, белки или метаболитов в различные органы и ткани.

В следующий пунктах приводится краткое введение в эти методы, в то время как их практической эффективности описан в разделе протокол.

Определение объемов органа/ткани
Определение весов орган и тома имеет важное значение в нескольких экспериментальных установках, как эти факторы могут указывать на изменения, потенциально связанных с экспериментально изучались факторы интереса. Для вычисления абсолютных количественных параметров, (например, числа общей ячейки), от stereologically численные объем плотности (то есть, количество клеток на единицу объема также часто требуется общий объем органа/ткани ткани)7,12. Помимо методов с использованием сложного технического оборудования, такие как компьютерная томография существуют в основном три практические методы, обычно используемые для определения абсолютный объем органа или ткани. Объем органа может определяться «прямого объемного измерения» согласно принципу Архимеда, т.е., измерения объема воды или физиологического раствора, перемещенных в результате структуры, когда полностью погружены. Однако соответствующе большие свинину органов, эти подходы являются непрактичными и склонны к неточности, так как они требуют очень больших объемных/измерительные колбы. Более удобно можно рассчитать объем органа/ткани от его веса и плотности7,12,16, которые эффективно может быть определено, используя «метод погружения»7,12 ,16 (протокол шаг 1.1.). Ткани органов томов может быть оценена с помощью volumetry подходы, основанные на «принцип Кавальери» (1598 — 1647). В простых терминах Cavalieri принцип гласит, что если два объекта секционного в плоскостях, параллельных плоскости земли, и профили секций прорезать двух объектов на соответствующем расстояния от заземленной у тех же областях, два объекта у того же тома. Таким образом объем произвольной формы объектов может быть оценена как продукт их раздела профиля областях в параллельной, столь же далекой секущих плоскостей и расстояние между секущих плоскостей. Это приемлемые с следующую аналогию: рассмотреть два стека, состоящий из одинаковое количество идентичных монеты расположены бок о бок, один стек с монеты аккуратность, накладываются на друг друга, давая цилиндрическую форму монета стека, и другие стопка монет с-центр расположены монеты (рис. 3A). Хотя разные формы как монета стеки, их объемы совпадают, поскольку области монет на соответствующих уровнях обоих стеков (т.е., области профилей параллельных секций прорезать оба монета стеки в равных расстояниях от молотый) идентичны. Оценки объемов свинину органов и тканей, с использованием Cavalieri принцип7,12,15 описано в шаге 1.2.

Определение степени усадки ткани, связанные с гистологическим внедрение
В анализ нескольких количественных морфологических параметров, измеряется в разделах ткани гистологических эффект встраивания связанных ткани усадка, происходящих во время обработки для Гистология ткани должен быть определены и приняты во внимание. Степень усадки встраивания связанных ткани может быть переменной и зависит как от ткани, ее обработки и внедрения средние8,13,,1718,19. Как правило происходят встраивание связанные изменения объема образца ткани (т.е., главным образом усадки) во всех трех измерениях пространства, и, таким образом, затрагивает все размерные параметры оценкам количественных анализов стереологических8 . В принципе можно оценить степень внедрения связанных с ткани усадка, выраженный в виде линейной ткани коэффициент усадки (fS), как показано в шаге 1.3. и используется для коррекции количественных морфологических параметров (усадка чувствительных)14.

Средневзвешенная по объему систематической выборки органов/тканей
Для создания биобанка коллекции образцов свинину органа/ткани средневзвешенная по объему систематического выборочного подходов, таких, как описано в шаге 2 оказались практический, экономящее время и эффективных методов для генерации представителя, многоцелевой ткани образцы7,8,9,15.

Поколение изотропной единообразные случайной разделов и вертикальные единообразные случайной для количественного анализа, стереологических
Образцы тканей биобанке нужно быть подходит для широкого спектра различных количественных стереологических анализа методов для оценки максимум параметров, которые не могут быть определены без надлежащим образом подготовленного образца. Почти все количественные параметры стереологических можно определить, используя «изотропного (независимой) единообразные случайных (IUR) разделы»8,9. В разделах IUR рандомизированных трехмерную ориентацию плоскости сечения образца ткани. Это может быть достигнуто путем рандомизации положения образца ткани относительно положения секущей плоскости, как применяется метод «Isector»11 (протокол шаг 3.1), или путем рандомизации ориентации секущей плоскости относительно образец ткани, как и метод «Ориентатор»10 (протокол шаг 3.2). В образцах тканей, такие, как кожи или слизистой оболочки образца, показ естественным образом присутствуют, или определенных и правильно идентифицировать вертикальной оси, подготовка «вертикальный единообразных случайных (VUR) секций» (протокол шаг 3.3.) строго секционного в плоскости их Вертикальная ось является выгодным8,20. Для полного дискурса теоретические основы выборки IUR/VUR и всеобъемлющего обсуждения потенциальных течению количественных стереологических анализов заинтересовавшийся читатель именуется учебники количественных stereology в жизни наук8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь использовать образцы тканей, полученных от мертвых животных и полностью соответствуют нормам немецкой правовой защиты животных.

1. Volumetry

  1. Погружение техника для определения плотности ткани/орган (Рисунок 1 и рис. 2) 7 , 12 , 16
    1. Подготовка материалов: скальпель лезвия, бумажные полотенца, тонкой щипцы, стандартные лабораторные весы, стекла или пластиковые стаканы, 0,9% физиологического раствора и держатели построенных собственными образца (рис. 2A).
    2. Акцизный кусок ткани (максимальный размер: 2 x 2 x 2 см3) от органа/ткани, в частности из отсека орган интерес. Малые органы, например гипофиза, или шишковидной железы, являются измеренные в полном объеме.
      Предупреждение: Убедитесь, что размер выборки особенно меньше, чем внутренний диаметр стакан (шаг 1.1.5 et seq.) и ее уровень наполнения разрешить полное погружение образца без обращения к внутренние стены стакан на шаге 1.1.7.
    3. Тщательно тампоном образца с бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток крови/тканевая жидкость.
    4. Взвесить образец в масштабе точности и запишите вес образца (м/сек). Определите вес образцов малых тканей до ближайшего мг (рис. 1A).
    5. Поместите стакан, наполненный комнатной 0,9% физиологического раствора на шкале. Не полностью заполнить стакан, чтобы позволить для погружения образца ткани на последующем шаге без переполнения.
      Предупреждение: Используйте стакан размер, соответствующий размер и вес ткани представленном(ых) измеряться и эффективный диапазон шкалы. Для больших выборок до 2 x 2 x 2 см3, стакан размером 50-100 мл подходит в сочетании со шкалой измерения от приблизительно 100 мг до 500 g, тогда как для малых выборок, используйте стаканы объемом 5-10 мл в сочетании с точностью весы с диапазоны измерения между приблизительно 0,1 мг и 20 г.
    6. Опускайте держателя образца (то есть, достаточно жестким петлю тонкой проволоки или что-то подобное, рисунок 2A) в Салине помеченную позицию (стрелки в Рисунок 1B, Рисунок 2Bи 2 c рисунок). Затем сбросьте (тары) отображение шкалы к нулю.
    7. Тщательно прикрепить образец ткани для держателя образца и полностью погрузить образец в Салине до указанной позиции на держателе образца (стрелки в Рисунок 1B, Рисунок 2Bи 2 c рисунок).
      Предупреждение: Погруженной образца и держателя образца не должны иметь контакта с внутренние стены или в нижней части стакан или поверхности физиологического раствора.
    8. Удерживая держателя образца и погруженной образец в этом положении, запишите вес, отображаются на шкале (mL), ссылаясь на вес физраствора, перемещенных в результате образца ткани (рис. 1 C, Рисунок 2B, и Рисунок 2 c).
    9. Рассчитать объем выборки (VS) от mLи плотность раствора при комнатной температуре (20 ° C) (ρфизиологическим = 1.0048 г/см³) как VS mL= / Ρсолевой [g/g/см ³] (Рис. 1).
    10. Рассчитать плотность образца ткани (ρобразца) от веса (т.е., массовые) образца (м/сек) и ее объем (VS): Пример ρ = мS /VS[г/см³] (рис. 1).
    11. Для органов измеряется в totoповторите измерение в три раза и рассчитать плотность средняя орган от одного измерения значений. Для крупных органов/тканей выполняют повторные измерения с различными образцами отсеке же органа/ткани/орган и вычислить среднюю плотность от одного измерения, соответственно.
    12. Вычислите общий объем отсека органа/ткани/органа от его веса и плотности (рис. 1).
  2. Применение метода Cavalieri для определения объемов свинину орган 7
    1. Подготовка материалов: правитель, суппорта, нож, ножницы, пинцет, водонепроницаемый перо, пластиковые прозрачные, сканер, Фото камеры и крест сетки печатаются на пластиковых пленок.
    2. Поместите весь органа/ткани на ровную поверхность (резка база) и измерить длину (l) органа вдоль его продольной оси (рисунок 3B, Рисунок 5A).
    3. Нарежьте на полный органа/ткани равноотстоящих параллельных ломтиками ортогональных орган продольной оси (рис. 3 c, Рисунок 5B). Выберите расстояние d между двумя секциями (т.е., Толщина резания разделе интервал, обычно примерно 1 см) достаточно мал, чтобы получать достаточное количество ткани/орган плит. Случайно поместите первый раздел на расстоянии между 0 и секущей интервал от края органа. Во время нарезки, визуально судите о позиции и ориентации каждого секущей плоскости, чтобы получить приблизительно параллельной органа/ткани плит примерно одинаковой толщины.
      Примечание: Необходимое количество ткани/орган плит зависит от формы и размера исследуемого органа/ткани. Если малые органы или образцы секционного в тонких плит ≤5 мм, внедрить образцы в агар до секционирование (см. шаг 1.3.3.) и использовать техническое устройство для нарезки агар встроенный образца. Эмпирически рекомендуется секущей интервалы для наиболее свинину органов и тканей, а также примеры для нарезки устройств, указаны в дополнительных материалах «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7.
    4. Все ткани органов плиты на той же поверхности вниз на базе резки (т.е., последовательно на правом или левом секущей плоскости каждого органа плиты, 3D рисунок, Рисунок 5 c) и количество плит (n).
    5. Получение раздела профили ткани плит одним из следующих подходов:
      1. Осторожно поместите ткани плит на соответствующей маркировкой пластиковых пленок, при сохранении ориентации их верхняя и нижняя секции поверхностей. Обведите контуры ткани плит на пластиковой пленки с использованием водонепроницаемый пера (3E рисунок1-2).
      2. Возьмите фотографические изображения тканей плит, держа камеру вертикально над поверхности раздела (Рисунок 3F). Для калибровки место размер линейки рядом с плитами ткани.
      3. Сканировать ткани плит на планшетный сканер при сохранении ориентации их верхняя и нижняя секции поверхности (рис. 3 g). Для калибровки место размер линейки рядом с плитами ткани.
    6. Измерьте области (проследить, сфотографировали или сканированные) раздел профили всех тканей плит одним из следующих подходов:
      1. Наложение или наложения проследить орган плиты профили с соответствующего размера, калиброванный сетки равноудаленных крестов, печатаются на пластиковых прозрачности и count, все кресты, попав в разделе Профиль (Рисунок 3E3-4; по сравнению с Рисунок 5 d). Вычислить площадь сечения профиля каждого органа плиты, умножив количество крестов, ударяя области профиль в области, соответствующей одной крест.
        Примечание: Чтобы получить достаточно точный объем сметы, выбрать крест сетки с достаточно малое расстояние между соседними кресты, так что в среднем по крайней мере 100 пересекает будет хит раздела поверхности плит одного органа в каждом случае рассмотрены исследования . Эмпирически рекомендуется крест сетка размеров для наиболее свинину органов и тканей, указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7.
      2. Измерить области ткани плит в цифровых изображений фотографий/сканирования с помощью соответствующих коммерчески доступных или freeware морфометрия мягкой - и аппаратных приложений (рис. 3 H), например коммерческих изображений анализа системы21, или ImageJ22.
        Предупреждение: Примечание что один ткани плиты (первый или последний) помещается на сканер, опираясь на его естественной поверхности, соответственно, стоит перед камерой с его естественной поверхности. Таким образом отсканированные изображения, Фото изображение этой плиты, не будет отображаться раздел поверхности. Таким образом профиль не раздел области измеряется в отсканированные изображения/фото образ этой ткани плиты (Рисунок 3I). Также Примечание чрезмерной проекции в сканированные изображения и фотографии плит органа/ткани, то есть, только измерить области фактического раздела профилей, но не из ткани в изображении лежа позади поверхности раздела плиты (рис. 12 G-H).
    7. Рассчитать объем сметных орган как произведение суммы все соответствующие секции профиль области всех тканей плит в каждом случае (т.е., последовательно по в правой или левой, соответственно, Секция верхняя или нижняя поверхность каждого органа горбыль и средняя толщина плиты (то есть, коэффициент измеренной длины оси вертикальный орган (l) и количество плит)15.
  3. Определение степени усадки трехмерной внедрения связанных с ткани при обработке образцов ткани для гистологии
    1. Подготовка материалов: микротом лезвия, щипцы, агар, металлических литейных форм, цифровой сканер и размер линейки (например, Диаграммная бумага).
    2. Вырежьте свежие, ровную поверхность раздела из выборки фиксированного ткани.
      Примечание: При использовании образцов легко деформируемых (мягких) тканей (жировой ткани, желеобразной ткани), внедрить образца фиксированной ткани в агар до резания (рис. 4A).
    3. Чтобы встроить образца в агар:
      1. Смешайте Стандартный агар порошок используется для микробиологии питательной среды с соответствующим объемом воды (примерно 0,5 – 1 г агара/10 мл воды) в стеклянный стакан. Перемешать смесь и тепло его в микроволновую печь на 700 Вт до кипения на 3 – 5 с. перемешать смесь и довести до кипения еще раз за 3-5 s.
      2. При необходимости, чтобы увеличить контраст агар для образца ткани, краска жидкий агар, например, с черными чернилами (добавить 1 мл чернил в 10 мл горячего жидкого агар и размешивать энергично).
      3. Залить горячей агар в литья плесень (например, металлической формы, используемые для парафина, встраивание, Рисунок 10А-D) и погрузить образец фиксированной ткани в теплой агар. Пусть агар остыть до затвердевания, удалить плесень и вырезать блок агар с встроенных ткани, используя микротом или лезвием бритвы.
        Предупреждение: При обработке горячие жидкости агар, надевайте защитные очки и перчатки. Образцы тканей процесса, фиксированной в раствор формальдегида под выхлопных капот и надевайте защитные очки и перчатки лабораторные.
    4. Поместите образец с ее поверхности раздела вниз на планшетный сканер, вместе с линейкой размер и сканирования поверхности раздела (рис. 4AB).
    5. Определите площадь поверхности раздела фиксированной ткани образца (f) в цифровой сканирования, используя один из методов, описанных в шаге 1.2.6 (рис. 4В).
    6. Внедрить образца в пластиковых вложения среде, таких как эпоксидные (например, Epon) или glycolmethacrylate/метилметакрилатом (GMA/ММА)23(25 следующие стандартные протоколы23,)24, Рисунок 4 c). Убедитесь, что раздел поверхности фиксированной выборки, проверенных на предыдущем шаге (1.3.4) поддерживается в образце встраиваемый пластик.
      Примечание: Для поддержания ориентации поверхности раздела образца во время обработки образца, последовательно поместить образец с ее поверхности предназначен раздел вниз в внедрения кассеты или литья плесень, или Марк предназначен раздел поверхность (или противоположной стороне образца) с чернилами.
    7. Вырезать гистологические раздел из пластиковых блока, соответствующий оригинальный раздел поверхности образца фиксированной ткани (шаг 1.3.2) используя микротом (рис. 4 d), смонтировать раздел на слайде стекла (рис. 4 d) и выведение его регулярно ( например, гематоксилином и эозином пятно, H & E)24,25.
      Предупреждение: Чтобы получить Гистологическое разделе примерно в той же плоскости, как оригинальный раздел поверхности образца фиксированной ткани, тщательно Отрегулируйте положение пластиковый блок на горе микротома перед секционирование.
    8. Поместите слайд с окрашенных раздел вниз на планшетный сканер вместе с линейкой размер и проверки секции (Рисунок 4E).
    9. Определите области раздела образец ткани, встраиваемый пластик (A-e) в цифровой сканирования, используя один из методов, описанных в шаге 1.2.6 (Рисунок 4F).
    10. Рассчитайте средний внедрения связанных с ткани усадка (для соответствующих тканей и внедрения среднего) от измеряемой области соответствующего раздела профили образцов ткани до и после внедрения в пластик, встраивание среднего. Линейная усадка фактор fs рассчитывается как квадратный корень частное области раздела профили n образцов ткани после внедрения в пластик, встраивание среднего (e) и области соответствующий раздел профили же образцов ткани до встраивания в пластик, встраивание среднего (f) (рис. 4 g)14.

2. объем взвешенный систематического случайной выборки путем подсчета и обработки проб тканей для различных течению типы анализа7

  1. Подготовка материалов: правитель, суппорта, нож, ножницы, пинцет, водонепроницаемый перо, точка/крест сетки печатаются на пластиковых пленок и случайные числа таблиц.
    Примечание: Копирование шаблоны для кросс-сетки (5-60 мм) предоставляются в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7.
  2. Место ткани органов на ровную поверхность (резка база) и измерить длину (l) органа вдоль его продольной оси (Рисунок 5A, рис. 6А).
  3. Нарежьте полный органа/ткани равноотстоящих параллельных ломтиками ортогональных своей продольной оси (Рисунок 5B). Выберите расстояние d между двумя секциями (т.е., Толщина резания разделе интервал, обычно примерно 1 см) достаточно мал, чтобы получить достаточное количество срезов ткани/орган. Случайно поместите первый раздел на расстоянии между 0 и секущей интервал от края органа. Во время нарезки, визуально судите положения и ориентации каждого секущей плоскости для получения приблизительно параллельно органа/ткани из примерно одинаковой толщины плит.
    Примечание: Необходимое количество ткани/орган плит зависит от размера исследуемого органа/ткани и количество мест пробы ткани. Если малые органы или образцы секционного в тонких плит ≤5 мм, внедрить образцы в агар до секционирование (см. шаг 1.3.3.) и использовать технические устройства для нарезки агар встроенный образца. Эмпирически рекомендуется секущей интервалы для наиболее свинину органов и тканей, а также примеры для нарезки устройств указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7.
  4. Поместите все ткани органов плиты на одной поверхности вниз на базе резки (рис. 6B).
  5. Ткани плиты с соответствующего размера сетки кросс печатаются на пластиковых прозрачности, поместив внешней оверлей покинул верхний крест сетки над случайной точки из ткани (рис. 5 c-D, Figure 6B).
    Примечание: Выберите крест сетки с достаточно малое расстояние между соседними кресты, таким образом, чтобы в каждом случае рассмотрены исследования, по крайней мере в два раза больше кресты будет хит раздела поверхность ткани отсека для выборки, как количество образцов, должны быть взяты из ткани отсеке. Эмпирически рекомендуется крест сетка размеров для наиболее свинину органов и тканей, указаны в дополнительный материал «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7.
  6. Марк и рассчитывать все кресты, поражения тканей (соответственно, ткани суб отсек для выборки). Последовательно применять единый режим подсчета и нумерация крестов, поражения тканей отсек для выборки в всех тканей плиты, например, путем последовательных нумерация соответствующих крестов в каждой линии, от слева направо и сверху вниз, или, например, по нумерации кресты в одной ткани плите после другой в направлении по часовой стрелке, начиная с крестом, ближе всего к двенадцати часов позиции, как образцово продемонстрировано в Рисунок 5E.
  7. Разделите количество крестов, ударяя отсеке ткани/ткани для выборки (n) на количество выборок, создаваемого для получения интервал систематической выборки (i).
  8. Определите в первую позицию выборки, выбора случайных чисел x в промежутке между 1 и я. Для этого используйте таблицы случайных чисел. Марк на первую позицию выборки (x) и каждый следующий x + i, x + 2я, x + 3iи т.д., крест, ударяя отсеке ткани/ткани для выборки на пластиковые прозрачности с помощью водонепроницаемый пера (Рисунок 5F).
    Примечание: Случайных чисел таблицы можно быстро и удобно создавать с помощью онлайн генератор случайных чисел.
  9. Тег ткани, соответствующий отмеченного места кресты, слегка поднимая пластиковые прозрачности и размещение небольшой кусочек бумаги чистой, пустой конфетти на поверхности плиты ткани, используя пинцет (рис. 5 g, Рисунок 6E ).
  10. Акцизный образца ткани из выбранных мест (рис. 5 H, 6F рис, рис. 7A) и далее подразделять их для различных типов последующих анализов (цилиндровая рисунок, Рисунок 7а-B), как указано в Таблица 1.
  11. После выборки, пластиковой пленки с теплой водой и мылом, сухой, чистой и повторно использовать их.

3. поколение изотропной единообразные случайной (IUR) разделов и вертикальные единообразные случайной (VUR) для количественного анализа, стереологических

  1. Техника «Isector»
    1. Подготовка материалов: бритвы или правки микротомных ножей, агар, сферические литейных форм (например, литейных для пралине, которые могут быть получены от поставщиков кондитер), foldback зажимы и пинцет.
    2. Место адекватно размера кусок (1 x 1 x 1 см3) фиксированной, систематически случайно пробы ткани в сферической литья плесень, держаться вместе foldback хомутами и заполнить форму с теплой жидкой агар (рис. 8A-E).
    3. Удаление области агар (рисунке 8F) из литья плесень после отверждения агара.
    4. Ролл сфере агар с образца встроенных ткани по всей таблице, остановить и раздел в случайные позиции.
      Примечание: Результирующий секущая плоскость является раздел ЕУР (рисунке 8F-G).
    5. Перейти к вставлять образец ткани в пластиковые смолы как GMA/MMA, поддержание ориентации секции ЕУР плоскости (см. 1.3.5).
  2. Техника «Ориентатор»
    1. Подготовить материалы: бритвы или правки микротомных ножей, агар, щипцы, случайное число таблиц, печатает равноугольные и косинус взвешенный кругов.
      Примечание: В предыдущих публикаций8,26предоставляются копии шаблонов кругов.
    2. Поместите образец фиксированной ткани (или агар встроенный фиксированной ткани) на печати равноугольные круга с одним краем параллельно 0 – 180 ° направлении (рис. 9а, Рисунок 10E).
    3. Определите случайный угол с помощью случайных чисел таблицы. Найти соответствующие отметки на шкале равноугольные круга, который образца опирается на. Использование этих знаков, вырезать раздел образца (или через агар, окружающих образца встроенных ткани), с ориентируясь секущей плоскости параллельно направлению случайный угол, показано на шкале равноугольные круга и вертикально отдыхает поверхности образца (рис. 9B-C, Рисунок 10F).
    4. Поместите блок ткани с поверхностью раздела, созданного на предыдущем шаге, сталкивается с недостатком на косинус взвешенный круг с края поверхности покоя, уложены параллельно оси 1-1 (9D рисунок, Рисунок 10 H).
    5. Повторите шаг 3.2.3 и вырезать новый раздел через образец на случайный угол определяется с использованием случайных чисел таблицы (Рисунок 9E-F, рис 10I-J).
      Примечание: Результирующий секущая плоскость является раздел IUR.
    6. При необходимости, определить области ЕУР раздел профиля выборки фиксированного ткани для определения связанных с встраивание ткани усадка (Рисунок 9 g-J), как описано в шаге 1.3 и приступить к вставлять образец ткани в пластик смолы, например GMA/ММА.
  3. Генерация вертикальных единообразные случайной (VUR) секций
    1. Подготовка материалов: бритвы или правки микротомных ножей, агар, щипцы, случайных чисел таблиц и печатает равноугольные кругов.
      Примечание: В предыдущих публикаций8,26предоставляются копии шаблонов кругов.
    2. Определение вертикальной оси в образец фиксированной ткани, которая всегда узнаваемый в разделах образца на последующих этапах.
      Примечание: Как правило, оси вертикальные природные поверхности образца ткани выбирается в качестве вертикальной оси.
    3. При необходимости, внедрить образца в агар (рис. 11B).
      Примечание: Агар встраивание до VUR - или ЕУР резании фиксированной выборки обычно рекомендуется для малых, тонких, хрупких или мягких образцах. Также используйте агар встраивание образцов для облегчения позиционирования образца секционного VUR во время последующего внедрения образца в пластиковые смолы.
    4. Поместите образец на печать равноугольные круга, с вертикальной осью, ориентируясь ортогонально к плоскости таблицу таблица/бумага (Рисунок 11C).
    5. Вырезать образца на случайный угол (определяется с помощью таблицы случайных чисел) с секущей плоскости ортогонально к таблице и параллельно вертикальной оси, чтобы получить VUR секущей плоскости (рис. 11 d).
    6. При необходимости, определить области ЕУР раздел профиля выборки фиксированного ткани для определения связанных с встраивание ткани усадка, как описано в шаге 1.3 (Сравните Рисунок 9 g-J) и приступить к вставлять образец ткани в пластиковые смолы как GMA/ММА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Метод погружения для определения плотности ткани/орган

Рисунок 12А -B показывает, представитель определение плотности и объема свиные почки методом погружения, описанный в шаге 1.1 (рис. 1, рис. 2). В таблице 2представлены более представительным результаты измерений плотности дополнительных свинину органов и тканей. Более полный список ссылок плотности свинину различных тканей и органов приводится в «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7. Действительность ткани плотность измерений, полученных с помощью метода погружения может быть определена с повторных измерений из того же образца и независимых образцов. Наиболее свинину ткани отображения значений плотности, немного выше, чем воды (воды ρ ≈ 1.0), тогда как тканей, купание в солевой раствор (жировой ткани, ткани легких) отображения плотности < 1.0.

Cavalieri метод для определения объемов орган

Рисунок 12 c -F показывает представитель определение объема свиные почки (же орган как показано на рисунке 12A-B). Области раздела поверхностей плит органа были определены точки подсчета, с помощью наложенного крест сетки печатаются на пластиковых прозрачности, а также планиметрических измерения области раздела орган плит в отсканированное изображение плит (платить внимание к чрезмерной проекции тканей, расположенных позади поверхности раздела плит, Рисунок 12 G-H). Точность органа/ткани тома данных, полученных по производительности Cavalieri подхода (шаг 1.2, рис. 3) может быть оценена путем сравнения соответствующих объему рассчитано исходя из веса и плотности ткани органов. Объемы почек, рассмотрены на рисунке 12 определяется методом погружения и Кавальери метод(ы) отличались друг от друга менее чем на 1%. Как мера точности оценок объема Кавальери его коэффициент ошибки (CE) может быть рассчитана, как описано ранее15.

Определение трехмерной внедрения связанных с ткани усадки при обработке образцов ткани для гистологии

Представитель результаты степени усадки ткани, связанные с встраивание образцов свинину ткани (корковых почечной ткани) в пластиковые смолы (GMA/ММА или эпоксидной) для изучения количественных гистоморфологических приведены в таблице 2 (ранее неопубликованные данные). Линейная усадка факторов, указанных в таблице 2 были определены как описано в шаге 1.3 (рис. 4). Они относятся к уменьшению трехмерного объема 29% для встраивания GMA/ММА и 22% для эпоксидных встраивания свинину корковых почечной ткани. На рисунке 13 показано показательные примеры адекватно и недостаточно подготовленных образцов встроенных агар, формалин Исправлена жировой ткани для измерения раздел поверхности образца до внедрения пластика.

Средневзвешенная по объему систематического выборочного точки подсчета и обработки проб тканей для различных типов течению анализ

«Резания и точки подсчета» техника для средневзвешенная по объему систематического выборочного Паренхиматозный органов (шаг 2, Рисунок 5, Рисунок 6, рис. 7) представляет создана, надежный метод для генерации представителя Примеры для нескольких последующих типов анализа2,7. Представитель результаты поколения систематически случайно пробы, высоко избыточных биобанке образца различных свинину органов и тканей, с последующей разностной обработки образцов подакцизным ткани для нескольких различных вниз по течению методы анализа с использованием метода выборки, описанный в шаге 2 (Рисунок 5, Рисунок 7и образцово продемонстрировано в Рисунок 6) были ранее опубликованы2. Например, для создания биобанка образцов ткани печени в предыдущие исследования свинину биобанке2, свиной печени были полностью секционного в приблизительно 20 плит толщиной 2-3 см, накладывается с с 3 см крест сетки, как описано в шаге 2 и 16 мест ткани приблизительно 2 x 2 x 2 см3 были систематически случайно пробы и вырезан в каждом конкретном случае. От каждого из образцов подакцизным пять проб были впоследствии созданы для молекулярного анализа (замороженные при температуре-80 ° C) из выбранных мест, один подвыборки для cryohistology, один подвыборки зафиксирована в Methacarn решение и в раствор формальдегида для последующие парафин вложения и гистологической- и иммуногистохимическое исследование. Поколение 74 различных выборок на случай (до замораживания или передачи образцов в фиксации раствор) был достигнут в течение приблизительно 20 минут, в среднем2. Осуществимость/успех описанных выборки и подвыборка подход может быть оценена путем оценки качества создаваемых образцов (т.е., качество РНК - или белковых изолятов, сохранение гистоморфологических и Ультраструктурные свойства образцов тканей, их пригодность для иммуногистохимического анализа и т.д.)2

Поколение изотропной единообразные случайной (IUR) разделов и вертикальные единообразные случайной (VUR) для количественного анализа, стереологических

Методы продемонстрировали для поколения вперед ориентированный изотропной единообразные случайной (IUR) разделов и VUR от образцов ткани свинину (биобанке) (протокол шаг 3, рис, рис, рис, Рисунок 11), позволяя для рассмотрения большинства количественных параметров стереологических, быстро может быть достигнуто с некоторой практики и без разумных трудности или источники ошибок. Таким образом поколение образцов IUR, показано на рисунке 9 (isector техника) и Рисунок 10 (ориентатор техника) является полностью представительным для этих методов.

Figure 1
Рисунок 1: схематическая иллюстрация методики «погружения» для определения плотности ткани/орган. (A) измерение веса пробы (т.е., массы, м/сек). (B) масштаб тарированного веса стакан наполнен 0,9% физиологического раствора 20 ° C и держатель образца, погруженной в Салине определенного, отмеченные позиции. (C) полное погружение образца заметное положение держателя образца без каких-либо контактов внутренние стены или в нижней части стакан. Вес, отображаются на баланс является вес объема физраствора, перемещенных в образце). Плотность образца вычисляется как указано (здесь: Пример ρ = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 г/см³). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: «Погружение техника» для определения плотности ткани/орган. (A) различные держатели изготовлены из тонкой проволоки. Слева направо: цикл тонкий провод нить через тонкий инъекции канюля, винтовой корзину провод держать мелкие и хрупкие образцов и простой ремень тонкой проволоки. Стрелки в A-C указывают должности, к которым держатели образца погружался в солевой раствор. (B, C) Позиционирование держателя образца во время погружения образца в солевой раствор (Сравните Рисунок 1 C). (B) полное свиного гипофиза помещается в держатель, корзина образный образца. (C) образец свинину миокарда. Обратите внимание полное погружение образцов в солевой раствор без связаться стены или в нижней части стакан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схематическая иллюстрация применения метода Cavalieri для определения объемов свинину орган. (A) монета стека пример для понимания принципа Cavalieri. Подробнее смотрите Введение. (B-H) Схематические демонстрация оценки объема фиксированной перфузии почек. (B) измерение длины (l) почки вдоль его продольной оси. (C) резки полный органа в n одинаково толстый (d) параллельно ломтики ортогональные оси продольной орган. (D) орган плит помещены на одной поверхности вниз. Обратите внимание, что первая плита (справа) ткани помещается на ее природные поверхности, то есть, не имеют поверхность раздела. (E-H) Различные подходы для определения площади поверхности раздела плит ткани. (E) отслеживание наброски каждый орган плиты водонепроницаемый ручкой на пластиковых прозрачность наложения указывается орган плиты профилей с соответствующего размера, калиброванные крест сетки печатаются на пластиковых прозрачности, подсчет пересекает удара профиль области. Области раздела профиля орган плиты рассчитывается количество крестов, ударяя раздел профиля и в области, соответствует один крест. (F,G) Определение областей раздела органа плит в фото изображений, снятых в вертикальной ориентации на поверхности раздела (F), или отсканированные изображения тканей плит (G), с линейки для калибровки. Определение (H) раздела областей ткани плит в цифровых изображений фотографий/сканирования с помощью соответствующих морфометрия программных приложений. (я) расчет объема сметных органа как продукт накопительного площадь соответствующего раздела поверхностей всех плит орган, умноженное на средняя толщина органа плиты15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: схематическая иллюстрация определение трехмерной внедрения связанных с ткани усадки при обработке образцов ткани для гистологии. (A) резка раздел свежий, плоскости поверхности от образец фиксированной ткани (стабилизация формы легкодеформируемые (мягкие) тканей, таких как жировой или легких тканей путем внедрения в агар до секционирование). Сканирование поверхности образца вместе с линейкой размер секции. (B) планиметрических определение области раздела поверхности образца фиксированной ткани (f). (C) режим Встраивание в пластик, встраивание среднего образца. (D) подготовка гистологическое части пластиковый блок с сохранением плоскости сечения образца. Монтаж секции на стеклянное скольжение и рутинной пятнать слайда. (E) сканирование слайда вместе с линейкой размер. (F) планиметрических определение области раздела встраиваемый пластик образца (e). (G) расчет степени усадки встраивания связанных ткани как частное измеряемой области соответствующего раздела профили образцов ткани до и после внедрения в пластик, встраивание средние14. На правой стороне снимках поверхности раздела формальдегида Исправлена выборки из жировой ткани, встроенных в почерневший чернила агар до встраивания в пластиковые смолы (вверху) и соответствующий раздел профиль (он окрашивание) GMA/ММА встроенный образца (внизу). Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: схематическая иллюстрация средневзвешенная по объему систематического выборочного. Представленный пример систематического случайной выборки из шести местах ткани внутри почечной коре почки перфузии исправлена. (A) измерение длины (l) почки вдоль его продольной оси. (B) Полное секционирование всего органа ломтиками одинаково толстый (d) параллельных ортогональные оси продольной орган. (C) органа/ткани плит размещены на том же (то есть, либо справа или слева) контактами вниз. (D) наложение ткани плит с соответствующего размера крест сетки печатаются на пластиковых прозрачности. Крайнюю слева верхний крест сетки помещается над случайной точки вне ткани (обозначается синей точкой, ). (E) учет и нумерация всех крестов, поражения почечной коры. В настоящем примере кресты, поражения почечной коры нумеруются последовательно в одной почки плите после другой (слева направо), в каждой плиты разбирательства в направлении по часовой стрелке, начиная с крестом, ближе к 12 часов позиции. Здесь 36 кресты ударил почечной коры. Шесть позиций выборки должны отбираться. Таким образом, каждый шестой позиции, где крест показов ткани пробы (36/6 = 6). (F) в настоящем примере положение четвертый крест (N ° 4) поражения почечной коры случайно выбрана в качестве первой позиции выборки. Каждый следующий шестой крест, ударяя маркированы почечной коры на пластиковые прозрачности с помощью водонепроницаемый пера. В настоящем примере это позиции 4, 10, 16, 22, 28 и 34. (G) меток соответствующих местах ткани на маленькие кусочки бумаги чистой, пустой конфетти, расположенных на поверхности ткани. (H) иссечение образцов ткани из случайно систематически отобранных мест и последующей обработкой для дальнейшего анализа. Этот рисунок был изменен из Albl et al. (2016), фигуры S236 и S237, страницы 186 (добавки)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: объем взвешенный систематического выборочного почечной коры свиные почки (см. рис. 5) и правила для подсчета точки. (A) свежие свиные почки. (B) почек секционного ломтиками одинаково толстый параллельных ортогональные оси продольной орган, обложил с крестом сетки печатаются на пластиковых прозрачности. Красный круг указывает положение случайные точки, используется в случайном порядке положение крест сетки. Иллюстрация (C) правил подсчета точки: cross/point считается как поражения тканей отсек для пробы (ссылка отсека), если правом верхнем внутренний угол вертикального и перекладина Креста (стрелка) охватывает ткани. (D) маркировка крестов, поражения почечной коры и систематической выборки участков ткани (здесь, 119 кресты ударил почечной коры и 17 местах систематически произвольно отбираются с помощью выборки интервал я = 7). (E) случайно систематически отобранных местах почечной коры, помеченный бумаги конфетти. (F) вырезан образцы. (G) дальнейшее подразделение подакцизным образцов для последующей обработки проб для различных течению анализ типов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: подразделение образцов ткани иссечена от систематически расположение случайно пробы ткани и обработки проб для различных течению анализ типов. (A) схематическая иллюстрация поколения проб тканей из одного систематически случайно выбранные местоположения почечной коры (родной ткани) для различных анализов (например, FF-PE: Формалин исправлена, парафин врезанных образца и MTC-PE: Methacarn исправлена, парафин врезанных образец для света микроскопические гистология; КРИО: Образец для гистологии замороженной секции; -80 ° C: сухой лед замороженных образцов ткани для молекулярного анализа). (B) иссечение систематически случайно отобранных местах почечной коре фиксированной перфузии почек, дальнейшее подразделение образцов подакцизным ткани и обработки проб для качественного и количественного морфологического анализа. Плиты перфузии Исправлена свиные почки (1), кросс сетки (2), случайных чисел таблицы (3), равноугольные и весил косинус круги (4) для генерации IUR разделов (см. рис. 9, рис. 10), фиксации различных решений (5, 6, 7) и пример контейнер для электрона микроскопических образцов (8). Этот показатель был изменен с Albl и др. (2016), рисунок S239, 186 (добавки)7стр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: «Isector» раздел подготовки от формалин Исправлена свинину ткани. (A) образец перфузии Исправлена свинину почечной коры. (B) сферической литейных форм. (C) жидкие агар. (D-E) Агар встраивание образцов в сферических литейных форм. (F) агар шар с образца встроенных ткани. (G) агар шар с встроенных ткани секционного в случайные позиции (IUR секущей плоскости). Этот показатель был изменен с Albl и др. (2016), рисунок S6, стр 14 (добавки)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: схематическая иллюстрация «Ориентатор» техника для подготовки разделов IUR. (A) представленном(ых) фиксированных тканей уложены на равноугольные круг (ci1) с краю параллельно 0 – 180 ° держателя (красная линия). (B) Sectioning образца на случайный угол (зеленая линия). (B, C) Вновь созданный раздел поверхности образца ткани (показано зеленым цветом). (D) образца сделан на косинус весил круг (ci2) с поверхностью секционные, созданный на предыдущем шаге, сталкиваются с недостатком и один край покоя поверхности, параллельной оси 1-1 (обозначен красной линией). (E) резка второй секции через образец на случайный угол. (F) результирующий случайно изотропной раздел плоскость образца (указано в синий цвет). (G) определение области раздела ЕУР фиксированной ткани выборки для оценки связанных с встраивание ткани усадки, как описано в шаге 1.3. (H) встраивание образца ткани в пластиковые смолы. (я) — Sectioning пластиковый блок секционного (параллельно плоскости IUR) на микротома. (J) монтаж ЕУР пластик-секций на стеклянных вставках. Этот показатель был изменен с Albl и др. (2016), рисунок S8, стр 15 (добавки)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10: «Ориентатор» техника для подготовки разделов IUR образцов агар врезанных тканей. (A-D) При необходимости, один может агар вставлять систематически случайно отобранных образцов фиксированной ткани (агар внедрение полезно для образцов небольших ткани, так что первый или обоих случайных разделы могут быть расположены в пределах агар без резки ткани). (E) позиционирование блока агар на равноугольные круг (ci1) с краю параллельно 1-1 держателя (красная линия). (F, G) Секционирование блока на случайный угол (здесь: 15-15, зеленая линия) определяется с помощью таблицы случайных чисел (РНТ, зеленая стрелка). (H) последующие позиционирование блока агар на поверхности раздела, нарезанные F с косинус взвешенный круг (ci2) с краем покоя поверхности уложены параллельно 1-1 держателя (красная линия). (I) во втором разделе прорезать образца на случайный угол (здесь: 20-20, обозначается синей линией), определяется с помощью таблицы случайных чисел (РНТ, синяя стрелка). (J) результирующий IUR раздел плоскость образца ткани. Этот показатель был изменен с Albl и др. (2016), выяснить S9, стр 16 (добавки)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11: схематическая иллюстрация VUR секции подготовки. (A) образец фиксированной ткани с определенным (идентифицировать) вертикальной оси (например, вертикальные природные поверхности). Образец фиксированной ткани (B) встроенный в Агаре. (C) позиционирование образца ткани the(agar-embedded) на печать равноугольные круга (ci1). VA: вертикальной оси. (D) Sectioning образца на случайный угол (случайных чисел таблицы; здесь: направление 30-30, обозначается синей линией) с секущей плоскости ортогонально ориентируясь на таблицу и параллельно вертикальной оси образца. Результате VUR плоскость сечения образца ткани (указано в синий цвет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 12
Рисунок 12: представитель volumetry свиные почки. (A-B) Метод погружения. (A) определение веса почек (ммалыш). (B) определение веса объем физиологического раствора, перемещенных в результате почек (displ.salineм). Почки висела на веревочке и полностью погруженной в солевой раствор не касаясь дна или стены стакан. Расчетный объем почки-92.6 см³. (C-D) Cavalieri техника, планиметрия точка-подсчитывая. (C) измерение длины (l) почки вдоль его продольной оси. (D) определение областей профиль раздела почки плит к моменту подсчета после наложения сетки равноудаленных крестов печатаются на пластиковых прозрачности. Расчетный объем почки вот 93,3 см³. (E-F) Cavalieri техника, планиметрия отсканированных изображений раздела профиль областей почек плит (F). Расчетный объем почки вот 92,8 см³. В C-E, природные круглые поверхности первого или последнего плиты почки на сканере или покрыт крест сетки прозрачности не поверхность раздела и таким образом, не площадь поверхности раздела измеряется в этой ткани плиты. (G-H) Демонстрация overprojection в отсканированных изображений органа/ткани плит (G) и плит органа/ткани, обложил с крест сетки прозрачности (H). Overprojecting частей ткани органа плит обозначаются пунктир белые и черные линии. Определяются только области фактического раздела профили (например, ткани, окруженный частично указанных белой пунктирной линией). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 13
Рисунок 13: представитель иллюстрации адекватных (A) и неоптимальной (B) подготовка образцов агар врезанных тканей для определения усадки ткани, относящиеся к встраивание образцов в гистологической пластик, встраивание СМИ. (A) отсканированные изображения поверхности раздела фиксированной выборки свинину подкожной жировой клетчатки до внедрения в пластиковые смолы. Образец встроен в почерневший чернила агар для стабилизации формы образца и четкое определение контуров поверхности раздела. (B) невнятный план секции поверхности и зависшие воздушный пузырь (стрелка) в пределах агар. Масштаб баров = 5 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Анализ Пример Обработка
Тип Методы
Молекулярный анализ Стенограмма РНК, белков, метаболит и профилирование липидов,
Метаболомика анализ, анализ ДНК
Небольшие кусочки * свежие ткани (родной) Замораживание на сухой лед или жидкий азот. Хранить при температуре-80 ° C.
Качественные морфологического анализа Гистология
[световой микроскопии, включая иммуногистохимия (IHC) и в гибридизации situ]
Свежий (родной) — или в situ - Исправлена * образцы тканей Использовать различные фиксаторы (например, 4% раствора формальдегида) и внедрение средств массовой информации (парафин, GMA/MMA, эпоксидные), при необходимости.
Cryohistology
(Замороженные разделы, включая ИГХ)
Образцы тканей свежие (родной) Внедрить образца в блокировки среднего и заморозить в жидкий азот охлажденный изопентана.
Ультраструктурные анализ
[Электронная микроскопия, включая передачи-(ТЕА) и растровая электронная микроскопия]
Мелкие кусочки свежих (родной) — или в situ- Исправлена * образцы тканей Исправить образца в 2,5 – 6,25% глютаральдегид решения и внедрить в пластиковые смолы эпоксидные.
Количественные морфологического анализа Световой микроскопии Свежий (родной) - или на месте - Исправлена * образцы тканей Подготовьте IUR-секций (ориентатор-, isector секции) и/или VUR-разделы образцов пластиковых встроенных ткани.
ТЕА Мелкие кусочки свежих (родной) — или в situ - Исправлена * ткани Подготовьте IUR (ориентатор-, isector разделы) разделы образцов эпоксидно врезанных тканей.

Таблица 1: обработка проб тканей, вырезан из систематически случайно отобранных мест для различных течению анализ типов. В зависимости от экспериментальный дизайн исследования и органа/ткани под следствием различное количество проб следует иссечена от каждого местоположения систематически случайно пробы ткани и обрабатываются для различных типов течению анализов. В «Ткани выборки направляющие для свинину биомедицинской модели»7предоставляются подробные протоколы для наиболее свинину органов/тканей и типы изучения. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/метилметакрилатом. ЕУР: Изотропного форма случайных. VUR: Вертикальная форма случайных. * Макс. 2 x 2 x 2 мм3. например, фиксированный перфузии тканей или легочной ткани легких, привили раствором закрепления.

Метод Представитель результаты
Метод погружения для определения плотности ткани/орган (шаг 1.1, рис. 1, рис. 2) Свинину органа/ткани Ρ (г/см³)
Печень 1,071 ± 0,007
Поджелудочная железа 1,062 ± 0,016
Желудочка миокарда 1.036 ± 0.014
Почка 1,044 ± 0,006
Брюшной висцеральных жировой ткани * 0,921 ± 0,032
Щитовидная железа 1.061 ± 0,007
Мозг 1.051 ± 0,007
Надпочечники 1,063 ± 0,025
Скелетных мышц ** 1,074 ± 0,003
Данные являются средства ± SD. конкретного органа/ткани веса были определены в n = 18 свиней (14 женщин и 4 мужчин свиньи; возраст 60 дней до 2 лет; 30 – 250 кг массы тела). * Жировой ткани из брыжейка тощей кишки. ** Значения для м. longissimus dorsi, cranialis м. tibialis, м. трицепсы brachii и м. gluteobiceps.
Определение трехмерной внедрения связанных с ткани усадки при обработке образцов ткани для гистологии (шаг 1.3, рис. 4) Органа/ткани Встраивание среднего       fS
Почечной коры (свиньи) GMA/MMA 0,89 ± 0,02
Эпоксидной смолы 0.92 ± 0,02
Данные являются ± SD средства измерений образцов 24 12 свиней. fS: линейная усадка поправочный коэффициент.

Таблица 2: Представитель результаты плотность отдельных органов и тканей свинину7, и линейная усадка поправочные коэффициенты для внедрения связанных с ткани усадка свинину корковых почечной ткани в различных пластиковых вложения средств массовой информации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поколения биобанке образца коллекций из свиных животных моделей требуются надежные методы и протоколы для определения объемов органа/ткани, воспроизводимые поколения представителя, подходит для широкого круга образцов избыточной ткани анализ различных методов и для рандомизации ориентации образца секций для количественного анализа, стереологических. Методы, описанные в настоящей статье, адаптированы к размерам свинину органов и тканей и были разработаны для эффективного удовлетворения этих потребностей2,7. Они основаны на признанных методологических принципов и ранее доказали свою целесообразность в различных опубликованных исследований2,7,12,21. Рекомендуемые методы имеют важное значение для различных видов исследований, изучения образцов ткани/орган, поскольку они обеспечивают основу для создания репрезентативных выборок и для приобретения различных параметров, которые в противном случае не может быть определено. Эти методы могут быть выполнены быстро с минимальными усилиями и совместимы с практически все виды анализов вниз по течению. Таким образом они считаются подходит не только для проектов биобанке свинину животных моделей, но также полезны в исследованиях, связанных с количественным гистоморфологических анализ образцов тканей других видов крупных животных моделей (например, овец), как также как и ветеринария. Принимая во внимание технические аспекты различных методов, несколько критических шагов и ограничения должны быть рассмотрены в ходе осуществления протоколов соответствующих методов.

Метод погружения для определения плотности ткани/орган

При определении плотности, с помощью метода погружения (шаг 1.1, рис. 1, рис. 2), ухода должны быть приняты не коснуться внутренние стены или в нижней части стакан с образца ткани или держателя образца а ткани ткани — образец Погруженный в солевой раствор. В противном случае масштаб будет отображаться вес образца, а не вес объем физиологического раствора, перемещенных в образце. Для образцов очень малых и легких тканей (несколько мг) ограничена метод погружения для определения плотности ткани, из-за surface tension солевой раствор и отрицательно высокий фактор объема выборки на объем жидкости погружения в стакан, который является препятствующие точность измерения. Здесь вес образца могут быть использованы для дальнейших вычислений вместо плотность вычисляется объем. Определение плотности ткани погружение также не является эффективным для свежих (незафиксированная) легочной ткани, из-за несовместимых содержание воздуха в ткани и в некоторых случаях, где органы, экспериментально увлажненную/внушали с фиксаторов.

Cavalieri метод для определения объемов орган

Метод volumetry Cavalieri свинину органов и тканей является более громоздким, по сравнению с определения объема орган органа вес и плотность. Однако это подходит для органов, которые надлежащим образом не могут быть весил благодаря их экспериментальной обработке (например, фиксированные перфузии органов или легкие, привили раствором закрепления). Здесь метод volumetry Cavalieri идеально может сочетаться с средневзвешенная по объему систематического выборочного техника, описанный в шаге 2 (Рисунок 5, Рисунок 6, рис. 12). В ходе оценки объема ткани органов из областей раздела профили параллельных, равноотстоящих кусочков ткани органов (Кавальери подход, шаг 1.2, рис. 3) поддержание ориентации ткани слябов (верхней и нижней секущей плоскости ), а также точного определения области все секции профили имеют большое значение. Особенно если цифровые фотографии или Сканы орган плит анализируются planimetrically, overprojections ткани (за пределами плоскости секционного ткани) ткани плиты (Рисунок 12G-H) должны тщательно рассматриваться для обеспечения надежной тома оценки.

Определение трехмерной внедрения связанных с ткани усадки при обработке образцов ткани для гистологии

Степень усадки встраивания связанных ткани зависит от внедрения среды и типа ткани и также могут варьироваться между дифференциально обработанные образцы же ткани.

Тогда как замороженные разделы считаются для отображения практически нет усадки в плоскости X-Y, и пластиковые встраивание обычно вызывает мало усадки ткани, усадка ткани, внедрение связанных с особенно большой в образцах парафин врезанных тканей и обычно значительно ухудшить количественных морфологического анализа размерных параметров в гистологических срезах этих образцов. В дополнение к значительной степени общей трехмерной усадка парафин встраивание также вызывает неоднородной, дифференциального, анизотропные и переменной усадка образца и различных анатомических структур, типы тканей и типов клеток в пределах ткани образца8,13. Кроме того особенно в толще в гистологических срезах образцов парафин врезанных тканей, степень усадки ткани могут также значительно различаются в X-Y и Z-направлении секции. Это может быть вызвано дифференциальные усадка области раздела (в направлении Y-X) и высоту секции (то есть, толщина разрез) во время растяжения секции в теплой ткани флотации водяной бане, после того, как Секция вырезать из ткани заблокировать и во время последующей обработки, окрашивание и coverslipping процедур секции установлен на стекло слайд (то есть, однородных свернуть разделы по оси z)8. Кроме того, в толстые секции, может быть соответствующе сильнее сжатие раздела самолет вблизи ткани регионов в рамках раздела в то время как Секция вырезать из ткани блока (что приводит к дифференциальной деформации разделы по оси z)19 . Эти эффекты могут также исказить оценки количество тканевых структур в рамках секции собственный количественный анализ стереологических методами, например оптических disector. Таким образом прогнозирования, мониторинга и коррекции усадки встраивания связанных ткани не является осуществимым для парафин врезанных тканей образцы8.

В отличие от степени объем усадка образцов ткани, встроенных в пластиковые смолы, например GMA/ММА или эпоксидной, является значительно ниже и, главное, становится более единообразным. Таким образом вложения в пластиковые смолы с предполагаемой однородной, изотропное и глобальные усадка ткани выгодно для нескольких методов анализа различных количественных морфологических параметров17,18. Во время оценки усадка ткани, связанные с внедрения в пластиковые смолы форма фиксированной ткани следует не дополнительно быть искажено во время внедрения процедуры, чтобы позволить для сравнения соответствующего раздела профиля областей фиксированной и встроенных образцы. Это может быть трудно в образцах тканей мягкий или легко сжимаемой например легких или жировой ткани, или в образцах тканей с высоким содержанием жидкости. Здесь, встраивание фиксированной выборки в агар до разрезания ткани полезно для стабилизации форму образца ткани во время последующих пластика, внедрение процедуры (протокол шаг 1.3., Рисунок 4). Для достижения надежных данных, должны выполняться повторные измерения усадки внедрения связанных с тканей, с использованием различных образцов же ткани. Степень усадки встраивания связанных ткани выражается в виде линейной ткани усадка фактор fs (протокол шаг 1.3.9., Рисунок 4 g). Приводятся примеры для уравнений с использованием fs для коррекции усадки различных длина, площадь поверхности и объем параметров различных тканевых структур в нескольких количественных исследований стереологических14, 21,27.

Средневзвешенная по объему систематической выборки путем подсчета и обработки проб тканей для различных течению анализ типов

Представленные средневзвешенная по объему выборки техника для свиных органов определяет места случайной выборки в ткани один раз и впоследствии создает все необходимые образцы для дальнейших различных анализов, подвыборка из образцов тканей, вырезан из Эти места7. Средневзвешенная по объему систематического выборочного режимов, каждое место возможной выборки в пределах общего объема ткани органов на рассмотрении имеет точно тот же случайных шанс отведать, и обобщения обеспечивается коллекции достаточное количество образцов. Поэтому, используя взвешенный объем систематической выборки образцов для поколения образцов от Паренхиматозный органов, эффективно предотвращает результаты анализа возможно пристрастный (потенциально неожиданные и непризнанных) неравного распределения различных ткани функциональные и Морфологические свойства в различных местах органа, которые были продемонстрированы, например, средний объем и численные объемная плотность свинину гепатоцитов в различных регионах паренхимы печени28 . Рекомендуемые «обжимной ткани и подвыборка» стратегия свинину органов легко понятным, соответствует техническим требованиям течению анализ методов и можно быстро осуществляется и адаптированы к требованиям конкретного исследования, тем самым избегая систематическая выборка предубеждения, сокращение экспериментальной изменчивости и увеличение точности общая эксперимента, будучи более эффективным, чем выборки стратегии, в которых каждый одной выборки местоположение определяется случайным образом9 ,15. Количество образцов, которые должны быть созданы, очевидно зависит от исследуемого параметра и его изменчивости в пределах образцов из разных мест пробы органа/ткани. Для создания биобанка образца коллекций, предназначенных для проведения экспертизы максимум различных параметров (не указан во время выборки) целый ряд различных аналитических методов такая стратегия перспективного выборки обычно графиков поколение относительно большое число избыточных выборок на ткани органов.

Поколение изотропной единообразные случайной (IUR) разделов и вертикальные единообразные случайной (VUR) для количественного анализа, стереологических

Некоторые из методов, используемых для генерации ЕУР и VUR секций для количественных стереологических анализы несколько сложных теоретических основ, и пояснения, поэтому часто избегают (излишне) многими учеными, хотя их практического Реализация достаточно проста. VUR разделы являются особенно легко генерировать и являются оптимальными для оценки плотности/площадь поверхности в сочетании с циклоиды тест систем8,9,20. Они часто являются предпочтительным из-за знакомые ориентацию плоскости сечения. Однако в отличие от IUR секции, секции VUR не подходят для оценки параметры длины8,9.

Во время подготовки ЕУР и VUR секций, важнейшим шагом является, в основном, для сохранения поверхности раздела ЕУР или VUR фиксированной выборки во время внедрения в пластиковые смолы и обеспечить, что вертикальной оси VUR разделы всегда могут быть определены (шаг 3, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11).

В будущем широкое применение описанных выше методов может существенно способствовать создать последовательно высоких стандартов качества для поколения сопоставимых, многоцелевой биобанке образцов из свинины и других крупных животных моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Лиза Pichl за отличную техническую помощь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics