Prøvetaking strategier og behandling av Biobank fra svin biomedisinsk modeller

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Praktisk programmet og gjennomførelse av metoder for generering av representant av svin dyremodeller for et bredt spekter av nedstrøms analyser i biobank prosjekter er vist, inkludert volumetry, systematisk stikkprøvekontroll, og differensial behandling av vevsprøver for kvalitativ og kvantitativ morfologiske og molekylære analyser typer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I medisinsk translasjonsforskning, har svin modeller stadig blitt mer populært. Vurderer den høye verdien av enkelte dyr, spesielt av genmodifiserte gris modeller, og ofte begrenset antall tilgjengelige dyr disse modellene, etablering av (biobank) samlinger av tilstrekkelig behandlet egnet for en bredt spekter av påfølgende analyser metoder, inkludert analyser ikke angitt på tidspunkt for prøvetaking, representerer meningsfull tilnærminger til å dra full nytte av translasjonsforskning verdien av modellen. Med hensyn til peculiarities av svin anatomi, er omfattende retningslinjer nylig etablert for standardisert generasjon av representant, høy kvalitet prøver fra ulike svin organer og vev. Disse retningslinjene er avgjørende forutsetninger for reproduserbarhet resultater og sammenlignbarheten mellom forskjellige studier og etterforskere. Innspillingen av grunnleggende data, for eksempel orgel vekter og volumer, fastsettelse av prøvetaking plasseringer og antall vevsprøver genereres, samt deres retning, størrelse, behandling og trimming retninger, er relevante faktorer avgjøre generalizability og brukervennlighet av prøven for molekylær, kvalitativ og kvantitativ morfologiske analyser. Her, en illustrasjon, praktisk, trinnvis demonstrasjon av de viktigste teknikkene for generering av representant, multi-purpose biobank prøven fra svin vev er presentert. Metodene som er beskrevet her inkluderer fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter, anvendelse av en volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll prosedyre for parenchymal organer av punkt-telling, bestemmelse av omfanget av vev krymping relatert til histologiske innebygging av eksempler og generering av tilfeldig orientert prøver for kvantitative stereological analyser, for eksempel isotropic uniform tilfeldig (IUR)-inndelinger generert av "Orientator" og "Isector", og loddrette uniform tilfeldig (VUR) deler.

Introduction

I translasjonsforskning medisin, griser er stadig mer vanlig for bruk som stor dyr modeller1,2,3,4,5, på grunn av flere fordelaktig likheter mellom den svin og Human anatomi og fysiologi, og tilgjengeligheten av etablerte molekylærbiologiske metoder tillater generering av skreddersydd, genmodifiserte gris modeller for en rekke sykdom forhold1,4.

Men er sammenlignet med gnager modeller, antall dyr av respektive gris modell som kan brukes i eksperimenter helst begrenset. Dette skyldes svin generasjon intervallet av ca ett år, og de finansielle og tidkrevende arbeid kreves for generasjonen av svin modeller og husdyrhold. Derfor er enkelte dyr porcine modell, i tillegg til prøvene som kan genereres fra disse griser, svært verdifulle, særlig hvis genmodifiserte svin modeller og/eller langsiktig eksperimentelle spørsmål (f.eks, sent komplikasjoner av kroniske sykdommer) undersøkt i alderen enkeltpersoner2,6,7.

I en studie, ytelse av flere analyser som ikke hadde planlagt i første eksperimentell design av studien kan senere viser seg for å være relevant, f.eksadresse forskjellige spørsmål som oppstår fra tidligere oppdaget uventede funn. Hvis egnet prøver for slike ekstra eksperimenter ikke er tilgjengelig, kan det hende uforholdsmessig høy pris og tidkrevende utgifter nødvendig å generere flere griser og vevsprøver. For å være forberedt for Slike eventualiteter, generasjon av biobank bevarte sikkerhetskopiere prøver av ulike organer og vev bio-væsker, kvalitativt og kvantitativt egnet for en rekke etterfølgende analyser, er ansett som en viktig nærme2,6,7. Avledet optimal fordeler fra en svin dyremodell, anvendeligheten av adekvat biobank prøver tilbyr også unike muligheten til å utføre et bredt spekter av forskjellige analyseteknologi på identiske utvalg materialer på flere organ nivå i den samme enkelte dyr, f.eksav distribusjon å forskere av ulike arbeidsgrupper organisert i en forskning nettverk2,6,7. I tillegg bidrar '' fremtidsrettede '' prøvetaking strategien i biobanking også til en reduksjon i antall dyr nødvendig i en studie. Fordelene med porcine modell biobanking er nylig blitt demonstrert i en multi organ, multiomics Studien undersøker orgel cross-talk i genmodifiserte porcine modell for langsiktige diabetes mellitus, med prøver fra München MIDY gris Biobank 2.

Det er noen obligatorisk krav biobank prøver må vanligvis overholde for å etablere pålitelighet og interpretability av resultatene av de senere utføres analysene. Prøvene må genereres reproduserbar, og de må representant, dvstilstrekkelig reflekterer interessert morfologiske og molekylære funksjonene i vev/orgel prøvene er tatt fra7. For å være egnet for en rekke nedstrøms analysetyper, må prøvene være tatt i tilstrekkelige mengder og bearbeidet etter kravene (inkludert tid og temperatur) av forskjellige analytiske metoder, inkludert beskrivende histopathological analyser, som cryohistology, parafin og plast histology, immunohistochemistry, i situ hybridisering, ultrastructural elektron mikroskopiske analyser og kliniske laboratoriet diagnostiske analyser, så vel som molekylær analyser av DNA, RNA, proteiner og metabolitter.

Som tillater for vurdering av en rekke forskjellige kvantitative morfologiske parametere som tall, volum, lengde eller flater av ulike vev strukturer av kvantitative stereological analyser, randomisert delen fly av den histologiske prøver av respektive organer/vev må være forberedt7,8,9,10,11. Kvantitativ morfologiske studier, nøyaktig bestemmelse av det totale volumet av vev, orgel eller orgel kupeen, prøvene var tatt fra (i.e.referanse plass) er avgjørende viktig7,9 , 12 for å beregne den absolutte mengder parameterne interessert i de respektive orgel, vev eller organisme. Til slutt, har effekten av bygge-relatert vev krymping av histologiske deler bestemt og tatt konto13. Derfor er kvantitative stereological analyser, spesielt med arkiverte prøver (fast vevsprøver, innebygde vev blokker, histologiske deler, etc.) fra tidligere studier sterkt begrenset eller umulig12, spesielt hvis volumetry av respektive organer/vev ikke ble utført, hvis ingen tilstrekkelig utvalg design ble brukt til å rettferdiggjøre representative utvalg, hvis tallene og mengder av tilgjengelige personlige prøver er ikke nok, eller hvis behandlingen av den Eksempler er inkompatibel med estimering av parameteren(e) kvantitative morfologiske rundt. De mange mulige påvirker faktorene hensiktsmessigheten av arkiv utvalg materiale for analyser av forskjellige kvantitative morfologiske parametere kan ikke utvetydig besvares, men avhenger nøye vurdering av hvert enkelt tilfelle.

Dermed som plasseringen, størrelsen, antall, behandling, trimming retning og orientering av prøvene vil påvirke resultatene av påfølgende analysene, disse faktorene er av stor betydning og må vurderes i eksperimentell design av noen studier. Disse aspektene og de spesielle funksjonene i den svin anatomien, omfattende, detaljert, omfattende utvalg retningslinjer tilpasset svin dyremodeller har nylig blitt opprettet, gir en robust referanse til standardisert, reproduserbare , og effektiv generasjon av overflødig, tilstrekkelig behandlet, høy kvalitet prøver fra mer enn 50 forskjellige svin organer og vev6,7.

Metodologiske beskrivelsene og videodemonstrasjon vises i denne artikkel gir detaljert, illustrasjon, forståelig, steg-for trinnvise instruksjoner for praktisk ytelse av en rekke teknikker for volumetry, prøvetaking av svin vev og organer og behandling av vevsprøver for nedstrøms analyse metoder. Utvalgte teknikkene omfatter metoder for fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter basert på prinsippene om Arkimedes og Cavalieri9, herunder fastsettelse av dimensjonene for tredimensjonale krymping av vev gjelder de innebygging i forskjellige innebygging media14 under behandlingen for histologiske eksamen, anvendelse av praktisk volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg tilnærminger, behandling av samplet vevsprøver for ulike etterfølgende analyser7,8,9,15, og generasjon riktig orientert og behandlet prøver for potensielle kvantitative stereological analyser7,8, 9,10,11. Ved sin søknad i svin biobank prosjekter er demonstrerte metodene generelt passende for alle studier undersøke kvantitative histo-morfologiske egenskaper av organer/vev. Videre er systematisk stikkprøvekontroll design spesielt nyttige for generering av representative utvalg eksperimenter bruker molekylær analyseteknologi for å oppdage overflod endringer av f.eks, RNAs, proteiner og metabolitter i ulike organer og vev.

De neste avsnittene gir en kort introduksjon til disse metodene, mens praktiske resultatene er beskrevet i delen protokollen.

Fastsettelse av orgel/vev volumer
Fastsettelse av orgel vekter og volumer er viktig i flere eksperimentelle innstillinger, som disse faktorene kan bety endringer, potensielt eksperimentelt undersøkt faktorer av interesse. Det totale volumet av en orgel/vev er også ofte nødvendig å beregne absolutt kvantitative parametere, (f.eks, hvor total-celle) fra stereologically beregnede numeriske volum tettheter (dvs., antall celler per Volumenhet av vev)7,12. Bortsett fra teknikker bruker komplekse tekniske utstyr, slik som konstatere, det er i utgangspunktet tre praktiske metoder som vanligvis brukes til å bestemme den absolutte mengden et organ eller vev. Volumet av et organ kan bestemmes av "direkte volumetriske measurement" i henhold til prinsippet om Arkimedes, dvs, måle volumet av vann eller saltløsning fortrengt av strukturen når helt neddykket. Men for relativt store svin organer er disse tilnærmingene upraktisk og utsatt for upresisjonsverdier, siden de krever stor volumetriske/måle flasker. Mer praktisk, volumet av en orgel/vev kan beregnes fra sin vekt og tetthet7,12,16, som kan effektivt bestemmes ved hjelp av "neddykking metoden"7,12 ,16 (protokollen trinn 1.1.). Orgel/vev volumer kan også estimeres ved hjelp av volumetry tilnærminger basert på "prinsippet om Cavalieri" (1598-1647). Enkelt sagt, Cavalieri prinsippet sier, at hvis to objekter er delt i fly parallelt med et grunnplan og profiler av delene skjære gjennom to objekter på tilsvarende avstand til på grunnplan har de samme områdene, to objekter har samme volum. Dermed kan volumet av vilkårlig formet objekter anslås som produktet av deres delen profil områder i parallell, like fjernt delen fly og avstanden mellom avsnittet flyene. Dette er forståelig med følgende analogien: Tenk to stabler bestående av samme antall identiske mynter er plassert side ved side, en stabel med mynter ryddig stablet oppå hverandre gir sylinderform mynt stabelen, og den andre stabel med mynter med midtstilt plassert mynter (figur 3A). Selv om formen på begge mynt stabler er forskjellige, volumene er den samme, siden områdene mynter på tilsvarende nivåer av begge stabler (i.e.områdene profiler av parallelle skjære gjennom begge mynt stabler i samme avstand fra den bakken) er identiske. Estimering av volum av svin organer og vev bruker Cavalieri prinsipp7,12,15 er beskrevet i trinn 1.2.

Fastsettelse av omfanget av vev krymping knyttet til histologiske innebygging
Analyser av flere kvantitative morfologiske parametere målt i histologiske vev deler, har effekten av bygge-relatert vev krymping forekommer under vev behandling for histology bestemt og tatt hensyn til. Omfanget av bygge-relatert vev krymping kan være variabel, og avhenger både på vevet, behandlingen og innebygging middels8,13,17,18,19. Generelt forekommer bygge-relaterte endringer av volumet av en Vevsprøve (dvsdet meste krymping) i alle tre dimensjoner av plass, og derfor påvirker alle dimensjonale parametrene anslått av kvantitative stereological analyser8 . I utgangspunktet kan omfanget av bygge-relatert vev krymping, uttrykt som den lineære vev krymping faktoren (fS), anslås som vist i trinn 1.3. og brukes for korreksjon (krymping-sensitive) kvantitative morfologiske parametere14.

Volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av organer/vev
For etableringen av en biobank samling av svin orgel/vevsprøver, volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll tilnærminger som beskrevet i trinn 2 har vist seg for å være praktisk, tidsbesparende og effektive teknikker for generering av representant, Multi-Purpose vev eksempler7,8,9,15.

Generasjons Isotropic Uniform tilfeldig deler og loddrett Uniform tilfeldig seksjoner for kvantitative stereological analyser
Biobank vevsprøver må være egnet for en rekke stereological kvantitativ analyse metoder for estimering av antallet parametere som ikke kunne fastslås uten en tilstrekkelig forberedt prøven. Nesten alle kvantitativt stereological parametere kan bestemmes, bruker "isotropic (uavhengig) uniform tilfeldig (IUR) kapitler"8,9. I IUR deler, er tredimensjonale retningen for inndelingsplanet av vev utvalget randomisert. Dette kan oppnås ved tilfeldiggjøring av stillingen vevet prøven i forhold til inndelingsplanet, som brukes i "Isector" metoden11 (protokollen trinn 3.1), eller av tilfeldiggjøring av retningen for inndelingsplanet forhold til den Vevsprøve, som "Orientator" metoden10 (protokollen trinn 3.2). I vevsprøver, for eksempel hud- eller mucosa prøven viser en naturlig tilstede, eller definert og riktig identifiserbar loddrett akse, utarbeidelsen av "vertikal uniform tilfeldig (VUR) kapitler" (protokollen trinn 3.3.) strengt delt i fly av deres loddrett akse er fordelaktig8,20. For en komplett diskurs av teoretiske grunnlaget for IUR/VUR prøvetaking og en omfattende diskusjon om potensielle nedstrøms kvantitative stereological analyser kalles den interesserte leseren lærebøker av kvantitative stereology i livet Sciences8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet bruker her vevsprøver avledet fra døde dyr og overholde tyske forskrifter av dyr velferd.

1. Volumetry

  1. Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel tettheter (figur 1 og figur 2) 7 , 12 , 16
    1. Forberede materialer: skalpell blader, papirhåndklær, fine tang, standard laboratorium skalaer, glass eller plast kanner, 0,9% saltløsning og selv konstruert prøven innehavere (figur 2A).
    2. Avgiftsdirektoratet et stykke vev (maksimal størrelse: 2 x 2 x 2 cm3) fra orgel/vevet, spesielt fra orgel rommet rundt. Liten organer, for eksempel hypofysen eller pinealkjertelen, er målt i toto.
      FORSIKTIG: Kontroller at størrelsen på utvalget er spesielt mindre enn den indre diameteren på begeret (trinn 1.1.5 flg..) og fylling nivået tillate full neddykking av utvalget uten kontakter indre veggene i begeret i trinn 1.1.7.
    3. Forsiktig vattpinnen prøven med et papirhåndkle å fjerne overflødig blod/vev væske.
    4. Veie prøven i presisjon skala og ta vekten av prøven (mS). Fastslå vekten av små til nærmeste mg (figur 1A).
    5. Plass et beger fylt med romtemperatur 0,9% saltløsning på skalaen. Ikke helt fyll begeret, å tillate en neddykking av vev utvalget i det påfølgende trinnet uten overflyt.
      Advarsel: Bruk passende størrelsen og vekten av vev prøven (e) skal måles og effektiv måling omfang av målestokken kanne størrelse. For større prøver opptil 2 x 2 x 2 cm3, en kanne størrelse 50-100 ml passer i kombinasjon med en skala måle fra ca 100 mg å 500 g, mens for små bruke kanner av 5-10 mL volum i kombinasjon med presisjon skalaer med måle varierer mellom ca 0,1 mg og 20 g.
    6. Senk eksempel holderen (dvs., en tilstrekkelig stive løkke av tynn tråd eller noe lignende, figur 2A) i saltkildene til en merket posisjon (piler i figur 1B, figur 2Bog figur 2C). Nullstill (tare) visningen av skalaen til null.
    7. Nøye feste Vevsprøve for eksempel innehaveren og helt Senk eksemplet i saltkildene til merket posisjon på prøven abonnenten (piler i figur 1B, figur 2Bog figur 2C).
      FORSIKTIG: Neddykket utvalget og prøve innehaveren kan ikke ha kontakt med indre veggene eller bunnen av begeret eller overflaten av saltkildene.
    8. Mens du holder eksempel holderen og senkes prøven i den posisjonen, registrere vekten på skalaen (mL), henviser til vekten av saline fortrengt av Vevsprøve (figur 1 C, figur 2B, og Figur 2C).
    9. Beregne volumet av prøven (VS) fra mLog tettheten av saline ved romtemperatur (20 ° C) (ρsaltvann = 1.0048 g/cm³) som VS = mL/ Ρsaltvann [g/g/cm³] (Figur 1).
    10. Beregne tettheten av Vevsprøve (ρutvalget) fra vekten (dvs., masse) av prøven (mS) og volumet (VS): ρeksempel = mS /VS[g/cm³] (figur 1).
    11. For organer målt i toto, gjenta målingen tre ganger og beregne gjennomsnittlig orgel tettheten av enkelt måling verdier. Utføre gjentatte målinger med forskjellige prøver av samme organ/vev/orgel kupé store organer/vev, og beregne gjennomsnittlig tetthet fra enkelt målingene, tilsvarende.
    12. Beregne det totale volumet av orgel/vev/orgel kupé fra dens vekt og tetthet (figur 1).
  2. Anvendelse av Cavalieri-metoden for fastsettelse av svin Organ volumer 7
    1. Forberede materialer: hersker, caliper, kniv, saks, pinsett, vannfast penn, plast transparenter, skanner, foto kamera og tvers rutenett på plast transparenter.
    2. Plasser hele orgel/vev på en ren overflate (kutte base) og måle lengden (l) av orgelet langs den langsgående aksen (figur 3B, figur 5A).
    3. Skivet komplett orgel/vevet equidistant parallelle ortogonale langsgående orgel aksen (Figur 3 c, figur 5B). Velg en avstand d mellom to deler (dvs., intervall/seksjon snittetykkelsen, vanligvis ca 1 cm) tilstrekkelig lite til å motta et tilstrekkelig antall vev/orgel plater. Tilfeldig plass den første delen innen avstand mellom 0 og snitting intervallet fra margen av orgelet. Mens kutting, visuelt dommer posisjonen og orientering av hver inndelingsplan, å få omtrent parallell orgel/vev plater av omtrent ensartet tykkelse.
      Merk: Det nødvendige antallet vev/orgel plater avhenger av formen og størrelsen på undersøkt orgel/vev. Hvis liten organer eller prøver må deles i tynne plater ≤5 mm, bygge prøvene i agar før snitting (se trinn 1.3.3.) og bruke en teknisk enhet for kutting av agar-embedded prøven. Empirisk anbefales snitting intervaller for mest svin organer og vev og eksempler for kutting enheter, angis i supplerende materiale av "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7.
    4. Plassere alle orgel/vev plater på samme vender ned på kutte basen (dvs., konsekvent på høyre eller venstre flyet hvert organ plate, figur 3D, figur 5C) og telle plater (n).
    5. Få delen profiler av vev plater av en av følgende fremgangsmåter:
      1. Forsiktig plassere vev plater på riktig merket plast transparenter, mens retningen på sin øvre og nedre delen overflater. Spor konturene av vev plater på plast transparentene med en vannfast penn (figur 3E1-2).
      2. Ta fotografier av vev slabs, holde kameraet vertikalt over delen overflater (figur 3F). Plass en størrelse hersker ved vev plater for kalibrering.
      3. Skanne vev plater på en planskanner samtidig retningen på sin øvre og nedre delen overflater (Figur 3 g). Plass en størrelse hersker ved vev plater for kalibrering.
    6. Måle områder av (spores, fotografert eller skannet) delen profiler av alle vev plater av en av følgende fremgangsmåter:
      1. Overlappe eller sammenligne spores orgel skive profilene en passende størrelse, kalibrert rutenett av med jevne mellomrom kors på en plast åpenhet og telle alle krysser treffer området profil (figur 3E3-4, i forhold til Figur 5 d). Beregne inndelingsområdet profil hver orgel plate ved å multiplisere antall krysser treffer området profil av området som en cross.
        Merk: Du mottar tilstrekkelig presist anslag, velger et kors rutenett med en tilstrekkelig liten avstand mellom tilstøtende kors, slik at et gjennomsnitt på minst 100 krysser treffes delen overflater av styrene i ett organ i hvert undersøkt tilfelle av studien . Empirisk anbefales tvers gitter størrelsene for mest svin organer og vev angis i supplerende materiale av "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7.
      2. Måle områder av vev slabs i digitale bilder av bilder/skanner hjelp nødvendig kommersielt tilgjengelig eller freeware morphometry myk- og maskinvare programmer (Figur 3 H), for eksempel en kommersiell bildet analyse system21, eller ImageJ22.
        FORSIKTIG: Merk at en vev SKIVE (første eller siste) er plassert på skanneren hviler på naturlige overflaten, henholdsvis, ansikter kameraet med naturlig overflaten. Derfor det skannede bildet, bildet denne plate, vises ikke en delen overflate. Derfor måles ingen delen området profil i skannede image/Foto bildet av dette vevet SKIVE (figur 3I). Også Merk over projeksjon presentere i skannede bilder og fotografier av orgel/vev plater, dvs, bare måle områder av faktiske delen profiler, men ikke av vev i bildet ligger bak plate delen overflaten (Figur 12 G-H).
    7. Beregn anslått orgel volumet som produktet av summen av alle tilsvarende delen profil områder av alle vev plater per tilfelle (dvs., konsekvent på høyre eller venstre, henholdsvis øvre eller nedre delen overflaten av hvert organ skive og mener tykkelsen av plater (dvs., kvotienten av målte lengden på den loddrette organ (l) og hvor mange plater)15.
  3. Fastsettelse av omfanget av tredimensjonale innebygging-relaterte vev krymping under behandling av vevsprøver for Histology
    1. Forberede materialer: mikrotomen blader, tang, agar, metall avstøpning muggsopp, digital skanner og størrelse hersker (f.eks, millimeterpapir).
    2. Skjær en frisk, flyet delen overflate fra en fast Vevsprøve.
      Merk: Hvis bruker prøver av lett bygge deformerbare (myk) vev (fettvev, geléaktige vev), den faste Vevsprøve i agar før snitting (figur 4A).
    3. Bygge inn prøven i agar:
      1. Bland standard agar pulver som brukes for mikrobiologi kultur medium med et riktig mengde vann (ca 0,5-1 g agar/10 mL vann) i et glass beaker. Rør blandingen og varme den i en mikrobølgeovn på 700 W til koking for 3-5 s. rør blandingen og kok opp igjen for 3-5 s.
      2. Fargestoff eventuelt den flytende agar, f.eksmed svart blekk for å øke kontrasten agar til vev prøven, (Legg 1 mL blekk til 10 mL av varm væske agar og røre kraftig).
      3. Hell den varme agar i casting mold (f.eks, en metall mold brukes for parafin embedding, figur 10AD) og senk den faste Vevsprøve i den varme agar. La agar kule til herding, fjerne mold og kuttet agar blokken med innebygde vev bruker mikrotomen eller barberblad.
        Advarsel: Ved håndtering varmt flytende agar, bruk beskyttende briller og hansker. Prosessen vevsprøver fast i formaldehyd løsningen under en eksos hette og ha beskyttende briller og laboratoriet hansker.
    4. Plasser prøven med overflaten delen vender ned på en planskanner, sammen med en størrelse linjal og skanne delen overflaten (figur 4AB).
    5. Bestemme området delen overflaten av den faste Vevsprøve (f) i den digitale skanningen, bruke en av teknikkene som beskrives i trinn 1.2.6 (figur 4B).
    6. Bygge inn prøven i plast innebygging medium, som epoxy (f.eksEpon) eller glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)23, følgende standardprotokoller23,24,25 ( Figur 4C). Sikre at delen overflaten av fast prøven skannet i forrige trinn (1.3.4) opprettholdes i plast-embedded utvalget.
      Merk: For å opprettholde retningen for avsnittet overflaten av prøven under behandling av prøven, konsekvent plasser prøven med tiltenkte delen overflaten vendt nedover i innebygging kassetten eller casting mold, eller merke den tiltenkte delen overflaten (eller motsatt side av prøven) med blekk.
    7. Skjær en histologiske delen fra plast blokk tilsvarer opprinnelige delen overflaten av den faste Vevsprøve (trinn 1.3.2) bruker en mikrotom (Figur 4 d), montere delen på et glass lysbilde (Figur 4 d) og flekk det rutinemessig ( f.eks, Hematoxylin og eosin flekk, H & E)24,25.
      Advarsel: For å motta en histologiske delen omtrent på samme fly som den faste Vevsprøve opprinnelige delen, må du nøye justere plasseringen av plast blokken i mount av mikrotomen før snitting.
    8. Lysbildet med farget delen vendt nedover på en planskanner med en størrelse linjal og skanne delen (figur 4E).
    9. Bestemme området delen av plast-embedded vev utvalget (Ae) i digitale skanningen, bruke en av metodene beskrevet i trinn 1.2.6 (figur 4F).
    10. Beregne gjennomsnittlig innebygging-relaterte vev svinn (for den respektive vev og innebygging medium) fra tilsvarende delen profiler av målt områdene før og etter innebygging i plast innebygging medium. Lineær krymping faktor fs beregnes som kvadratroten av kvotienten av områdene av delen profiler av n etter innebygging i plast innebygging medium (e) og områdene i tilsvarende delen profiler av de samme før innebygging i plast innebygging medium (f) (figur 4G)14.

2. volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av telling og behandling av vev underutvalg for ulike nedstrøms analysetyper7

  1. Forberede materialer: hersker, caliper, kniv, saks, pinsett, vannfast penn, punkt/kryss rutenett på plast transparenter og tilfeldig tall tabeller.
    Merk: Kopier maler for cross rutenett (5-60 mm) er gitt i supplerende materiale av "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7.
  2. Plasser orgel/vev på en ren overflate (kutte base) og måle lengden (l) av orgelet langs den langsgående aksen (figur 5A, figur 6A).
  3. Skivet komplett orgel/vevet equidistant parallelle ortogonale til den langsgående aksen (figur 5B). Velg en avstand d mellom to deler (dvs., intervall/seksjon snittetykkelsen, vanligvis ca 1 cm) liten nok til å få et tilstrekkelig antall vev/orgel skiver. Tilfeldig plass den første delen innen avstand mellom 0 og snitting intervallet fra margen av orgelet. Mens kutting, visuelt dommer posisjonen og orientering av hver inndelingsplan å få omtrent parallell orgel/vev plater av omtrent ensartet tykkelse.
    Merk: Det nødvendige antallet vev/orgel plater, avhenger av størrelsen på undersøkt orgel/vevet og antall samplet vev lokasjoner. Hvis liten organer eller prøver må deles i tynne plater ≤5 mm, bygge prøvene i agar før snitting (se trinn 1.3.3.) og bruker tekniske enheter for kutting av agar-embedded prøven. Empirisk anbefales snitting intervaller for mest svin organer og vev og eksempler for kutting enheter er angitt i supplerende materiale av "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7.
  4. Plassere alle orgel/vev plater på samme vender ned på kutte basen (figur 6B).
  5. Overlegg vev plater med et passende stor kryss rutenett trykt på plast gjennomsiktighet ved å plassere den ytterste venstre øverst på tvers i rutenettet over et tilfeldig punkt av vev (figur 5C-D, finne 6B).
    Merk: Velg et kors rutenett med en tilstrekkelig liten avstand mellom tilstøtende kors, slik at i hvert undersøkt tilfelle av studien, minst dobbelt så mange kors vil treffe den delen surface(s) av vev kupé som skal avsøkes, som antall eksempler som må hentes fra vev kupé. Empirisk anbefales tvers gitter størrelsene for mest svin organer og vev angis i supplerende materiale av "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7.
  6. Merke og telle alle krysser treffer vev (henholdsvis vev sub rommet som skal avsøkes). Konsekvent bruke en ensartet måte å telle og nummerering av kors treffer vev rommet skal tas prøver i alle vev plater, f.eksav fortløpende nummerering av respektive kors i hver linje for linje, fra venstre til høyre og topp til bunn, eller, f.eksved nummerering kors i en vev skive etter hverandre i klokkens retning starter med korset nærmest til tolv stillingen, som exemplarily demonstrert i figur 5E.
  7. Dele antall krysser treffer vev/vev rommet skal samplet (n) hvor å bli generert for å få systematisk prøvetaking intervallet (i).
  8. Bestemme første prøvetaking plasseringen ved å velge et tilfeldig tall x i intervallet mellom 1 og jeg. Til dette bruk en tilfeldig-tall-tabell. Merke første prøvetaking posisjon (x) og hver neste x + i, x + 2jeg, x + 3i, etc., kors treffer vev/vev rommet skal tas prøver av plast gjennomsiktighet bruker en vannfast penn (figur 5F).
    Merk: Tilfeldig nummer tabeller kan enkelt og raskt genereres ved hjelp av en online tilfeldig nummer generator.
  9. Tag vev steder tilsvarer den merkede krysser ved å heve litt plast gjennomsiktigheten og plassere en liten bit av ren, tom konfetti papir på overflaten av vev skive med en pinsett (figur 5G, figur 6E ).
  10. Avgiftsdirektoratet prøven av vev fra samplet steder (figur 5 H, figur 6F, figur 7A) og ytterligere dele dem for ulike typer påfølgende analyser (figur 6G, figur 7A-B), som angitt i Tabell 1.
  11. Etter prøvetaking, ren plast transparentene med varmt vann og såpe, tørr, og bruke dem på nytt.

3. generasjon Isotropic Uniform tilfeldig (IUR) deler og loddrett Uniform tilfeldig (VUR) deler for kvantitative Stereological analyser

  1. "Isector" teknikken
    1. Forberede materialer: Razor eller mikrotomen blader, agar, sfærisk avstøpning muggsopp (f.eksavstøpning former for pralines, som kan fås fra konditor leverandører), foldback klemmer og tang.
    2. Plasser en tilstrekkelig størrelse stykke (1 x 1 x 1 cm3) fast systematisk tilfeldig samplet vev i en sfærisk tetningsplate, hold sammen foldback klemmer og fylle formen med varm væske agar (figur 8A-E).
    3. Fjerne agar sfæren (figur 8F) fra casting mold etter herding av agar.
    4. Rulle agar sfæren med innebygde vev prøven over bordet, stoppe, og del det en tilfeldig plassering.
      Merk: Det resulterende inndelingsplanet er en IUR del (figur 8F-G).
    5. Fortsette å bygge inn Vevsprøve i plastikk harpiks som GMA/MMA, opprettholde retningen for avsnittet IUR flyet (se 1.3.5).
  2. "Orientator" teknikken
    1. Forberede materialet: Razor eller mikrotomen blader, agar, tang, tilfeldig nummer tabell(er), utskrifter av equiangular, og cosinus-vektet sirkler.
      Merk: Kopier maler sirkler er gitt i tidligere publikasjoner8,26.
    2. Plasser prøven av fast vev (eller av agar-embedded fast vev) på en utskrift av en equiangular sirkel med en kant parallelt med 0-180 ° retning (figur 9A, figur 10E).
    3. Finne en tilfeldig vinkel ved hjelp av tilfeldige tall tabellen. Finn tilsvarende merkene på omfanget av equiangular sirkel, som prøven hviler på. Bruke disse merkene, kuttet en del gjennom utvalget (eller gjennom agar omringer det innebygde Vevsprøve), med inndelingsplanet blir orientert parallell retning av tilfeldige vinkelen angitt på omfanget av equiangular sirkelen og loddrett i hvile overflaten av prøven (figur 9BC, figur 10F).
    4. Plassere vev blokken med delen overflaten generert i forrige trinn mot ulempen på en cosinus-vektet sirkel med kanten av hvile overflaten plassert parallelt med 1-1 retning (figur 9 d, Figur 10 H).
    5. Gjenta trinn 3.2.3 og kuttet en ny del gjennom utvalget i tilfeldig vinkel bestemmes ved hjelp av tilfeldige tall tabellen (figur 9E-F, finne 10I-J).
      Merk: Det resulterende inndelingsplanet er en IUR del.
    6. Eventuelt bestemmer området IUR delen profilen til den faste Vevsprøve for fastsettelse av bygge-relatert vev svinn (figur 9G-J) som beskrevet i trinn 1.3, og fortsetter å bygge Vevsprøve i plast harpiks som GMA/MMA.
  3. Generasjon av vertikal Uniform tilfeldig (VUR)
    1. Forberede materialer: Razor eller mikrotomen blader, agar, tang, tilfeldig nummer tabell(er) og utskrifter av equiangular sirkler.
      Merk: Kopier maler sirkler er gitt i tidligere publikasjoner8,26.
    2. Definere en akse i den faste Vevsprøve som alltid er gjenkjennelig i prøven/delene i de etterfølgende trinnene.
      Merk: Vanligvis aksen vertikal til naturlige overflaten av vev prøven er valgt som den loddrette aksen.
    3. Eventuelt kan du bygge inn prøven i agar (figur 11B).
      Merk: Agar-embedding før VUR - eller IUR-skjæring av fast prøven er vanligvis anbefales for liten, tynn, skjør eller myk prøver. Også bruke agar-innebygging av prøver for å rette plasseringen av VUR inndelte prøven under påfølgende innebygging av prøven i plastikk harpiks medium.
    4. Plass prøven på en utskrift av en equiangular sirkel, med den loddrette aksen blir ortogonalt orientert på Planet i tabellen Tabell/papir (figur 11C).
    5. Kutt prøven i tilfeldig vinkel (bestemmes ved hjelp av en tilfeldig nummer tabell) med inndelingsplanet ortogonale til bordet og parallelt med den loddrette aksen skal motta en VUR inndelingsplan (Figur 11 d).
    6. Eventuelt bestemme området IUR delen profilen til den faste Vevsprøve for fastsettelse av bygge-relatert vev svinn som beskrevet i trinn 1.3 (sammenligne med figur 9G-J) og fortsetter å bygge Vevsprøve i plastikk harpiks som GMA/MMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel

Figur 12A -B viser representant fastsettelse av tetthet og volum for en svin nyre bruke neddykking teknikken beskrevet i trinn 1.1 (figur 1, figur 2). Mer representativt resultatene av tetthet målinger av flere svin organer og vev er presentert i tabell 2. En mer omfattende liste over referanse tettheter på ulike svin vev og organer vises i "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7. Gyldigheten av vev tetthet målingsverdiene innhentet med metoden neddykking kan estimeres ved gjentatte målinger av samme prøven og uavhengige prøver. Mest svin vev vise densitet litt høyere enn vann (ρvann ≈ 1.0), mens vev svømming i saltvann (fettvev, lungevev) vise tettheter < 1.0.

Cavalieri metoden for fastsettelse av orgel volumer

Figur 12C -F viser representant fastsettelse av volumet av svin nyre (den samme orgelet som vist i figur 12A-B). Områdene delen overflater av orgel slabs var bestemt punkt-telling, bruker et lagt tvers rutenett på plast gjennomsiktighet og planimetric måling av delen i orgel plater i et skannet bilde av slabs (betale oppmerksomhet til over projeksjon av vev ligger bak plater delen overflater, Figur 12 G-H). Nøyaktigheten av orgel/vev volum data innhentet av ytelse av Cavalieri tilnærming (trinn 1.2, Figur 3) kan estimeres sammenligning respektive volumet beregnet vekt og tetthet av orgel/vev. Volum av nyre undersøkt i Figur 12 avgjøres ved neddykking-metoden og Cavalieri metoden(e) skilte seg med mindre enn 1% fra hverandre. Som et mål på nøyaktigheten av Cavalieri volum anslagene, kan varmefaktor feil (CE) beregnes som beskrevet tidligere15.

Fastsettelse av tredimensjonale innebygging-relaterte vev krymping under behandling av vevsprøver for Histology

Representant resultatene av omfanget av vev krymping knyttet til innebygging av svin (kortikale nyre vev) i plast harpiks (GMA/MMA eller epoxy) for kvantitative histomorphological eksamen er vist i tabell 2 (tidligere upubliserte data). Lineær krymping faktorene angitt i tabell 2 var bestemt som beskrevet i trinn 1.3 (Figur 4). De henviser til en tredimensjonal volum reduksjon av 29% for GMA/MMA innebygging og 22% for epoxy innebygging av svin kortikale nyre vev. Figur 13 viser representative eksempler på tilstrekkelig og tilstrekkelig forberedt prøver av agar-innebygd, formalin-fast fettvev for måling av prøven delen arealet før plast-innebygging.

Volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av punkt opptelling og behandling av vev underutvalg for ulike nedstrøms analysetyper

"Snitt og punkt-telling" teknikken for volum-vektet systematisk tilfeldig prøvetaking av parenchymal organer (trinn 2, figur 5, figur 6, figur 7) representerer en etablert, robust metode for generering av representant prøver for flere påfølgende typer analyser2,7. Representant resultatene av generasjon av systematisk tilfeldig samplet, svært redundant biobank av ulike svin organer og vev, med påfølgende differensial behandling av de forbrukeravgift for flere forskjellige nedstrøms dataanalyse metoder ved hjelp av prøvetaking teknikken beskrevet i trinn 2 (figur 5, figur 7og exemplarily vist i figur 6) har tidligere blitt publisert2. For generasjon av biobank prøver av leveren vev i en tidligere svin biobank studie2, for eksempel svin lever var helt delt i ca 20 plater av 2-3 cm tykkelse, lagt med en med 3 cm cross rutenett, som beskrevet i trinn 2 og 16 vev steder av ca 2 x 2 x 2 cm3 systematisk tilfeldig samplet og forbrukeravgift i hvert tilfelle. Fra hver forbrukeravgift prøvene, fem underutvalg ble senere generert for molekylær analyser (frosset om-80 ° C) samplet steder, en subsample for cryohistology, en subsample ble løst i Methacarn løsning, og i formaldehyd løsning for etterfølgende parafin innebygging og histologiske- og immunohistochemical undersøkelse. Generasjonen av 74 forskjellige prøvene per tilfelle (til frysing eller overføring av prøvene i fiksering løsning) ble oppnådd i ca 20 min, på gjennomsnittlig2. Gjennomførbarhet/suksessen beskrevet prøvetaking og delsampling tilnærming kan estimeres ved vurdering av kvaliteten på de genererte prøvene (dvs., kvaliteten på RNA- eller protein isolerer, bevaring av histomorphological og ultrastructural egenskaper av vevsprøver, deres egnethet for immunohistological analyser, etc.)2

Generasjons Isotropic Uniform tilfeldig (IUR) deler og loddrett Uniform tilfeldig (VUR) deler for kvantitative Stereological analyser

Teknikkene demonstrert for en frem-orientert generasjon isotropic uniform tilfeldig (IUR) deler og VUR inndelinger fra svin (biobank) vevsprøver (protokollen trinn 3, Figur 8, figur 9, Figur 10, figur 11), slik at for undersøkelse av de fleste kvantitative stereological parametere, kan raskt gjøres med litt øvelse, og uten rimelig problemer eller feilkilder. Derfor er generering av IUR-eksempler vist i figur 9 (isector teknikk) og Figur 10 (orientator teknikk) fullt ut representative for disse metode(r).

Figure 1
Figur 1: skjematisk illustrasjon av "neddykking teknikken" for fastsettelse av vev/orgel tettheter. (A) måling av prøven vekten (dvs., masse, mS). (B) skala tared til vekten av et beger fylt med 0,9% saltløsning 20 ° C og en prøve holder neddykket i saltkildene til merket, definerte plasseringen. (C) full neddykking av utvalget til merket posisjonen til prøven abonnenten uten kontakt indre veggene eller bunnen av begeret. Vekten vises på balansen er vekten av volumet av saline fortrengt av utvalget). Tettheten av prøven beregnes som angitt (her: ρeksempel = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: "Neddykking technique" for fastsettelse av vev/orgel tettheter. (A) forskjellige utvalg holdere konstruert fra tynn tråd. Fra venstre til høyre: en løkke av tynn tråd tråden gjennom en tynn injeksjon kanyle, en spiralformede kurv av wire å holde små og skjøre prøver, og en enkel slynge tynn tråd. Pilene i A-C angir plasseringen som eksempel innehaverne er nedsenket i saltvann. (B, C) Posisjonering av prøven holderen under neddykking på utvalget i saltvann (sammenligne med figur 1 C). (B) komplett svin hypofysen plassert i en kurv-formet eksempel holder. (C) prøve av svin myokard. Merk den full neddykking prøvene i saltvann uten kontakter veggene eller bunnen av begeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk illustrasjon av Cavalieri metoden for fastsettelse av svin orgel volumer. (A) mynt stable eksempel for forståelsen av Cavalieri prinsippet. Se innføringen for detaljer. (B-H) Skjematisk demonstrasjon av volum estimering av en perfusjonsmåling-fast nyre. (B) måling av lengden (l) av nyre langs den langsgående aksen. (C) kutte av komplett orgelet i n like tykk (d) parallelle skiver ortogonale langsgående orgel aksen. (D) Organ plater plassert på samme overflaten vender ned. Merk at første (høyre) vev hellen er plassert på naturlige overflaten, dvs, har ikke en delen overflate. (E-H) Måter å finne delen overflaten områder av vev slabs. (E) sporing omrisset av hvert organ skive med en vannfast penn på en plast åpenhet overlegg av disponerte orgel skive profiler med en passende størrelse, kalibrert cross rutenett på plast gjennomsiktighet, telling av krysser treffer den profil området. Orgel plate delen profil området beregnes fra antall krysser treffer delen profil området og området til et kors. (F,G) Fastsettelse av delen områder av orgelet plater i foto bilder tatt i loddrett retning til delen overflaten (F) eller skannede bilder av vev slabs (G), med herskere for kalibrering. (H) fastsettelse av delen i vev plater i digitale bilder av bilder/skanner med riktig morphometry programmer. (jeg) beregningen av det estimerte volumet av orgelet som produktet av den kumulative området tilsvarende delen overflater av alle orgel plater multiplisert mener tykkelsen av orgelet plater15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: skjematisk illustrasjon til fastsettelse av tredimensjonale innebygging-relaterte vev krymping under behandlingen av for histology. (A) kutting av en frisk, plane delen overflate fra en fast Vevsprøve (stabilisering av formen på lett deformerbare (myk) vev som liggende under adipose eller lunge vev ved å bygge i agar før snitting). Skanning av delen overflaten av prøven med en størrelse hersker. (B) Planimetric fastsettelse av delen overflaten av den faste Vevsprøve (f). (C) rutine innebygging av prøven i plast innebygging medium. (D) utarbeidelse av en histologiske del av plast blokk med bevaring av inndelingsplanet av utvalget. Montering av delen på et glass lysbilde og rutinemessig farging av lysbildet. (E) skanning av lysbildet med en størrelse hersker. (F) Planimetric fastsettelse av delen av plast-embedded prøven (e). (G) beregning av omfanget av bygge-relatert vev krymping som kvotienten av målt i tilsvarende delen profiler av før og etter innebygging i plast innebygging middels14. Bildene til høyre viser del overflaten av et formaldehyd-fast utvalg av fettvev innebygd i blekk-svertet agar før innebygging i plastikk harpiks (øverst) og den tilsvarende del profilen (han flekker) på GMA/MMA-embedded utvalget (nederst). Skalere barer = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: skjematisk illustrasjon av volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll. Presentert eksemplet viser systematisk stikkprøvekontroll av seks vev steder i nyre cortex av en perfusjonsmåling-fast nyre. (A) måling av lengden (l) av nyre langs den langsgående aksen. (B) komplett snitting av hele orgel i like tykk (d) parallelle skiver ortogonale langsgående orgel aksen. (C) orgel/vev plater plassert på samme (dvs., høyre eller venstre) overflate vender ned. (D) overlapping av vev plater med et passende stor kryss rutenett skrevet på plast gjennomsiktighet. Det ytterste venstre øverst på tvers av rutenettet er plassert over et tilfeldig punkt utenfor vev (angitt med en blå prikk, ). (E) opptelling og nummerering av alle korsene treffer nyre cortex. I dagens eksempel er kors treffer nyre cortex nummerert i rekkefølge i en nyre skive etter hverandre (fra venstre til høyre), i hver skive fortsetter i klokkens retning starter med korset nærmest til stillingen tolv. Her traff 36 krysser nyre cortex. Seks prøvetaking posisjoner skal prøves. Derfor hver sjette posisjon der et kors treff vevet Samples (36/6 = 6). (F) i eksemplet nåværende plasseringen av fjerde cross (N ° 4) treffer nyre cortex er tilfeldig valgt som første prøvetaking posisjon. Alle følgende krysse sjette treffer nyre cortex er merket på plast gjennomsiktigheten med en vannfast penn. I dagens eksempel er dette stillingene 4, 10, 16, 22, 28 og 34. (G) merking av tilsvarende vev steder av små biter av ren, tom konfetti papir plassert på overflaten av vev. (H) Excision av vevsprøver fra tilfeldig systematisk samplet steder og etterfølgende behandling for videre analyser. Dette tallet er endret fra Albl et al. (2016), tall S236 og S237, side 186 (tilskudd)7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av nyre cortex på en svin nyre (se figur 5) og regler for punkt-telling. (A) frisk gris nyre. (B) nyre delt i like tykk parallelle skiver ortogonale langsgående orgel aksen, kledde med kryss rutenett på plast gjennomsiktighet. Den røde sirkelen angir posisjonen til et tilfeldig punkt brukes til randomize plasseringen av korset rutenettet. (C) illustrasjon av punkt-telling regler: en cross/point regnes som treffer vev rommet skal Samples (referanse rom), hvis øvre høyre indre hjørne av vertikalt og horisontale bar kors (pil) dekker vevet. (D) merkes krysser treffer nyre cortex og systematisk stikkprøvekontroll av vev steder (her 119 krysser traff nyre cortex og 17 steder systematisk tilfeldig samples ved hjelp av et utvalg intervall jeg = 7). (E) samplet tilfeldig systematisk steder av nyre cortex merket av konfetti papir. (F) forbrukeravgift prøver. (G) videre underinndeling av forbrukeravgift prøver for etterfølgende behandling av underutvalg for ulike nedstrøms analysetyper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: oppdeling av forbrukeravgift fra systematisk tilfeldig samplet vev steder og behandling av underutvalg for ulike nedstrøms analysetyper. (A) skjematisk illustrasjon av generasjon av vev underutvalg fra en systematisk tilfeldig samplet plassering av nyre cortex (native vev) for ulike analyser (f.eksFF-PE: Formalin-fast, parafin-innebygd eksempler og MTC-PE: Methacarn-fast, parafin-innebygd eksempler for lys-mikroskopiske histology; CRYO: Utvalg for frosne delen histology; -80 ° C:-tørris frosset vevsprøver for molekylær analyse). (B) Excision systematisk tilfeldig samplet steder nyre cortex på en perfusjonsmåling-fast nyre, videre underinndeling av de forbrukeravgift og behandling av underutvalg for kvalitativ og kvantitativ morfologiske analyser. Plater av perfusjon-fast svin nyre (1), cross-grid (2), tilfeldige tall tabellen (3), equiangular og cosinus-veide sirkler (4) for generering av IUR deler (se figur 9, Figur 10), ulike fiksering løsninger (5, 6, 7), og utvalg beholder for elektron mikroskopiske prøver (8). Dette tallet har blitt endret fra Albl et al. (2016), finne S239, side 186 (tilskudd)7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: "Isector" delen forberedelse fra formalin-fast svin vev. (A) eksempel på perfusjon-fast svin nyre cortex. (B) sfærisk avstøpning muggsopp. (C) flytende agar. (D-E) Agar-innebygging av prøver sfærisk avstøpning muggsopp. (F) Agar sphere med innebygd Vevsprøve. (G) Agar sphere med innebygde vev delt på et tilfeldig sted (IUR inndelingsplan). Dette tallet har blitt endret fra Albl et al. (2016), finne S6, side 14 (tilskudd)7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: skjematisk illustrasjon av "Orientator" teknikken for utarbeidelse av IUR delene. (A) prøven (e) av fast vev plassert på en equiangular sirkel (ci1) med en kant parallelt med 0-180 ° retning (angitt med en rød linje). (B) Sectioning på utvalget i tilfeldig vinkel (grønn linje). (B, C) Nylig generert delen overflaten av Vevsprøve (angitt i grønn farge). (D) eksempel plassert på en cosinus-veide sirkel (ci2) med seksjon overflaten generert i forrige trinn ulemper og en kant av hvile overflaten parallelt med 1-1 retning (angitt med en rød linje). (E) skjæring av den andre delen gjennom utvalget i tilfeldig vinkel. (F) noe som resulterte tilfeldig isotropic delen flyet av prøven (angitt med blått). (G) fastsettelse av den IUR delen av det faste Vevsprøve ved beregning av bygge-relatert vev krymping som beskrevet i trinn 1.3. (H) innebygging av Vevsprøve i plastikk harpiks. (jeg) Sectioning av plast blokk er delt (parallell til IUR flyet) på en mikrotom. (J) montering av IUR plast-delene på glass lysbilder. Dette tallet har blitt endret fra Albl et al. (2016), finne S8, side 15 (tilskudd)7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: "Orientator" teknikken for utarbeidelse av IUR deler av agar-embedded vevsprøver. (A-D) Eventuelt en kan agar bygge inn en systematisk tilfeldig samplet prøven av fast vev (agar-innebygging er nyttig for små vevsprøver, slik at først eller begge tilfeldig deler kan plasseres innenfor agar uten å kutte vev). (E) Positioning av agar blokken på en equiangular sirkel (ci1) med en kant parallelt med 1-1 retning (angitt med en rød linje). (F, G) Skjæring av blokken i tilfeldig vinkel (her: 15-15, grønn linje) bestemmes ved hjelp av en tilfeldig nummer tabell (rnt, grønn pil). (H) etterfølgende plasseringen av agar blokken på delen overflaten kutt i F på en cosinus-vektet sirkel (ci2) med kanten av hvile overflaten plassert parallelt med 1-1 retning (angitt med en rød linje). (jeg) andre delen skjære gjennom utvalget i tilfeldig vinkel (her: 20-20, angitt av en blå linje), bestemmes ved hjelp av en tilfeldig nummer tabell (rnt, blå pil). (J) resulterende IUR delen flyet av vev prøven. Dette tallet har blitt endret fra Albl et al. (2016), finne S9, side 16 (tilskudd)7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: Mactac VUR delen forberedelser. (A) fast Vevsprøve med en definert (identifiseres) loddrett akse (f.eksloddrett naturlig overflaten). (B) fast Vevsprøve innebygd i agar. (C) Positioning av the(agar-embedded) Vevsprøve på en utskrift av en equiangular sirkel (ci1). VA: loddrett akse. (D) Sectioning på utvalget i tilfeldig vinkel (tilfeldige tall tabellen; her: 30-30 retninger, angitt av en blå linje) med inndelingsplanet blir ortogonalt orientert til tabell og parallelt med den loddrette aksen av utvalget. Resulterende VUR inndelingsplan av Vevsprøve (angitt med blått). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12: representant volumetry for en svin nyre. (A-B) Neddykking teknikk. (A) fastsettelse av nyre vekt (mkid). (B) fastsettelse av vekten av volumet av saline fortrengt av nyre (mdispl.saline). Nyre er hengt på en streng og fullstendig neddykket i saltvann uten å berøre veggene av begeret eller nederst. Beregnet volumet av nyre er 92.6 cm³. (C-D) Cavalieri teknikk, planimetry av punkt-telling. (C) måling av lengden (l) av nyre langs den langsgående aksen. (D) fastsettelse av delen profil i nyrene plater med punkt telle etter overlapping av et rutenett av med jevne mellomrom krysser trykt på plast gjennomsiktighet. Her er det estimerte volumet av nyre 93,3 cm³. (E-F) Cavalieri teknikk, planimetry på skannede bilder av delen profil nyre plater (F). Her er det estimerte volumet av nyre 92.8 cm³. I C-E, naturlige rundt overflaten av først eller siste plate av nyre plassert på skanneren eller kledde av korset rutenettet åpenhet er ikke en delen overflate og derfor ingen delen areal måles i denne vev skive. (G-H) Demonstrasjon av overprojection i skannede bilder av orgelet/vev plater (G) og orgel/vev plater kledde med korset rutenettet gjennomsiktighet (H). Overprojecting deler av vev av orgel plater angis med prikkede hvite og svarte linjer. Bare områdene av faktiske delen profiler (dvs., vevet omgitt av den delvis angitt hvite stiplede linjen) bestemmes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13: representant illustrasjon av tilstrekkelig (A) og suboptimal (B) forberedelse av agar-embedded for fastsettelse av vev krymping gjelder innebygging av prøver i histologiske plast innebygging media. (A) skannet bilde av delen overflaten av et fast utvalg av svin subkutan fettvev før innebygging i plastikk harpiks. Prøven er innebygd i blekk-svertet agar for stabilisering av formen på prøven og fjern identifikasjon av delen overflaten konturene. (B) utydelig omriss av delen overflate og fanget luftboble (pil) innen agar. Skalere barer = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Analyse Eksempel Behandling
Type Metode(r)
Molekylær analyser RNA transkripsjon, protein, metabolitten og lipid profilering,
metabolomics analyse, DNA-analyse
Små biter * av ferskt vev (innebygd) Fryse på tørris eller i flytende nitrogen. Butikken på-80 ° C.
Kvalitativ morfologiske analyser Histology
[* lys, inkludert immunohistochemistry (IHC) og i situ hybridisering]
Frisk (ukomprimert), eller i situ - fast * vevsprøver Bruke forskjellige fiksativene (f.eks, 4% formaldehyd løsning) og innebygging media (parafinen, GMA/MMA, epoxy) etter behov.
Cryohistology
(frosne snitt, inkl IHC)
Frisk (ukomprimert) vevsprøver Bygg inn prøven i blokkering medium og fryse i flytende nitrogen-avkjølt isopentane.
Ultrastructural analyse
[elektronmikroskop, inkludert overføring (TEM) og skanning elektronmikroskop]
Små biter av frisk (ukomprimert), eller i situ- fast * vevsprøver Fikse utvalg i 2.5-6,25 prosent glutaraldehyde løsning og bygge i epoxy plast harpiks.
Kvantitativ morfologiske analyser * Lys Frisk (innebygd)- eller i situ - fast * vevsprøver Forberede IUR-partiene (orientator-, isector-partiene) og/eller VUR-deler av plast innebygd.
TEM Små biter av frisk (ukomprimert), eller i situ - fast * vev Forberede IUR (orientator-, isector-partiene) deler av epoxy-embedded vevsprøver.

Tabell 1: behandling av vev underutvalg forbrukeravgift systematisk tilfeldig samplet steder for ulike nedstrøms analyser typer. Avhengig av eksperimentell design av en studie og orgel/vev under etterforskning, skal forskjellig antall underutvalg være forbrukeravgift fra hvert systematisk tilfeldig samplet vev sted og behandlet for ulike typer nedstrøms analyser. Detaljert protokoller for mest svin organer/vev og studiet tilbys i "Vev prøvetaking guider for svin biomedisinsk modeller"7. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: Isotropic uniform tilfeldig. VUR: Vertikal uniform tilfeldig. * maks. 2 x 2 x 2 mm3. f.eks, perfusjon fast vev eller lunge vev i lungene innpodet fiksering løsning.

Metoden Representant resultater
Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel tettheter (trinn 1.1, figur 1, figur 2) Svin orgel/vev Ρ (g/cm³)
Leveren 1.071 ± 0.007
Bukspyttkjertel 1.062 ± 0.016
Ventrikkel myokard 1.036 ± 0.014
Nyre 1.044 ± 0.006
Abdominal visceral fettvev * 0.921 ± 0.032
Skjoldbruskkjertelen 1.061 ± 0.007
Hjernen 1.051 ± 0.007
Binyrene 1.063 ± 0.025
Skjelettlidelser muskel ** 1.074 ± 0.003
Data er betyr ± SD. spesifikke orgel/vev vekter ble bestemt i n = 18 griser (14 hunn og 4 mannlige griser, alder 60 dager til 2 år; kroppen vekt 30 – 250 kg). * Fettvev fra jejunal mesentery. ** Mener verdier for M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachii og M. gluteobiceps.
Fastsettelse av tredimensjonale innebygging-relaterte vev krymping under behandlingen av for histology (trinn 1.3, Figur 4) Orgel/vev Innebygging medium       fS
Nyre cortex (gris) GMA/MMA 0.89 ± 0,02
Epoxy 0,92 ± 0,02
Dataene er betyr ± SD av målinger av 24 prøver av 12 griser. fS: lineær krymping korrigeringsfaktoren.

Tabell 2: Representant resultatene av tettheter på valgte svin organer og vev7og lineær krymping korreksjonsfaktorer for innebygging-relaterte vev krymping av svin kortikale nyre vev i forskjellige plast innebygging media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generasjon av biobank prøvekolleksjoner fra svin dyremodeller krever robust teknikker og protokoller for fastsettelse av orgel/vev volumer, reproduserbare generering av representant, redundant vevsprøver egnet for en rekke analyse metoder, og for tilfeldiggjøring av retningen for eksempel deler for kvantitative stereological analyser. Metodene som er beskrevet i denne artikkel er tilpasset størrelsen på svin organer og vev, og er utviklet for å effektivt møte disse kravene2,7. De er basert på anerkjent metodologiske prinsipper og har tidligere vist deres gjennomførbarhet i forskjellige publiserte studier2,7,12,21. Utvalgte metoder er viktige for ulike typer studier undersøke vev/orgel prøver, siden de gir grunnlag for generering av representative utvalg og oppkjøp av en rekke parametere som ikke kunne ellers bestemmes. Disse metodene kan raskt utføres med liten innsats, og er kompatibel med nesten alle typer nedstrøms analyser. Derfor de anses egnet ikke bare for svin dyremodell biobank prosjekter, men er også nyttige i studier som involverer kvantitativ histomorphological analyser av andre store dyremodell arter (f.eks, sau), som vel som veterinær studier. Hensyntatt de tekniske aspektene ved ulike metoder, må noen avgjørende skritt og begrensninger vurderes ved implementering av protokoller av respektive teknikker.

Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel

Under bestemmelse av vev tettheter bruker neddykking metoden (trinn 1.1, figur 1, figur 2), omsorg må tas ikke å berøre indre veggene eller bunnen av kanne med Vevsprøve eller prøve abonnenten mens vevet er prøven neddykket i saltvann. Ellers vises skalaen vekten av prøven ikke vekten av volumet av saline fortrengt av prøven. For svært liten/lys vevsprøver (noen mg) er neddykking metoden for fastsettelse av vevs tetthet begrenset på grunn surface tension av saltkildene og negativt høy kvotienten av prøven volumet volumet av neddykking væske i begeret, som er hindrer at målingen. Her, brukes vekten av prøven for ytterligere beregninger i stedet for tetthet beregnet volumet. Fastsettelse av vev tettheter ved neddykking er ikke effektive for frisk (unfixed) lungevev, på grunn av inkonsekvent innholdet av luft i vev, og i noen tilfeller der organer er eksperimentelt perfused/innpodet med fiksativene.

Cavalieri metoden for fastsettelse av orgel volumer

Cavalieri volumetry av svin organer og vev er mer tungvint i forhold til fastsettelse av orgel volumet fra orgel vekt og tetthet. Men er det egnet for organer som ikke riktig veies på grunn av deres eksperimentelle behandling (f.eks, perfusjon-fast organer eller lungene innpodet fiksering løsning). Her kombineres metoden Cavalieri volumetry ideelt med volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll teknikken beskrevet i trinn 2 (figur 5, figur 6, Figur 12). Ved beregning av orgel/vev volumer fra områdene delen profiler av parallelle, equidistant skiver av orgel/vev (Cavalieri tilnærming, trinn 1.2, Figur 3), vedlikehold av retningen på vevet plater (øvre og nedre inndelingsplan ), samt den nøyaktig bestemmelse av alle delen profiler er av stor betydning. Spesielt hvis digitale bilder eller skanner av orgel plater analyseres planimetrically, må overprojections av vev (utenfor inndelte vev flyet) av vev SKIVE (Figur 12G-H) nøye vurderes å gi pålitelig volum estimater.

Fastsettelse av tredimensjonale innebygging-relaterte vev krymping under behandlingen av for histology

Omfanget av bygge-relatert vev krymping avhenger innebygging mediet og av vev, og kan også variere mellom ulikt behandlet eksempler av samme vev.

Mens frosne snitt anses å vise nesten ingen krymping i X-Y flyet, og plast innebygging årsaker generelt liten krymping av vev, er bygge-relaterte vev spesielt omfattende i parafin-embedded vevsprøver , og vil vanligvis betydelig svekke kvantitative morfologiske analyser av dimensjonale parameterne i histologiske deler av disse prøvene. I tillegg til store omfanget av samlet tredimensjonale krymping, parafin-innebygging fører også til en ikke-uniform, differensiell, Anisotrop og variabelt svinn av utvalget og ulike anatomiske strukturer, vev typer og celletyper i den vev eksempel8,13. Videre, spesielt i tykkere histologiske deler av parafin-embedded, omfanget av vev krymping også betydelig avvike i X-Y og Z-retningen for avsnittet. Dette kan skyldes en differensiell krymping av inndelingsområdet (i X-Y-retning) og delen høyden (dvs., loddrett snittykkelsen) under strekking i inndelingen i varm vev flotasjon vannbad etter avsnittet er kuttet fra vevet blokkere, og under de påfølgende behandling farging og coverslipping prosedyrene i delen montert på et glass lysbilde (dvs., en homogen kollaps av delene z-akse)8. I tillegg i tykke snitt, kan det være sammenlignbare sterkere komprimering av regionene delen-fly-nær vev i delen mens delen er kuttet fra vev blokken (som fører til en differensiell deformasjon av delene z-akse)19 . Disse effektene kan deretter også forvrenge anslag over antall vev strukturer i delen av forskjellige kvantitative stereological analyse metoder, for eksempel den optiske disector. Derfor er prediksjon, overvåking og korrigering av bygge-relatert vev krymping ikke mulig for parafin-embedded vev prøver8.

I kontrast, er omfanget av volum krymping av vevsprøver i plast harpiks, som GMA/MMA eller epoxy, betydelig lavere og, viktigst, mer enhetlig. Derfor innebygging i plastikk harpiks med en antatt homogen, isotropic og globale av vev er fordelaktig for flere analyseteknologi ulike kvantitative morfologiske parametere17,18. Ved beregning av vev krymping gjelder innebygging i plastikk harpiks, bør form av fast vev ikke i tillegg forvrenges ved innebygging prosedyren, å tillate sammenligning av tilsvarende delen profil områder av fast og innebygd prøver. Dette kan være vanskelig i myk eller lett Komprimerbar vevsprøver som liggende under adipose eller lunge vev eller vevsprøver med høyt væske innhold. Her innebygging av fast prøven i agar før snitting av vev er nyttig å stabilisere form av vev prøven under påfølgende plast innebygging prosedyre (protokollen trinn 1.3., Figur 4). For å oppnå pålitelige data, skal gjentatte målinger av bygge-relatert vev svinn utføres, og ulike utvalg av samme vev. Omfanget av bygge-relatert vev krymping uttrykkes som lineær vev krymping faktor fs (protokollen trinn 1.3.9., figur 4G). Eksempler på formler ved hjelp av fs for krymping korreksjon av ulike lengde, areal og volum parametere av ulike vev strukturer leveres i flere kvantitative stereological studier14, 21,27.

Volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av telling og behandling av vev underutvalg for ulike nedstrøms analysetyper

Presentert volum-vektet prøvetaking teknikken for svin organer bestemmer stikkprøvekontroll steder i vevet en gang, og deretter genererer alle nødvendige prøver for videre ulike analyser ved punktreduksjon av vevsprøver forbrukeravgift fra disse steder7. I volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll regimer, hver mulig utvalg plassering i det totale volumet av orgel/vev under eksamen har akkurat samme tilfeldig sjanse til samples, og generalizability er sikret ved en tilstrekkelig antall eksemplarer. Bruke volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll design for generering av prøver fra parenchymal organer, derfor forhindrer effektivt analyseresultater muligens partisk av (potensielt uventet og ukjent) ulike distribusjoner av forskjellige funksjonelle eller morfologiske vev egenskaper innen forskjellige steder i en organ, som har blitt vist, f.eksfor mener volumet og numeriske volum tetthet svin hepatocytes i ulike regioner i leveren parenchyma28 . Utvalgte "vev-slabbing og delsampling" strategi for svin organer kan er lett forståelig, overholder de tekniske kravene av nedstrøms analyser metoder, og raskt utført og tilpasset kravene til en bestemt studie, og dermed unngå systematisk prøvetaking biases, redusere eksperimentell variasjoner og øker presisjonen for generelle eksperimentet, mens å være mer effektiv enn prøvetaking strategier der hver enkelt prøvetaking plassering bestemmes tilfeldig9 ,15. Antall eksemplarer som må genereres, åpenbart avhenge av parameteren undersøkt og sin variasjon i prøver fra ulike steder av samplet orgel/vev. For generasjon biobank prøvekolleksjoner beregnet på tillate for undersøkelse av maksimalt ulike parametere (ikke angitt ved prøvetaking) av en rekke forskjellige analytiske metoder, planlegger slik fremtidsrettede prøvetaking strategi vanligvis generering av relativt høye antallet overflødige samplinger orgel/vev.

Generasjons Isotropic Uniform tilfeldig (IUR) deler og loddrett Uniform tilfeldig (VUR) deler for kvantitative stereological analyser

Noen av teknikkene som brukes for generering av IUR og VUR for kvantitative stereological analyser har noe komplisert teoretisk baser, og forklaringer er derfor ofte (unødvendig) unngikk av mange forskere, selv om deres praktiske er rimelig lett. VUR delene er spesielt lett å generere og er optimale for tetthet/areal beregninger i kombinasjon med cycloid test systemer8,9,20. De blir ofte foretrukket på grunn av kjente orienteringen for inndelingsplanet. Men i motsetning til IUR deler er VUR deler ikke egnet for estimering av lengde-parametere8,9.

Under utarbeidelsen av IUR og VUR, det kritiske trinnet er i utgangspunktet å opprettholde IUR eller VUR delen overflaten av fast prøven under innebygging i plastikk harpiks og å sikre at den loddrette aksen VUR deler alltid kan identifiseres (trinn 3, Figur 9, Figur 10, Figur 11).

I fremtiden, kan bredere anvendelse av metodene beskrevet ovenfor bidra betydningsfullt for å etablere konsekvent høy kvalitet standarder for generering av sammenlignbare, multi-purpose biobank prøver fra svin og andre store dyr modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Lisa Pichl for utmerket kundestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics