Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

Medicine

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Summary

Le applicazioni pratiche e le prestazioni dei metodi per la generazione di campioni di tessuto rappresentativo di porcini modelli animali per un ampio spettro di analisi a valle nella biobanca progetti sono dimostrati, tra cui volumetria, campionamento casuale sistematico, e trattamento differenziale dei campioni di tessuto per i tipi di analisi qualitative e quantitative morfologiche e molecolari.

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

Nella ricerca medica traslazionale, porcini modelli costantemente sono diventati più popolari. Considerando l'alto valore dei singoli animali, specialmente di maiale geneticamente modelli e il numero spesso limitata di animali disponibili di questi modelli, creazione di raccolte di (biobanca) dei campioni di tessuto adeguatamente elaborato adatto per un ampio spettro di metodi di analisi successive, incluse le analisi non specificati nel punto del tempo di campionamento, rappresentano significativi approcci per sfruttare appieno il valore traslazionale del modello. Per quanto riguarda le peculiarità dell'anatomia suina, le linee guida complete recentemente sono state stabilite per generazione standardizzato di rappresentante, campioni di alta qualità da suini diversi organi e tessuti. Queste linee guida sono prerequisiti essenziali per la riproducibilità dei risultati e la loro comparabilità tra diversi studi e gli investigatori. La registrazione dei dati di base, come pesi dell'organo e volumi, la determinazione di punti di campionamento e il numero di campioni di tessuto da generare, come pure loro orientamento, dimensione, elaborazione e indicazioni di rifilatura, sono fattori rilevanti determinazione della generalizzabilità e usabilità del campione per analisi morfologiche molecolari, qualitative e quantitative. Qui, una dimostrazione illustrativa, pratica e dettagliata delle tecniche più importanti per la generazione del rappresentante, multi-purpose biobanca esemplare da tessuti di origine suine è presentato. I metodi descritti qui includono la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità, l'applicazione di una procedura di campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume per organi parenchimali di punto-conteggio, determinare l'entità del restringimento del tessuto legate alla inclusione istologici di campioni e generazione di campioni orientati casualmente per analisi stereologiche quantitative, come le sezioni di casuale uniforme isotropici (IUR) generate dai metodi "Orientatore" e "Isector" e uniforme verticale sezioni (RVU) casuale.

Introduction

In medicina traslazionale, maiali sono sempre più comuni per uso come animale di grandi dimensioni modelli1,2,3,4,5, a causa di parecchie somiglianze vantaggiose tra il porcino e anatomia umana e fisiologia e la disponibilità di metodi biologici molecolari stabiliti permettendo per generazione di su misura, geneticamente modelli di maiale per una vasta gamma di condizioni di malattia1,4.

Tuttavia, rispetto ai modelli del roditore, il numero di animali di un modello di rispettivi maiale che possono essere fornite per gli esperimenti in qualsiasi momento è limitato. Ciò è dovuto l'intervallo di generazione porcino di circa un anno e gli sforzi finanziari e richiedono molto tempo richiesti per la generazione di modelli porcine e zootecnia. Pertanto, singoli animali di un modello porcino, come pure i campioni che possono essere generati da questi suini, sono molto utili, specialmente se geneticamente porcine modelli e/o a lungo termine problemi sperimentali (ad esempio, le complicazioni ritardate di malattie croniche) sono esaminate in individui invecchiati2,6,7.

Nel corso di qualsiasi studio, prestazioni di analisi aggiuntive che non era stata prevista nel progetto sperimentale iniziale dello studio più tardi potrebbero rivelarsi per essere rilevante, per esempio, all'indirizzo distinte domande derivanti da precedentemente scoperto risultati inattesi. Se non sono disponibili campioni idonei per tali ulteriori esperimenti, sproporzionatamente elevato costo e dispendiose spese potrebbero essere necessarie generare ulteriori maiali e campioni di tessuto. Per essere preparati per tali eventualità, generazione delle collezioni Biobanca di campioni di backup conservati di diversi organi, tessuti o bio-liquidi, quantitativamente e qualitativamente adatti per una vasta gamma di analisi successive, è considerato un importante approccio2,6,7. I benefici ottimali la derivazione da un modello animale porcino, la disponibilità di campioni adeguati biobanca offre anche la possibilità unica per eseguire un'ampia gamma di metodi differenti di analisi sui materiali campione identico a livello multi-organo nella stessa singoli animali, per esempio, di distribuzione dei campioni agli scienziati di diversi gruppi di lavoro organizzati in una rete di ricerca2,6,7. Inoltre, la strategia di campionamento ' lungimirante ' in biobanking contribuisce anche ad una riduzione del numero di animali necessari in uno studio. I vantaggi del modello porcino biobanking recentemente sono stati dimostrati in un multi-organo, multiomics studio, esaminante organo cross-talk in un modello porcino geneticamente di mellito di diabete a lungo termine, usando gli esemplari da Monaco di Baviera MIDY maiale biobanca 2.

Ci sono alcuni requisiti obbligatori biobanca campioni generalmente devono rispettare per stabilire l'affidabilità e l'interpretabilità dei risultati delle analisi eseguite successivamente. I campioni devono essere generati in modo riproducibile, e devono essere adeguatamente rappresentante, cioè, che riflette le caratteristiche morfologiche e molecolari interessate dell'organo/tessuto sono stati prelevati i campioni da7. Per essere adatto per una vasta gamma di tipi di analisi a valle, i campioni devono essere presi in quantità sufficiente e trattati secondo le richieste (comprese le condizioni di tempo e temperatura) dei metodi analitici diversi, tra cui descrittivo analisi istopatologiche, come cryohistology, paraffina e plastica istologia, immunoistochimica, ibridazione in situ , analisi al microscopio elettronico ultrastrutturali e analisi diagnostiche di laboratorio clinico, anche come molecolare analisi del DNA, RNA, proteine e metaboliti.

Per consentire la valutazione di una vasta gamma di parametri morfologici quantitativi distinti quali numeri, volumi, lunghezze o superfici di strutture di tessuto distinti dalle analisi stereologiche quantitative, sezione randomizzato gli aerei della campioni istologici dei rispettivi organi/tessuti devono essere preparati7,8,9,10,11. In studi morfologici quantitativi, la determinazione precisa del volume totale del tessuto, organo o vano di organo, i campioni sono stati prelevati da (cioè, lo spazio di riferimento) è fondamentalmente importante7,9 , 12 per calcolare le quantità assolute dei parametri interessati entro il rispettivo organo, tessuto o organismo. Alla fine, l'effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto durante la preparazione delle sezioni istologiche deve essere determinato e presi in considerazione13. Pertanto, analisi quantitative stereologiche, soprattutto di campioni archiviati (fissata i campioni di tessuto, tessuto incorporato blocchi, sezioni istologiche, ecc.) da studi precedenti sono a volte severamente limitata o addirittura impossibile12, specialmente se volumetria dei rispettivi organi/tessuti non è stata eseguita, se non disegni di campionamento adeguato sono stati applicati per mandato campioni rappresentativi, se i numeri e le quantità di campioni singoli disponibili non sono sufficienti, o se l'elaborazione della campioni è incompatibile con la valutazione dei parametri morfologici quantitativi di interesse di. A causa di molteplici fattori d'influenzano possibili, l'idoneità dei materiali di archivio-campione per l'analisi dei parametri morfologici quantitativi distinti non può essere risolta in modo inequivocabile, ma dipende la valutazione attenta di ogni singolo caso.

Così, come la posizione, dimensioni, numero, elaborazione, direzione di taglio e orientamento dei campioni potenzialmente influenzerà i risultati delle analisi successive, questi fattori sono di grande importanza e devono essere considerati nel disegno sperimentale di qualsiasi studio. Per quanto riguarda questi aspetti e le caratteristiche speciali dell'anatomia suina, linee guida di campionamento completo, dettagliato, su larga scala modelli animali adattati a suina recentemente sono stati stabiliti, fornendo un robusto riferimento standardizzato, riproducibile e generazione efficiente di campioni ridondanti, adeguatamente elaborati, di alta qualità da più di 50 diverse specie suina organi e tessuti6,7.

Le descrizioni metodologiche e il video tutorial illustrato nel presente articolo forniscono dettagliate, illustrativi, comprensibile, passo a passo le istruzioni per esecuzione pratica di una varietà di tecniche per volumetria, campionamento dei tessuti suine e organi e trattamento dei campioni di tessuto per metodi differenti di analisi a valle. Le tecniche consigliate includono metodi per la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità sulla base dei principi di Archimede e Cavalieri9, compresa la determinazione delle dimensioni del restringimento tridimensionale del tessuto relativo alla incorporamento in diversi incorporamento media14 durante l'elaborazione per esame istologico, applicazione del campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume praticabile si avvicina, elaborazione di campioni di tessuto campionata per diverse successive analisi7,8,9,15e generazione di opportunamente orientato ed elaborati campioni per potenziali analisi quantitative stereologiche7,8, 9,10,11. Accanto a loro applicazione nei progetti di porcino biobanca, i metodi hanno dimostrati sono generalmente adatti per tutti gli studi che esaminano proprietà quantitativa histo-morfologiche di organi/tessuti. Inoltre, disegni di campionamento casuale sistematico sono particolarmente utili per la generazione di campioni rappresentativi in esperimenti utilizzando metodi di analisi molecolare per rilevare alterazioni di abbondanza di, per esempio, RNA, proteine o metaboliti in vari organi e tessuti.

I prossimi paragrafi forniscono una breve introduzione a questi metodi, mentre loro prestazioni funzionali sono descritto nella sezione protocollo.

Determinazione dei volumi di organi/tessuti
Determinazione dei volumi e pesi dell'organo è importante in diverse impostazioni sperimentali, come questi fattori potrebbero indicare cambiamenti, potenzialmente correlati al sperimentalmente esaminati fattori di interesse. Il volume totale di un organo/tessuto è anche comunemente richiesto per il calcolo di parametri quantitativi assoluti, (ad esempio, il numero totale delle cellule), dalle densità numerica stereologically stima del volume (cioè, il numero di celle per unità di volume del tessuto)7,12. Oltre alle tecniche utilizzando attrezzature tecniche complesse, quali tomografia del calcolatore, ci sono fondamentalmente tre metodi pratici comunemente utilizzate per determinare il volume assoluto di un organo o tessuto. Il volume di un organo può essere determinato da "diretto misura volumetrica" secondo il principio di Archimede, cioè, misurazione del volume di acqua o soluzione salina spostato dalla struttura quando completamente sommerso. Tuttavia, per in modo paragonabile grandi organi porcini, questi approcci sono poco pratico e incline a imprecisione, poiché richiedono molto grande/misurazione volumetrica boccette. Più convenientemente, il volume di un organo/tessuto può essere calcolato dal suo peso e densità7,12,16, che può essere determinato in modo efficiente utilizzando il "metodo di immersione"7,12 ,16 (passaggio di protocollo 1.1.). Volumi di organo/tessuto possono inoltre essere stimate utilizzando la volumetria approcci basati sul "principio di Cavalieri" (1598-1647). In termini semplici, afferma il principio di Cavalieri, che, se due oggetti sono sezionati in piani paralleli ad un piano terra, e i profili delle sezioni tagliano attraverso i due oggetti alle corrispondenti distanze dal piano di terra hanno le stesse aree, i due oggetti hanno lo stesso volume. Quindi, il volume degli oggetti di forma arbitraria può essere valutato come il prodotto delle loro zone di profilo di sezione in sezione parallela, altrettanto lontani gli aerei e la distanza tra i piani di sezione. Questo è comprensibile con la seguente analogia: considera due stack composto lo stesso numero di monete identiche sono collocati fianco a fianco, uno stack con l'inserviente di monete impilata una sopra l'altra producendo una forma cilindrica dello stack delle monete e l'altro pila di monete con fuori centro posizionato monete (Figura 3A). Anche se le forme di entrambi gli stack di moneta sono diverse, i volumi sono gli stessi, poiché le zone delle monete a livelli corrispondenti di entrambi gli stack (vale a dire, le aree di profili di sezioni parallele tagliano attraverso entrambi gli stack di moneta a distanze uguali dalla terra) sono identici. Stima dei volumi di porcini organi e tessuti utilizzando il principio di Cavalieri7,12,15 è descritto al punto 1.2.

Determinazione del grado di restringimento del tessuto legata alla inclusione di istologico
Nelle analisi di diversi parametri morfologici quantitativi misurati nelle sezioni istologiche del tessuto, l'effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto che si verificano durante la lavorazione per l'istologia del tessuto deve essere determinato e presi in considerazione. L'entità del restringimento di incorporamento-relative del tessuto può essere variabile e dipende sia il tessuto, l'elaborazione e l'incasso medio8,13,17,18,19. Generalmente, cambiamenti relativi all'incorporamento del volume di un campione di tessuto (cioè, per lo più restringimento) si verificano in tutte le tre dimensioni dello spazio e, di conseguenza, influisce su tutti i parametri dimensionali stimati dalle analisi stereologiche quantitative8 . In sostanza, il grado di restringimento di incorporamento-relative del tessuto, espresso come il fattore di ritiro lineare tessuto (fS), può essere stimato come indicato al punto 1.3. e usate per la correzione di parametri morfologici quantitativi (restringimento sensibile)14.

Campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume di organi/tessuti
Istituzione di una raccolta di Biobanca di campioni dell'organo/tessuto suino, approcci sistematici di campionamento casuale-ponderato sul volume come descritti nel passaggio 2 hanno dimostrato di essere pratiche, risparmio di tempo ed efficienti tecniche per la generazione del rappresentante, tessuto multi-purpose campioni7,8,9,15.

Generazione di sezioni isotropica uniforme casuale e casuale uniforme verticale per analisi quantitative stereologiche
Biobanca di campioni di tessuto devono essere adatto per una vasta gamma di metodi differenti di analisi stereologiche quantitativa per la stima di un massimo di parametri che non potrebbe essere determinato senza un esemplare adeguatamente preparato. Quasi tutti i parametri quantitativi stereologiche possono essere determinati, utilizzando "isotropo (indipendente) casuale (IUR) sezioni uniformi"8,9. Nelle sezioni IUR, l'orientamento tridimensionale del piano di sezione del campione di tessuto è casuale. Ciò può essere ottenuto dalla randomizzazione della posizione del campione di tessuto rispetto alla posizione del piano di sezione, come applicato nei "Isector" metodo11 (punto 3.1 del protocollo), o da casualizzazione dell'orientamento del piano di sezione relativi alla campione di tessuto, come il metodo di "Orientatore"10 (passo 3.2 del protocollo). Nei campioni di tessuto, come la pelle o la mucosa esemplare Mostra un asse verticale naturalmente presente, o definito e correttamente identificabile, preparazione di "verticale uniforme casuale (RVU) sezioni" (fase di protocollo 3.3.) sezionato rigorosamente all'interno del piano di loro asse verticale è vantaggioso8,20. Per un discorso completo dei fondamenti teorici del campionamento IUR/VUR e una discussione esaustiva delle potenziali a valle analisi quantitativi stereologiche, si rimanda il lettore interessato ai libri di testo di stereology quantitativa nella vita Scienze8,9.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui utilizzano campioni di tessuto derivati da animali morti e rispondono pienamente le norme di legge tedesche del benessere degli animali.

1. volumetria

  1. Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo (Figura 1 e Figura 2) 7 , 12 , 16
    1. Preparare i materiali: bisturi lame, asciugamani di carta, una pinzetta, bilance da laboratorio standard, vetro o bicchieri di plastica, soluzione fisiologica allo 0,9% e portacampioni auto-costruito (Figura 2A).
    2. Asportare un pezzo di tessuto (dimensione massima: 2 x 2 x 2 cm3) dal organo/tessuto, in particolare dal vano dell'organo di interesse. Piccoli organi, ad esempio l'ipofisi o ghiandola pineale, sono misurati in toto.
      Attenzione: Assicurarsi che la dimensione del campione è considerevolmente più piccola rispetto al diametro interno del becher (passo 1.1.5 e segg.) e il suo livello di riempimento per consentire la completa immersione del campione senza contatto con le pareti interne del bicchiere nel passaggio 1.1.7.
    3. Tampone con cura il campione con un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso di sangue/tessuto.
    4. Pesare il campione su una scala di precisione e registrare il peso del campione (mS). Determinare il peso di piccoli campioni di tessuto con l'approssimazione di mg (Figura 1A).
    5. Posizionare un bicchiere riempito con soluzione fisiologica 0,9% temperatura sulla scala. Non riempire completamente il becher, per consentire un'immersione del campione del tessuto nel passaggio successivo senza fuoriuscirne.
      Attenzione: Usare una dimensione di Becher appropriata per le dimensioni e peso del tessuto il campione da misurare e la gamma di misurazione effettiva della scala. Per i più grandi campioni fino a 2 x 2 x 2 cm3, una dimensione di Becher di 50 – 100 mL è appropriata in combinazione con una scala di misura da circa 100 mg a 500 g, mentre per i piccoli campioni, utilizzare bicchieri di 5 – 10 mL di volume in combinazione con bilance di precisione con campi di misura tra circa 0,1 mg e 20 g.
    6. Immergere il portacampioni (cioè, un ciclo sufficientemente rigido di filo sottile o qualcosa di simile, Figura 2A) in saline a una posizione contrassegnata (frecce in Figura 1B, Figura 2Be Figura 2). Quindi, reimpostare (Tara) la visualizzazione della scala a zero.
    7. Fissare con attenzione il campione di tessuto per il portacampioni e immergere completamente il campione in saline fino a raggiungere la posizione segnata sul supporto del campione (frecce in Figura 1B, Figura 2Be Figura 2).
      Attenzione: Il campione sommerso e il supporto del campione non deve avere contatto con le pareti interne o il fondo del bicchiere o la superficie delle saline.
    8. Tenendo il supporto del campione e il campione sommerso in quella posizione, registra il peso visualizzato sulla scala (m.L), facendo riferimento al peso di salino spostata dal campione di tessuto (Figura 1 C, Figura 2B, e Figura 2).
    9. Calcolare il volume del campione (VS) da m.Le la densità della soluzione fisiologica a temperatura ambiente (20 ° C) (ρSalina = 1,0048 g/cm ³) come VS = mL/ ΡSalina [g/g/cm ³] (Figura 1).
    10. Calcolare la densità del campione tessuto (ρcampione) da (cioè, massa) il peso del campione (mS) e il suo volume (VS): campione ρ = mS /VS[g/cm ³] (Figura 1).
    11. Per organi misurati in toto, ripetere la misurazione tre volte e calcolare la densità media dell'organo dai valori di misurazione singola. Per i grandi organi/tessuti, eseguire misurazioni ripetute con diversi campioni del compartimento stesso organo/tessuto/organo e calcolare la densità media da singole misurazioni, di conseguenza.
    12. Calcolare il volume totale del vano organo/tessuto/organo dal suo peso e la densità (Figura 1).
  2. Applicazione del Cavalieri-metodo per la determinazione dei volumi di organo di suino 7
    1. Preparare i materiali: righello, pinza, coltello, forbici, pinze, pennarello, plastica lucidi, scanner, foto fotocamera e croce griglie stampate su plastica lucidi.
    2. Posizionare l'intero organo/tessuto su una superficie piana (base di taglio) e misurare la lunghezza (l) dell'organo lungo il suo asse longitudinale (Figura 3B, Figura 5A).
    3. Tagliare l'organo/tessuto completo a fette paralleli equidistanti ortogonale all'asse longitudinale dell'organo (Figura 3, figura 5B). Scegliere una distanza d tra due sezioni sufficientemente piccoli per ricevere un numero sufficiente di tessuto/organo lastre (cioè, lo spessore di sezione intervallo/sezionamento, solitamente circa 1 cm). Posizionare in modo casuale la prima sezione a distanza tra 0 e l'intervallo di taglio dal margine dell'organo. Mentre affettare, giudicare visivamente la posizione e l'orientamento di ogni piano di sezione, per ottenere lastre di circa parallelo organo/tessuto di spessore uniforme.
      Nota: Il numero necessario di tessuto/organo lastre dipende la forma e la dimensione del organo/tessuto esaminato. Se piccoli organi o campioni devono essere sezionato in lastre sottili di ≤ 5 mm, incorporare i campioni in agar prima del sezionamento (v. punto 1.3.3) e utilizzare un dispositivo tecnico per affettare del campione incorporato agar. Intervalli di sezionamento empiricamente raccomandabili per suini più organi e tessuti, così come esempi per i dispositivi di sezionamento, sono indicati nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7.
    4. Posizionare tutte le lastre di organi/tessuti sulla stessa superficie rivolta verso il basso (vale a dire, sempre sulla destra o il piano di sezione a sinistra di ogni lastra di organo, Figura 3D, Figura 5) sulla base di taglio e contare le lastre (n).
    5. Ottenere profili di sezione delle lastre del tessuto da uno dei seguenti approcci:
      1. Posizionare le lastre di tessuto su adeguatamente etichettati plastica lucidi, mantenendo l'orientamento delle loro superfici di sezione superiore e inferiore. Tracciare i contorni delle lastre del tessuto sui lucidi plastica utilizzando un pennarello (3E figura1-2).
      2. Prendere immagini fotografiche delle lastre del tessuto, tenendo la fotocamera in posizione verticale sopra le superfici di sezione (Figura 3F). Per la calibrazione, posizionare un righello di dimensioni accanto le lastre di tessuto.
      3. Scansione delle lastre di tessuto su uno scanner piano mantenendo l'orientamento delle loro superfici di sezione superiore e inferiore (Figura 3). Per la calibrazione, posizionare un righello di dimensioni accanto le lastre di tessuto.
    6. Misurare le aree dei profili (tracciati, fotografati o digitalizzato) sezione di tutte le lastre di tessuto da uno dei seguenti approcci:
      1. Sovrapposizione o sovrapporre i profili di lastra organo tracciata con una griglia di dimensione appropriate, calibrato di ugualmente distanziati croci stampato su una plastica trasparenza e conteggio tutti attraversa colpendo la zona di profilo (Figura 3E3-4; confronta con Figura 5). Calcolare l'area di sezione di profilo di ogni lastra di organo moltiplicando il numero di croci colpendo la zona di profilo nell'area corrispondente a una croce.
        Nota: Per ricevere il volume sufficientemente preciso stima, scegli una griglia incrociata con una distanza sufficientemente piccola tra croci adiacenti, così che una media di almeno 100 attraversa colpirà le superfici di sezione delle lastre di un organo in ogni caso esaminato dello studio . Il materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7sono indicate dimensioni empiricamente raccomandabile griglia trasversale per suini più organi e tessuti.
      2. Misurare le aree delle lastre del tessuto nelle immagini digitali delle foto/scansioni utilizzando appropriato disponibile in commercio o freeware morfometria morbido - e applicazioni hardware (Figura 3 H), ad esempio un'immagine commerciale analisi sistema21, o ImageJ22.
        Attenzione: Nota che una lastra di tessuto (il primo o l'ultimo) viene inserito nello scanner che riposa sulla sua superficie naturale, rispettivamente, rivolto verso la videocamera con la superficie naturale. Pertanto, la scansione di immagine, l'immagine della foto di questa lastra, non mostrerà una superficie di sezione. Di conseguenza, nessun profilo di zona di sezione viene misurato nell'immagine immagine/foto digitalizzata di questa lastra di tessuto (Figura 3I). Anche la sovra-proiezione nota presente in immagini digitalizzate e fotografie di lastre di organi/tessuti, cioè, solo misurare le aree dei profili sezione effettiva, ma non del tessuto nell'immagine che si trova dietro la superficie di sezione di solaio (Figura 12 G-H).
    7. Calcolare il volume stimato dell'organo come il prodotto della somma di tutte le aree di sezione di profilo corrispondente di tutte le lastre di tessuto per caso (cioè, sempre di destra o sinistra, rispettivamente, la superficie di sezione superiore o inferiore di ogni organo della lastra e lo spessore medio delle lastre (cioè, il quoziente della lunghezza misurata sull'asse verticale dell'organo (l) e il numero di lastre)15.
  3. Determinazione del grado di restringimento del tessuto tridimensionale incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per istologia
    1. Preparare i materiali: microtomo lame, forcipe, agar, stampi di colata del metallo, scanner digitale e dimensioni righello (ad es., carta millimetrata).
    2. Tagliare una superficie di sezione piana fresco, da un campione di tessuto fisso.
      Nota: Se facilmente utilizzando campioni di tessuti (molli) deformabili (tessuto grasso, tessuti gelatinosi), incorporare il campione di tessuto fisso in agar prima del taglio (Figura 4A).
    3. Per incorporare campione in agar:
      1. Mescolare polvere di agar standard come usato per mezzo di coltura di microbiologia con un volume adeguato di acqua (circa 0,5 – 1 g agar/10 mL di acqua) in un becher di vetro. Mescolate il composto e scaldarla nel forno a microonde a 700 W fino a ebollizione per 3 – 5 s. mescolare il composto e far bollire ancora per 3 – 5 s.
      2. Facoltativamente, per aumentare il contrasto dell'agar per il campione di tessuto, tingere l'agar liquido, per esempio, con inchiostro nero (aggiungere 1 mL di inchiostro a 10 mL di agar di liquido caldo e mescolare energicamente).
      3. Versare l'agar caldo in uno stampo di colata (ad esempio, uno stampo di metallo utilizzato per paraffina incorporamento, Figura 10A-D) e immergere il campione di tessuto fisso nell'agar caldo. Lasciate che l'agar raffreddare fino a solidificazione, rimuovere la muffa e tagliare il blocco di agar con il tessuto incorporato utilizzando un microtomo o una lama di rasoio.
        Attenzione: Durante la manipolazione di agar liquido caldo, indossare guanti e occhiali protettivi. Processo tessuto campioni fissati in soluzione di formaldeide sotto uno scarico cappa e indossano occhiali protettivi e guanti da laboratorio.
    4. Posizionare il campione con la sua superficie di sezione rivolto verso il basso su uno scanner piano, insieme a un righello di dimensioni e la superficie di sezione (fig. 4AB) la scansione.
    5. Determinare l'area della superficie di sezione del campione tessuto fisso (unaf) durante la scansione digitale, utilizzando una delle tecniche descritte nel punto 1.2.6 (Figura 4B).
    6. Incorporare il campione in plastica mezzo di inclusione, come la resina epossidica (ad es., Epon) o glycolmethacrylate/metilmetacrilato (GMA/MMA)23, seguenti protocolli standard23,24,25 ( Figura 4). Assicurarsi che la superficie di sezione del campione fisso analizzato nel passaggio precedente (1.3.4) viene mantenuta nel campione di plastica incorporato.
      Nota: Per mantenere l'orientamento della superficie sezione del campione durante l'elaborazione del campione, costantemente il campione viene posto con la sua superficie di sezione desiderato rivolto verso il basso verso la cassetta incasso o lo stampo di colata o contrassegnare la sezione desiderata superficie (o dalla parte opposta del campione) con inchiostro.
    7. Tagliare una sezione istologica da plastica blocco corrispondente alla superficie di sezione originale del campione tessuto fisso (passo 1.3.2) usando un microtomo (Figura 4), montare la sezione su un vetrino (Figura 4) e macchiarlo ordinariamente ( ad esempio, ematossilina ed eosina macchia, H & E)24,25.
      Attenzione: Per ricevere una sezione istologica approssimativamente nello stesso piano della superficie di sezione originale del campione tessuto fisso, regolare con cura la posizione del blocco di plastica sul Monte del microtomo prima di sezionamento.
    8. Porre il vetrino con la sezione macchiata rivolto verso il basso su uno scanner piano con un righello di dimensione e la scansione della sezione (Figura 4E).
    9. Determinare l'area della sezione del campione di tessuto di plastica (Ae) nella scansione digitale, utilizzando una delle tecniche descritte nel passaggio 1.2.6 (Figura 4F).
    10. Calcolare il restringimento del tessuto medio incorporamento-correlati (per i rispettivi tessuti e mezzo di inclusione) dalle aree misurate dei corrispondenti profili di sezione dei campioni di tessuto prima e dopo l'incorporamento in plastica mezzo di inclusione. Il fattore di ritiro lineare fs viene calcolata come la radice quadrata del quoziente delle zone dei profili sezione dei campioni di tessuto n dopo l'incorporamento in plastica incorporamento medio (Ae) e le zone della profili di sezione corrispondente dei campioni di tessuto stesso prima di incorporare in plastica montante (unaf) (Figura 4)14.

2. volume-weighted campionamento casuale sistematico di punto di conteggio e l'elaborazione dei sottocampioni di tessuto per diversi tipi di analisi a valle7

  1. Preparare i materiali: righello, pinza, coltello, forbici, pinze, pennarello, punto/croce griglie stampate su plastica lucidi e tabelle di numero casuale.
    Nota: Modelli di copia per croce griglie (5-60 mm) sono disponibili nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7.
  2. Posizionare l'organo/tessuto su una superficie piana (base di taglio) e misurare la lunghezza (l) dell'organo lungo il suo asse longitudinale (Figura 5A, Figura 6A).
  3. Tagliare l'organo/tessuto completo a fette paralleli equidistanti ortogonale al suo asse longitudinale (figura 5B). Scegliere una distanza d tra due sezioni (cioè, l'intervallo/spessore di sezionamento, solitamente circa 1 cm) abbastanza piccoli per ottenere un numero sufficiente di fette di tessuto/organo. Posizionare in modo casuale la prima sezione a distanza tra 0 e l'intervallo di taglio dal margine dell'organo. Mentre affettare, giudicare visivamente la posizione e l'orientamento di ogni piano di sezione per ottenere lastre di approssimativamente parallelo organo/tessuto di spessore uniforme.
    Nota: Il numero di lastre di tessuto/organo necessario dipende dalle dimensioni dell'organo/tessuto esaminato e il numero delle posizioni dei tessuti campionati. Se piccoli organi o campioni devono essere sezionato in lastre sottili di ≤ 5 mm, incorporare i campioni in agar prima del sezionamento (v. punto 1.3.3) e utilizzare dispositivi tecnici per affettare del campione incorporato agar. Intervalli di sezionamento empiricamente raccomandabili per suini più organi e tessuti, così come esempi per affettare dispositivi sono indicati nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7.
  4. Posizionare tutte le lastre di organi/tessuti sulla stessa superficie rivolta verso il basso sulla base di taglio (Figura 6B).
  5. Sovrapposizione delle lastre di tessuto con una griglia di dimensione appropriate Croce stampate su una trasparenza plastica inserendo più esterno sinistra superiore trasversale della griglia sopra un punto casuale fuori il tessuto (Figura 5-D, Figura 6B).
    Nota: Scegliere una griglia incrociata con una distanza sufficientemente piccola tra croci adiacenti, in modo che in ogni caso esaminato dello studio, almeno due volte come molte croci colpirà le superfici di sezione del vano del tessuto da sottoporre a campionamento, come il numero di campioni che devono da quello scompartimento del tessuto prelevato. Il materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7sono indicate dimensioni empiricamente raccomandabile griglia trasversale per suini più organi e tessuti.
  6. Mark e conteggio di tutte le croci che colpisce il tessuto (rispettivamente, il tessuto sub-vano da campionare). Applicare in modo coerente una modalità uniforme di conteggio e numerazione delle croci colpendo il vano del tessuto da campionare in tutte le lastre di tessuto, per esempio, di numerazione delle rispettive croci in ciascuna riga per riga, da sinistra a destra e da dall'alto in basso, o, per esempio, numerando le croci in lastra di tessuto uno dopo l'altro in senso orario, a partire con la croce più vicina alla posizione 12, come esemplarmente dimostrato in Figura 5E.
  7. Dividere il numero di croci colpendo il vano del tessuto/tessuto per essere inclusi nel campione (n) per il numero di campioni deve essere generato per ottenere l'intervallo di campionamento sistematico (i).
  8. Determinare la posizione di campionamento prima scegliendo un numero casuale x nell'intervallo compreso tra 1 e io. Per questo, utilizzare una tabella di numeri casuali. Contrassegnare la prima posizione di campionamento (x) e ogni successivo x + i, x + 2ho, x + 3i, ecc., cross colpendo il vano del tessuto/tessuto da sottoporre a campionamento sulla trasparenza in plastica utilizzando un pennarello (Figura 5F).
    Nota: Tabelle numero casuale possono essere comodamente e rapidamente generate utilizzando un generatore di numeri casuali online.
  9. Tag il tessuto percorsi corrispondenti per il marcato attraversa sollevando leggermente la trasparenza plastica e posizionando un piccolo pezzo di carta coriandoli pulito, vuoto sulla superficie della lastra del tessuto usando un paio di pinzette (Figura 5, Figura 6E ).
  10. Recidere dei campioni di tessuto dai percorsi campionati (Figura 5 H, Figura 6F, figura 7A) e suddividere ulteriormente le loro per diversi tipi di analisi successive (Figura 6, figura 7A-B), come specificato nella Tabella 1.
  11. Dopo il campionamento, pulire i lucidi in plastica con acqua tiepida e sapone, asciutto e riutilizzarli.

3. generazione di sezioni casuale uniforme isotropo (IUR) e verticale uniforme casuale (RVU) per analisi Quantitative stereologiche

  1. Tecnica di "Isector"
    1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, stampi di colata sferica (ad es., stampi pressofusione di praline, che possono essere ottenuti dai fornitori di dolciumi), foldback morsetti e pinze.
    2. Posizionare un pezzo adeguatamente dimensioni (1 x 1 x 1 cm3) di fisso, sistematicamente in modo casuale a campionamento del tessuto in uno stampo di colata sferica, tenere insieme di foldback morsetti e riempite lo stampo con agar liquido caldo (Figura 8A-E).
    3. Rimuovere la sfera di agar (Figura 8F) dallo stampo colata dopo la solidificazione dell'agar.
    4. Rotolare la sfera di agar con il campione di tessuto incorporato attraverso la tavola, interrompere e nella sezione in una posizione casuale.
      Nota: Il piano di sezione risultante è una sezione IUR (Figura 8F-G).
    5. Procedere per incorporare il campione di tessuto in resina plastica come GMA/MMA, mantenendo l'orientamento della sezione IUR aereo (Vedi 1.3.5).
  2. Tecnica di "Orientatore"
    1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, forcipe, / e di numero casuale, stampe dei cerchi equiangoli e ponderati per il coseno.
      Nota: Modelli di copia dei cerchi sono forniti in precedenti pubblicazioni8,26.
    2. Posizionare il campione di tessuto fisso (o di tessuto fisso agar) su una stampa di un cerchio equiangolo con un bordo parallelo 0-180 ° direzione (Figura 9A, Figura 10E).
    3. Determinare un angolo casuale utilizzando la tabella dei numeri caso. Trovare i segni corrispondenti alla scala del circolo equiangolo, che il campione si basa su. Usando questi segni, tagliare una sezione attraverso il campione (o l'agar che circondano il campione di tessuto incorporato), con il piano di sezione viene orientato parallelamente alla direzione dell'angolo casuale indicata sulla scala del circolo equiangolo e verticale per la superficie del campione (figura 9B-C, Figura 10F) di riposo.
    4. Posizionare il blocco di tessuto con la superficie di sezione generata nel passaggio precedente inconveniente su un cerchio ponderati per il coseno di fronte con il bordo del piano d'appoggio posizionato parallelamente alla direzione di 1-1 (Figura 9, Figura 10 H).
    5. Ripetere il punto 3.2.3 e tagliare una nuova sezione attraverso il campione ad angolo casuale determinato utilizzando la tabella dei numeri caso (Figura 9E-F, Figura 10I-J).
      Nota: Il piano di sezione risultante è una sezione IUR.
    6. Se del caso, determinare l'area del profilo sezione IUR del campione tessuto fisso per la determinazione del restringimento incorporamento-relative del tessuto (Figura 9-J) come descritto al punto 1.3 e procedere per incorporare il campione di tessuto in plastica resina ad esempio GMA/MMA.
  3. Generazione delle sezioni verticale uniforme casuale (RVU)
    1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, forcipe, / e di numero casuale e stampe di cerchi equiangoli.
      Nota: Modelli di copia dei cerchi sono forniti in precedenti pubblicazioni8,26.
    2. Definire un asse verticale all'interno del campione di tessuto fisso che è sempre riconoscibile nelle sezioni/campione durante le fasi successive.
      Nota: In genere, l'asse verticale per la superficie naturale del campione di tessuto viene scelto come l'asse verticale.
    3. Se appropriato, è possibile incorporare il campione in agar (Figura 11B).
      Nota: Prima del VUR - o IUR-sezionamento del campione fisso Agar-incorporamento è generalmente raccomandabile per campioni piccoli, sottili, fragili o morbidi. Anche utilizzare agar-incorporamento di campioni per facilitare il posizionamento del campione VUR sezionato durante l'incorporamento successive del campione nel terreno di resina plastica.
    4. Il campione viene posto su una stampa di un cerchio equiangolo, con l'asse verticale essendo orientato ortogonalmente al piano del tavolo tavolo/carta (Figura 11).
    5. Tagliare il campione ad angolo casuale (determinato utilizzando una tabella di numeri casuale) con il piano di sezione ortogonale al tavolo e parallelo all'asse verticale di ricevere un piano di sezione VUR (Figura 11).
    6. Se del caso, determinare l'area del profilo sezione IUR del campione tessuto fisso per la determinazione della contrazione tessuto incorporamento-correlati come descritto al punto 1.3 (confronta Figura 9-J) e procedere per incorporare il campione di tessuto in resina plastica quali GMA/MMA.

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Representative Results

Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo

Figura 12A -B Mostra il rappresentanza determinazione della densità e il volume di un rene porcino usando la tecnica di immersione descritta nel passaggio 1.1 (Figura 1, Figura 2). Risultati più rappresentativi delle misurazioni di densità di suini ulteriori organi e tessuti sono presentati nella tabella 2. Un elenco più completo delle densità di riferimento di suini diversi tessuti e organi è mostrato in "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7. La validità dei valori di misura di densità del tessuto ottenuti utilizzando il metodo di immersione può essere stimata da misure ripetute dello stesso campione e di campioni indipendenti. Tessuti più porcini di visualizzare i valori di densità leggermente superiori di acqua (ρdell'acqua ≈ 1.0), mentre tessuti nuoto in soluzione salina (tessuto adiposo, tessuto polmonare) visualizzare densità < 1.0.

Metodo di cavalieri per la determinazione dei volumi di organo

Figura 12 -F Mostra il rappresentanza determinazione del volume di porcino del rene (l'organo stesso come mostrato in Figura 12A-B). Le aree delle superfici delle lastre organo sezione sono state determinate dal conteggio di punto, utilizzando una griglia sovrapposta Croce stampata su una trasparenza di plastica, così come tramite la misura planimetrica delle zone sezione di lastre di organo in un'immagine digitalizzata delle lastre (a pagamento attenzione alla proiezione eccessiva di tessuto che si trova dietro le superfici di sezione di lastre, Figura 12 G-H). La precisione del volume di organi/tessuti dati ottenuti dalle prestazioni dell'approccio Cavalieri (punto 1.2, Figura 3) possono essere stimati in confronto al rispettivo volume calcolato dal peso e densità del organo/tessuto. I volumi del rene ha esaminato nella Figura 12 determinata dal metodo di immersione e la scelta delle modalità di Cavalieri ha differito da meno dell'1% da altro. Come una misura della precisione delle stime del volume di Cavalieri, il relativo coefficente di errore (CE) può essere calcolata, come descritta precedente15.

Determinazione del ritiro tridimensionale del tessuto di incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per istologia

Risultati rappresentativi del grado di restringimento del tessuto legata alla inclusione di campioni di tessuto suino (tessuto corticale renale) in resine plastiche (GMA/MMA o resina epossidica) per quantitativi istomorfologiche esame sono mostrati nella tabella 2 (in precedenza dati non pubblicati). I fattori di ritiro lineare indicati nella tabella 2 sono stati determinati come descritto al punto 1.3 (Figura 4). Si riferiscono ad una riduzione di volume tridimensionale del 29% per l'incorporamento di GMA/MMA e 22% per resina epossidica embedding del tessuto renale corticale suino. Figura 13 Mostra esempi rappresentativi di adeguatamente e sufficientemente preparati campioni di tessuto adiposo agar-embedded, formalina-fisso per la misura dell'area campione sezione prima dell'inclusione in plastica.

Campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume di punto di conteggio e l'elaborazione dei sottocampioni di tessuto per diversi tipi di analisi a valle

La tecnica "sezionamento e punto di conteggio" per campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume degli organi parenchimali (passaggio 2, Figura 5, Figura 6, Figura 7) rappresenta un metodo stabilito, robusto per la generazione del rappresentante campioni per più tipi di successivi di analisi2,7. Risultati rappresentativi della generazione dell'esemplare biobanca sistematicamente casualmente campionata, altamente ridondanti di varie specie suini organi e tessuti, con successiva elaborazione differenziale dei campioni di tessuto asportato per differenti di multiplo a valle metodi di analisi utilizzando la tecnica di campionamento descritta nel passaggio 2 (Figura 5, Figura 7ed exemplarily ha dimostrato in Figura 6) sono stati precedentemente pubblicati2. Per la generazione di biobanca campioni di tessuto del fegato in un precedente porcina biobank Studio2, ad esempio, fegati porcini completamente sono stati sezionati in circa 20 lastre di 2-3 cm di spessore, sovrapposti con un con un 3 cm attraversare la griglia, come descritto nel passaggio 2 e 16 posizioni di tessuto di circa 2 x 2 x 2 cm3 erano sistematicamente in modo casuale a campionamento e asportati in ogni caso. Da ciascuno dei campioni asportati, cinque sottocampioni successivamente sono stati generati per analisi molecolari (congelate a-80 ° C) delle posizioni campionate, un sottocampione per cryohistology, un sottocampione è stato risolto nella soluzione di Methacarn e nella soluzione di formaldeide per paraffina successivo incorporamento e istologico- e l'esame di immunohistochemical. La generazione di 74 diversi campioni per caso (fino al congelamento o trasferimento dei campioni in soluzione di fissazione) è stata realizzata in circa 20 minuti, in media2. Il praticabilità/successo di campionamento descritto e di sottocampionamento approccio può essere stimato dalla valutazione della qualità dei campioni generati (vale a dire, la qualità del RNA o la proteina isolati, conservazione dell'istomorfologiche e Proprietà ultrastrutturali di campioni di tessuto, la loro idoneità per analisi immunoistochimiche, ecc.)2

Generazione di sezioni casuale uniforme isotropo (IUR) e verticale uniforme casuale (RVU) per analisi Quantitative stereologiche

Illustrate le tecniche per una generazione avanti-orientata di sezioni (IUR) isotropici casuale uniforme e VUR da campioni di tessuto porcino (biobanca) (passaggio del protocollo 3, Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11), che consente l'esame della maggior parte dei parametri quantitativi stereologiche, rapidamente può essere compiuto con una certa pratica e senza difficoltà ragionevole o fonti di errore. Di conseguenza, la generazione di IUR-negli esempi illustrati in Figura 9 (tecnica di isector) e Figura 10 (tecnica di orientatore) è pienamente rappresentativa per questi metodi.

Figure 1
Figura 1: illustrazione schematica della tecnica"immersione" per la determinazione della densità di tessuto/organo. (A) misurazione del peso del campione (cioè, massa, m.S). (B) scala tarata al peso di un becher riempito con soluzione fisiologica 0,9% di 20 ° C e un portacampioni sommerso nella soluzione salina in una posizione definita, contrassegnata. (C) completa immersione del campione verso la posizione rilevata del supporto del campione senza alcun contatto con le pareti interne o il fondo del bicchiere. Il peso visualizzato il saldo è il peso del volume di soluzione fisiologica spostato dal campione). La densità del campione è calcolata come indicato (qui: campione ρ = mS/VS = mS/ (m.L/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1,141 g/cm ³). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: "Tecnica di immersione" per la determinazione della densità di tessuto/organo. (A) diversi portacampioni costruiti con filo sottile. Da sinistra a destra: un cappio di filo sottile attraverso una cannula sottile iniezione, un cesto di elicoidale del filo per tenere esemplari piccoli e fragili e una semplice fionda di filo sottile. Frecce in A-C indicano le posizioni a cui i portacampioni sono immersi in soluzione fisiologica. (B, C) Posizionamento del supporto del campione durante l'inondazione del campione in soluzione salina (confronta Figura 1 C). (B) completa porcina ghiandola pituitaria inseriti in un supporto a forma di cestino. (C) campione del miocardio porcina. Si noti la sommersione completa dei campioni in soluzione salina senza contatto con le pareti o il fondo del bicchiere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: illustrazione schematica dell'applicazione del metodo per la determinazione dei volumi di organo porcina Cavalieri. (A) moneta pila esempio per la comprensione del principio di Cavalieri. Per dettagli, vedere Introduzione. (B-H) Schematica dimostrazione di stima del volume di un rene di aspersione-risolto. (B) misurazione della lunghezza (l) del rene lungo il suo asse longitudinale. (C) taglio dell'organo completo in n ugualmente denso (d) parallelo fette ortogonale all'asse longitudinale dell'organo. (D) lastre di organo collocato sulla stessa superficie rivolta verso il basso. Si noti che la prima lastra di tessuto (a destra) è posizionato sulla sua superficie naturale, vale a dire, non ha una superficie di sezione. (E-H) Diversi approcci per determinare le aree di superficie di sezione delle lastre del tessuto. (E) traccia il contorno di ogni lastra di organo con un pennarello su una sovrapposizione di plastica trasparenza dei profili lastra organo strutturato con una dimensione adeguata, calibrato Croce griglia stampata su una trasparenza di plastica, contiamo di croci colpire la area di profilo. L'area di profilo sezione di organo lastra viene calcolato dal numero di croci che colpisce l'area della sezione di profilo e l'area corrispondente a una croce. (F,G) Determinazione delle aree di sezione dell'organo lastre in immagini fotografiche scattate in orientamento verticale per le superfici di sezione (F), o in immagini digitalizzate delle lastre del tessuto (G), con i righelli per la calibrazione. (H) determinazione della sezione aree del tessuto delle lastre nelle immagini digitali delle foto/scansioni utilizzando applicazioni software morfometria appropriato. Zona (io) calcolo del volume stimato dell'organo come il prodotto del valore cumulativo delle corrispondenti superfici di sezione di tutte le lastre di organo moltiplicate per lo spessore medio dell'organo lastre15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: illustrazione schematica della determinazione di restringimento del tessuto tridimensionale incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per istologia. (A) taglio di una superficie di sezione fresca, piano da un campione di tessuto fisso (stabilizzazione della forma dei tessuti (molli) facilmente deformabili come tessuto adiposo o polmone incorporando in agar prima del sezionamento). Scansione della superficie del campione con un righello di dimensione sezione. (B) determinazione planimetrica dell'area della superficie del campione tessuto fisso (unaf) sezione. Routine (C) l'incorporamento del campione in plastica mezzo di inclusione. (D) preparazione di una sezione istologica del blocco in plastica con conservazione del piano di sezione del campione. Montaggio della sezione su un vetrino e colorazione di routine della diapositiva. (E) scansione della diapositiva con un righello di dimensione. (F) determinazione planimetrica dell'area della sezione del campione di plastica incorporato (Ae). (G) calcolo del limite del restringimento del tessuto incorporamento-correlate come il quoziente tra le aree misurate di corrispondenti profili di sezione dei campioni di tessuto prima e dopo l'incorporamento in plastica incorporamento media14. Immagini sulla destra mostrano la superficie di sezione di un campione di formaldeide-fisso del tessuto grasso incorporato in agar annerito inchiostro prima di incorporare in resina plastica (in alto) e il profilo di sezione corrispondente (HE-macchiatura) del campione GMA/MMA-incorporato (in basso). Scala bar = 2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: illustrazione schematica del campionamento casuale sistematico ponderato sul volume. L'esempio presentato Mostra campionamento sistematico casuale di sei sedi di tessuto all'interno della corteccia renale di un rene di aspersione-risolto. (A) misurazione della lunghezza (l) del rene lungo il suo asse longitudinale. (B) completa sezionamento dell'organo intero fettine ugualmente spesse (d) parallela ortogonale all'asse longitudinale dell'organo. (C) lastre di organo/tessuto collocato sullo stesso (vale a dire, la destra o la sinistra) superficie rivolta verso il basso. (D) sovrapposizione delle lastre con una griglia di dimensione appropriate croce tessuto stampato su una trasparenza di plastica. Il più esterno a sinistra traversa superiore della griglia è posizionato sopra un punto casuale di fuori del tessuto (indicato da un punto blu, ). (E) Counting e numerazione di tutte le croci che colpisce la corteccia renale. Nell'esempio, le croci che colpisce la corteccia renale sono numerate consecutivamente in lastra di un rene dopo l'altro (da sinistra a destra), in ogni procedimento di lastra in senso orario, a partire con la croce più vicina alla posizione 12. Qui, 36 croci ha colpito la corteccia renale. Sono sei posizioni di campionamento da campionare. Di conseguenza, ogni sesta posizione dove una croce colpisce il tessuto viene campionata (36/6 = 6). (F) nell'esempio, la posizione del quarto trasversale (N ° 4) colpendo la corteccia renale viene scelto casualmente come la prima posizione di campionamento. Ogni seguente attraversare sesto colpendo la corteccia renale è contrassegnata sulla trasparenza in plastica utilizzando un pennarello. Nell'esempio, queste sono le posizioni 4, 10, 16, 22, 28 e 34. (G) Tagging delle corrispondenti posizioni del tessuto di piccoli pezzi di carta coriandoli pulito, vuoto posizionato sulla superficie del tessuto. (H) l'asportazione di campioni di tessuto dalla località casualmente sistematicamente campionata e successiva elaborazione per ulteriori analisi. Questa figura è stata modificata da Albl et al (2016), figure S236 e S237, pagina 186 (supplementi)7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: ponderati per il Volume di campionamento casuale sistematico della corteccia renale di un rene porcina (vedere Figura 5) e le regole per il conteggio di punto. Rene di maiale fresco (A). (B) rene sezionato fette ugualmente spesse parallela ortogonale all'asse longitudinale dell'organo, sovrapposti con croce griglia stampata su una trasparenza di plastica. Il cerchio rosso indica la posizione del punto casuale utilizzato per randomizzare la posizione della griglia trasversale. (C) illustrazione di regole di calcolo dei punti: un cross/point viene conteggiato come colpire il vano del tessuto per essere campionata (compartimento di riferimento), se l'interno superiore destro nell'angolo della verticale e barra orizzontale della Croce (freccia) copre il tessuto. (D) marcatura di croci colpendo la corteccia renale e campionamento casuale sistematico delle posizioni del tessuto (qui, 119 croci ha colpito la corteccia renale e 17 sedi sono sistematicamente casualmente campionati utilizzando un campionamento intervallo ho = 7). (E) in modo casuale sistematicamente campionamenti della corteccia renale contrassegnati da carta coriandoli. (F) asportato campioni. (G) ulteriore suddivisione dei campioni asportati per l'elaborazione successiva dei sottocampioni per tipi differenti di analisi a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: suddivisione dei campioni di tessuto asportato da sistematicamente casualmente campionata tessuto posizioni ed elaborazione dei sottocampioni per tipi differenti di analisi a valle. (A) illustrazione schematica della generazione dei sottocampioni di tessuto da una posizione sistematicamente casualmente campionata della corteccia renale (tessuto nativo) per diverse analisi (ad es., FF-PE: campione fissato in formalina, paraffina e MTC-PE: Campione di Methacarn-fisse, paraffina per istologia fotomicroscopico; CRYO: Campione per istologia sezione congelata; Campioni di tessuto di-80 ° c: ghiaccio secco congelato per l'analisi molecolare). (B) l'asportazione delle posizioni campionate sistematicamente in modo casuale della corteccia renale di un rene di aspersione-fisso, ulteriore suddivisione dei campioni di tessuto asportato e l'elaborazione dei sottocampioni per analisi qualitative e quantitative morfologiche. Lastre di rene aspersione-fisso suino (1), Croce-griglia (2), tabella dei numeri caso (3), equiangolo e coseno-pesato cerchi (4) per la generazione delle sezioni IUR (Vedi Figura 9, Figura 10), soluzioni di fissaggio diversi (5, 6, 7) e campione contenitore per campioni al microscopio elettronico (8). Questa figura è stata modificata da Albl et al. (2016), figura S239, pagina 186 (supplementi)7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: "Isector" sezione preparazione da formalina tessuto suino. (A) campione della corteccia renale porcina aspersione-risolto. (B) sferico pressofusione stampi. (C) agar liquido. (D-E) Agar-incorporamento di campioni in stampi di colata sferica. (F) Agar sfera con campione di tessuto incorporato. (G) Agar sfera con tessuto incorporato sezionato a una posizione casuale (piano di sezione IUR). Questa figura è stata modificata da Albl et al. (2016), figura S6, pagina 14 (supplementi)7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: illustrazione schematica della tecnica "Orientatore" per la preparazione di sezioni IUR. (A) dei campioni di tessuto fisso collocato su un cerchio equiangolo (ci1) con un bordo paralleli 0-180 ° direzione (indicata da una linea rossa). (B) sezionamento del campione ad angolo casuale (linea verde). (B, C) Appena generato superficie della sezione del campione tessuto (indicato in colore verde). Campione (D) posto su un cerchio di coseno-pesato (ci2) con la superficie sezionale generata nel passaggio precedente fronte lato negativo e un bordo del piano d'appoggio parallela alla direzione di 1-1 (indicata da una linea rossa). (E) taglio della seconda sezione attraverso il campione con un angolo casuale. (F) derivanti in modo casuale isotropo sezione aereo del campione (indicato in colore blu). (G) determinazione dell'area della sezione IUR del campione tessuto fisso per la stima del restringimento del tessuto incorporamento-correlati come descritto al punto 1.3. (H) Embedding del campione di tessuto in resina plastica. (io) sezionamento del blocco in plastica è sezionato (parallelo al piano IUR) su un microtomo. (J) montaggio delle sezioni IUR plastica sulle lastre di vetro. Questa figura è stata modificata da Albl et al. (2016), figura S8, pagina 15 (supplementi)7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: tecnica di "Orientatore" per la preparazione di sezioni IUR dei campioni di tessuto incorporato agar. (A-D) Facoltativamente, uno può agar-incorpora un esemplare sistematicamente casualmente inclusi nel campione di tessuto fisso (agar-incorporamento è utile per piccoli campioni di tessuto, cosicché il primo o entrambe le sezioni casuale possono essere posizionate all'interno di agar senza tagliare il tessuto). (E) posizionamento del blocco agar su un cerchio equiangolo (ci1) con un bordo parallelo alla direzione di 1-1 (indicata da una linea rossa). (F, G) Sezionamento del blocco ad angolo casuale (qui: 15-15, linea verde) determinato utilizzando una tabella di numeri caso (rnt, verde freccia). (H) successivo posizionamento del blocco agar sulla superficie sezione tagliata in F su un cerchio ponderati per il coseno (ci2) con il bordo del piano d'appoggio posto parallelamente alla direzione di 1-1 (indicata da una linea rossa). (io) seconda sezione tagliata attraverso il campione ad angolo casuale (qui: 20-20, indicata da una linea blu), determinato utilizzando una tabella di numeri caso (rnt, blu freccia). (J) risultante IUR sezione aereo del campione di tessuto. Questa figura è stata modificata da Albl et al. (2016), figura S9, pagina 16 (supplementi)7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: illustrazione schematica della preparazione sezione VUR. Campione di tessuto fisso (A) con un asse di verticale (identificabile) definito (ad es., verticale per la superficie naturale). Campione di tessuto fisso (B) incorporato nell'agar. (C) posizionamento di the(agar-embedded) campione di tessuto su una stampa di un cerchio equiangolo (ci1). VA: asse verticale. (D) sezionamento del campione ad angolo casuale (tabella numero casuale; qui: 30-30 direzione, indicata da una linea blu) con il piano di sezione essendo orientato ortogonalmente al tavolo e parallelamente all'asse verticale del campione. Piano di sezione VUR risultante del campione di tessuto (indicato in colore blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12: volumetry rappresentante di un rene porcino. (A-B) Tecnica di immersione. (A) determinazione del peso del rene (mragazzino). (B) determinazione del peso del volume di soluzione fisiologica spostato dal rene (mdispl.saline). Il rene è appeso su una stringa e completamente immersa in una soluzione salina senza toccare il fondo o le pareti del bicchiere. Il volume calcolato del rene è 92,6 cm ³. (C-D) Tecnica di cavalieri, planimetria punto-contando. (C) misurazione della lunghezza (l) del rene lungo il suo asse longitudinale. (D) determinazione delle zone di profilo sezione del rene lastre di punto che conta dopo sovrapposizione di una griglia di punti equidistanti Croce stampata su una trasparenza di plastica. Qui, il volume stimato del rene è 93,3 cm ³. (E-F) Tecnica di cavalieri, planimetria di immagini scannerizzate delle aree profilo sezione delle lastre del rene (F). Qui, il volume stimato del rene è 92,8 cm ³. In C-E, il naturale superficie della prima rotonda o l'ultima lastra del rene collocato sullo scanner o sovrapposti per la trasparenza di griglia trasversale non è una superficie di sezione e di conseguenza, nessuna area di superficie di sezione viene misurata in questa lastra di tessuto. (G-H) Dimostrazione di ipoproiezione in immagini scannerizzate delle lastre organo/tessuto (G) e in lastre di organi/tessuti sovrapposti con una trasparenza di griglia trasversale (H). Overprojecting parti del tessuto delle lastre organo sono indicate da linee punteggiate di bianche e nere. Solo le aree dei profili sezione effettiva (cioè, il tessuto circondato dalla linea tratteggiata bianca parzialmente indicata) sono determinate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13: illustrazione rappresentativa di adeguata (A) e non ottimale (B) preparazione dei campioni di tessuto agar per la determinazione del restringimento del tessuto legate alla inclusione dei campioni in plastica istologico incorporamento media. (A) immagine digitalizzati della superficie di sezione di un campione fisso del tessuto adiposo sottocutaneo porcino prima dell'inclusione in resina plastica. Il campione è incorporato in inchiostro-annerito agar per la stabilizzazione della forma del campione e chiara identificazione dei contorni superficie sezione. (B) contorni indistinti della bolla di aria intrappolata e superficie di sezione (freccia) all'interno l'agar. Scala bar = 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi Campione Elaborazione
Tipo Metodo (i)
Analisi molecolari Trascrizione del RNA, proteine, metabolita e profilatura dei lipidi,
analisi metabolomica, analisi del DNA
Piccoli pezzi * di tessuto fresco (nativo) Congelare il ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare a-80 ° C.
Analisi morfologiche qualitative Istologia
[microscopia chiara, incl. immunohistochemistry (IHC) e l'ibridazione in situ]
Fresco (nativo) — o in situ - fissata * campioni di tessuto Utilizzare diversi fissativi (ad es., soluzione al 4% di formaldeide) e l'incorporamento di media (paraffina, GMA/MMA, epossidica), a seconda dei casi.
Cryohistology
(sezioni congelate, incl. IHC)
Campioni di tessuto freschi (nativo) Incorporare il campione in mezzo blocco e congelare in isopentano raffreddato ad azoto liquido.
Analisi ultrastrutturale
[la microscopia elettronica, incl. trasmissione (TEM) e microscopia elettronica]
Piccoli pezzi di fresco (nativo) — o in situ- fissata * campioni di tessuto Difficoltà campione in soluzione di glutaraldeide 2,5 – 6,25% e incorporare in resina plastica.
Analisi quantitative morfologiche Microscopia chiara Fresco (madrelingua) - o in situ - fisse * campioni di tessuto Preparare IUR-sezioni (orientatore-, isector-sezioni) e/o VUR-sezioni di campioni di tessuto incorporato in plastica.
TEM Piccoli pezzi di fresco (nativo) — o di in situ - fissata * tessuto Preparare sezioni IUR (orientatore-, isector-sezioni) dei campioni di tessuto incorporato a resina epossidica.

Tabella 1: elaborazione dei sottocampioni di tessuto asportati da posizioni sistematicamente casualmente campionate per i tipi di analisi a valle diverse. Secondo il disegno sperimentale di uno studio e l'organo/tessuto in esame, diversi numeri dei sottocampioni dovrebbero essere asportati da ogni posizione di tessuto sistematicamente casualmente campionata e trattati per diversi tipi di analisi a valle. Protocolli dettagliati per più porcine organi/tessuti e tipi di studi sono forniti in "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"7. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/metilmetacrilato. IUR: Isotropica uniforme casuale. RVU: Verticale uniforme casuale. * max. 2 x 2 x 2 mm3. ad esempio, perfusione fissata tessuto o tessuto polmonare dei polmoni instillato con soluzione di fissazione.

Metodo. Risultati rappresentativi
Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo (punto 1.1, Figura 1, Figura 2) Organo/tessuto suino Ρ (g/cm ³)
Fegato 1.071 ± 0,007
Pancreas 1.062 ± 0,016
Miocardio del ventricolo 1,036 ± 0,014
Rene 1.044 ± 0,006
Il tessuto adiposo viscerale addominale * 0,921 ± 0,032
Ghiandola tiroide 1.061 ± 0,007
Cervello 1.051 ± 0,007
Ghiandola surrenale 1,063 ± 0.025
Muscolo scheletrico * * 1,074 ± 0.003
Dati sono mezzi ± pesi organo/tessuto specifiche SD. sono stati determinati in n = 18 suini (14 suini femmine e 4 maschi; età 60 giorni a 2 anni; 30 – 250 kg di peso corporeo). * Tessuto adiposo dal mesentery scarso. * * Valori medi per il M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachii e M. gluteobiceps.
Determinazione del ritiro tridimensionale del tessuto di incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per l'istologia (passaggio 1.3, Figura 4) Organo/tessuto Mezzo di inclusione       fS
Corteccia renale (maiale) GMA/MMA 0.89 ± 0.02
Resina epossidica 0.92 ± 0.02
Dati sono mezzi ± SD di misurazioni di 24 campioni di 12 maiali. fS: fattore di correzione di ritiro lineare.

Tabella 2: Risultati rappresentativi delle densità di organi e tessuti porcina selezionato7e fattori di correzione del ritiro lineare per restringimento di incorporamento-relative del tessuto del tessuto porcino corticale del rene in plastica diversa l'incorporamento di media.

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Discussion

Generazione di biobanca campionari da modelli animali suine richiede tecniche robuste ed i protocolli per la determinazione dei volumi di organi/tessuti, la generazione riproducibile del rappresentante, campioni di tessuto ridondante adatti per una vasta gamma di metodi di analisi diversi e per la randomizzazione dell'orientamento delle sezioni del campione per analisi stereologiche quantitative. I metodi descritti nel presente articolo sono adattati alle dimensioni dei suini organi e tessuti e sono stati sviluppati per rispondere efficacemente a queste esigenze2,7. Si basano su principi metodologici ben riconosciuti e precedentemente hanno dimostrato la loro praticabilità in diversi studi pubblicati2,7,12,21. I metodi consigliati sono importanti per vari tipi di studi che hanno esaminato campioni di tessuto/organo, poiché forniscono una base per la generazione di campioni rappresentativi e per l'acquisizione di una varietà di parametri che altrimenti potrebbe non essere determinato. Questi metodi possono essere eseguiti rapidamente con poco sforzo e sono compatibili con praticamente tutti i tipi di analisi a valle. Di conseguenza, sono considerati adatti non solo per i progetti di modello animale porcino biobanca, ma sono anche utili in studi condotti su analisi istomorfologica quantitativa dei campioni di tessuto di altre specie di grande modello animale (ad es., pecore), come così come in studi veterinari. Tenendo conto di aspetti tecnici dei diversi metodi, alcuni passaggi critici e le limitazioni devono essere considerati durante l'implementazione dei protocolli delle rispettive tecniche.

Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo

Durante la determinazione della densità usando il metodo di immersione (passo 1.1, Figura 1, Figura 2), cura deve essere presa non toccare le pareti o il fondo del bicchiere con il campione di tessuto o supporto del campione, mentre il tessuto tessuto campione è immersi in soluzione fisiologica. In caso contrario, la bilancia mostrerà il peso del campione, piuttosto che il peso del volume di soluzione fisiologica spostato dal campione. Per campioni di tessuto molto piccolo/luce (pochi mg), il metodo di immersione per la determinazione della densità del tessuto è limitato, a causa della surface tension delle saline e negativamente alto quoziente di volume di campione per il volume di liquido di immersione nel becher, che è ostacolare la precisione della misurazione. Qui, il peso del campione potrebbe essere utilizzato per ulteriori calcoli invece il volume calcolato in base alla densità. Determinazione della densità del tessuto da immersione non è anche efficace per il tessuto del polmone (slegato) fresco, a causa del contenuto incoerente dell'aria nel tessuto e in alcuni casi, dove gli organi sono sperimentalmente irrorato/instillato con fissativi.

Metodo di cavalieri per la determinazione dei volumi di organo

Il metodo di Cavalieri volumetria di porcini organi e tessuti è più ingombrante rispetto alla determinazione del volume dell'organo dal peso dell'organo e densità. Tuttavia, è adatto per gli organi che non possono essere pesati in modo appropriato a causa della loro elaborazione sperimentale (ad esempio, organi di aspersione-fisso o polmoni instillati con soluzione di fissazione). Qui, il metodo di volumetria di Cavalieri idealmente può essere combinato con la tecnica di campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume descritta nel passaggio 2 (Figura 5, Figura 6, Figura 12). Durante la stima dei volumi di organi/tessuti dalle zone di profili a sezione parallela, equidistante fette di organi/tessuti (approccio di Cavalieri, punto 1.2, Figura 3), manutenzione dell'orientamento del tessuto lastre (piano di sezione superiore e inferiore ), così come la determinazione accurata della zona di tutti i profili di sezione sono di grande importanza. In particolare, se immagini digitali o scansioni di organo lastre vengono analizzati accogliere, overprojections del tessuto (di fuori l'aereo di tessuto sezionato) della lastra del tessuto (Figura 12G-H) deve essere considerato con attenzione per fornire volume affidabile stime.

Determinazione del ritiro tridimensionale del tessuto di incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per istologia

L'entità del restringimento di incorporamento-relative del tessuto dipende il mezzo di inclusione e il tipo di tessuti e può anche variare tra campioni differenzialmente trattati dello stesso tessuto.

Considerando che le sezioni congelate sono considerate per non visualizzare praticamente nessun restringimento nel piano X-Y, e inclusione di plastica generalmente causa piccolo restringimento del tessuto, tessuto incorporamento-correlati restringimento è particolarmente ampia nei campioni di tessuto paraffina-incastonato e solitamente significativamente alterare la analisi quantitative morfologiche dei parametri dimensionali nelle sezioni istologiche di questi campioni. Oltre il grande limite di restringimento nel complesso tridimensionale, inclusione in paraffina anche causa un restringimento non uniforme, differenziale, anisotropo e variabile del campione e di strutture anatomiche differenti, tipi di tessuti e tipi di cellule all'interno il tessuto campione8,13. Inoltre, particolarmente nelle più spesso sezioni istologiche di campioni di tessuto paraffina-incastonato, nella misura del restringimento del tessuto può differire anche significativamente in X-Y e la Z-direzione della sezione. Questo può essere a causa di un ritiro differenziale dell'area della sezione (in direzione X-Y) e l'altezza di sezione (cioè, lo spessore di sezione verticale) durante l'allungamento della sezione nel bagno d'acqua di galleggiamento caldo tessuto dopo la sezione è tagliata dal tessuto bloccare e durante le successive procedure di elaborazione, colorazione e coprioggetto della sezione montata su un vetro diapositiva (cioè, un crollo omogeneo dell'asse z delle sezioni)8. Inoltre, in sezioni spesse, ci potrebbe essere una compressione in modo paragonabile più forte delle regioni all'interno della sezione sezione-aereo-vicino tessuto mentre la sezione è tagliata dal blocco del tessuto (che portano ad una deformazione differenziale dell'asse z dei sezioni)19 . Questi effetti possono quindi distorcere le stime del numero di strutture di tessuto all'interno della sezione di metodi di analisi stereologiche quantitativi distinti, come l'ottica disector. Pertanto, previsione, monitoraggio e correzione del restringimento del tessuto incorporamento-correlati non è fattibile per i campioni di tessuto paraffina-incastonato8.

Al contrario, il grado di restringimento del volume dei campioni di tessuto incorporato in resine plastiche, quali GMA/MMA o epossidica, è significativamente inferiore e, soprattutto, più uniforme. Di conseguenza, l'incorporamento in resina plastica con un presunto omogenea, isotropo e global restringimento del tessuto è vantaggioso per diversi metodi di analisi di diversi parametri morfologici quantitativi17,18. Durante la stima di restringimento del tessuto legata alla inclusione in resina plastica, la forma del tessuto fisso non dovrebbe inoltre essere distorto durante la procedura di incasso, per consentire una comparazione delle aree di profilo corrispondente sezione del fisso e incorporato campioni. Questo può essere difficile nei campioni di tessuto morbido o facilmente comprimibile come tessuto adiposo o polmonare, o nei campioni di tessuto con un alto contenuto di fluido. Qui, l'incorporamento del campione fisso in agar prima del sezionamento del tessuto è utile per stabilizzare la forma del campione del tessuto durante la successiva plastica incorporamento procedura (passo di protocollo 1.3., Figura 4). Per ottenere dati affidabili, misurazioni ripetute del restringimento incorporamento-relative del tessuto devono essere eseguite, utilizzando diversi campioni dello stesso tessuto. L'entità del restringimento di incorporamento-relative del tessuto è espressa come il fattore di restringimento lineare tessuto fs (passaggio di protocollo 1.3.9., Figura 4). Vengono forniti esempi per equazioni utilizzando fs per la correzione di restringimento di varie lunghezza, superficie e parametri di volume delle strutture differenti del tessuto in diversi studi quantitativi stereologiche14, 21,27.

Campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume di punto di conteggio e l'elaborazione dei sottocampioni di tessuto per i tipi differenti di analisi a valle

La tecnica di campionamento ponderato sul volume presentato per organi porcini determina punti di campionamento casuale all'interno del tessuto una volta e successivamente genera tutti i campioni necessari per ulteriori diverse analisi di sottocampionamento dei campioni di tessuto asportati dalla Queste posizioni7. Nei regimi di campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume, ogni posizione possibile campionamento all'interno del volume totale del organo/tessuto in esame ha esattamente la stessa probabilità casuale da campionare e generalizzabilità è garantito dalla raccolta di un numero sufficiente di esemplari. Pertanto, utilizzando disegni di campionamento casuale sistematico ponderato sul volume per la generazione di campioni da organi parenchimali, previene efficacemente i risultati dell'analisi possibilmente prevenuti da distribuzioni disuguali (potenzialmente impreviste e non riconosciute) di distinte proprietà funzionali o morfologiche del tessuto all'interno di posizioni diverse di un organo, che sono state dimostrate, ad esempio, per il volume medio e la densità di volume numerica degli epatociti suini in diverse regioni del parenchima del fegato28 . La strategia consigliati "macchine scrostamento tessuto e sottocampionamento" per organi suini è facilmente comprensibile, conforme ai requisiti tecnici dei metodi di analisi successive, può essere rapidamente effettuata e adattata alle esigenze di uno studio specifico, evitando così pregiudizi sistematici di campionamento, riduzione della variabilità sperimentale e aumentando la precisione dell'esperimento globale, pur essendo più efficiente di strategie in cui ogni posizione di campionamento singolo è determinata in modo casuale di campionamento9 ,15. Il numero di campioni che devono essere generati, dipendono ovviamente il parametro esaminato e la sua variabilità all'interno di campioni provenienti da diverse località del campionata organo/tessuto. Per la generazione della BioBanca campionari progettato per consentire l'esame di un massimo di diversi parametri (non specificato al momento del campionamento) da una varietà di metodi analitici diversi, tale strategia lungimirante campionamento solitamente Pianifica generazione di un numero relativamente alto di ridondanti campioni per organo/tessuto.

Generazione di sezioni casuale uniforme isotropo (IUR) e verticale uniforme casuale (RVU) per analisi quantitative stereologiche

Alcune delle tecniche utilizzate per la generazione delle sezioni IUR e VUR per quantitativi analisi stereologiche hanno un po ' complicato basi teoriche, e le spiegazioni sono quindi spesso evitato (inutilmente) da molti scienziati, anche se loro pratico attuazione è ragionevolmente facile. VUR sezioni sono particolarmente facile da generare e sono ottimo per le valutazioni di superficie densità in combinazione con test di cicloide sistemi8,9,20. Essi sono spesso preferiti a causa dell'orientamento familiare del piano di sezione. Tuttavia, in contrasto con sezioni IUR, VUR sezioni non sono adatti per la stima di parametri di lunghezza8,9.

Durante la preparazione delle sezioni IUR e VUR, il passaggio fondamentale è, fondamentalmente, per mantenere la superficie di sezione IUR o VUR del campione fisso durante l'incorporamento in resina plastica e per garantire che l'asse verticale delle sezioni VUR può essere sempre identificato (passaggio 3, Figura 9, Figura 10, Figura 11).

In futuro, la più ampia applicazione dei metodi sopra descritti sostanzialmente potrebbe contribuire a stabilire costantemente elevati standard qualitativi per la generazione di campioni comparabili, multi-purpose biobanca dai suini e altri grandi modelli animali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Lisa Pichl per l'eccellente assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

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