ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ アッセイ。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

血管新生は既存の血管から新しい血管の成長を胚形成と開発、創傷治癒、腫瘍の成長と転移を含む多くの生物的プロセスと眼と心血管疾患の重要なコンポーネントです。要約血管新生学効果の in vitroモデルは、適切にこのプロセスを研究し、新しい治療戦略のための最終的にターゲットすることができます調節機構が必要です。ビーズ血管新生アッセイは、以前内皮発芽の複数の段階を要約する実証されている体外。しかし、この試金の制限が無い体内の血管内皮-キーを内皮細胞の分子と表現の規制である壁画細胞の相互作用,機能します。ここに与えられたプロトコル ビーズ血管新生アッセイに壁細胞の混入のための方法論を提示し、発芽の培養中に血管内皮細胞と血管の緊密な関連を示します。プロトコルでは、効果的なサイレンシング機構研究の内皮細胞で siRNA を用いた遺伝子のための方法論についても詳しく説明します。完全に、このプロトコルは提供の in vitroアッセイをより適切に発芽して、血管新生に関与するさまざまな細胞タイプをモデル化し、治療評価の新規発見より生理学的関連性の高いプラットフォームを提供します血管新生の調節機構。

Introduction

血管新生は適切な胚形成、創傷治癒に不可欠ながん進行1冠動脈疾患を含む多くの疾患で重要な役割を果たします。2,3は、小説、効果的な治療法の開発のために重要な血管新生がどのように通常の開発時に発生して、それは病理学的コンテキストの再アクティブ化方法のより良い理解を持っていることです。良い運転して血管新生の分子機構を特徴と新しい発見をする研究者を許可する重要な段階と生体内の血管新生に関与する細胞の種類を再現忠実の in vitroモデルが必要内皮の規則。

中津とヒューズは、血管新生を発芽の多くの知られていた段階を経るを示している発芽ビーズ アッセイを最適化しています。4,5ここで紹介した方法の目的は、アッセイに perictyes を組み込むことで中津とヒューズを最適化壁画発芽血管内皮細胞のパラクリンおよび juxtracrine の役割に組み込むことができるアッセイに構築するには新規血管新生研究。ペリサイトは、細胞を維持する彼らの血管基底膜に埋め込まれているため内皮細胞に物理的に接触の近くにその役割で定義されている壁画のセルです。6ペリサイトおよび内皮細胞の複雑なクロス話-従事ノッチを含む経路のシグナルを介したシグナリング、Ang Tie2、PDGFRβ、TGFRβ、および他の多くの。7,8マウス モデルこれらのシグナル伝達経路の欠乏を示す悪い血管リモデリングにつながる胚の血管と血管系の機能不全を開発の貧しい周報道。7また、病的血管新生におけるペリサイトの役割は重要ですが、しばしば感謝です。たとえば、腫瘍血管の特徴にある血管より未熟な漏れ、貧しい周報道による機能不全。9それが劇的にペリサイトの有無は、腫瘍の血管の表現型に影響を与えるし、抗血管新生および抗腫瘍療法への応答の重要な仲介者は、提案されています。9このように、生体外の試金のペリサイトの役割を含むは内皮規制の重要なメカニズムをより完全にキャプチャするためのキーです。

現在、血管新生の研究に採用多くの体外体外の試金が、それぞれに考慮する欠点があります。内皮細胞増殖や血管内皮移動分析など、いくつかは過度に簡略化し、焦点組織培養プラスチックの分離設定では 1 つの血管内皮機能に。10他のアッセイが発生する詳細 3 次元 (3 D) の設定でなどマトリゲル管形成アッセイ、10しかし、これらの試はまだ単純化移行・ デ ・ ノボ血管を形成する内皮細胞の機能に重点既存の血管から発芽するのではなく、構造体。さらに、これらのアッセイのどれもは壁画のセルの種類を組み込みません。前のヴィヴォモデル リング大動脈アッセイなどペリサイト ホスト器官に存在を組み込むことがありますが、これらのモデルの遺伝子操作はのノックアウト、トランスジェニック マウス モデルの生成の必要性のためにより挑戦的、関心の経路。発芽アッセイ ビーズは、内皮発芽、増殖、移行、および 3 D マトリックスでも吻合と内腔形成をモデル化するので最適です。4アッセイは内皮細胞またはより制御された設定でペリサイトの直接遺伝的変更を許可しながら、発芽の多くの異なる段階の機構の評価のために忠実にできます。発芽のビーズを含むフィブリン血栓とが簡単固定、染色、発芽; のさまざまな段階でイメージこれらもやしは、発芽のリアルタイム イメージングを実行するライブ イメージングの商工会議所にも配置できます。ここで紹介する方法は、深さの表現型解析における血管新生の基本的なメカニズムと血管新生中に活性化経路を徹底的に分析研究に最適です。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 日目:

1. 血管内皮細胞のトランスフェクション

  1. 必要な場合は、トランスフェクションのひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活遺伝子規制オリゴヌクレオチド (例えばマイクロ Rna または小さい干渉の RNA (siRNA)) と適切な lipofectamine 試薬を使用してを実行します。節してください。
    注: このプロトコルはカスタム siRNA 配列と商業のトランスフェクション試薬 (材料表参照) 逆 transfections を実行する偉大な成功を収めています。著者らは、他のトランスフェクション プロトコルとこの試金の試薬をテストしていません。記載されている試薬を用いる逆の transfection のための手順は次のとおりです。
  2. 凍結乾燥の Sirna やヌクレアーゼ フリー水で 20 μ M の濃度でマイクロ Rna を再構築します。
  3. 以下の比率でトランスフェクション ソリューションを作る: 血清無料メディアのマイクロ Rna、siRNA の 9 μ L で 1 mL です。
  4. ソリューションを扇動し、室温で 5 分間インキュベートします。
  5. ソリューションにトランスフェクション試薬の 18 μ l 添加し攪拌します。
  6. 孵化の持続期間のため 10 に 15 分毎攪拌ソリューション、20-40 分間室温でインキュベートするソリューションを許可します。
  7. トランスフェクション ソリューションを培養すると、一方は、血管内皮細胞の剥離液を (例えばAccutase) を使用してをデタッチします。T175 フラスコ 10 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、フラスコを洗う細胞剥離溶液 5 mL を追加し、10 分の 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。
  8. T175 フラスコに完全なメディア 5 mL を加え、フラスコと 1200 rpm で 3 分間遠心から細胞懸濁液を取り外します。
  9. 真空吸引装置を使用して上澄みを除去し、EGM2 の mL あたり 1 X 10 の6セルの密度で細胞ペレットを再懸濁します。
    注: このプロトコルは、内皮細胞成長培地 (EGM2) 標準成長因子弾丸キットとして 10% の追加を含むを使用して偉大な成功を収めている政府短期証券。
  10. トランスフェクション ソリューションが孵化して終わったらプレート 10 cm プレートに溶液 1 mL と上血管内皮の懸濁液の 1 mL を追加します。
  11. 9 mL に 10 cm のプレートで最終巻を持って完全なメディアの追加 7 mL を追加します。
  12. 細胞アッセイの後の手順で使用可能な十分なセルがあることを確認する各トランスフェクション条件の価値が少なくとも 2 つの 10 cm プレートを確認します。
    注: これらの条件は、20 の遺伝子規制オリゴヌクレオチドの最終作業濃度 nM。著者は、そのターゲット遺伝子発現の 60-80% の打撃が発生するこれらの条件を発見しました。他の研究者は、彼らの実験のニーズによるとトランスフェクション条件を最適化する必要があります。
  13. メディアの 4 〜 6 時間ポスト添加 siRNA 錯体の新鮮な完全なメディアを交換します。
    注: このプロトコルの通路を使用して開発された 1-2 新生活。

日 2

2 マイクロ ・ キャリア ビーズ内皮細胞を塗

  1. PBS でオートクレーブ 60,000 ビーズ/mL の濃度 (例えばCytodex 3) マイクロ ・ キャリア ビーズを再構築します。
    注: マイクロ ・ キャリア ビーズは 1 グラムあたり約 3 x 10 の6のビーズの濃度で来る。ビーズ ビーズ/mL の約 60,000 のビーズの密度を得るための PBS の mL あたり 20 mg の割合でビーズを再構築します。
  2. 分注 1 mL 丸底並べ替え蛍光活性化セル (FACS) チューブの目的の数に完全なメディア。
  3. 各チューブ (ビーズ ソリューションはよくピペッティングする前に再停止されることを確認する注意してください) にマイクロ ・ キャリア ビーズ懸濁液 20 μ L をピペットします。
    注: 存在する可能性は劇的な変動与えられたマイクロ ・ キャリア ビーズ懸濁液中のビーズの最終作業濃度に。ビーズは、ビーズ濃度を大幅に変更することができますプラスチックおよびガラス容器の側面に付着することができます。マイクロ ・ キャリア ビーズ懸濁液の各バッチの FACS チューブに追加ビーズ ソリューションの最も適切なボリュームは、調査官によって経験的に定められる必要があります。ここで示した数字の出発点としてよりサービスを提供するものです。理想的には、10-20 ビーズ アッセイの終わりに 24 well プレートにウェルあたりフィブリン ゲル内で埋め込まれているので条件を最適化する必要があります。ビーズ数試金のための最適化に関する以下の説明にさらなる議論を参照してください。
  4. Transfected 螢光 24 h ポスト トランスフェクション細胞剥離液を次のように使用をデタッチします。
    1. 5 ml の PBS のセルの各 10 cm プレートを洗うと細胞剥離溶液 2 mL を追加し、37 ° C, 10 分で細胞を孵化させなさい。
    2. 完全なメディアの 1 X 106セル/ml の濃度で細胞を再懸濁します。
  5. ビーズを含む各 FACS チューブに細胞懸濁液 (すなわち1 X 106螢光) の 1 つの mL を追加します。
  6. 振とう FACS チューブ 20 毎分 4 37 ° C (存在する場合は、ステップ 3.4 に進む) または 2.5 に 3 h で h の期間 (場合 3.2 の手順に進む)。
    注: この期間および攪拌の頻度が経験的によって決定されて発芽アッセイ基本的なビーズは、最適化前の者。4撹拌の他の周波数とビーズ コーティング ステップの期間ない著者によってテストされています。

3 マイクロ ・ キャリアの螢光コーティング ビーズのペリサイトの連続コーティング

  1. デタッチ 10T1/2 セル (ペリサイト) 細胞剥離液 (トリプシン) を次のように使用を開始します。
    1. 10 mL の PBS、T175 フラスコを洗いトリプシンの 5 mL を追加し、10 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    2. 完全なメディアで 2 X 105セル/0.5 mL の濃度で 10T1/2 を再懸濁します。
      注: セルはアメリカのタイプ文化コレクション (ATCC) から購入しました。
      注: 細胞 10T1/2 最小必須培地 (MEM) で 10 %fbs と 1% ペニシリン ストレプトマイシンを補った。
  2. ビーズ + 螢光ソリューションを攪拌の 2.5 に 3 h 後、管の底に沈殿するビーズとフローティング螢光を許可する 5 分を待ちます。
  3. P1000 ピペットを使用して各チューブから完全なメディアの 0.5 mL を削除し、各 FACs 管に 0.5 mL の容積の完全なメディアの 2 × 105 10T1/2 を追加します。セルとビーズのソリューションを扇動し、37 ° c. で孵化し続けてくださいビーズが攪拌されて合計 4 時間まで 20 分毎を扇動するために続けます。
    注: 5 螢光の比率: ビーズで 1 周皮細胞は血管周皮細胞適切な維持するために不可欠であります。
    注: 次の代替手順は、プロトコルのこの時点で代わりに続くことができます。
  4. 4 h だけのビーズと新生活を振りま します。
  5. マイクロ ・ キャリア ビーズの螢光コーティングの 4 h が完了すると、最後にもう一度チューブを扇動 30-60 秒、待機、FACS 管から 1.5 1.75 mL の溶液をすぐに削除します。
    注: これがメディアで多くの浮遊新生活が削除中に解決するビーズのほとんどに十分な時間を許可しました。
    1. 完全なメディアで 2 X 105 10T1/2 を追加し、FACS のボリュームをもたらす管 2 mL まで。
    2. さらに 1 時間振とう FACS チューブ 20 分毎。
  6. 動揺が完了すると、優しく扇動チューブ 1 つの最後の時間とすぐに (2 mL)、ソリューション全体を削除して 6 cm プレートに追加。各プレートに完全なメディアの追加 3 mL を追加し、37 ° C のインキュベーターで一晩プレートを置きます。

日 3

4. フィブリン ゲル溶液の調製

  1. PBS で 1 mg/mL の濃度でアプロチニンと 50 単位/mL でトロンビンの作業ソリューションを準備します。
    注: これらのソリューションの大規模な在庫ことができます作られて、少なくとも 1 年間の 4 ° C で保存します。
  2. 2 Mg/ml の濃度では、フィブリノゲンの新鮮なソリューション。興奮の FACS チューブあたり溶液 2.5 mL を持っている十分なソリューションを確認します。
    1. ソリューションにフィブリノゲンのすべてを許可する 10 分の 37 ° C の水浴の解決を暖めます。
    2. フィブリノゲン溶液 1 mL あたりアプロチニン溶液の 37.5 μ L を追加します。
    3. 無菌フィルター ソリューション、室温で脇に。

5. ゲル注入のビーズを準備

  1. すべてのビードは、内皮細胞によって十分に塗装しているように 20 × 対物を使用して顕微鏡下でマイクロ ・ キャリアをコートしたビーズを含む料理を確認します。
  2. 精力的に 6 cm プレートからそれらを外し、チューブにソリューションを配置するセルのメッキ溶液をピペットします。完全なメディアとプレートに付着することがありますすべての残ったビーズを収集するチューブに転送 2 倍追加、洗浄します。
    1. 気泡を導入することを避けるため、内皮細胞をコートしたビーズのせん断応力を最小限に抑える p1000 ピペットを使用します。
    2. 血管内皮細胞で siRNA ノックダウン効率の評価が必要な場合、手順 2 で必ず採取専用のコーティングを施したビーズのプレートを持っています。このステップ (5.2) の間にビーズをデタッチし、残留 RNA 単離と qPCR 解析用プレートに接続されている血管内皮を収集します。
  3. チューブの底に解決するソリューションで、ビーズを許可する 3 分を待ちます。
  4. P1000 のピペット チップを使用してビード ペレットを乱すことがなく、できるだけ上澄みの多くを削除 (真空吸引装置を使用しないでください)。
  5. 各管に完全なメディアの 1 つの mL を追加し、ビードを再停止しなさい。
  6. 底に沈殿するためにビーズを許可する 30-60 秒を待機します。ビーズ ペレットを妨げないで P1000 ピペットを使用して可能として清の多く、削除します。ビーズ ペレットを誤って削除の可能性が大幅に増加、真空吸引装置を使用しないでください。
  7. 追加で 5.5、5.6 2 回、手順を繰り返します。目標はない浮遊細胞よりも早く FACS チューブで解決する必要がありますあまりにも多くの血管内皮をコートしたビーズを除去しながら、可能な限り 6 cm プレートから切り離されている可能性があります浮動の螢光をできるだけ取り除くことです。
  8. ビーズに完全なメディアの 1 つの mL を追加します。

6. 埋め込みフィブリン ゲルでビーズをコーティング

  1. P1000 ピペットを使用して各 FACS チューブ ビーズ ペレットを乱すことがなく、できるだけ多くのメディアを削除します。
  2. フィブリノゲン溶液 2.5 mL でビーズを再懸濁します。
  3. 24 ウェル ガラス底プレートの希望ごとにトロンビン溶液の 13 μ L をピペットします。ガラス底板のメッキは、もやしの最適な画像処理を実現するため不可欠です。
    注: は、次のステップの前に 5-10 分以上よく座っているトロンビンを放置しないでください。
  4. ビーズ ・ フィブリノーゲン溶液 0.5 mL を各ウェルに追加します。
    1. 必ずピペッティング ソリューションたびに前にもビーズのソリューションを再懸濁します。
    2. 慎重に井戸に存在のトロンビンに直接ピペットに注意してください。ピペットを上下 2 〜 3 回のゆっくりと気泡を導入しないこと注意を取って解決策を徹底的にミックスします。
    3. 必ず井戸間ピペット チップを変更してください。
    4. 移動またはゲルの形成を破壊するかもしれない任意の動きとして初期のフィブリンが凝固中に任意の時点でプレートを邪魔しないように注意してください。
  5. 室温で 30 分のためのフードに座っているプレートを残します。
  6. 完全に固化するゲルを許可するようにさらに 1.5-2 時間 37 ° C の定温器にプレートを慎重に転送します。

7. めっきフィブリン ゲルの上に線維芽細胞

  1. ジェルの固化の最後の 30 分の間に、次のとおり正常ひと肺線維芽細胞 (NHLF) をデタッチします。
    1. 10 ml の PBS のセルの T175 フラスコを洗う細胞剥離溶液 5 mL を追加し、10 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    2. 完全なメディアで 20,000 セル/ml の濃度で NHLF を再懸濁します。
      注: NHLF 細胞を培養することができますとダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 %fbs と 1% ペニシリン ストレプトマイシン。
  2. プレートの各ウェルのジェルの上に NHLF 細胞懸濁液の 1 mL、インキュベーターに配置します。
  3. アッセイの期間の毎日完全なメディアを変更します。

8. 次のビードの注入をフィブリン ゲル 2 ~ 7 日間にわたって発芽を観察します。発芽に必要な時間の長さは、螢光の通路と多くの数に依存します。

9. 発芽アッセイの固定

  1. すべての井戸を 2 mL の PBS で 1 回洗浄、治療グループの表現型の違いを決定することができるように一度十分な萌芽が発生しました。
  2. 各ウェルに細胞剥離溶液 0.5 mL を追加し、5 分の 37 ° C の定温器でプレートを配置します。
  3. インキュベーターからプレートを外し、プレートの側面をタップします。
    注: この手順の目的は、抗体ゲルのイメージングと同様、ゲルの浸透を容易にするために可能な限りフィブリン ゲルの上に成長している NHLF 細胞の多くを取り除くことです。細胞剥離液の総培養時間は、NHLF 除去を最適化するために調整する必要があります。研究者は、細胞剥離液がジェルに浸透、内血管内皮の構造を中断することを始めない過剰な期間のゲルをインキュベートすると警告されます。
  4. NHLF 細胞の十分な量を削除すると、完全なメディアの 1 mL の細胞剥離液を癒します。
  5. 戸建の NHLF、真空吸引装置を使用してメディアを吸引し、1 mL の PBS で 1 回洗浄します。
  6. 各ウェルに PBS で 2% パラホルムアルデヒド溶液 300 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。
  7. 2% パラホルムアルデヒド溶液を削除し、室温で 3 分の 1 mL の PBS で 3 回もそれぞれを洗います。
    注: 2% パラホルムアルデヒド溶液環境健康と安全 (EHS) のガイドラインに従って適切に処理してください。
    1. まあそれぞれ染色やもやしをイメージにする準備ができるまで 4 ° C で保存し PBS の 1 mL を追加します。

10. 発芽アッセイの染色

  1. それぞれに PBS でトリトン X 100 がよく、室温で 30 〜 45 分間インキュベート 0.5 %300 μ L を追加します。
  2. 真空吸引装置を使用して、トリトン X100 を削除し、3 回を 5 分 PBS で洗浄します。
  3. 各ゲルにソリューションをブロックを 500 μ l 添加し、4 ° C で一晩インキュベート
    注: ブロックのソリューションで構成される次のコンポーネント: 1% ウシ血清アルブミン (BSA)、5 %fbs、0.1% トゥイーン-20、および 1% の抗血清 (あなたの二次抗体の派生元である同じ種使用) PBS の。
  4. ブロッキング液を各ウェルから外し、染色液を各ウェルに一次抗体を含む 300 μ L を追加します。
    注: 染色液は、抗血清の存在なくブロッキング液として同じです。著者らは、1: 400、1: 200 の希釈液で一次抗体の孵化成功を収めています。
  5. 染色液を 4 ° C で 24 時間の一次抗体を孵化します。
  6. 一次抗体溶液を吸引し、穏やかな揺動と室温で 20 分間 0.5% トゥイーンと TBS で 3 回を洗ってください。第 3 洗浄後もう一度、新鮮な洗浄バッファーに置き換えます、一晩 4 ° C で保存します。
  7. 染色液に室温で 2 時間で希釈した蛍光の二次抗体を 1: 1000 で孵化させなさい。
  8. 二次抗体染色液を削除し、穏やかなロッキング常温 0.5% トゥイーンを含む TBS で 5 回各 20 分間洗浄します。
  9. PBS で核染色を希釈し、4 ° C で一晩インキュベート
    注: このプロトコル PBS で希釈したヘキスト 1:10000 で大成功があったが。
    注: イメージ作成前核の染色液を削除する必要はありません。
  10. 最適な蛍光信号をキャプチャする染色完了の数日内のイメージ。

11. 発芽アッセイの定量化

  1. もやしをイメージして、ImageJ にイメージ ファイルをインポートし、芽の数をカウントするカウント ツールまたは芽の長さを測定する [線] ツールを使用します。
    注: もやしは内皮の突起から発芽しているビーズの直径以上の長さとして定義されます。11芽の長さは、新芽の先端にビーズの突出を新芽が開始点からの距離として測定できます。平均ビードごとの長さの芽し、ビーズあたりの芽の平均数が発芽して血管新生におけるジーンサイレンシングの表現型の影響を評価するために有用な指標。治療グループごとに少なくとも 1 つの芽を含むビーズの平均数は、発芽のロバスト性を評価する指標として使用できます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

このプロトコルは、2 つのセル型in vitro でのタイトな協会と、ペリサイトの存在が発芽 (図 1 a, B) の発生を補完します。プロトコルも効果的なサイレンシング (例えばRNA 干渉経由) (具体的には血管内皮細胞の VEGFA) またはペリサイトの PDGFRβ など7,12のセル型の興味の遺伝子の中に有効にアッセイを阻害アッセイにおける発芽表現型に変換できます。このプロトコルを用いた研究者が分析を実行する標準的な血管内皮細胞だけ発芽血管機能のペリサイトのユニークな貢献をより徹底的に調査する周コーティング発芽アッセイに平行に奨励表現型が研究されています。

このプロトコルで記述されている条件に準拠してフィブリン ゲルで堅牢な発芽を受けることができる十分なコーティング ビーズ (図 2 aB) を得るために重要です。著者はする井戸内の明瞭な血管構造を識別する全体も、それ以降できないの周皮細胞増殖のペリサイト (などを 1 螢光 1 10T1/2 の割合でコーティング ペリサイト) 結果の過剰を発見しました。

Figure 1
図 1。ペリサイトはしっかりと発芽アッセイ ビーズ内皮血管に関連付けます。(A) 血管内皮だけコーティングを施したビーズと標準発芽アッセイ。周皮細胞アッセイを発芽の (B) 共焦点顕微鏡画像を示すペリサイト発芽アッセイにおける内皮血管の周りをラップ、発芽を妨げることはありませんが。青はヘキスト (核染色) です。赤は CD31 (内皮細胞染色)、緑はデスミン (周皮細胞染色)。すべてスケール バー、50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。コーティングを施したビーズがある外観のような荒い、ゴルフボール。裸のマイクロ ・ キャリア ビーズ (A) 持ち、適切にコートしたビーズとフィブリン ゲル注入 (B) の準備ができてラフ、ゴルフ ボールのような外観に完全に滑らかな表面を持ちます。スケール バー、50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

このプロトコルは、複雑なステージと徹底解明研究を実施する遺伝とイメージングの方法を採用する研究者を有効にすることによって血管新生を発芽の血液細胞間相互作用を特徴付けるための方法を示します。分析を実行すると、そのビーズの内皮塗着効率の間に起こるビーズ撹拌手順が不可欠です。貧しい内皮コーティングはビーズ ゲル注入前に次の朝のゴルフ ボールのような粗面を有し、代わりに完全に滑らかな表示に表示されない場合は、明らかになります。ビーズが十分に精力的に内皮細胞にビード表面の最大の露出を許可するチューブの攪拌により各撹拌ステップ中に再停止されるが、それがないので積極的に既に内皮細胞を引き起こすように注意してください。ビーズから分離することに接続されています。

ペリサイトをアッセイに追加すると、1 周に 5 の内皮細胞の比率が維持されることが不可欠です。ペリサイトの過剰にはびこるしてアッセイ中血管内皮細胞集団を追い抜くし、ペリサイトの欠乏を引き起こす血管のカバレッジが不足。適切な細胞密度を維持、血管周皮細胞貧しいカバレッジはまだ観察されるペリサイトの攪拌時間は変更する必要があります。携帯電話番号を変更することはお勧めできません。細胞液とビーズが定住しているが、細胞の前に、メディアの削除が定住していると別のアプローチ 4 h は内皮細胞とビーズをコートにいて、そのビーズを再してメディアから内皮細胞を削除、ペリサイトの追加および追加の時間の 20 分を攪拌します。

フィブリン血栓でコーティングを施したビーズを埋め込み、時また血栓形成中にプレートを混乱させることによって、ゲルの整合性を邪魔しないように不可欠です。マトリックス形成の混乱可能性があります異常発芽します。また、ゲルで適切なビーズの密度を維持に不可欠です。ビーズの人口密度が高すぎる場合、互いに近くにビーズ ビーズを隣接の発芽に影響を与えるだろうし、お互いに向かってと吻合するが開始されます。研究員及び利息容器容器の相互作用を特徴付けることの究極の目標によってビーズの密度を変更する必要があります。ただし、孤立したビーズとゲル内で互いに近くにビーズの異種集団は、主変数の発芽の表現型を与える可能性があります。ビーズの密度は、プロトコルのかくはん手順中に FACS チューブに追加ビーズ ソリューションの量を変えることによってまたはゲル注入前にビードを再停止しなさいにフィブリン液量を変えることによって調整できます。

また、mL あたり 20,000 セルの密度で健康的な NHLFs が各フィブリン塊の上にメッキが不可欠です。分析中に堅牢な発芽に必要な成長因子を積極的に分割の NHLFs によって提供されるの連続的な供給を入力してください。NHLF 付きの EGM2 は十分な代替ではないです。13アッセイ中発芽不良が見られる場合、完全なメディアの新鮮なボトルと NHLF セルの新しい、健康な通路を使用することをお勧めします。

この試金より高い解像度で血管新生の細胞と形質の複雑さに対処し始めると、それはまだ true の場合、生体内でコンテキストを基準にして単純化システムを表します。さらに、このアッセイで発生する発芽血管新生は腫瘍血管新生などの病理学的コンテキストとは対照的に健康的な生理学的なコンテキストにより似ています。このメソッドの将来のアプリケーションは、追加のセル型 (血管新生反応を調節する免疫細胞群) などの導入を含めることができますこの複雑なプロセスに関与する血液細胞間相互作用をさらに要約します。外部ストレス - フィブリン ゲル -体外病的血管新生をシミュレートする発芽血管の近くに埋め込まれた腫瘍などの導入もより徹底的に、機械的特性を許可するように使用されるかもしれない、病理組織学的のコンテキストでアクティブ化の分子経路。これらの進歩より制御された設定では、最終的に検出とターゲットの新規治療経路のより多くの詳細な特性評価を有効化における血管新生の複雑な段階を研究する研究者の能力向上のために重要になります病的血管新生。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

有用な議論、夫妻ビクトリア Bautch とジョシュア ブーシェに感謝し、標準的なビーズの最適化に関するアドバイス発芽アッセイ条件と発芽の試金のプロトコルを汚します。S.H.A. だったから国立科学研究所の一般医療下での補助金によって一部にはサポート 5T32 GM007092 賞を受賞します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86, (3), 353-364 (1996).
  2. Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
  3. Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8, (5), 491-500 (2009).
  4. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
  5. Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, (3), 311-322 (1995).
  6. Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18, (2), 153-174 (1986).
  7. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21, (2), 193-215 (2011).
  8. Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19, (2), 201-215 (2016).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, (5706), 58-62 (2005).
  10. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  11. Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (5), 1011-1019 (2014).
  12. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, (7070), 937-945 (2005).
  13. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22, (20), 3791-3800 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Very nice

    Reply
    Posted by: huihui a.
    June 5, 2019 - 4:58 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics