Forbedret genom-redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i forskellige celler og organismer

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

Udnytter en hovedmeningen Cas9 er ribonucleoprotein komplekse (RNP) en kraftfuld metode for præcis, effektiv genom-redigering. Her, fremhæve vi sin nytte over en bred vifte af celler og organismer, herunder primære menneskeceller og både klassiske og nye modelorganismer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Farboud, B., Jarvis, E., Roth, T. L., Shin, J., Corn, J. E., Marson, A., Meyer, B. J., Patel, N. H., Hochstrasser, M. L. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J. Vis. Exp. (135), e57350, doi:10.3791/57350 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lokationsspecifikke eukaryote genom-redigering med CRISPR (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser)-Cas (CRISPR-forbundet) systemer er hurtigt blevet et almindeligt blandt forskere forfølger en bred vifte af biologiske spørgsmål. Brugere anvender oftest Cas9 protein afledt af Streptococcus pyogenes i et kompleks med en let omprogrammeret guide RNA (gRNA). Disse komponenter er indført i celler, og gennem en base parring med en supplerende region af dobbelt-strenget DNA (dsDNA) genom, enzymet, der kløver begge tråde for at generere en dobbelt-strenget pause (DSB). Efterfølgende reparation fører til enten tilfældige indsættelse eller sletning begivenheder (indels) eller indarbejdelse af eksperimentatoren-forudsat DNA i stedet for pause.

Brug af en renset single-guide RNA og Cas9 protein, formonteret til at danne en RNP og leveret direkte til cellerne, er en potent tilgang til opnåelse af højeffektive gen redigering. RNP redigering øger især hastigheden af gen indsættelse, et resultat, der er ofte en udfordring at opnå. I forhold til levering via et plasmid, fører kortere Persistensen af Cas9 RNP inden for cellen til færre off target begivenheder.

Trods sine fordele er mange casual brugere af CRISPR gen redigering mindre bekendt med denne teknik. For at sænke adgangsbarriere, redegøre vi for detaljerede protokoller for gennemførelse af RNP strategien i en række sammenhænge, fremhæver sin særskilte ydelser og forskellige applikationer. Vi dækker redigering i to typer af primære menneskelige celler, T-celler og hæmatopoietisk stem/stamceller (HSPCs). Vi viser også, hvordan Cas9 RNP redigering gør det muligt for facile genmanipulation af hele organismer, herunder den klassiske model rundorm Caenorhabditis elegans og mere for nylig indført model krebsdyr, Parhyale hawaiensis.

Introduction

fThe CRISPR-Cas9 system giver forskerne til at ændre målrettede regioner af enhver genom1. Denne hurtig og billig teknologi har revolutioneret grundforskning og lover at gøre en dybtgående indflydelse på udviklingen af personlig sygdom behandlinger, precision landbrug, og ud over2. CRISPR redigering er et værktøj, demokratisering og implementering af systemet i et nyt laboratorium kræver ingen særlig ekspertise i genom engineering, bare grundlæggende molekylær biologi færdigheder. Forskere kan nu studere tidligere genstridig organismer med et par alternative midler til genmanipulation3,4. Alene i de sidste fem år, er CRISPR genom-redigering blevet brugt til ingeniør over 200 forskellige hvirveldyr, hvirvelløse, vegetabilske og mikrobielle arter.

Tilpasset fra CRISPR prokaryote forsvar pathway, de centrale elementer kræves for lokationsspecifikke genom-redigering er Cas9 protein, typisk fra S. pyogenes og codon-optimeret med en tilføjet nukleare lokalisering signal (NLS), og dets specialiserede RNA guide5,6. Selvom ikke diskuteret her, kan også andre Cas9 orthologues eller CRISPR endonucleases bruges. De naturligt forekommende gRNA er sammensat af to separat transskriberede stykker, CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktiveringen crRNA (tracrRNA)7. Disse RNA'er kan være smeltet sammen til en enkelt udskrift, kendt som single-guide RNA (sgRNA)8. De fleste genom redaktører vælger strømlinet sgRNA9, men dual-guide er også brugt regelmæssigt10,11. Eksperimentatorer vælge en 20-nukleotid (nt) genomisk DNA mål, at sikre, at det ligger en kort licensudstedende signatur kræves for Cas9 anerkendelse, kaldet en protospacer tilstødende motiv (PAM), og designe en gRNA, der indeholder supplerende12 .

Når inde i cellen, den komplekse RNP lokaliserer sit genomisk mål, gRNA basepar med supplerende DNA strand og derefter enzymet kløver bryde begge DNA-strenge til at generere en dobbelt-strand2. Celle reparation maskiner løser DSB ved en af mindst to ruter: via den fejlbehæftede ikke-homologe at deltage i slutning (NHEJ) vej eller homologi-instrueret reparation (HDR), der problemfrit indeholder DNA, der indeholder 'arme' af homologi til begge sider af pausen. Den tidligere reparation pathway typisk fører til indel dannelse og deraf følgende gen forstyrrelser, mens sidstnævnte tillader eksperimentatorer indsætte eller ændre DNA sekvenser1.

Redigering effektivitet og nøjagtighed afhænger af de midler, hvormed Cas9 og gRNA træder i cellen. Disse komponenter kan leveres til kulturperler celler, embryoner eller organismer i form af nukleinsyrer eller som en hovedmeningen RNP komplekse13,14,15. Fælles nukleinsyre-baserede leveringsmetoder omfatter viral transduktion, Transfektion eller elektroporation af mRNA eller plasmid DNA. Cas9 protein og guide RNA er derefter fremstillet i cellen og de forbinder til at danne et kompleks.

Den direkte levering af RNP kræver særskilt rensning af Cas9 protein og guide RNA. Dette kan gøres internt, eller protein og sgRNA kan købes fra en af flere kommercielle leverandører. Når erhvervet, Cas9 og gRNA blandes til at danne enzymatisk kompetente RNP komplekset og introduceret til celler injiceres direkte i befrugtede æg/embryoner, lipid-baserede Transfektion16eller elektroporation. Den første rapport af RNP redigering involveret injektion i C. elegans gonaderne17. Mikroinjektion er stadig det foretrukne middel til at indføre RNP i embryoner og hele organismer, men effektiv elektroporation er blevet påvist i mus18,19 og rotte20 embryoner. Vi beskriver protokoller for direkte indsprøjtning RNP i C. elegans gonaderne og P. hawaiensis embryoner og anbefaler en specialiseret type af elektroporation at levere RNP, når du redigerer primære humane celler. Denne metode, nucleofection, indebærer optimeret elektroporation programmer og celle type-specifikke løsninger og tillader RNP at indtaste både cytoplasma og kerne21.

Genom-redigering med RNP tilbyder flere forskellige fordele. Fordi protein og RNA komponenter er pre-samlet, og kvaliteten kan sikres før levering, undgår RNP redigering mange faldgruber forbundet med nukleinsyre-baserede levering. Nemlig, der er ingen risiko for Cas9-kodning DNA integreres vært genom, mRNA er aldrig udsat for nedbrydning og det omgår problemer med i vivo gRNA eller protein udtryk, folde og foreningen22,23. Yderligere, ved hjælp af RNP fører til lavere toksicitet og langt færre off target begivenheder end den plasmid-baserede udtryk, et resultat af den RNP kortere halveringstid inde i cellen24,25,26,27.

Endelig fører RNP redigering beviseligt til høje redigering priser i en bred vifte af menneskelige cellelinjer, primærelementer såsom fibroblaster, embryonale stamceller (økonomiske), induceret pluripotente stamceller (iSPCs), HSPCs, og T celler16,24, 25,26,27,28,29; hvirvelløse dyr herunder C. elegans, P. hawaiensisog bananfluer3,17,30; i vertebrater som zebrafisk, mus og rotter31,32; i plantearter, herunder Arabidopsis, tobak, salat, ris, grapevine, æble, majs og hvede33,34,35,36; og i Chlamydomonas, Penicilliumog Candida arter37,38,39. Hyppigheden af indel dannelse kan være højere, når du bruger RNP sammenlignet med plasmid levering, og HDR-medieret DNA indsættelsen kan være lettere at opnå25,27,29.

Protokollen beskrevet her bruger Cas9 RNP og er en effektiv, let fleksibel teknik, der er ligetil at anvende en bred vifte af biologiske systemer40,41, især i celler, som ellers er svære at arbejde med og i organismer uden veletablerede systemer for præcise genmanipulation. Vi starter med at beskrive hvordan man designer, opnå og samle Cas9 RNP før der dækker dets anvendelse på tværs af forskellige model celletyper og organismer. Hæmatopoietisk stem/stamceller-celler (HSPCs) og T-celler er redigeret ved hjælp af samme metode, nucleofection, så de er dækket sammen i trin 2 og 3 i denne protokol. Redigering procedurer for C. elegans er beskrevet i trin 4 og 5, og P. hawaiensis redigering er dækket i trin 6 og 7. Endelig, da en gen-redigering eksperiment succes i enhver organisme kan vurderes af genotype sekventering, undertrin beskriver mulige analysemetoder for alle celler og organismer beskrevet i protokollen er skitseret i trin 8.

Protocol

1. RNP forsamling

  1. Designe eksperimentet godt i forvejen, erhverve alle RNA, DNA og protein komponenterne før tid. Som en first-pass, kan du prøve en af de positive kontroller, der er anført i tabel 1 og bruge de kommercielle reagenser beskrevet i tabel materialer til at sikre en pålidelig eksperimentelle design og integriteten af materialerne. Yderligere tip til planlægning af et nyt genom-redigering eksperiment, se papirer på dette emne12,42,43.
    Bemærk: Når samlet som beskrevet i de efterfølgende trin, RNPs forberedt på forhånd kan opbevares ved-80 ° C.
    1. Efter at vælge hvilke gen til målet, skal du bruge en af de gratis online værktøjer til at designe en optimal gRNA44,45,46,47,48. Sørg for at målrette en exon hvis håb om at generere en knockout.
      Bemærk: Disse værktøjer vil bidrage til at identificere et målwebsted med en tilstødende S. pyogenes PAM sekvens, høj kvalitet score og lav off-målscoren.
    2. Rense S. pyogenes Cas9 protein gennem offentliggjorte metoder8, eller købe det hos en kommerciel leverandør.
    3. Forberede en typisk Cas9 buffer for RNA fortynding, RNP forberedelse og opbevaring af protein, som indeholder 20 mM for HEPES pH 7,5, 150 mM af KCl, 10% glycerol og 1 mM af TCEP. Brug altid nukleasen-frit vand i buffere, der skal bruges til resuspend eller fortyndes RNA for at forhindre nedbrydning.
    4. Producere guide RNA (tracrRNA og crRNA eller sgRNA) gennem en in vitro- transskription ved hjælp af offentliggjorte metoder, eller købe det hos en nukleinsyre syntese selskab17,21,49, 50 , 51.
    5. Hvis du indsætter et gen, syntetisere eller købe en donor DNA skabelon.
    6. Gemme proteiner og RNA alikvoter ved-80 ° C og tø på is umiddelbart før brug.
      Bemærk: Hver fryse-tø lidt sænker effektivitet. Detaljeret, åben adgang protokoller til Cas9 rensning52 og in vitro- transskription af sgRNAs53 er tilgængelige andre steder.
  2. Hvis arbejder med C. elegans, springe til trin 1,5. P. hawaiensis -protokollen springe til trin 1,6. Hvis du bruger sgRNA, springe til trin 1.4. Fortsæt til trin 1.3 for at samle en gRNA redigeringsværktøjer primære celle.
  3. Samle en gRNA ved at blande equimolar mængder af tracrRNA og crRNA. Gøre 100 µL 80 µM gRNA materiel, for omkring 50 genom redigering eksperimenter.
    1. Inkuber gRNA ved 37 ° C i 30 min. og lad den langsomt køle af til stuetemperatur derefter.
  4. RNP prep for HSPC og T celle redigering: samle en kompleks RNP ved at blande en 1-2 x kindtand mængde gRNA til 200 pmol Cas9 protein i en samlet maengde paa 10 µL. meget langsomt tilføje koncentreret Cas9 til gRNA (forud fortyndet i Cas9 buffer) for omkring 30 s , hvilket gør hurtig cirkler med pipette, at bringe de endelige Cas9 koncentration til 20 µM.
    1. Forberede elektroporation kuvetter.
      Bemærk: Denne protokol er specifikke for det kommercielle system omhandlet i Tabel af materialer, men RNP redigering kan også opnås med andre elektroporation enheder.
    2. Tilføj 5 µL (100 pmols, T-celler) eller 10 µL (200 pmol, HSPCs) af RNP til hver kuvette.
    3. Hvis indsættelse af nye DNA i stedet for at gøre en knockout, tilføje 1 µL af 100 µM (100 pmol) enkeltstrenget oligonukleotid donor DNA (ssODN)25,54,55 til kuvetter eller pladens huller.
    4. Spring til trin 2 for de næste instruktioner i redigering primære celler protokol.
  5. RNP prep for C. elegans redigering: samle RNP komplekse ved at tilføje de følgende reagenser for at skabe en endelige mængden af 20 µL (de endelige koncentrationer er angivet i parentes): Cas9 (2 µM), HEPES pH 7,5 (10 µM), KCl (115 µM), crRNA (12 µM) , tracrRNA (40 µM), og reparation skabeloner hvis nødvendigt (0,5 µM ssDNA eller op til 350 ng/µL dsDNA).
    Bemærk: Effektiviteten af en Cas9-medieret DSB-skabelonbaserede reparation er proportional med koncentrationen af dsDNA reparation konstruktion; Derfor, jo højere koncentration af reparation skabelon, mere effektiv skabelonbaserede reparation. Dog har en indsprøjtning af blandinger indeholdende mere end 350 ng/µL af dsDNA vist sig at reducere levedygtigheden af de injicerede orme. Derfor, er det bedst at bruge op til, men ikke mere end 350 ng/µL af dsDNA i blandingen for at maksimere reparation effektivitet og minimere dens dødelighed.
    1. Tilføje flere crRNAs til at målrette flere loci samtidigt, som er nødvendig for co-CRISPR/co-conversion screening fremgangsmåden i trin 5.4. Når du tilføjer mere end én crRNA, tilføje hver sekventielt til master mix.
      Bemærk: Mængden af hver crRNA behøver ikke at være den samme, og endda fordoble den samlede koncentration af crRNAs i master mix uden at ændre koncentrationen af Cas9 synes ikke at blande sig med hyppigheden af mutagenese på en bestemt locus. Eksempler er beskrevet i detaljer i Paix et al. 56.
    2. Mix af pipettering og spin RNP løsning på 16.000 x g for 5 s til at sikre, at løsningen er indsamlet i bunden af røret.
    3. Inkuber løsning ved 37 ° C i 15 m.
    4. Der centrifugeres prøve på 16.000 x g til 1 min til pellet eventuelle partikler, der kan tilstoppe tynd-kede mikroinjektion nålen. Bruge supernatanten i de efterfølgende trin.
    5. Gå til trin 4 for den resterende del af C. elegans protokol.
  6. RNP prep for P. hawaiensis redigering: forberede engangsbrug Cas9 delprøver af udvande dem med nukleasen-gratis vand og fenol rød (til at visualisere injektioner) til en slutkoncentration på 6,25 µM Cas9 og 0,15% phenol rød.
    1. Samle RNP komplekse ved at blande en 2-5 x kindtand overskud af gRNA til Cas9 protein i en samlet maengde paa 6 µl. tilføje 12 pmol af Cas9 til gRNA, at bringe Cas9 slutkoncentration 2 µM, gRNA koncentration til 4-8 µM og phenol rød koncentration til 0,05%.
    2. Inkuber blanding ved stuetemperatur i 10 min til komplekse RNP.
    3. Spring til trin 6 for de næste instruktioner i P. hawaiensis redaktionprotokol.

2. celle kultur og forberedelse

Bemærk: Udfør trin 2.1.1 til 3.3.3 i en biologisk sikkerhed kabinet.

  1. Køb befrugtede menneskelige mobiliseret perifert blod CD34+ HSPCs fra en kreditor.
    1. Tø ~ 1 x106 HSPCs i et 37 ° C vand bad i 3 min og overføre dem til en 15 mL konisk slange. Der tilsættes 10 mL af en serum-fri ekspansion medium fra en kommerciel kilde og spin blanding på 100 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspend celler i 2 mL af suppleres med SFEM. Plade celler i 6-godt plader og kultur dem i et 37 ° C inkubator i 24-48 timer før RNP elektroporation.
    2. Tælle celler med en hemocytometer og overføre det samlede antal HSPCs behov (150.000-200.000 HSPCs pr. kuvette skal electroporated) til et centrifugeglas.
    3. Spin tube på 100 x g i 10 min. at sammenpresse cellerne.
  2. Købe menneskelige primære CD4+ T celler fra en kreditor eller isolere dem fra humant fuldblod af tæthed gradient centrifugering29.
    1. Inden T-celle aktivering, pre pels 48-og kultur plader med αCD3 (UCHT1) og αCD28 (CD28.2). Coat plader med 500 µL af 10 µg/mL αCD3 og 10 µg/mL αCD28 i PBS i mindst 2 timer ved 37 ° C.
      Bemærk: For nogle loci NHEJ kan opnås uden forudgående stimulation, men herunder dette trin maksimerer dets effektivitet.
    2. Kultur T celler i 48 timer ved 37 ° C på αCD3/αCD28 antistof-bundet plader i en RPMI komplet medium [RPMI-1640 suppleret med 5 mM af HEPES, 2 mM af kommerciel alternativ til L-glutamin, 50 µg/mL af penicillin/streptomycin, 50 µM af 2-mercaptoethanol, 5 mM ikke-essentielle aminosyrer, 5 mM af natrium pyruvat, og 10% (vol/vol) FBS]. Kultur T celler med en tæthed på 2.000.000 T celler i 500 µL af medier pr. brønd af en 48-godt plade.
    3. Count T celler ved hjælp af en hemocytometer og overføre eksperiment det samlede antal T-celler nødvendige for elektroporation (100.000-1.000.000 T celler pr. kuvette skal electroporated) til et centrifugeglas.
    4. Spin tube på 90 x g for 8 min at sammenpresse cellerne. Hvis cellerne har været tæthed farveforløb-adskilt inden for 2 dage, spin dem ved 200 x g i 8 min.
  3. For begge celletyper, Aspirér supernatanten med en pipette/vakuum, at fjerne eventuelle bobler.
    1. Forsigtigt resuspend celler med 20 µL af elektroporation buffer pr. kuvette.
    2. Tilføj 20 µL af cellerne (150.000-200.000 HSPCs eller 100.000-1.000.000 T celler) til hver kuvette, der allerede indeholder 10 µL RNP og bland godt ved pipettering op og ned uden at skabe bobler.

3. RNP elektroporation

  1. Electroporate kuvetter efter at placere dem i en nucleofector. HSPCs, bruge pulse kode ER100. T-celler, bruge koden puls EH-115.
  2. HSPCs kun: Tilsættes 100 µL af en suppleret SFEM medium (opvarmet til 37 ° C) til hver kuvette umiddelbart efter elektroporation og lad cellerne inddrive for 10-15 min.
    1. Overfør celler til kultur dem i en 96-brønd runde-nederste plade og tilføje en yderligere 100 µL af den suppleres med SFEM medium i 24 timer.
    2. Ændre dem til en frisk suppleret SFEM medium og inkuberes dem i en yderligere 24-72 timer.
    3. Fjerne celler til genotypebestemmelse dem 48-96 h post-elektroporation. Spin celler ved 300 x g i 5 min og Fjern supernatanten før du begynder DNA-ekstraktion (trin 8.2).
  3. T celler kun: tilføje 80 µL af RPMI komplet kultur medier pre varmet til 37 ° C fra reservoir til hver kuvette eller godt, ved hjælp af en multi-kanal pipette (hvis nødvendigt).
    1. Inkuber dem ved 37 ° C i 15 min.
    2. Tilføje passende medier, antistoffer, cytokiner, etc. til destination skilte og pre varme dem i et 37 ° C inkubator.
    3. Overføre 107 µL electroporated celler fra brøndene til en runde-96-brønd bundplade ved hjælp af en multi-kanal pipette (hvis nødvendigt).
  4. For oplysninger om vurderingen af de redigering resultater, spring til trin 8.

4. C. elegans forberedelse

  1. 1 dag før mikroinjektion: forberede mikroinjektion Agarosen puder.
    1. Gøre en 3% (w/v) Agarosen løsning i vand ved at tilføje Agarosen til vand og bringer løsningen til en byld på en varmeplade eller i mikrobølgeovn.
    2. Arrangere 24 mm x 50 mm x 1,5 mm coveret glas lysbilleder på et bord og bruge et glas Pasteur pipette til at placere en lille (~ 15 µL) dråbe Agarosen løsning i diaset. Hurtigt flade Agarosen drop ved at placere en anden coverslip på toppen. Tillad Agarosen at størkne og derefter fjerne en af coverslips.
    3. Forlade Agarosen-belagt coverslip opad på en bordplade natten til tørre. Efter 24 timer, skal du gemme Agarosen puder i en ren, tør beholder.
      Bemærk: Disse kan anvendes på ubestemt tid.
  2. Trække mikroinjektion nåle: ved hjælp af borsilikatglas kapillærer med filamenter (ydre diameter 1.0 mm og indre diameter 0.58 mm), trække nålene baseret på Mello og brand57 og andre ressourcer58. Nålene kan bruges umiddelbart eller kan opbevares i en ren, tør beholder, afstivet af ler understøtter.
  3. For vedligeholdelse af orme, forberede en Nematode vækst medier (NGM) agar hældes i Petri plader og spottet med OP50 bakterier (protokoller på standard C. elegans vedligeholdelse og opskrifter til vækst medier, se Stiernagle59).
  4. Etape orme for mikroinjektion: 12-24 timer før mikroinjektion, vælge L4-iscenesatte hermafroditter til en ny NG-agar plade med OP50 bakterier og inkuberes dem natten over ved 20 ° C. For hver Cas9 target/injektion mix, vælge ~ 30 orme til pladen.
  5. Dag af mikroinjektion: Indlæses trak mikroinjektion nålen med RNP løsning supernatanten forberedt i trin 1.5.
    1. Der afpipetteres supernatanten fra trin 1.5.4 til en trak kapillær pipette og opfyldning løsningen fra den kapillære pipette i rede mikroinjektion nålen (generelt lastning mindre end 0.1 µL).
  6. Montere indlæst nålen på apparatet mikroinjektion knyttet til en micromanipulator. Indstil injektion apparater pres til 250 kPa og balance presset til 25 kPa.
  7. Bryde tilbage læsset nål tip til at generere en skarp nål kant. Placere en 15 mm x 15 mm x 1,5 mm kvadratiske coverslip på toppen af en 24 mm x 50 mm x 1,5 mm coverslip.
    1. Overlejre en kant af den firkantede coverslip med halocarbon olie 700.
    2. Placer nålen i olie, i udkanten af 15 mm firkantet coverslip.
    3. Bruge en hånd til at guide mikroskop fase og coverslip, børste diaset op og langs kanten af nålen mens deprimerende injektion pedal/knappen. Bryde den nål spids tilbage, øge strømmen af væske ud af nålen. Opnå en optimal strømningshastighed ved at foretage injektionen Bland flow langs kanten af nålen, danner ~ 1 boble/s.
  8. Bekræfte, at ormene L4 tog 12-24 timer før mikroinjektion er udviklingshæmmede iscenesatte unge voksne på dagen for injektion. Vælge de unge voksne orme til en NG-agar plade, der mangler OP50 bakterier og tillade dem at kravle rundt i 5 min. Dette reducerer mængden af bakterier overføres til injektion pad, minimere nål træsko.
  9. Placere en Agarosen injektion pad/coverslip på en dissektion anvendelsesområde. Ved hjælp af en orm pick, lægge et lille spor af halocarbon olie langs kanten af underlaget.
  10. Brug orm pick belagt med olie, løfte flere orme ud NG-agar plade og i spor af olie. Et fint hår knyttet til en pipette, som en øjenvipper eller cat whisker, Placer orme i parallel, forsigtigt at skubbe ormene i Agarosen pad. Indtil komfortable med mikroinjektion procedure, kun montere og injicere sig orm ad gangen.
    Bemærk: Den tørre Agarosen vil væge fugt fra orme, forårsager dem til at overholde pad. Derfor skal man arbejde hurtigt som orme kan udtørre.
    1. Én gang i position og knyttet til pad, overlay orme med et andet par dråber af halocarbon olie (~ 20 µL) fra spidsen af ormen pick.

5. C. elegans gonade mikroinjektion med RNPs og post injektion pleje

Bemærk: Mikroinjektion protokol er tilpasset fra Mello og brand57og beskrevet i detaljer andetsteds60,61.

  1. Placer coverslip med ormene monteret på injektion mikroskop. Placer ormene vinkelret på injektion nål under en lav forstørrelse (5 X mål, 10 X okulær).
    1. Skift til en høj forstørrelse (40 X mål, 10 X okulær), flytte nålen støder op til gonade arm svarende til regionen nær kerner i midt - til slutningen-pachytene.
    2. Ved hjælp af micromanipulator, flytte nålen mod orm, deprimerende neglebånd lidt. Tryk på siden af mikroskop fase at bumpe nål gennem neglebånd med den ene hånd. Trykkes injektion pedal/knappen og langsomt fylde gonade arm med indsprøjtning mix og fjerne nålen.
    3. Gentag dette trin med andre gonade armen.
  2. Når ormene er indsprøjtet, fjerne coverslip/Agarosen pad og placere den under et dissekere mikroskop.
    1. Bruger en trak kapillær pipette, fortrænge olie fra ormene når der afpipetteres en M9 buffer over dem. Udføre denne behandling for at frigive orme fra agaren.
    2. Efter 10 min, når ormene gennemdrøfte omkring i bufferen, flytte dem til en NG-agar plade med OP50 bakterier bruger den trak kapillær pipette. Pladen anbringes ved 20 ° C i 2-3 timer indtil ormene har genvundet og bevæger sig rundt.
  3. Når inddrives, individuelt overføre orme til NG-agar plader med OP50 og overføre pladerne til en 25 ° C inkubator.
  4. Tillad P0-indsprøjtet orme at vokse og lægge afkom i 3 dage. Skærm F1 afkom.
    1. Hvis du bruger co-CRISPR eller co konverteringen62,vælge63,64,65, derefter ormene kandidat for screening baseret på om de har mutant Fænotypen af reference-genet. Individuelt overføre disse markante orme til nye NG-agar plader med OP50 og tillade dem at lægge F2 afkom ved 20 ° C.
      Bemærk: Fænotype bruges til en co-CRISPR screening eller udvalg bør give et tidligt estimat for succes Cas9 redigering.
    2. Hvis co-CRISPR fænotype ikke er til stede, microinject en positiv kontrol plasmid til at hjælpe med at forbedre mikroinjektion effektivitet.
      Bemærk: For eksempel, herunder en plasmid injektion mix, der koder mCherry-tagged MYO-2 vil hjælpe med at vurdere injektion effektivitet. Orme med held injiceres med pCFJ90 vil have nogle afkom med fluorescerende pharynxes.
  5. Undersøge F1 orme for tilstedeværelsen af de ønskede ændringer. Vælge F1 mor til en individuel godt af en 96-brønd plade, lyse hende og undersøge hendes DNA af Indsæt-specifikke PCR-amplifikation, DNA Sekvensanalyse eller landmåler nukleasen assay (CEL-1)66.
    Bemærk: Disse assays kan udføres, når du bruger en co-CRISPR/co-conversion eller andre screening eller udvalg regimer65,66,67,68.
  6. For oplysninger om vurderingen af de redigering resultater, spring til trin 8.

6. P. hawaiensis forberedelse

  1. 1 dag før mikroinjektion, berige for de tidlige embryoner ved at oprette et par tank natten før; nyligt separerede kvinder vil indeholde frisk befrugtede embryoner. Se Rehm et al. 69 for yderligere oplysninger.
  2. På dagen for mikroinjektion, indsamle encellede Parhyale embryoner (0-4 h efter befrugtning) af bedøve fælderne hunner med 0,02% fed olie i havvand og forsigtigt skrabe embryoner ud af hendes ventrale rugepose ved hjælp af en flamme-trukket og afrundede glas pipette og en kedelig par #3 pincet.

7. P. hawaiensis Embryo mikroinjektion med RNPs og post injektion pleje

  1. Opfyldning en trak kapillarrør med ca 1 µL af RNP injektion mix beskrevet ovenfor.
  2. Brug komprimerede nitrogen til microinject hvert embryon, som beskrevet i Rehm et al. 69.
    1. Injicere Parhyale embryoner under dissekere mikroskop ved hjælp af en microinjector og en micromanipulator. Indlæse 1,5 µL af injektion blandingen ind i bagsiden af en trak kapillarrør (4 inches - 1,0 mm med filamenter, trukket med en mikropipette trække apparater) ved hjælp af en microloader pipette tip.
    2. Opsætning af nålen på apparatet injektion og bryde spidsen af nålen (en meget lille mængde) ved hjælp af et par pincet dissekere omfattet. Kalibrere volumen leveret af indsprøjtning i halocarbon olie 700 og måle diameteren af boblen.
    3. Skære en 'lavpunktet' ud af hærder ved hjælp af et barberblad. Fyld den halvvejs med filter-steriliseret havvand, og line Parhyale embryoner op i trug til at stabilisere.
    4. Injicere embryoner ved hjælp af mikroinjektion setup, stabilisere hver embryo med et par pincet under injektionen. Efter injektion, skal du bruge et glas overførsel pipette til at overføre embryonet til en frisk 60 mm kultur fad fyldt halvvejs med filter-steriliseret havvand.
  3. Hvis den første division har allerede fundet sted til at danne en 2-celle embryon (4-6 h efter befrugtning), generere fuldt mutant dyr ved at indsprøjte begge blastomeres. For at sikre en total kløvningen af 2-celle stadium, co injicere blastomeres med FITC eller TRITC dextran og konstatere, at signalet er begrænset til en enkelt blastomer under en fluorescerende dissekere anvendelsesområde efter injektionen.
    1. Alternativt kan du generere 'halv-mutant' dyr ved at indsprøjte blot én af de to blastomeres på 2-celle stadium (groft delt venstre-højre afhængigt af de væv og position på A-P akse).
    2. Indsprøjtes en celle i et 8-celle embryon (7,5-9 h efter befrugtning) at begrænse redigering til en enkelt Kim lag. Se Gerberding et al. 70 for et kort over tidlige blastomer lineages.
  4. Inkuber embryoner i 60 mm kultur retter (ikke mere end 25 pr parabol), fyldt halvvejs med filter-steriliseret havvand, 'pre iltet' ved hjælp af en akvarium Bobleflasken eller ved at ryste voldsomt.
    1. Placer retter af embryoner i et løst lukket plasticware foret med våde køkkenrulle til at bevare fugt og placere dem i en 26 ° C kuvøse med en 12-timers lys-mørke cyklus.
    2. Overføre de overlevende embryoner til rent havvand retter hver par dage.
      Bemærk: Embryoner kan kulturperler ved stuetemperatur, selv om de vil udvikle sig meget mere langsomt.
  5. Dissekere og fastsætte embryoner på forskellige stadier for en udtryk analyse af i situ hybridisering eller antistof farvning (Se Browne et al. 71 for en midlertidige guide, og yderligere henvisninger til dissektion og fiksering72, i situ hybridisering73og antistof farvning74).
    1. Gøre dissektion nåle ved threading et bøjet stykke af wolfram wire ca 0,5 i længde i slutningen af en insulin nål. Skærpe nålen i natriumhydroxid under en strøm. Bruge en 1 mL sprøjte som håndtag af dissektion nålen.
    2. Fyld et godt af en 3-godt glasfad halvvejs med en frisk fremstillet opløsning af 9 dele PEM Buffer (0,1 M rør pH 6.95, 2 mM af EGTA, 1 mM MgSO4), 1-del 10 x PBS og 1 del 32% PFA. Placer 3-5 embryoner i fadet og stikke et lille hul ind i hvert embryon, ved hjælp af en skarp wolfram nål til sækken og en lidt sløvet for at stabilisere, så blommen flyder ud og fiksativ at køre.
    3. Med en skærpet wolfram nåle, drille forsigtigt væk de ydre to membraner omgiver Parhyale embryo. Dissekere dem i fiksativ for at embryonerne mere robust, men arbejdet hurtigt at holde membranen fra at blive fastgjort til embryo, som vanskeliggør membran fjernelse. Tillade embryoner til fix for i alt 15-20 min. for antistoffarvning eller 40-50 min. i situ hybridisering.
  6. Billede live hatchlings og analysere dem for morfologiske og adfærdsmæssige fænotyper eller fix og bejdse dem for mere detaljerede analyser. Hæve hatchlings til seksuel modenhed i 2-3 måneder at etablere knockout og transgene linjer (Se Kontarakis og Pavlopoulos75 Nyudklækket pleje og andre nyttige oplysninger).

8. vurdering af redigering resultater

  1. Hvis det er relevant, kigge efter en visuel eller funktionelle fænotype i den redigerede celler eller organismer.
    Bemærk: Denne proces varierer meget ved ansøgning, og nogle eksempler er beskrevet i slutningen af deres relevante protokol trinene ovenfor. Efter korrektion seglcelle mutation i HSPCs, analysere hæmoglobin produktion af differentierede erythroblasts ved hjælp af HPLC (fig. 1A). En knockout af IL-2-receptoren genet i T-celler kan bekræftes af overflade pletter og flow flowcytometri (figur 1B). For at vurdere C. elegans og P. hawaiensis fænotyper, observere dyr morfologi og adfærd under en lys eller fluorescerende mikroskop (tal 1 c og 1 D).
  2. For at fastslå effektiviteten og type af genomisk redigeringerne genereret, lyse puljer af redigerede celler og uddrag deres genomisk DNA ved hjælp af en kommerciel udvinding kit21.
  3. For en hurtig vurdering af indel dannelse, PCR-Forstærk mindst 200 basepar omkring cut websted og udføre en T7 endonuclease1 (T7E1)76 eller landinspektør (CEL-1 nukleasen) assay77.
    1. Hvis en indel dannelse på Cas9-cut websted eller succesfulde HDR vil oprette eller fjerne en kendt begrænsning websted, kan du overveje at bruge en restriktion enzym fordøjelsen for at anslå den redigering effektivitet6. Begrænsning fragment længde polymorfisme (RFLP) analysen kan være en nem måde at kontrollere effektivitet, hvis det sker for at være tilgængelige.
    2. For en nøjagtig kvantificering af redigering effektivitet og bestemmelse af fremherskende redigering resultater, sende PCR-amplikon for en standard Sanger sekventering med både forward og reverse primere.
      Bemærk: Hvis analysere en enkelt klon eller organisme, analyse af Sanger resultater er enkel, som vist i figur 2A. Hvis analysere en pulje af celler, derefter analysere kromatogrammer med online værktøj78, som vist i figur 2B.
    3. For en fuld kvantificering og sekvenser af redigering resultater, udføre dyb sekventering27,54, som afbilledet i figur 2C.
    4. At vurdere et bestemt sæt af off-mål ændringer, PCR-forstærke de forudsagte off-målwebsteder og sende dem til NGS. For at muliggøre påvisning af kromosomale translokationer, udføre GUIDE-seq79 eller høj overførselshastighed, genome-wide translokation sekventering (HTGTS)80. For et komplet billede af off-target redigeringer i en klonal befolkning, udføre hele-genome sequencing (WGS)81,82,83.
      Bemærk: Der er en række metoder til kvantificering af på - og off-målet genom redigeringer, forklarede yderligere i forskellige review artikel84,85,86.

Representative Results

Disse eksperimenter viser hvordan formonteret Cas9 RNP kan bruges til at manipulere genomer af primærelementer og hele organismer. Forskere rense eller køb Cas9 protein og sgRNA, kombinerer de to komponenter for at pre danne komplekset og indføre RNP i deres celler eller organisme af interesse. Efter at der tid nok til redigering til at opstå og for afkom af den næste generation at blive født (hvis relevant), check for fænotyper og/eller indsamle celler til genotypebestemmelse. Fænotyper kan iagttages via funktionel assays, udtryk assays, visualisering (med det blotte øje eller med mikroskopi) eller andre metoder, der passer til eksperimentet.

For eksempel, kan HSPCs, der blev udeladt for at korrigere den β-globin mutation, der forårsager seglcelleanæmi opdeles i erytrocytter og analyseres for produktionen af sunde eller seglcelle hæmoglobin27,87 (figur 1 A). T-celler redigeret for at banke ud af høj-affinitet IL-2-receptoren genet, CD25 (IL2RA), kan analyseres af overflade pletter og flow flowcytometri88og funktionelt analyseres for at påvise en signaling svar til IL-2 stimulation (figur 1B ). T-celler kan også omprogrammeres i mange klinisk vigtige måder, der kræver vurdering af forskellige fænotyper, herunder effekten af HIV infektion89 og i vivo antitumor effekt af bil-T celler11.

Ved hjælp af en co-CRISPR/co-conversion screening tilgang, er C. elegans orme redigeret samtidigt på to loci62. HDR på dpy-10 reference gen ved hjælp af en ssODN reparation skabelon resultater i en let scorede dominerende dpy-10 gevinst af funktion mutation. Heterozygous F1dpy-10(gof) dyr er roller (Rol) og homozygote dpy-10(gof) dyr er dumpy (Dpy). Tilstedeværelsen af Fænotypen angiver at Cas9 redigering opstod i disse dyr og forbedrer odds for at identificere en redigering begivenhed i den anden locus i Rol eller Dpy F1 dyr. En vellykket redigering eksperiment bør resultere i 33-50% af indsprøjtet P0 orme giver 20 eller flere F1 afkom der er Rol eller Dpy90. Det er derefter muligt at vælge ikke-Rol dyr at returnere dpy-10 til vildtype og vælge for den homozygote redigering af interesse. Som en tommelfingerregel bør koncentrationen af crRNA rettet mod co-CRISPR reference gen halvdelen at af crRNA rettet mod gen af interesse. Hvis en redigering i gen af interesse ikke er inddrevet, kan nøgletal for de to CRISPR RNA'er justeres for at øge sandsynligheden for at inddrive de ønskede mutation. For eksempel, vil øge mængden af crRNA for gen af interesse i forhold til reference gen crRNA øge procentdelen af orme besidder redigeringer i gen af interesse i befolkningen af orme, der også besidder redigeringer på reference gen locus. Co konverteringen frekvenser varierer, men satserne, der er typisk 20-60%, ofte giver homozygot redigeringer i F1 generation (figur 1C).

P. hawaiensis hatchlings, der blev udeladt for at banke ud Abdominal-B genet (Abd-B) vise klare morfologiske abnormiteter3 (fig. 1D). Dette gen er nødvendige for korrekt abdominal mønstre, og dens forstyrrelser resultater i thorax-type hoppe og gå ben erstatter svømning og anker benene, der normalt er til stede på maven.

Bestemmelse af genom-redigering resultater på den genotypiske plan kræver enten sekvensering eller en in vitro- forsøg, der registrerer ændringer i sekvensen. Her viser vi repræsentative sequencing data fra vores model celletyper og organismer, fremhæve forskellige tilgange til redigering kvantificering. Bemærk, at figuren etiketter er generaliseret fordi alle metoder vist her kan anvendes på ethvert biologiske system.

Sekventering-baserede tilgange varierer i tekniske kompleksitet og dybde af resultater. For klonede redigerede populationer eller let adskilles individuelle organismer, kan blive sekventeret redigerede enkeltpersoner efter genomisk DNA-ekstraktion. Standard Sanger sekventering resultater vil afsløre sekvens ændring på webstedet Cas9-cut i en given person med hypotetiske frameshifts, der ville forstyrre dens funktion (fig. 2A). Den online værktøj, der anvendes til sekvensering er en anden Sanger sekventering-baseret tilgang, der kan anvendes til blandede befolkninger snarere end individuelle mutanter78. Sekvenser er analyseret med et online-værktøj, som kan tilnærme samlede redigering effektivitet samt fremherskende sekvens resultater. De repræsentative data er vist i figur 2B.

Den mest grundige sekventering metode beskrevet her er dybe sekventering (undertiden benævnt høj overførselshastighed eller næste generation sequencing). Denne metode giver DNA-sekvenser fra individuelle genomer i en blandet population. Sådanne data kan illustreres i en række forskellige måder. Her har vi klassificeret individuelle sekventering læsninger fra redigerede celler baseret på redigering resultatet (figur 2C). De fleste celler er redigeret via NHEJ vej, hvilket typisk resulterer i afbrydelse af genet. I andre har mål-genet været byttet ud for en alternativ version via HDR27.

Table 1
Tabel 1: positiv kontrol for foreløbige genom-redigering eksperimenter. Denne tabel viser de vigtigste oplysninger kræves for at udføre en første gang genom-redigering eksperiment i hver af de celler og organismer, der er beskrevet i denne protokol. Efter disse parametre er tilbøjelige til at give et vellykket resultat, der kan bruges til at teste protokollen eller som en baseline til sammenligning en gang eksperimentatoren er rettet mod et gen i deres egen interesse. F: fremad, R: reverse, HDR: homologi-instrueret reparation. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant fænotypiske resultater fra Cas9 RNP redigering af primære menneskelige celler og organismer. (A) dette er en HPLC spor viser, at efter vellykket genom-redigering, HSPCs, der er differentieret i sene erythroblasts vil producere mere funktionelle hæmoglobin end seglcelle hæmoglobin. Mutant erytrocytter producere segl hæmoglobin (HB), mens held redigeret celler vil producere sundt hæmoglobin (HbA og HbA2) samt føtalt hæmoglobin (HbF). Absorbansen er grafen i arbitrære enheder (au). Dette panel blev først offentliggjort i DeWitt et al. 27. det er genoptrykt med tilladelse fra American Association for avancement of Science. (B) til venstre for hver betingelse, dette panel viser flow flowcytometri data viser, at overflade-farvede T celler ikke udtryk CD25 efter CD25 gen har været slået ud med RNP. CD25 overflod er afbildet på x-aksen med Cellestørrelse på y-aksen. Til højre for hver betingelse, viser dette panel Phospho-Stat5 (pStat5) kvantificering efter en induktion med IL-2. Den signalerer reduceres, når IL-2-receptoren er fraværende (CD25 KO). PStat5 overflod er afbildet på x-aksen og de data fra tre forskellige niveauer af IL-2 input sammenlignes lodret. (C) dette panel viser en Caenorhabditis elegans co-CRISPR/co-conversion skærm rettet mod dpy-10 som co konverteringen til afgiftsmærkning. To guide RNA'er mål to loci, dpy-10 og din favorit gen (yfg), i den samme P0-injiceres dyr. HDR på dpy-10 resultater en Rol eller Dpy fænotype. Udvælgelsen af Rol - eller Dpy-F1 dyr øger chancerne for at identificere ændringer i den anden locus. (D) dette panel viser at vildtype Parhyale hawaiensis hatchlings har normal underliv med svømning og anker ben. Abd-B knock-out hatchlings (F0 personer) udvikle en maven omdannet mod brystkassen. Således, svømning og ankre ben er væk og erstattet af hoppe og vandreture benene forbundet med en normal brystkasse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Typiske resultater fra redigering resultatet analysemetoder. (A) dette panel viser eksempler på Sanger sekventering resultater fra individuelle F1 P. hawaiensis organismer, herunder vildtype sekvens og tre forskellige indels, der forstyrrer funktionen gen ved at flytte rammen åben læsning. (B) disse tidevand resultaterne viser omfanget af indsætninger og sletning begivenheder, der fandt sted på en Cas9-mål-webstedet i en pulje af sekventeret T celler. X-aksen angiver længden på en given indsættelse eller sletning i nukleotider. (C) disse dybe sekventering resultaterne viser ingen genom-redigering uden nucleofection eller gRNA, og vellykket redigering med intakt Cas9 RNP, grupperet efter DNA reparation resultatet i HSPCs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Oprettelse af en robust genom-redigering protokol i en celle linje eller organisme af interesse kræver optimering og empirisk afprøvning af flere vigtige parametre, diskuteres i dette afsnit. Prøver et par variationer af de generelle tilgange præsenteres her er stærkt tilskyndes. Den vigtigste begrænsning af denne protokol er at anvende disse metoder til andre celler eller organismer kan føre til et andet resultat dyrearten studerede, og en eksperimentel design, der fører til en højeffektiv gen knockout må ikke promovere DNA indsættelse. Dermed, vi anbefaler at starte med de metoder, der præsenteres her og fejlfinding som beskrevet nedenfor.

Fejlfinding genom-redigering reagens kvalitet:
Generere eller købe høj kvalitet reagenser er et afgørende skridt i enhver genom-redigering protokol. Cas9 protein kan renses i laboratoriet eller købt kommercielt. Mange protokoller Bemærk en endelig koncentration for Cas9 i RNP opskrifter, men det optimale gen redigering aktivitet vil afhænge af den specifikke aktivitet af individuelle Cas9 protein præparater, som varierer afhængigt af kilden. Når protokollen præsenteres her er orden, overveje at optimere mængden af RNP bruges ved at titrere Cas9 niveauer til at etablere en optimal koncentration: en, der giver meget specifikke mål DNA kavalergang uden unødvendige off target kavalergang forårsaget af overdreven Cas940.

Guide RNA renhed og homogenitet kan også være determinanter for genom-redigering succes22. Købt sgRNAs eller separate komponenter, crRNA og tracrRNA er generelt høj kvalitet reagenser og en lang række kemiske ændringer er tilgængelige til at bekæmpe problemer med RNA nedbrydning eller til at give ekstra funktioner til RNP91. Mens kemisk modificerede gRNAs ikke må være nødvendig for standard genom-redigering eksperimenter, nogle grupper har observeret meget højere redigering effektivitetsgevinster med sådanne reagenser, så de kan være værd at prøve efter mastering processen og/eller når gRNA nedbrydning synes at være et spørgsmål22,91. In vitro transskription og efterfølgende gel rensning er et billigt alternativ, som kan være tilstrækkeligt til rutinemæssig genom-redigering eksperimenter17,21,49,50. Yderligere, flere tilgange, der er almindeligt anvendt til at producere homogen gRNA populationer i vivo, herunder ribozym - og tRNA-baserede excision af individuelle vejledninger, kan udvides til in vitro- RNA forberedelse til at generere renere produkter92.

Guide RNA og donor DNA design tips:
Guide RNA udvælgelse er en kritisk faktor for opnåelse af højeffektive på target redigering samtidig minimere chancerne for off-target kavalergang. For at støtte i guide udvælgelse, har flere undersøgelser brugt høj overførselshastighed skærme koblet med næste generation sequencing kompilere sekvens funktioner af vellykket guider47,79,93,94, 95,96. Disse funktioner har været brugt til at udvikle intelligent algoritmer og online værktøjer til at hjælpe med at guide udvælgelse44,45,46,47,48. Sådanne algoritmer er funderet på skærme ved hjælp af DNA-baserede systemer til guide RNA udtryk. Guider er udtrykt ved hjælp af en Pol III promotor, og deres udtryk er derfor udsat for de begrænsninger i forbindelse med Pol III transskription, såsom for tidlig afslutning når de støder på spor af uracil97,98, 99. Dog gjort brug af RNPs med in vitro-syntetiserede guide RNA'er omgår disse bekymringer og forenkler begrænsningerne på guide design. Et fælles træk, der fremgik af disse algoritmer og er blevet bekræftet i talrige undersøgelser med meget effektiv genom-redigering, er tilstedeværelsen af en purin, især en guanin, for 3 ' enden af guide's target-specifikke sekvens. Denne guide funktion har været meget vellykket blandt organismer spænder fra pattedyr til C. elegans, bananfluer og zebrafisk65,100,101. Derudover for C. eleganser design guides med en GG dinucleotid for 3 ' enden af den guide målretning region en effektiv strategi til at forudsige meget effektiv guide RNA'er65. Ideelt, teste flere guider i parallel til at afgøre, hvilket er mest succesfulde for en given ansøgning.

Når du forsøger at indføre en DNA-sekvens i genomet, er design af donor eller DNA-template også afgørende. Enkeltstrenget oligonukleotid donorer (ssODNs) der indsættes mere pålideligt end andre typiske reparation skabeloner, lineære dobbelt-strenget og plasmid DNA54,55,102. På nogle loci, kan HDR effektivitet forbedres med ssODNs, der supplerer de ikke-målarter eller fordrevet DNA streng og besidde homologi våben, der er asymmetrisk i længde27,55. Da reparation skabelon er ved at blive sat på webstedet cut og indeholder den målrettede sekvens, skal der tages skridt til at forhindre Cas9 i at holde donor DNA før eller efter genomisk indsættelse. Dette opnås ved at gøre tavs mutationer til PAM sekvens eller frø område og undgå anerkendelse af Cas9 samtidig bevare funktionen af indsatte gen21,103. Selvom selv enkelt nucleotid ændringer i PAM er tilbøjelige til at afskaffe bindende104, prøv at ændre mindst fire nucleotider for at være sikker.

Betydning og fremtidige ansøgninger:
Genom-redigering med CRISPR-Cas9 er opstået som en kraftfuld metode gør det muligt for facile genmanipulation af enhver organisme. Redigering med Cas9 RNP tager en lidt større indsats i første omgang men er ligetil at bruge når reagenser og protokoller, der er etableret i et laboratorium. Redigering af celler med formonterede RNP i stedet for plasmid DNA fører til højere samlet redigering effektivitet, herunder vanskeligt at opnå gen indsættelse via HDR, med færre off target effekter24,25,26 , 27 , 29. Desuden eksperimentatorer undgå problemer med genekspression RNA nedbrydning, proteinfoldning og tilknytningen mellem gRNA og Cas9 molekyler syntetiseret separat inden for celle22,23. RNP redigering også omgår sikkerhed bekymringer om pattedyrsceller mutagenese og vedvarende udtryk, der kan opstå, når viral leveringsmetoder er anvendt klinisk14. På grund af disse fordele favor mange forskere foretage prækliniske, proof of concept eksperimenter RNP redigering for menneskelige terapeutiske anvendelsesmuligheder. Både i vivo og ex vivo RNP-baseret genom redigering metoder er under udvikling til at behandle eller endda kurere en række betingelser, fra genetiske sygdomme som Duchenne muskeldystrofi105 og seglcelleanæmi27 til HIV29 og kræft11. Det er interessant, er Cas9 RNP stadig ansat som en leveringsmetode for landbrugs udvikling, fordi det giver mulighed for 'DNA-fri' redigering af planter33,34,36.

Disclosures

Forfatterne Alexander Marson og Jacob E. Corn er medstiftere af Spotlight Therapeutics. Jacob E. Corn er rådgiver for Mission Therapeutics og hans laboratorium har fået sponsoreret forskning opbakning fra AstraZeneca og Pfizer. Alexander Marson er rådgiver for Juno Therapeutics og PAGTEN Therapeutics, og hans laboratorium har fået sponsoreret forskning opbakning fra Juno Therapeutics, Epinomics og Sanofi. Sit laboratorium har også ansøgt om patenter relateret til Cas9 RNP teknologi.

Acknowledgments

Vi takker mange tidligere medlemmer af vores labs og Bay Area genom redigering Fællesskabet for deres bidrag til udviklingen af disse metoder. Vi takker Ross Wilson til kritisk læsning af dette manuskript.

Alexander Marson forskning er understøttet af en gave fra Jake Aronov og en National dissemineret sklerose samfundet yde (CA 1074-A-21). Alexander Marson holder en karriere Award for medicinsk forskere fra fondens Burroughs Wellcome og er en Chan Zuckerberg Biohub Investigator. Jacob E. Corn forskning er støttet af Li Ka Shing Foundation, arv medicinsk forskning Medical Institute og California Institute for regenerativ medicin. Behnom Farboud og Barbara J. Meyers forskning er delvis finansieret af NIGMS grant R01 GM030702 til Barbara J. Meyer, der er en investigator af Howard Hughes Medical Institute. Erin Jarvis og Nipam H. Patels forskning er delvis finansieret af NSF grant IOS-1257379 og Erin Jarvis anerkender støtte fra en NSF GRFP og en Philomathia Graduate stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies - IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs Synthego - Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) New England Biosciences M0646T If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells AllCells PB032-2
StemSpan SFEM  StemCell Technologies 09650
StemSpan CC110 StemCell Technologies 02697
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit Lonza V4XP-3032
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid Sigma R0883-6X500ML
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit Stemcell 17951
cell culture plate, 96 wells, round Fisher Scientific 3799
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Life Tech 40203D 
Reombinant Human IL-2 UCSF Pharmacy NA
SepMate-50 500-pack IVD Stemcell Technologies 85460
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP-50 https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes - - See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID World Precision Instruments 1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID  World Precision Instruments 1B200-6 
Cover glass; 24 × 50 mm Thermo Fisher Scientific 12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm Thermo Fisher Scientific 12-518-105K
Apex LE agarose Genesee Scientific 20-102
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich  H8898-100ML
pCFJ90 plasmid Addgene 19327
Compressed nitrogen -
60 mM culture dishes BD
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)  World Precision Instruments T2100F-4
Sylgard 184 Dow Corning
Petri dishes (100 × 15 mm) -
Tungsten wire (0.005 in. diameter) Ted Pella
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) -
Marine salt -
9" pasteur pipettes -
Phenol red -
Nuclease-free water -
Equipment
4D Nucleofector Lonza AAF-1002X
MZ75 Stereomicroscope Leica  Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope Zeiss Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) Sutter Instrument  FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) Warner Instruments PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator Narishige International MO-202U
Coarse manipulator Narishige International MMN-1
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) Sutter Instrument  P-80/PC
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) Narishige IM300
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
NG-agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell. 1-17 (2016).
  2. Barrangou, R., Horvath, P. A decade of discovery: CRISPR functions and applications. Nature Microbiology. 2, 1-9 (2017).
  3. Martin, A., Serano, J. M., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26, (1), 14-26 (2016).
  4. Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26, (11), 818-824 (2016).
  5. Mali, P., Yang, L., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  6. Cong, L., Ran, F. A., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  7. Deltcheva, E., Chylinski, K., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, (7340), 602-607 (2011).
  8. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-821 (2012).
  9. Nowak, C. M., Lawson, S., Zerez, M., Bleris, L. Guide RNA engineering for versatile Cas9 functionality. Nucleic Acids Research. 44, (20), 9555-9564 (2016).
  10. Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 1-9 (2013).
  11. Rupp, L. J., Schumann, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells. Scientific Reports. 7, (1), 737 (2017).
  12. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16, 260 (2015).
  13. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 2270 (2016).
  14. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering delivery vehicles for genome editing. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 7, 637-662 (2016).
  15. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews Drug Discovery. 16, (6), 387-399 (2017).
  16. Zuris, J. A., Thompson, D. B., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, (1), 73-80 (2015).
  17. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. -S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195, (3), 1177-1180 (2013).
  18. Wang, W., Kutny, P. M., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43, (5), 319-327 (2016).
  19. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14457-14467 (2016).
  20. Remy, S., Chenouard, V., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, (1), 16554 (2017).
  21. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 1-7 (2017).
  22. Hendel, A., Bak, R. O., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology. 33, (9), 985-989 (2015).
  23. Thyme, S. B., Akhmetova, L., Montague, T. G., Valen, E., Schier, A. F. Internal guide RNA interactions interfere with Cas9-mediated cleavage. Nature Communications. 7, 11750 (2016).
  24. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. -S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24, (6), 1012-1019 (2014).
  25. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  26. Liang, X., Potter, J., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  27. DeWitt, M. A., Magis, W., Bray, N. L., Wang, T. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Science Translational Medicine. 8, (360), (2016).
  28. Ramakrishna, S., Kwaku Dad, A. -B., Beloor, J., Gopalappa, R., Lee, S. -K., Kim, H. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24, (6), 1020-1027 (2014).
  29. Schumann, K., Lin, S., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (33), 10437-10442 (2015).
  30. Lee, J. -S., Kwak, S. -J., et al. RNA-guided genome editing in Drosophila with the purified Cas9 protein. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda, MD). 4, (7), 1291-1295 (2014).
  31. Sung, Y. H., Kim, J. M., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24, (1), 125-131 (2014).
  32. Menoret, S., De Cian, A., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  33. Woo, J. W., Kim, J., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33, (11), 1162-1164 (2015).
  34. Malnoy, M., Viola, R., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  35. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  36. Liang, Z., Chen, K., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  37. Shin, S. -E., Lim, J. -M., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  38. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5, (7), 754-764 (2016).
  39. Grahl, N., Demers, E. G., Crocker, A. W., Hogan, D. A. Use of RNA-protein complexes for genome editing in non-albicans Candida species. mSphere. 2, (3), (2017).
  40. Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A standard methodology to examine on-site mutagenicity as a function of point mutation repair catalyzed by CRISPR/Cas9 and ssODN in human cells. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  41. Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient generation and editing of feeder-free IPSCs from human pancreatic cells using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  42. Mohr, S. E., Hu, Y., Ewen-Campen, B., Housden, B. E., Viswanatha, R., Perrimon, N. CRISPR guide RNA design for research applications. The FEBS Journal. 283, (17), 3232-3238 (2016).
  43. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (95), e52118 (2015).
  44. Hsu, P. D., Scott, D. A., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, (9), 827-832 (2013).
  45. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11, (2), 122-123 (2014).
  46. Moreno-Mateos, M. A., Vejnar, C. E., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12, (10), 982-988 (2015).
  47. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  48. Haeussler, M., Schönig, K., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17, (1), 148 (2016).
  49. Lo, T. -W., Pickle, C. S., et al. Precise and heritable genome editing in evolutionarily diverse nematodes using TALENs and CRISPR/Cas9 to engineer insertions and deletions. Genetics. 195, (2), 331-348 (2013).
  50. Bassett, A., Liu, J. -L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69, (2), 128-136 (2014).
  51. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and co-CRISPR independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. Bethesda, MD. (2017).
  52. Hirsh, A. Cas9 expression and purification protocol. protocols.io. (2017).
  53. DeWitt, M. A., Wong, J. In vitro transcription of guide RNAs. protocols.io. (2017).
  54. Yang, L., Guell, M., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41, (19), 9049-9061 (2013).
  55. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34, (3), 339-344 (2016).
  56. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
  57. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  58. Sutter Pipette Cookbook. Available from: https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2017).
  59. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. (2006).
  60. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook: the online review of C. elegans biology. (2006).
  61. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  62. Kim, H., Ishidate, T., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197, (4), 1069-1080 (2014).
  63. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X. H., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198, (3), 837-846 (2014).
  64. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199, (2), 363-377 (2015).
  65. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199, (4), 959-971 (2015).
  66. Wood, A. J., Lo, T. -W., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, (6040), 307 (2011).
  67. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10, (8), 741-743 (2013).
  68. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10, (10), 1028-1034 (2013).
  69. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (1), (2009).
  70. Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development (Cambridge, England). 129, (24), 5789-5801 (2002).
  71. Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, (3), New York, NY. 124-149 (2005).
  72. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (1), (2009).
  73. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (1), (2009).
  74. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (1), (2009).
  75. Kontarakis, Z., Pavlopoulos, A. Transgenesis in non-model organisms: the case of Parhyale. Methods in Molecular Biology. 1196, Clifton, NJ. 145-181 (2014).
  76. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. -S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Research. 19, (7), 1279-1288 (2009).
  77. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. BioTechniques. 36, (4), 702-707 (2004).
  78. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, (22), 168 (2014).
  79. Tsai, S. Q., Zheng, Z., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33, (2), 187-197 (2015).
  80. Frock, R. L., Hu, J., Meyers, R. M., Ho, Y. -J., Kii, E., Alt, F. W. Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nature Biotechnology. 33, (2), 179-186 (2015).
  81. Smith, C., Gore, A., et al. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15, (1), 12-13 (2014).
  82. Veres, A., Gosis, B. S., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15, (1), 27-30 (2014).
  83. Kim, D., Bae, S., et al. Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nature Methods. 12, (3), 237-243 (2015).
  84. Hendel, A., Fine, E. J., Bao, G., Porteus, M. H. Quantifying on- and off-target genome editing. Trends in Biotechnology. 33, (2), 132-140 (2015).
  85. O'Geen, H., Yu, A. S., Segal, D. J. How specific is CRISPR/Cas9 really. Current Opinion in Chemical Biology. 29, 72-78 (2015).
  86. Tsai, S. Q., Joung, J. K. Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases. Nature Reviews Genetics. 17, (5), 300-312 (2016).
  87. Hoban, M. D., Cost, G. J., et al. Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 125, (17), 2597-2604 (2015).
  88. Simeonov, D. R., Gowen, B. G., et al. Discovery of stimulation-responsive immune enhancers with CRISPR activation. Nature. (2017).
  89. Hultquist, J. F., Schumann, K., et al. A Cas9 ribonucleoprotein platform for functional genetic studies of HIV-host interactions in primary human T cells. Cell Reports. 17, (5), 1438-1452 (2016).
  90. Paix, A., Wang, Y., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198, (4), 1347-1356 (2014).
  91. Lee, K., Mackley, V. A., et al. Synthetically modified guide RNA and donor DNA are a versatile platform for CRISPR-Cas9 engineering. eLife. 6, (2017).
  92. Minkenberg, B., Wheatley, M., Yang, Y. CRISPR/Cas9-enabled multiplex genome editing and its application. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 111-132 (2017).
  93. Doench, J. G., Fusi, N., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34, (2), 184-191 (2016).
  94. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 1-8 (2014).
  95. Liu, H., Wei, Z., Dominguez, A., Li, Y., Wang, X., Qi, L. S. CRISPR-ERA: a comprehensive design tool for CRISPR-mediated gene editing, repression and activation. Bioinformatics (Oxford, England). 31, (22), 3676-3678 (2015).
  96. Wu, X., Scott, D. A., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. 32, (7), 670-676 (2014).
  97. Bogenhagen, D. F., Brown, D. D. Nucleotide sequences in Xenopus 5S DNA required for transcription termination. Cell. 24, (1), 261-270 (1981).
  98. Cozzarelli, N. R., Gerrard, S. P., Schlissel, M., Brown, D. D., Bogenhagen, D. F. Purified RNA polymerase III accurately and efficiently terminates transcription of 5S RNA genes. Cell. 34, (3), 829-835 (1983).
  99. Chen, B., Gilbert, L. A., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155, (7), 1479-1491 (2013).
  100. Gagnon, J. A., Valen, E., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9, (5), 98186 (2014).
  101. Ren, X., Yang, Z., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Reports. 9, (3), 1151-1162 (2014).
  102. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8, (11), 2281-2308 (2013).
  103. Serano, J. M., Martin, A., et al. Comprehensive analysis of Hox gene expression in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Developmental Biology. 409, (1), 297-309 (2016).
  104. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 1-17 (2014).
  105. Lee, K., Conboy, M., et al. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair. Nature Biomedical Engineering. 1, (11), 889-901 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics