Snabb In Vivo bedömning av adjuvants cytotoxiska T-lymfocyter generations möjligheter för utveckling av vaccin

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar här en ansökan om en standardiserad immunologisk teknik (CFSE målat OT-jag spridning) avsedd att snabbt övervaka adjuvant-medierad cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) generation invivo. Detta snabb uppskattning av CTL kapacitet är användbar för utveckling av profylaktiska vacciner mot intracellulära patogener samt terapeutiska cancervacciner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bedömning av moderna underavdelning vacciner avslöjar att generationen av neutraliserande antikroppar är viktigt men inte tillräckligt för adjuvant urval. Därför behövs omgående adjuvans med både humorala och cellulära immun-stimulerande funktioner som klarar främja cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) svaren. Således, trogen övervakning av adjuvant kandidater som inducerar cross-grundning och därefter förbättra CTL generation utgör ett avgörande steg för utvecklingen av vaccin. Här presenterar vi en ansökan om en metod som använder SIINFEKL-specifika (OT-jag) T-celler att övervaka cross-presentationen av modellen antigenet ovalbumin (OVA) i vivo i närvaro av olika adjuvant kandidater. Denna metod representerar en snabb test att välja adjuvans med bästa cross-priming kapacitet. Spridningen av CD8+ T celler är mest värdefulla indikeringen av cross-grundning och det är också betraktas som ett korrelat av adjuvant-inducerad cross-presentation. Denna funktion kan bedömas i olika immun organ som lymfkörtlarna och mjälten. Omfattningen av den CTL generationen kan också övervakas, vilket ger insikter på en lokal karaktär (dränerande lymfkörtel främst) eller en systemisk reaktion (avlägsna lymfkörtlar och mjälte). Denna teknik ytterligare gör flera ändringar för att testa läkemedel som kan hämma specifik cross-presentation vägar och erbjuder även möjligheten att användas i olika stammar av konventionella och genetiskt modifierade möss. Sammanfattningsvis, vilja det program som vi presenterar här vara nyttig för vaccin laboratorier i näringslivet eller den akademiska världen att utveckla eller ändra kemiska tillsatsmedel för vaccinforskning och utveckling.

Introduction

Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) inducera vacciner är viktiga terapeutiska interventioner som har utvecklats för att bekämpa vissa typer av cancer1. CTL är också viktiga för profylaktiska vacciner mot intracellulära patogener2. CTL är dessutom en av de få immuna försvar mekanismerna funktionellt aktiva i riskgrupper såsom nyfödda3,4 , vilka också är beroende av CTL att bekämpa tidiga liv infektioner5. I detta avseende resulterade vacciner mot Respiratory Syncytial Virus (RSV) som har utvecklats med ett adjuvans som inte framkallar CTL svaren (Alun) i ett totalt misslyckande av vaccinet leder till allvarliga komplikationer vid infektioner i spädbarn6. Dessa negativa effekter av vaccination kan vändas genom en CD8+ T-cell svar7. Vi har tidigare visat att de viktigaste cytokiner (typ I interferoner) framkallas av vissa stimulator av interferon gener (STING)-agonister är avgörande för CTL Svaren genereras av dessa tillsatser8, delvis genom att mäta spridningen av OT-I T-celler efter vaccination och med dessa resultat som ett mått på CTL inducerande kapacitet hos extended vaccination scheman9. Mätning av spridning av OT-jag CD8+ T-celler i en vildtyp (WT) C57BL/6 mottagare mus av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dye utspädning är en robust uppskattning av adjuvans vaccin förmåga att generera Cross-priming av SIINFEKL, (immuno-dominerande peptiden av äggalbumin, ägg). Varianter av denna teknik används för bedömning av spridningen av OT-jag CD8+ och OT-II CD4+ T celler. Det har exempelvis använts i avsaknad av valda cytokiner (KO möss) eller att mäta vaccinets effekt efter antigen minns i WT djur. Vi tagit fram ett kort protokoll (4 dagar experiment) där efter passiv överföring av CFSE-färgade OT-jag CD8+ T celler, en subkutana (s.c.) immunisering som består av en dos av 50 µg av endotoxinfria OVA kompletteras med test adjuvans administreras (Figur 1). Uppföljningen av resultaten 48 h efter vaccination ger ett tillförlitligt bevis på adjuvant förmåga att generera CTL svaren. Genom denna strategi är det möjligt att bedöma styrkan hos det lokala immunsvaret i dränerande lymfkörteln efter immunisering samt omfattningen av svaret genom att mäta aktiviteten CTL i mjälte (eller avlägsna lymfkörtlar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss som används i denna studie var från C57BL/6 bakgrunden. Alla djuren hölls patogenfria villkor. Alla experimenten utfördes enligt de normativa av den tyska djurskyddslag (TierSchG BGBl. JAG S 1105; 25.05.1998) och godkändes av lägre Sachsen utskottet etik av djur experimenten och staten office (lägre Sachsen statligt kontor för konsumentskydd och livsmedelssäkerhet), under tillstånd nummer 33,4-42502-04-13/1281 och 162280.

1. CFSE färgning av OT-jag T celler och överföring

Obs: OT-jag möss är transgenically genererade djur som uttrycker en T-cell receptor (TCR) med fasta α och β-kedjor som tillsammans igen immuno-dominerande peptiden ägg, SIINFEKL10,11. Som ett resultat, dessa möss har ett betydligt hög antal SIINFEKL-specifika CD8+ T cells (97%)12 jämfört med normala eller ägg-vaccinerade möss (≤ 1%)13.

  1. Isolering av spårbar CD8+ T celler från OT-jag möss uttrycker T-lymfocyter-specifika Thy1en (Thy1.1) allel:
    1. Euthanize 6-9 veckor gamla OT-jag möss av CO2 inandning följt av cervikal dislokation14. Dissekera mjälten och stora lymfkörtlar (endast inguinal, axillär och cervikal-par) genom att skära huden med kirurgisk sax, du lossar huden från kroppen med hjälp av kirurgiska tänger och pincetter och placera dem i petriskålar (60 x 15 mm) vardera med en 100 µm porstorlek mesh cup för vävnad slipning och cell release.
    2. Upprätthålla petriskålar (vardera med en mesh cup) i 3-5 mL komplett RPMI medium (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin) förvaras på is.
    3. Mosa organ med hjälp av en kolv eller ett liknande sterila instrument (tidigare skärande behövs inte) och samla resulterande enda cellsuspensionen i 15 mL centrifugrör.
    4. Centrifugera cellsuspension vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Tvätta cellerna i 10 mL kall PBS genom centrifugering och lyse av erytrocyter från mjälten genom att åter avbryta pelleten i 1 mL/mjälte ammoniumklorid buffert (ACK buffert, kommersiellt tillgängliga). Inkubera cellerna för 1,5 min på is och därefter tvätta cellerna med 10 mL kall PBS genom centrifugering (som gjort innan).
    5. Resuspendera pelleten i samma rör i 1 mL PBS (pH 7,2) som innehåller 5% fetalt bovint serum för magnetiska isolering.
  2. För att utföra magnetiska isolering, gå vidare till det negativa urvalet av CD8+ T celler med hjälp av en magnetisk isolering kit enligt tillverkarens anvisningar eller publicerade protokoll15.
  3. För att utföra CFSE färgning, först räkna antalet CD8+ T celler som erhållits från OT-jag möss med hjälp av en automatiserad cell räknare (partikelräknare). Fläcken 1-5 x 107 celler/mL i en volym av 1-5 mL med 5 µM CFSE i PBS under 7 minuter vid 37 ° C, skyddas från ljus i en 15 ml falconrör.
  4. Släcka CFSE färgningen genom att lägga till samma volym (1:1) fetalt bovint serum till cellerna och inkubera dem i ytterligare 7 min vid 37 ° C skyddas från ljus. Tvätta cellerna med 10 mL PBS två gånger.
  5. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare. Ställa in cell nummer till 3-5 x 107 celler/mL PBS för att injicera 3-5 x 106 celler/mus i 100 µL intravenöst (i.v.) via svans venen.
  6. För att utföra svans ven injektioner, immobilisera möss i lämpliga restrainers. Värm det tillbaka område och svans av mössen att injiceras med ett rött ljus lampa, placeras mellan 20 till 25 cm från möss för 1-3 min att tillåta svans ven vasodilatation.
    Obs: Detta bidrar till att underlätta ven identifiering och administrering av cellsuspensionen.
  7. Säkerställa (med handen placeras mellan möss och lampan) att det inte är alltför het för möss och när svansen venerna är klart synliga, fortsätta till injektion. Injicera cellerna i laterala eller ryggens svans ven med en 1mL spruta med en 25-gauge nål16.

2. immunisering (Endo-fri OVA +/-Adjuvant)

  1. Placera de möss som transplanteras med OT-jag celler (steg 1,7, figur 1) i en anestesi kammare och administrera isofluran i syre genom en anestesi maskin14.
  2. När musen är helt somna under anestesi, ta ut från kammaren och raka päls av musen på området över den gluteus superficialis (laterala nedre ryggen) med hjälp av en elektrisk hår trimning maskin, för att utföra en ren injektion med bra utsikt över området.
  3. Injicera 50 µL av vaccinet, s.c. i den rakade området med en 25-gauge nål.

3. isolering av lymfocyter och färgning för flödescytometri Flödesanalys

  1. Isolering av lymfocyter och splenocytes
    1. Euthanize vaccinerade möss av CO2 inandning följt av cervikal dislokation.
    2. Extrahera dränerande och avlägsna lymfkörtlar och mjälten och placera dem i separata petriskålar som innehåller 100 µm porstorlek mesh koppar vävnad slipning och cell frigivning. Följ steg 1.1.2 genom 1.1.3.
    3. Dekantera supernatanten efter centrifugering och slamma cell pellets i samma volym av kvarlevan PBS (ca 100 µL).
  2. Färgning för flödescytometri Flödesanalys
    1. Förbereda en master mix som innehåller färgning antikropparna i de koncentrationer som skildras i tabell 1, vilket ger en 2 x koncentrerad färgning mix i en 15 mL centrifugrör. Förbereda tillräckligt med volym av master mix ha 100 µL per prov. Blanda cellerna och huvudmixen 1:1 och inkubera det vid 4° C i 30 min.
      Obs: Sista färgning volymen per prov bör vara 200 µL (100 µL av cell pellets + 100 µL av antikropp master mix).
    2. Tvätta cellerna två gånger genom centrifugering som beskrivs i 1.1.3, att tillsätta 10 mL PBS, två gånger.
    3. Återsuspendering färgade celler i 0,5-1 mL PBS för förvärv och överlåtelse suspensionen flöde cytometer rör. Alltid hålla proverna på is och skyddas från ljus.

4. flödescytometri

  1. Alltid förfilter cell proverna med 70-100 µm filter.
  2. Förbereda enda färgning ersättning kontroller för den fluorophores som beskrivs i tabell 1 (pärlor eller celler).
    Obs: Ersättning bör utföras i cytometer eller analys programvara17,18,19 och tillämpas på alla prover.
  3. Följa den portande strategi som avbildas i figur 2. Kort, gate populationer i framåt scatter höjd vs. framåt scatter området (figur 2A), och återigen side scatter brett vs. side scatter område (SSA, figur 2B) för att utesluta midjekort jacka.
  4. Gate befolkningen från figur 2B av plottning BV 650 (auto-fluorescens) vs. FITC (CFSE) för att diskriminera sant CFSE färgade celler från hög auto-fluorescerande celler. Inkludera pärlor eller cellerna färgas med antikropp konjugerat till BV 650 ersättning kontroller. Denna tomt (figur 2 c) BV 650 vs. FITC används för att utfärda utegångsförbud för OT-jag CFSE färgade celler.
  5. Utfärda utegångsförbud för befolkningen från figur 2 C för Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) för att särskilja celler från givare vs mottagarens möss.
    Obs: Celler härstammar från OT-jag donator möss är Thy1.1+ (CD90.1), medan WT (C57BL/6, mottagare) möss-derived celler är Thy1.2+ (CD90.2) (figur 2D). Vissa laboratorier har OT-jag möss i en Thy1.2 bakgrund och WT (C57BL/6) i en Thy1.1. I detta fall måste du använda en antikropp mot Thy1.2 för OT-jag cell gating.
  6. Re gate CD8+ celler från Thy1.1+ befolkningen genom att rita det på en grind bestående av BV 450 (CD4) vs APC (CD8) (figur 2E).
  7. Visa befolkningen gated i figur 2E med hjälp av ett histogram-visning av CD8+ celler visar CFSE (FITC, 530/15 kanal - blå laser-), utfärda utegångsförbud för den proliferated befolkningen av inklusive intensiteter från 102 upp till nivån där de odelade kontroll populationerna är (stödnivåer ~ 105, beroende på effekten av CFSE färgningen och inställningen spänning på flödescytometer) (figur 2F).
  8. Göra en ytterligare gate (visas inte i figur 2) plotting FITC vs. L/D-markör (450/20 kanal, UV laser) för att bedöma döda celler parallellt till spridning utvärderingen.
  9. Förvärva minst 5000 händelser för ersättning kontroller och 10.000 händelser (gate E, figur 2) prover på en flödescytometer. Kör cytometer vid lågt eller medelhögt flöde (Överskrid inte flöden av 20.000 evenemang/s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att testa de behandlingar som använder en annan kombination av adjuvans (ADJ1 och ADJ2), har vi bedömt den CTL kapaciteten genom att mäta spridningen av adoptively överförda OT-jag CD8+ T celler av flödescytometri (figur 2). För detta målat vi tidigare isolerade celler från dränerande lymfkörtlar och mjälte (tabell 1). Genom att mäta spridningen av CD8+ T celler i lymfkörtlarna och mjälten, kunde vi bekräfta en högre CTL produktionskapacitet av ADJ2 i dränerande lymfkörtlarna (figur 3) jämfört till ADJ1, ägg ensam eller PBS kontroll. Däremot har vi observerat att ADJ2 var inte kunna generera en CTL svar i systemisk kupé (mjälten), medan ADJ1 var visar höga nivåer av spridning av mjälten CD8+ T celler, inte bara jämfört med kontroller (PBS och ägg) men också överlägsen till ADJ1. Genom att dissekera åtgärden av ADJ2 med hjälp av denna snabba in-vivo proliferation assay, kan vi bekräfta dess kraftfulla åtgärder som en lokal men inte en systemisk CTL-generator. Dessutom fungerar ADJ1 både på den lokala platsen för injektionen (dränerande lymfkörtlar) samt som systemiskt med en ökad OT-jag spridning i mjälten. De erhållna resultaten möjligt att karakterisera adjuvanss verksamhet och dess omfattning, exemplifieras av de observerade effekterna av ADJ2 (lokala) och ADJ1 (systemisk).

Figure 1
Figur 1: assay tidslinjen. Assay tidslinje representerar den första OT-jag T cell överföra på dag 0, s.c. vaccination dag 1, och provtagning mjälte och dränerande lymfkörtlar 2 dagar senare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Flödesdiagram för Usenets strategin följde för att mäta spridningen av CD8+ T celler (OT-I, Thy1.1+) av flödescytometri. Två prover representeras i olika färger (röd och ljusblå) för en bättre visualisering. A-B. Enstaka celler diskrimineras från midjekort jacka successivt i två första grindarna av plottning framåt-scatter-höjd vs. framåt-scatter-området och side-scatter-bredd vs. sida-scatter-området. C. celler gated i B visas genom deras fluorescens stödnivåerna BV 650 kanal (auto fluorescens) plottas mot deras CFSE intensitet (där diming anger celler divisioner/spridning) i 530/30 YG kanalen. Denna grind tillåter val av sann CFSE positiva celler genom att diskriminera dem som har hög auto fluorescens. D. CFSE positiva celler var gated med sin höga fluorescensintensiteten hos Pe-Cy7 (Thy1.1, markör för OT-I-celler) vs. deras APC intensitet (CD8). E. BV 450 (CD4) plottas mot APC (CD8) för tidigare gated Thy1.1 positiva celler för att noggrant välja CD8+ T celler. F. tidigare gated CD8+ celler är ritade i ett histogram mot CFSE intensiteten till slutligen utfärda utegångsförbud för den proliferated befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Adjuvant driven CTL generation. Förmågan att framkalla lokala eller systemiska CTL Svaren avbildas för 2 olika adjuvant behandlingar (ADJ1 och ADJ2) längs antigen och PBS kontroller. Spridningen av adoptively överförda OT-jag T cellerna undersöks i dränerande lymfkörteln (inguinal, exemplifieras subkutana (s.c.) förvaltning) och i mjälten, som anges i figur raderna. Cellproliferation mäts i alla relevanta behandlingar (kolumner) för att kunna jämföra omfattningen av immunsvaret i sin lokala (dränerande lymfkörtel) eller systemisk (mjälten) utbud av action. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Färgämnen - antikroppar Klon Fluorophore/kanal-filter Koncentration 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1: 750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 R 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450 50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (enligt CFSE-färgning protokollet)
DCM (döda cellen markör) - -/ UV - 450/50 UV 1: 500

Tabell 1: antikropp infärgning för flödescytometri. Fluorophore-konjugerad antikropp kloner används och rekommenderas färgning koncentrationer (2 x).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moderna vacciner är idealiskt composedof renat antigen och adjuvans, med eventuella tillägg av ett leveranssystem som liposomer, virusliknande partiklar, nanopartiklar eller levande vektorer. En viktig aspekt när du utformar ett vaccin är att välja rätt adjuvans enligt kliniska behov. En del av tillämpningsområdet kan innebära gynnar en humorala vs. cellulära immunsvaret (eller båda), valet av en lokal vs. en systemisk immunsvar (eller båda) och typ av minne som vaccinet måste generera i målpopulationen. En avgörande aspekt av adjuvant utvärdering är att snabbt fastställa sin kapacitet att generera CTL. Vi presenteras här en metod baserad på redan kända tekniker, för att snabbt fastställa funktionerna i CTL svar i vivo i en musmodell genom att mäta OT-I CD8 T cell spridning. Denna metod gör det möjligt för förutsägelse av styrkan av immunsvaret framkallas av adjuvans (spridning av OT-jag T celler) i endast 4 arbetsdagar. Denna metod ytterligare underlättar jämförelsen av åtgärder av tillsatser i form av immunsvaret (lokal kontra systemisk) och dess effektiva åtgärder. Här har vi visade ett exempel på hur immunisering med olika adjuvant behandling (ADJ1 vs ADJ2) kommer att påverka immunsvaret. Handlingen av ADJ2 begränsades till det lokala området administration där det aktiverar immunförsvaret i dränerande lymfkörtlarna, medan effekten av ADJ1 med samma dos var mer utbredd, genererar en CTL svar både på den lokala och systemiska nivå men med lägre potens än ADJ2 i dränerande lymfkörtlarna.

Kritiska steg för lyckad utvärdering av adjuvanss CTL kapacitet är valet av unga OT-jag djur (som en källa av CD8 T-celler) och användning av endotoxinfria OVA för immunisering. Sedan OT-jag möss är transgena djur genereras för att producera CD8 T-celler som känner igen OVA peptid SIINFEKL i en MHC-jag sammanhang, dess artificiellt urval av musen TCR ökar framträdanden av hyper proliferativ CD8+ T cells20 med åldern. En inflammation i armhålan lymfkörtlarna är således ett vanligare inslag i år OT-jag möss. Beaktat detta, är det rekommenderat att använda unga OT-jag djur när det är möjligt (6-9-vecka-gammal djur) och att undvika att isolera cellerna från något förstorade organ (antingen mjälte lymfkörtlar). Användning av förstorade organ med prolifererande CD8 T-celler kommer att påverka hela analysen eftersom troligen skillnader i spridningen mellan kontroller och behandlingar inte kommer erhållas. En liknande fallgrop för diskrimineringen av adjuvant CTL produktionskapacitet kan genereras med hjälp av ägg protein med spår av endotoxin, som kan framkalla en mer potent immunsvar jämfört med endotoxinfria ägg21,22 (se Material och reagens), sedan endotoxiner är stark immuno-modulatorer i sig. 23. Därför måste det ägg protein används för immunisering endotoxinfria. Användning av 20 eller 50 µg av endotoxinfria ägg beror på sträckan immunisering är 50 µg en lämplig dos för subkutan testning av tillsatsmedel. Dessutom, användning av höga koncentrationer av CFSE har rapporterats i litteraturen att döda den färgade celler24 och kan också leda till misslyckande av analysen.

Vissa ändringar eller förbättringar av olika tekniker som används i protokollet genomfördes för att minska stressen i djuren, att öka reproducerbarhet av experimenten. Exempelvis relaterade att minimera uppvärmning av djur genom att bara värma ryggen och svansen av möss och inte hela djuret, eller för att undvika subkutan injektion stress av anesthetizing djuren före vaccination. Anestesi krävs inte av djurskyddsbestämmelserna för en subkutan injektion men i vår erfarenhet, det förbättrar reproducerbarhet genom att minska variationer infördes genom stressreaktionen.

En stor begränsning med denna metod är att eftersom CFSE fläckar membranet i celler, dess hög ljusstyrka oftast försämrar detektion av signaler från cytosolen. Därför, om bekräftelse av CTL kapacitet behövs, utsöndringen av IFN-γ bör utvärderas av en viss sekretion assay 25, och inte av intracellulära cytokin färgning.

Användning av mätning av spridning att uppskatta den CTL kapaciteten av tillsatsmedel i bara 4 dagar har fördelen av kortare tid behövs än traditionella CTL analyser26 och det är en bra blivande experimentera i fall där ytterligare krävs en bekräftelse av andra metoder.

Även om begränsade till OVA som antigen, och därför användningen av OT-I T-celler, den metod som presenteras här gör studien av egenskaperna för aktivering inducerade av olika tillsatsmedel efter sortering av proliferated celler. En av de möjliga tillämpningarna är studiet av de metabola signaturer som induceras av olika tillsatser i proliferated OT-jag T celler och dess relationer med utvecklingen av minne27. Ytterligare sekundära filmvisningar kunde bedöma de biologiska egenskaperna av de stimulerade cellerna, såsom uttrycket av cytokiner eller degranulering markörer av flödescytometri eller deras cytotoxiska kapacitet genom att utföra invivo CTL tester8, 26 , 28. Eftersom denna ansökan har begränsning av dess användning i möss, kan extrapoleringar till människor utföras genom att utnyttja filmvisningar baserat på humaniserade möss29,30,31.

Denna metod är som vi har presenterat här robust nog att användas som en första screening för val av cellulära svar aktivatorer och också tillräckligt flexibel för att ändras eller kopplat till ytterligare analys av de proliferated T-cellerna. I sammanfattning är här snabb i vivo bedömning av adjuvant CTL produktionskapacitet ett idealiskt verktyg för vaccin laboratorier i akademi och industri som är intresserad av en snabb karakterisering av verkningsmekanismen av deras adjuvant kandidat molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi står i skuld till våra tekniska assistenter: U. Bröder och H. Shkarlet, som hjälpt oss under experimentella rutiner. Detta arbete har delvis finansierats av EU-bidrag (UniVax, kontrakt nr 601738 och TRANSVAC2, kontrakt nr 730964) och Helmholtz föreningen bidrag (HAI-IDR). Finansiering källor påverkade inte forskningen design, generation av manuskript eller beslutet att lägga fram det för publicering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics