Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتحوير التحوير التعبير استخدام تبديل الجين المفرد pEUI(+) بالمعاملة تيبوفينوزيدي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

من المستحسن مراقبة دقيقة للتعبير التحوير في الدراسات السريرية والبيولوجية. ومع ذلك، نظراً للميزة ثنائي لتبديل الجينات المستخدمة حاليا يتطلب نقل وحدتين التعبير العلاجية وفي نفس الوقت في خلية واحدة، يقتصر التطبيق العملي لنظام العلاج الجيني. لتبسيط نظام التعبير التحوير، أنشأنا تبديل جينات سميت pEUI(+) يضم مجموعة كاملة من وحدات التعبير التحوير في ناقل واحد. تتألف من المجال GAL4 الحمض النووي ملزم وتعديل لائحة المجلس الأوروبي (جفيكر)، مجال تنشيط VP16 الحد أدنى تنصهر مع مجال GAL4 الحمض النووي ملزم، فضلا عن مستقبل ecdysone المورفولوجية معدلة (EcR)، التبديل الجين المفرد المطورة حديثا الغاية تستجيب لإدارة محفز الكيميائية بطريقة تعتمد على وقت وجرعة. ناقل pEUI(+) أداة قوية لتحسين السيطرة على التعبير التحوير في البحوث البيولوجية والدراسات ما قبل السريرية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتحوير لتعبير التحوير عابرة ومستقرة باستخدام ناقلات pEUI(+) بمعاملة تيبوفينوزيدي (Teb). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نشاطر مبادئ توجيهية هامة لاستخدام Teb كمحفز المواد كيميائية.

Introduction

تم استكشاف العديد من رموز تبديل الجينات المختلفة لقدرتها على تنظيم الذات التعبير التحوير في خلية ثقافة ونماذج حيوانية، بدرجات متفاوتة من النجاح1،،من23. نظم التبديل الجينات المحتملة ينبغي أن تجتمع عدة معايير صارمة، بما في ذلك: التعبير الاتجاه الدقيق للتحوير، وتعتمد على الجرعة ووقت الاستجابة للحمام، يجتازها ضئيلة من المروج، وإمكانية الرجوع للتحوير التنشيط عن طريق إزالة محفز، ومحفِّز السمية مستويات مقبولة لخطوط الخلايا ومختبر الحيوانات1،،من23. استغلوا مستحثات جزيء صغيرة عديدة، بما في ذلك تترسكلين4،5، ربمسن6،،من78، الميفيبريستون9،10، و ecdysone11،12،،من1314. بشكل عام، هذه الأنظمة تتطلب اثنين على الأقل البلازميدات المحتوية على وحدات التعبير منفصلة اثنين أو ثلاثة، وواحد أو اثنين من الذي يؤلف عنصر تنظيمي (محفز بلازميد) التي تربط محفز جزيء صغير لاكتساب النشاط الترانسكربتي؛ وآخر بلازميد (المستجيب بلازميد) التي تحتوي على التحوير تحت سيطرة منطقة الحمض النووي التنظيمية التي تسمح الوصول لعنصر تنظيمي محفز زمنياً. ويعتبر العيب الرئيسي للنظام الثنائي أنه يتطلب إدخال ما يصاحب ذلك من موجهات اثنين (محفز والمستجيب) في الخلية الهدف. في تجارب التعبير التحوير عابرة، تنتج تعداء المتزامن لاثنين والبلازميدات حتما عدد أن خلايا منفردة transfected مع محفز أو المستجيب، أو شارك transfected غير متكافئ. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نظام ثنائي على الأقل جولتين من اختيار المضادات الحيوية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة، وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. وهكذا، الجمع بين جميع العناصر المطلوبة للتحوير التعبير والتنظيم إلى ناقل واحد سيكون أمرا مثاليا لضمان التعبير الملازمة لجميع العناصر المطلوبة في خلية واحدة وتسمح لتنظيم التعبير التحوير من خلال المعاملة مع مستحثات جزيء صغير.

للتغلب على أوجه قصور تبديل ثنائي الجينات، نحن مؤخرا بوضع رمز تبديل جين المفرد، استخدام melanogaster المورفولوجية الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي نظام إيندوسيبلي15. اكديسوني يتوسط التعبير الجيني عند ذلك بربط هيتيروديمير EcR/أولتراسبيراكلي (جامعة جنوب المحيط الهادئ)، مما يدفع بدوره ملزم من لائحة المجلس الأوروبي للحمض النووي العناصر التنظيمية3،11. مستقبلات ريتينويد الفقاريات X (ركسر)، أورثولوج الحشرات جامعة جنوب المحيط الهادئ، المجندين EcR النموذج نشط منشط النسخي16. وهكذا، للتعبير المستهدفة من التحوير في خلايا الفقاريات أو الأنسجة، لائحة المجلس الأوروبي ركسر يجب أن يكون والمشترك أعرب في نفس الوقت قبل أن تحفزها ecdysone أو أن يضع. نظراً لميزة هيتيروديميريك للتبديل الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي يمكن أن يتأثر بالذاتية ركسر المستوى، باديدام وآخرون. الاستعاضة عن المجالات EcR الحمض النووي ملزم والتنشيط مع مغايرة GAL4 الحمض النووي ملزم، vmw65 بروتين فيروس الحلأ البسيط تنصهر فيها مجالات التنشيط (VP16) إلى المجال ملزم يجند لائحة المجلس الأوروبي، ثم أصبح لا يستجيب ركسر الذاتية وشكلت هوموديمير للحصول على نشاط النسخي17. تبديل الجين على أساس لائحة المجلس الأوروبي كذلك تحسنت بتشييد بروتين تشيميريك تتألف من أدنى مجال التنشيط VP16 جنبا إلى جنب مع جفيكر، التي شكلت هوموديمير وفي سيتوسول في غياب مؤثر اكديسوني،، Teb16مترجمة 18. بالربط إلى Teb, تغير جفيكر تعريب سوبسيلولار من سيتوسول إلى نواة الاعتراف بمروج مختلطة المؤلفة من الزرد E1b المروج الحد الأدنى جنبا إلى جنب مع عشرة جنبا إلى جنب تكرار تسلسلات التنشيط المنبع (أواس) الشروع في النسخ من الجينات الهدف16.

لتبسيط الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي سبق الإبلاغ عنها تبديل16،18، نحن دمج ميزات النظام الثنائي في ناقل واحد مجهزة بجميع العناصر المطلوبة لحفز التحوير التعبير ومن ثم عينت الموجه الذي تم إنشاؤه حديثا، pEUI(+) (رقم الانضمام إلى بنك الجينات: KP123436، الشكل 1A)15. المستجيب الاستجابة إلى برنامج تشغيل جفيكر (يشار إليها فيما بعد سائق) يتكون من عشر جنبا إلى جنب UAS يكرر بجوار مروج الحد أدنى E1b يليه موقع الاستنساخ لأغراض متعددة (MCS) اكوري، بملي، ني، بمتى، افتتاح، وأفليي من الاعتراف بتسلسل (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل الاختيار transfected الخلايا، بوروميسين يحركها مروج SV40 ن-أسيتيل-جين ترانسفيراز (PAC) وضعت بين منطقتي السائق والمستجيب للحفاظ على خطوط خلايا مستقرة (الشكل 1).

يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحوير التحوير التعبير باستخدام pEUI(+) عابرة ومستقرة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم إرشادات مفصلة عن الاستخدام الناجح ل Teb كمؤثر اكديسوني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التحوير سوبكلونينغ

  1. اختر موقع اعتراف بإنزيم التقييد ملائمة (أو المواقع) في الإشراف pEUI(+)، وسوبكلون في الجينات للفائدة في الاتجاه المطلوب (الشكل 1).
    ملاحظة: تكرار أنكيرين اجفب أو العلم حانمه معلم المجال 13A التحوير (ANKRD13A) وكان سوبكلونيد في موقع اكوري ناقل pEUI(+) استخدام بوليميراز الدنا T4 في التسلسل وربط-مستقلة عن استنساخ الأسلوب19.
  2. لينيريزي pEUI(+) مع اكوري ح 1 في 37 درجة مئوية. ميكس 50 نانوغرام/ميليلتر من خطيا pEUI(+) مع 40 نانوغرام/ميليلتر من تضخيم بكر اجفب أو ANKRD13A، وتتفاعل مع بوليميراز الدنا T4 (1 يو) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الحضانة على الجليد للحد الأدنى 10 ميليلتر 10 إضافة خليط رد فعل مباشرة إلى 100 ميليلتر من تجربة DH10B الخلايا المختصة للتحول التالية.
    ملاحظة: على الرغم من أن العديد من المواقع الاعتراف إنزيم التقييد أضيفت إلى الإشراف pEUI(+) (الشكل 1B)، نوصي سوبكلونينغ الجينات المستهدفة في الموقع اكوري، استخدام تكنولوجيا الاستنساخ مستقلة عن عملية ربط19،20.
  3. التحقق من الإدراج بالتسلسل وتنقية ثم الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الذي مناسبة تعداء.

2-عابر تعداء والعلاج Teb

  1. تحضير خلية أربعة ثقافة الأطباق (قطرها 60 ملم) التي تحتوي على خلايا HEK293 باساجيد طازجة في 5 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) تستكمل مع 5-10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية (البنسلين يو/مليلتر 100، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين). الآخرة، يمثل "خلية الثقافة المتوسطة" أو ببساطة "المتوسطة الثقافة" دميم وتستكمل مع FBS والمضادات الحيوية. الحفاظ على الخلايا HEK293 عند 37 درجة مئوية.
  2. ترانسفيكت 1 ميكروغرام لتنقية الحمض النووي في الخلايا HEK293 في 50-60% كثافة استخدام 3 ميليلتر من تعداء كاشف. إضافة الكاشف تعداء إلى 200 ميليلتر من مخفف (دميم دون FBS والمضادات الحيوية) التي تحتوي على الحمض النووي. بعد الحضانة لرد فعل الخليط لمدة 30 دقيقة في الرايت، إضافة الخليط إلى الخلايا HEK-293 على الطبق الثقافة. استخدم أطباق اثنين تعداء، وترك الأخريين دون علاج كعناصر تحكم.
  3. بعد 12-24 ساعة تعداء، إضافة Teb (تركيزات النهائي، 0.2-10 µmol) أحد نماذج ترانسفيكتيد وإلى أحد عناصر التحكم غير ترانسفيكتيد. اترك العينتين الأخرى دون علاج كعناصر تحكم تجريبية.
    ملاحظة: يمكن أن تضعف الحل Teb الأسهم (50 مم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد) في خلية ثقافة متوسطة أو دميم أو مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بتركيز مناسب قبل إضافة إلى الخلايا المستزرعة استناداً إلى المعلمات التجريبية. ومع ذلك، بسبب انخفاض معدلي الذوبان من Teb في المحلول، تجنب إعداد مزيج رئيسي مع تركيزات عالية من Teb في المتوسط؛ بدلاً من ذلك، استبدال مستنبت الخلية كاملة مع متوسطة جديدة تتضمن Teb في التركيز المطلوب.
  4. زراعة الخلايا Teb المعالجة وغير المعالجة ح 12-48 في 37 درجة مئوية.
  5. في حالة استخدام اجفب إدراج، تحليل التعبير اجفب تحت مجهر فلوري ( الشكل 2). وبخلاف ذلك، حصاد الخلايا لفحص إيمونوبلوتينج.
    1. لفحص إيمونوبلوتينج، شطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج وثم تتخلص منها باستخدام مكشطة خلية.
    2. لتتراكم في الخلايا، تدور انخفاض المحاصيل في أنبوب مخروطي 15 مل في 21,000 س ز 2 دقيقة عند 18-25 درجة مئوية (RT).
    3. بعد تجاهل برنامج تلفزيوني تماما، إضافة 0.5 مل كاشف استخراج البروتين الثدييات المثلج (م-الواحدة)، جنبا إلى جنب مع مثبط مبطلات (5 ميليلتر من 100 × مثبطات البروتياز كوكتيل)، إلى بيليه إذا كانت الخلايا تستزرع في صحن 60 ملم.
    4. تعليق إعادة الخلايا مع عدة جولات من بيبيتينج، ومن ثم احتضان الخلايا مع وقف التنفيذ لمدة 15 دقيقة في 18-25 درجة مئوية (RT).
    5. تدور الخلية ليساتي في 21,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. نقل المادة طافية مائي في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 طازجة.
    7. تحليل المادة طافية إيمونوبلوتينج، البروتوكولات القياسية التالية مع الأجسام المضادة المناسبة.

3-جيل من "خطوط الخلايا HEK293 مستقرة" مع "دمج الجينوم" pEUI(+) تبديل الجينات

  1. ترانسفيكت 5-10 ميكروغرام من pEUI(+) المنقي مع التحوير في خلايا HEK293 التي روافد 50-60% في طبق ثقافة خلية قطرها 90 مم، باستخدام 15-30 ميليلتر من الكاشف تعداء. إضافة الكاشف تعداء إلى 500 ميليلتر من مخفف (دميم دون FBS والمضادات الحيوية) التي تحتوي على الحمض النووي. بعد الحضانة لرد فعل الخليط لمدة 30 دقيقة في الرايت، إضافة الخليط إلى الخلايا HEK-293 على الطبق الثقافة.
  2. وبعد تعداء، تسمح ترانسفيكتانتس تنمو والتعبير عن منتجات الجينات المقاومة بوروميسين تحت غير انتقائية الثقافة المتوسطة (بدون بوروميسين) ح 24-48 في 37 درجة مئوية.
  3. فصل الخلايا من أطباق الثقافة التي تريبسينيزيشن. بعد تجاهل الثقافة المتوسطة، شطف ترانسفيكتانتس مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) وإضافة 1 مل حمض التربسين/الإيثيلين 0.25% (يدتا)، واحتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تسقيه التربسين/يدتا بإضافة حرارة قبل الثقافة المتوسطة (10 مل، 37 درجة مئوية)، حصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية، متبوعاً بالطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل في 21,000 س ز 2 دقيقة في 18-25 درجة مئوية.
  4. إعادة تعليق ترانسفيكتانتس في 50 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة (37 درجة مئوية)، ونقل 10 مل الخلايا في أطباق الثقافة خلية جديدة 90 ملم. الثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى 50-60% كونفلوينسي قبل العلاج بوروميسين (بشكل عام، وهذا يستغرق حوالي 24-48 ح).
  5. زراعة ترانسفيكتانتس في 37 درجة مئوية في المتوسط الثقافة خلية يكمل مع 3 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 3-4 أسابيع. أثناء فترة التحديد، تغيير مستنبت الخلية التي تحتوي على بوروميسين (3 ميكروغرام/مل) كل 2-3 أيام للحفاظ على ضغط الانتخاب. عندما تصبح الخلايا تماما المتلاقية، تقسيمها على اتباع الإجراءات المذكورة في الخطوات 3.3-3.4، مع متوسط الثقافة التي تحتوي على بوروميسين. تجاهل الخلايا المتبقية في الأجلين المتوسط والثقافة، إذا كان غير مطلوب.
    ملاحظة: بوروميسين التحديد يجب أن تضع شروطا تجريبيا لأنواع معينة من الخلايا. كنا 3 ميكروغرام/مل من بوروميسين في خلية ثقافة متوسطة؛ وكان هذا كافياً للحث على موت الخلايا في HEK293 غير ترانسفيكتيد.
  6. حصاد الخلايا من مستعمرات فردية، باستخدام اسطوانة استنساخ، واتبع إرشادات الشركة المصنعة.
    1. تجاهل مستنبت الخلية. شطف لوحة مرتين مع حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا العائمة.
    2. استخدام الملقط العقيمة، تعيين الاسطوانة الاستنساخ على المستعمرات الفردية.
    3. إضافة مل 0.2 0.35 في المائة التربسين/يدتا لكل اسطوانة.
    4. احتضان الطبق في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى يتم فصل الخلايا، ثم إضافة بضع قطرات من قبل حرارة (37 درجة مئوية) الثقافة المتوسطة إلى الاسطوانات.
    5. نقل الخلايا من كل اسطوانة إلى الآبار الفردية من لوحة 6-جيدا، مع 2 مل من الثقافة المتوسطة و 1 ميكروغرام/مل من بوروميسين في كل بئر.
      ملاحظة: عندما تصبح الخلايا المتلاقية، الارتقاء الثقافة. الآن وقد أنشئت clone(s).
  7. الحفاظ على الحيوانات المستنسخة الفردية في خلية ثقافة المتوسطة وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
  8. التحقق من صحة مستعمرات فردية باختبار حساسيتها لعلاج Teb (التركيز النهائي، 10 ميكرون) h. 24 اختبار مدى استجابة استنساخ إلى Teb عن طريق تحليل مستوى التعبير التحوير مع إيمونوبلوتينج. حدد استنساخ المطلوب (أو النسخ). زراعة Teb-معاملة وهي عينة غير معالجة في مستنبت ح 12-48 في 37 درجة مئوية قبل تحليل مستوى التعريفي التحوير. ويمكن قياس مستوى التعبير التحوير عن طريق إيمونوبلوتينج، اتباع الإجراءات المذكورة في الخطوات 2.5.1-2.5.7.

4-استنزاف Teb

  1. إخماد المحفزات Teb باستبدال Teb تحتوي الخلية الثقافة المتوسطة بمتوسطة Teb خالية.
    ملاحظة: من المستحسن لاستبدال وسائط النمو دون البذر الأولى الخلايا على طبق ثقافة جديدة. ويبدو أن التشبث بالطبق البلاستيك Teb المتبقية وسوف تحظى بتعبير خلفية قوية للتحوير. قبل البذر الخلايا على لوحة ثقافة جديدة، شطف الخلايا المقطوع عدة مرات مع الثقافة المتوسطة أو برنامج تلفزيوني.
    1. فصل الخلايا من أطباق الثقافة التي تريبسينيزيشن. بعد تجاهل Teb تتضمن الثقافة المتوسطة، شطف الخلايا تحفز Teb مرتين مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) وإضافة 1 مل من 0.25% التربسين/يدتا، واحتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تسقيه التربسين/يدتا بإضافة المعالجون مسبقاً خالية Teb الثقافة المتوسطة (10 مل، 37 درجة مئوية)، حصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية، متبوعاً بالطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل في س 21,000 ز لمدة 2 دقيقة في 18-25 درجة مئوية.
    2. إعادة تعليق الخلايا في 50 مل من قبل حرارة خالية Teb الثقافة المتوسطة (37 درجة مئوية)، ونقل 5 مل الخلايا في خلية جديدة 60 ملم ثلاثة ثقافة الأطباق. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية ل 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي.
    3. حصاد الخلايا عند نقاط زمنية مختلفة وقياس مستوى التعبير التحوير باستخدام إيمونوبلوتينج.
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف التجريبية، التعبير التحوير أصبح غير قابل للكشف تقريبا 3 أيام ما بعد ثقافة الخلايا في الوسط الثقافي Teb خالية (الشكل 3). يمكن قياس مستوى التعبير التحوير إيمونوبلوتينج، وفقا للخطوات 2.5.1-2.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1Aتبديل الجين المفرد على أساس جفيكر. ناقل pEUI(+) الأمثل للتعبير التحوير التنظيم المعاملة مع Teb. وتضم منطقة المستجيب في pEUI(+) 10xUAS و E1b مروج الحد الأدنى التي تليها الرصد والمراقبة التي تحتوي على مواقع الاعتراف بتقييد إنزيم اكوري، بملي، ني، بمتى، افتتاح، وأفليي. تم إضافة إشارة poly(A) SV40 وراء MCS (الشكل 1B). تم إدراج جين باك بين مناطق pEUI(+) لإضفاء مقاومة بوروميسين سائق والمستجيب.

تقييم النشاط ويجتازها من pEUI(+)، ونحن سوبكلونيد اجفب في موقع اكوري الإشراف (pEUI(+)-EGFP)، عابر transfected بناء بلازميد في خلايا HEK293، والتي تديرها Teb بتركيزات مختلفة على 24 ح ( الشكل 2). بينما إشارات ناقلات وهمية لم تظهر ترانسفيكتانتس نيون بغض النظر عن المعاملة Teb (الشكل 2 أ، ب)، بيوي (+)-ترانسفيكتانتس اجفب أصبح توعيتهم تدريجيا بزيادة مقدار Teb (الشكل 2و ). الأهم من ذلك، بي (+)-ترانسفيكتانتس اجفب دون معاملة Teb لم تثر أي إشارات اجفب يمكن كشفها تحت مجهر فلوري (الشكل 2).

كذلك التحقق من مدى استجابة pEUI(+) إلى Teb، نحن سوبكلونيد ANKRD13A حانمه معلم علم جينات في موقع اكوري pEUI(+) وتحويل بنية إلى خلايا HEK293 وثم تعرض منهم لاختيار بوروميسين لمدة 3 أسابيع إنشاء خط خلايا المطلوب مع التحوير ANKRD13A . قمنا بتحليل التعبير عن التحوير ANKRD13A بعد علاج 24 ساعة مع Teb ورد خط الخلية المحددة جيدا (الشكل 3). كذلك أثبتنا إمكانية الرجوع لتبديل الجين pEUI(+) قبل استنفاد Teb من الوسائط الثقافية. التعبير ANKRD13A كما هو موضح في الشكل 3، لم يعد يمكن كشفها عند نحن استزراع الخلايا في وسائل الإعلام الحرة Teb.

Figure 1
الشكل 1 . رسم تخطيطي ل pEUI(+). (A) خريطة متجه pEUI(+) شيد. مروج CMV محركات التأسيسي التعبير عن جفيكر. وسوف ترانسلوكاتي في النواة جفيكر Teb زمنياً وربط 10xUAS رابطة الدول المستقلة-تعمل بتسلسل تنظيمي لتحفيز التعبير عن التحوير إدراجها في الإشراف. (ب) التسلسل المعلومات بين القوسين المعقوفين في (أ) يحتوي على تسلسل المستجيب كامل من pEUI(+). تمثل الأسهم الفردية تقييد إنزيم الاعتراف بالمواقع المدرجة في الإشراف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . تبديل الجين المفرد على أساس جفيكر ويستجيب لعلاج Teb. تم transfected الخلايا HEK293 مع الحمض النووي المحدد بنيات. بعد 24 ساعة تعداء، حفز الخلايا على 24 ساعة مع Teb في تركيز المشار إليه. ولوحظ نشاط التحوير اجفب تحت مجهر فلوري. ترانسفيكتانتس وهمية مع pEUI(+) ولم تظهر أي الأسفار الاكتشاف مع (أ) أو بدون معاملة Teb (ب). (جه) كثافة الفلورسنت في بيوي (+)-اجفب-transfected الخلايا يزيد بطريقة تعتمد على جرعة Teb. مقياس بار، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . HEK293 الخلايا بي ستابلي إيواء (+)/علم-ANKRD13A الاستجابة عكسية للإدارة Teb. علم معلم حانمه ANKRD13A التعبير أثارته Teb العلاج (1.5 ميكرومتر). بعد 24 ساعة علاج مع Teb، تحولت الخلايا إلى Teb تسرب وسائل الإعلام لمقدار الوقت المشار إليه. كان يقاس مقدار نسبي ANKRD13A النشاف الغربية مع الأجسام المضادة العلم. وتم قياس مستوى التعبير الذاتية α-tubulin مع الأجسام المضادة-α-tubulin كعنصر تحكم. النجمة البيضاء تشير إلى أنواع تحسن مجهولي الهوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويعتبر العيب الرئيسي لاستخدام مفتاح تبديل تعبير جينات ثنائي هو الحاجة إلى توصيل والبلازميدات منفصلة اثنين (سائق والمستجيب) في نفس الوقت إلى الخلية الهدف. وهذا يمكن أن يؤدي إلى توزيع غير متكافئ والبلازميدات والنتيجة في استجابة غير متناسقة للتبديل إلى الحمام1،،من23. عيب آخر اثنين-ناقل النظام أن الحد ني جولتين من اختيار المضادات الحيوية اللازمة لتحديد خطوط الخلايا تبشر بالخير. ولذلك منذ فترة طويلة قد التمست كاسيت جين إيندوسيبلي تتألف من وحدة واحدة لاستخدامها في البحوث البيولوجية. رمز التبديل pEUI(+) التحوير المفرد التعبير يرد في ناقل واحد مجهزة بجميع الوحدات التنظيمية اللازمة لحفز التحوير. وهكذا، المستوى التعريفي للتحوير، سوبكلونيد في pEUI(+)، اعتماداً على الكمية من الحمض النووي ترانسفيكتيد في تجربة تعداء عابرة والجرعة من محفز كيميائية. وباﻹضافة إلى ذلك، ونحن اختبار المزيد من استخدام ناقل pEUI(+) عن طريق توليد خط خلية مستقرة التي تحتوي على نسخة واحدة من التحوير ANKRD13A 15. خط الخلية المحددة وأظهرت حساسية عالية للعلاج Teb (الشكل 3). صورة جماعية لها حساسية عالية وإمكانية الرجوع ويجتازها منخفضة15، جنبا إلى جنب مع تباين محدود في مستوى التعبير جعل pEUI(+) أداة قيمة الجزيئية والخلوية للتلاعب بالجينات المستهدفة.

فيما بين مختلف النظم الجينات إيندوسيبلي، اخترنا كاسيت تحريض الجينات تعتمد على جفيكر. جفيكر مزايا عديدة على النظم الأخرى: أولاً، طبيعة محبتين من النظير ecdysone عدة تستخدم مستحثات الكيميائية (بما في ذلك Teb) مفيد لكفاءة اختراق الأغشية الخلوية21؛ ثانيا، هناك لا أورثولوجس EcR في الفقاريات، حيث يضع اكديستيرويد لا تؤثر الوظيفة أعرب اندوجينوسلي عن المستقبلات النووية21،22؛ وثالثاً، اكديستيرويدس حميدة في الفقاريات وتطهيرها سريعاً من تعميم النظام في فيفو21،23؛ ورابعاً، منذ عديدة ecdysone يضع وضعت حتى الآن، عن طريق اختيار جزيئات صغيرة الحجم على النحو الأمثل، يمكن تجنب الباحثين مضاعفات غير مرغوب فيها13،،من2224. على الرغم من pEUI(+) يظهر حساسية عالية ل Teb، قد يثبت قيمة اختبار مدى استجابة pEUI(+) ليضع اكديستيرويد الأخرى. الوجود غير الستيرويدية يضع لائحة المجلس الأوروبي، مثل ميثوكسيفينوزيدي، التي أكثر قابل للذوبان في الماء مما Teb24 يجوز توسيع نطاق تطبيقات pEUI(+). على الرغم من أن التعبير عن التحوير في pEUI(+) أضعف نسبيا في تيت في نظام15، يمكن زيادة مستوى التحوير التعريفي بإضافة نسخة متعددة من المجال transactivation VP16 (البيانات لا تظهر). تطبيقات العلاج الجيني الأخيرة ركزت على إيصال الجين المستهدف بأمان إلى الخلايا أو الأنسجة التي تفتقر إلى المنتج الجينات الوظيفية المعنية نظراً للأمراض الوراثية25،،من2627. ومع ذلك، يمكن الحصول على التحوير غير المقننة تحت سيطرة المروجين التأسيسية الخاصة بالانسجة أو الفيروسية فرط التعبير عن الجينات المستهدفة، مما يرفع احتمال تلف الأنسجة المحلية28،29. وهكذا، تطبيق مفتاح تبديل الجينات يمكن الاعتماد عليها للعلاج الجيني يمكن أن تجنب المضاعفات غير المرغوب فيها. ناقل pEUI(+) يوفر أداة ملائمة وفعالة للتحكم في التعبير التحوير في الدراسات السريرية والبيولوجية. حاليا، نقوم بتطوير ناقل لينتيفيرال المفرد استناداً إلى جفيكر زيادة نطاق تطبيق نظامنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لدينا لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون "تشوي" S-Y (الجامعة الوطنية أكثر) لقراءة دقيقة لدينا المخطوط والتعليقات القيمة. وأيد هذا العمل إنشاء صندوق بحوث لجامعة تشونجنام الوطنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9, (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7, (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1, (1), 29 (2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68, (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366, (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60, (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97, (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39, (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5, (9), e367 (2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3, (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12, (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78, (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43, (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59, (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37, (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57, (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15, (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (4), a015149 (2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110, (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19, (3), 470-478 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics