Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nauwkeurige controle van transgenic expressie is wenselijk in biologische en klinische studies. Aangezien de binaire functie van momenteel werkzaam gen-switches de overdracht van twee therapeutische expressie eenheden gelijktijdig tot een enkele cel vereist, is de praktische toepassing van het systeem voor gentherapie echter beperkt. Ter vereenvoudiging van het systeem van de expressie transgenic, we genereerden een genen schakelaar uitgeroepen tot pEUI(+) omvat een complete set van transgenic expressie modules in een enkele vector. Bestaande uit het domein van GAL4 DNA-bindende en gemodificeerde EcR (GvEcR), een minimale VP16 activering domein gefuseerd met een GAL4 DNA-bindende domein, alsmede een gemodificeerde Drosophila ecdysone receptor (EcR), de nieuw ontwikkelde enkelvoud gene schakelaar is zeer inspelen op de administratie van een chemische inductor in een tijd - en dosis-afhankelijke manier. De pEUI(+)-vector is een potentieel krachtig hulpmiddel voor het verbeteren van de controle van transgenic expressie in zowel biologisch onderzoek en pre-klinische studies. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor modulatie van een voorbijgaande en stabiele transgenic uitdrukking pEUI(+) vector via de behandeling van tebufenozide (Teb). Daarnaast delen we belangrijke richtlijnen voor het gebruik van Teb als een chemische inductor.

Introduction

Verschillende parameters van de verschillende gen werden onderzocht voor hun vermogen om te precies regelen van transgenic expressie in celkweek en diermodellen, met wisselend succes1,2,3. Potentiële gene schakelaar systemen moeten beantwoorden aan verschillende strenge criteria, met inbegrip van: precieze directionele uitdrukking van de transgenic, dosering - en tijdafhankelijke responsiviteit inductoren, te verwaarlozen leakiness voor de promotor, omkeerbaarheid van transgenic activering door de inductor verwijdering en inductor toxiciteit niveaus draaglijk cellijnen en laboratorium dieren1,2,3. Verschillende kleine molecuul inductoren hebben benut, met inbegrip van tetracycline4,5, rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, en ecdysone11,12,13,14. In het algemeen, deze systemen vereisen minstens twee plasmiden met twee of drie afzonderlijke expressie eenheden, één of twee van die componeren een regelgevende element (inductor plasmide) die een klein molecuul inductor bindt te winnen van transcriptionele activiteit; en een ander plasmide (effector plasmide) met de transgenic onder toezicht van een regelgevende DNA regio waarmee de toegang van het regelgevende element inductor-gebonden. Het grootste nadeel van het binaire systeem is dat het vereist dat de daarmee gepaard gaande invoering van twee vectoren (inductor en effector) in de doelcel. In voorbijgaande transgenic expressie experimenten produceert de gelijktijdige transfectie van twee plasmiden onvermijdelijk een bevolking van cellen die afzonderlijk transfected met de inductor of de effector of mede transfected ongelijk. Bovendien, vereist het binaire systeem ten minste twee rondes van antibiotica selectie om vast te stellen stabiele cellijnen, die tijdrovend en moeizaam. Zo combineren alle onderdelen vereist voor transgenic expressie en verordening in een enkele vector zou ideaal te garanderen van de daarmee gepaard gaande uitdrukking van alle vereiste elementen in één cel en voor de regulering van transgenic expressie door behandeling met klein molecuul inductoren.

Om te overwinnen van de tekortkomingen van binaire gene schakelaars, ontwikkelde we recent een enkelvoud gene schakelaar, met behulp van een Drosophila melanogaster EcR gebaseerde gene afleidbare systeem15. Ecdysone bemiddelt genexpressie wanneer het zich bindt aan de EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer, die op zijn beurt binding van de kassa tot DNA regelgevende elementen3,11 induceert. De gewervelde retinoid X receptor (RXR), een ortholog van insect USP, werft EcR om te vormen van een actieve transcriptionele activator16. Dus, voor de gerichte uitdrukking van een transgenic in gewervelde cellen of weefsel, de EcR en RXR moet mede uitgedrukt gelijktijdig voordat wordt gestimuleerd door ecdysone of haar agonisten. Aangezien de functie van de heterodimeric van de schakelaar EcR gebaseerde gen kan worden beïnvloed door de endogene RXR niveau, Padidam et al.. vervangen van de EcR DNA-bindende en activering domeinen met heterologe GAL4 DNA-bindende, herpes simplex virus eiwit vmw65 (VP16) activering domeinen gesmolten bij het EcR ligand-bindend domein, die vervolgens werd gereageerd op de endogene RXR en vormde een homodimer verwerven van transcriptionele activiteit17. De schakeloptie gene EcR gebaseerde is verder verbeterd door de aanleg van een chimeer eiwit samengesteld van minimale VP16 activering domein gecombineerd met GvEcR, die een homodimer gevormd en gelokaliseerd in het cytosol in het ontbreken van de ecdysone-agonist, Teb16, 18. Door binding aan Teb, veranderde de GvEcR haar subcellular localisatie van het cytosol tot de kern te herkennen een promotor van de hybride bestaat uit zebrafish E1b minimale promotor gecombineerd met een tien tandem herhaalde upstream activering sequenties (UASs) op gang te brengen de transcriptie van de target gene16.

Ter vereenvoudiging van de eerder gemelde EcR gebaseerde gene schakelt16,18, we de binaire eigenschappen van het systeem gecombineerd in een enkele vector uitgerust met alle vereiste elementen voor stimulerende transgenic expressie, en vervolgens aangewezen de nieuw gegenereerde vector, pEUI(+) (GenBank toetreding nummer: KP123436, figuur 1A)15. De effector reageren op het GvEcR-stuurprogramma (hierna rijder) bestaat uit tien tandem UAS herhaalt naast een minimale promotor van E1b, gevolgd door een meerdere klonen site (MCS) met EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI en AflII erkenning sequenties (figuur 1B). Bovendien, om de selectie van transfected cellen, een SV40 promotor-gedreven puromycin N-acetyl-transferase (PAC) gen werd geplaatst tussen de bestuurder en effector regio's te handhaven van stabiele cellijnen (Figuur 1).

Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbijgaande en stabiele modulatie van transgenic expressie met behulp van pEUI(+). Daarnaast bieden we gedetailleerde instructies voor een succesvol gebruik van Teb als een agonist van het ecdysone.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. transgenic Subcloning

  1. Kies een geschikte restrictie-enzym erkenning site (of sites) in de MCS-server voor pEUI(+) en subclone het gen van belang in de gewenste richting (Figuur 1).
    Opmerking: De ankyrin van EGFP of vlag epitoop-gelabeld Herhaal domein 13A subcloned (ANKRD13A) transgenic was in EcoRI site van het pEUI(+) vector met behulp van de polymerase van DNA van de T4 in een reeks - en Afbinding-onafhankelijke methode19klonen.
  2. Linearize de pEUI(+) met EcoRI gedurende 1 uur bij 37 ° C. Mix-50 ng/µL van gelineariseerde pEUI(+) met 40 ng/µL van het PCR-versterkte EGFP of ANKRD13A, en reageren met T4 DNA polymerase (1 U) voor 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) voordat de incubatie op ijs voor 10 min. toevoegen 10 µL van het reactiemengsel rechtstreeks naar 100 µL DH10B bevoegde cellen voor de volgende transformatie experimenteren.
    Opmerking: Hoewel verschillende restrictie-enzym erkenning sites werden toegevoegd aan de MCS-server voor pEUI(+) (figuur 1B), raden we het target-gen subcloning in de EcoRI site, afbinding-onafhankelijke klonen technologie19,20.
  3. Controleer de invoegen door sequentiebepaling en vervolgens zuiveren het DNA met een kit voor de zuivering van DNA die geschikt is voor Transfectie.

2. een voorbijgaande transfectie en Teb behandeling

  1. Bereiden vier cel cultuur gerechten (60 mm doorsnede) met vers gepasseerd HEK293 cellen in 5 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5-10% foetale runderserum (FBS) en antibiotica (100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine). Hierna, vertegenwoordigt "drager van de cultuur van de cel" of gewoon "voedingsbodem" de DMEM aangevuld met FBS en antibiotica. Handhaven van de cellen van de HEK293 bij 37 ° C.
  2. Transfect 1 µg gezuiverde DNA in de cellen van de HEK293 bij 50-60% dichtheid met behulp van 3 µL van transfectiereagens. Toevoegen van de transfectiereagens aan 200 µL verdunningsmiddel (DMEM zonder FBS en antibiotica) met het DNA. Na de incubatie van het reactiemengsel gedurende 30 minuten op RT, toevoegen het mengsel op de HEK-293-cellen op de schotel van cultuur. Twee gerechten gebruiken voor transfectie, en laat de andere twee onbehandeld als besturingselementen.
  3. Na 12-24 h van transfectie, Teb (eindconcentraties, 0.2 - 10 µmol) de transfected voorbeelden en toevoegen aan een van de besturingselementen niet-transfected. Laat de overige twee monsters onbehandeld als experimentele besturingselementen.
    Opmerking: De Teb stockoplossing (50 mM opgelost in dimethylsulfoxide) kan worden verdund in cel kweekmedium, DMEM of -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een geschikte concentratie alvorens toe te voegen aan de gekweekte cellen afhankelijk van de experimentele parameters. Echter, als gevolg van de lage oplosbaarheid van Teb in waterige oplossing, vermijdt voorbereiding van een master mix met een hoge concentratie van Teb in medium; in plaats daarvan, vervang het kweekmedium volledige cel met verse medium dat Teb op de gewenste concentratie.
  4. Cultiveren van de Teb behandeld en onbehandeld cellen gedurende 12-48 uur bij 37 ° C.
  5. Als met behulp van de EGFP invoegt, analyseren expressie van EGFP onder een fluorescente microscoop ( Figuur 2). Anders oogst de cellen voor een immunoblotting assay.
    1. Voor de immunoblotting assay, spoel de cellen tweemaal met ijskoude PBS en dan Schraap hen uit met behulp van een cel schraper.
    2. Voor het stapelen van de cellen, spin down de oogsten in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C (RT).
    3. Na de PBS volledig teruggooi, Voeg 0,5 mL ijskoud zoogdieren eiwitreagens extractie (M-PER), samen met proteaseinhibitor (5 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail), aan de pellet als de cellen worden gekweekt in een schotel van 60 mm.
    4. Resuspendeer de cellen met verschillende rondes van pipetteren, en vervolgens uit te broeden de zwevende cellen gedurende 15 minuten staan bij 18-25 ° C (RT).
    5. Draai de cel lysate bij 21.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    6. Breng de waterige bovendrijvende substantie in een tube van verse 1,5 mL microcentrifuge.
    7. Analyseer het supernatant door immunoblotting, volgende standaardprotocollen met passende antilichamen.

3. productie van stabiele HEK293 cellijnen met Genomic integratie van het pEUI(+) Gene Switch

  1. Transfect 5-10 µg van het gezuiverde pEUI(+) met de transgenic in HEK293 cellen die heuvels van de 50-60% in een 90 mm diameter cel cultuur schotel, met behulp van 15-30 µL van het transfectiereagens. Toevoegen van de transfectiereagens aan 500 µL verdunningsmiddel (DMEM zonder FBS en antibiotica) met het DNA. Na de incubatie van het reactiemengsel gedurende 30 minuten op RT, voeg toe het mengsel aan HEK-293 cellen op de schotel van cultuur.
  2. Na de transfectie, toestaan dat de transfectants om te groeien en het uiten van de puromycin-resistentie genproducten onder niet-selectieve voedingsbodem (zonder puromycin) gedurende 24-48 uur bij 37 ° C.
  3. De cellen van de cultuur-schotels distantiëren door trypsinebehandeling. Na het verwijderen van het kweekmedium, spoel de transfectants met voorverwarmde PBS (37 ° C), voeg 1 mL 0,25% trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 ° C. Na het blussen van de trypsine/EDTA door voorverwarmde kweekmedium (10 mL, 37 ° C) toe te voegen, het oogsten van de cellen met behulp van een cel schraper, gevolgd door centrifugeren in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C.
  4. Resuspendeer de transfectants in 50 mL voorverwarmde kweekmedium (37 ° C), en de overdracht 10 mL van de cellen tot 90 mm verse cel cultuur gerechten. Cultuur van de cellen bij 37 ° C tot 50-60% confluentie vóór de behandeling van puromycin (in het algemeen, dit duurt ongeveer 24-48 h).
  5. Cultiveren van de transfectants bij 37 ° C in de cel kweekmedium aangevuld met 3 µg/mL puromycin voor 3-4 weken. Tijdens de periode van de selectie, de cel-kweekmedium dat puromycin (3 µg/mL) elke 2-3 dagen om te handhaven selectiedruk wijzigen Wanneer de cellen volledig confluente, opgesplitst volgens de procedures in stappen 3.3-3.4, met puromycin-bevattende kweekmedium. Gooi de resterende cellen in het kweekmedium, indien niet nodig.
    Opmerking: Puromycin selectie voorwaarden moeten experimenteel vastgesteld worden voor specifieke celtypes. Wij 3 µg/mL puromycin gebruikt in cel kweekmedium; Dit was genoeg voor het opwekken van celdood in niet-transfected HEK293.
  6. Oogsten van de cellen van afzonderlijke kolonies, met behulp van een cilinder van klonen, en volg de instructies van de fabrikant.
    1. Gooi het kweekmedium cel. Spoel de plaat twee keer met voorverwarmde (37 ° C) PBS te verwijderen van de zwevende cellen.
    2. Gebruik steriel pincet en laat de klonen cilinder over de afzonderlijke kolonies.
    3. 0,2 mL van 0,35% trypsine/EDTA toevoegen aan elke cilinder.
    4. Incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 1 minuut totdat de cellen vrijstaand zijn en voeg vervolgens een paar druppels van het kweekmedium voorverwarmde (37 ° C) naar de cilinders.
    5. De cellen van elke cilinder overbrengen aan individuele putjes van de plaat van een 6-well, met 2 mL gestolde voedingsbodem en 1 µg/mL van puromycin in elk putje.
      Opmerking: Wanneer de cellen confluente worden, schaal omhoog de cultuur. Nu kunnen de clone(s) worden vastgesteld.
  7. Handhaven van individuele klonen in cel kweekmedium aangevuld met 1 µg/mL puromycin.
  8. Afzonderlijke kolonies valideren door het testen van hun gevoeligheid voor Teb behandeling (eindconcentratie, 10 µM) voor 24 h. Test het reactievermogen van de klonen aan de Teb door het analyseren van het niveau van de expressie van de transgenic met immunoblotting. Selecteer een gewenste kloon (of klonen). Cultiveren een Teb-behandeld en een onbehandelde monster in een kweekvloeistof voor 12-48 h bij 37 ° C voor het analyseren van het niveau van de inductie van de transgenic. Het niveau van de expressie van transgenic kan worden gemeten door middel van immunoblotting, volgens de procedures in stappen 2.5.1 - 2.5.7.

4. uitputting van Teb

  1. Doven de Teb prikkels door vervanging van Teb met cel kweekmedium met Teb-gratis medium.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen ter vervanging van de groei-media zonder eerste voort de cellen op een nieuwe cultuur schotel. Residuele Teb lijkt vast te klampen aan de kunststof schotel en een sterke achtergrond uitdrukking van de transgenic zal ontlokken. Voordat de cellen op een nieuwe plaat van de cultuur voort, spoel de geoogste cellen verschillende malen met kweekmedium of PBS.
    1. De cellen van de cultuur-schotels distantiëren door trypsinebehandeling. Na de Teb met kweekmedium teruggooi, spoel de cellen Teb-gestimuleerd tweemaal met voorverwarmde PBS (37 ° C), voeg 1 mL van 0,25% trypsine/EDTA en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 ° C. Na het blussen van de trypsine/EDTA door voorverwarmde Teb-vrije kweekmedium (10 mL, 37 ° C) toe te voegen, het oogsten van de cellen met behulp van een cel schraper, gevolgd door centrifugeren in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C.
    2. Resuspendeer de cellen in 50 mL voorverwarmde Teb-vrije kweekmedium (37 ° C) en 5 mL van de cellen overdracht in drie 60 mm verse cel cultuur gerechten. De cellen bij 37 ° C gedurende 24, 48 en 72 h respectievelijk cultuur.
    3. De cellen op verschillende tijdstippen van de oogst en het meten van het niveau van de expressie van de transgenic met behulp van immunoblotting.
      Opmerking: In deze experimentele omstandigheden werd de transgenic expressie niet detecteerbaar ongeveer 3 dagen na cultuur van de cellen in het Teb-gratis culturele medium (Figuur 3). Het niveau van de expressie van transgenic kan worden gemeten door immunoblotting, volgens stappen 2.5.1 - 2.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De schakeloptie GvEcR gebaseerde enkelvoud gen is afgebeeld in figuur 1A. De pEUI(+)-vector is geoptimaliseerd voor gereglementeerde transgenic expressie door de behandeling met Teb. De effector regio van pEUI(+) bestaat uit een 10xUAS en een E1b minimale promotor gevolgd door een MCS met EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI en AflII restrictie-enzym erkenning sites. Een SV40 poly(A) signaal is toegevoegd achter de MCS (figuur 1B). Een PAC -gen is ingevoegd tussen de bestuurder en effector regio's pEUI(+) te verlenen weerstand tegen puromycin.

Om te beoordelen van de activiteit en de leakiness van pEUI(+), we subcloned EGFP in de EcoRI site voor de MCS (pEUI(+)-EGFP), Transient transfected het plasmide-construct in HEK293 cellen en Teb toegediend in verschillende concentraties gedurende 24 uur ( ) Figuur 2). Terwijl mock vector transfectants geen fluorescerende toonde signalen ongeacht Teb behandeling (figuur 2A, B), pEUI (+)-EGFP transfectants werd geleidelijk gesensibiliseerd om het verhoogde bedrag van Teb (figuur 2C-F ). Nog belangrijker, pEUI (+)-EGFP transfectants zonder behandeling van Teb deed niet onthullen geen detecteerbare EGFP signalen onder een fluorescente microscoop (figuur 2C).

Als u wilt verder valideren het reactievermogen van pEUI(+) naar Teb, we subcloned een vlag epitoop-gelabeld ANKRD13A gen in de EcoRI site van pEUI(+), overgedragen van de constructie in HEK293 cellen en hen vervolgens onderworpen aan puromycin selectie voor 3 weken om een gewenste cellijn met de ANKRD13A transgenic. We de expressie van het ANKRD13A transgenic na een 24 h behandeling met Teb geanalyseerd en de gevestigde cellijn goed gereageerd (Figuur 3). We verder de omkeerbaarheid van de pEUI(+) gen schakelaar aangetoond door het afbreken van Teb van de culturele media. Zoals blijkt uit Figuur 3, was ANKRD13A expressie niet langer opspoorbaar wanneer we cellen in Teb-vrije media gekweekte.

Figure 1
Figuur 1 . Schematisch diagram van pEUI(+). (A) de vector kaart van pEUI(+) werd gebouwd. Een CMV-promotor rijdt constitutieve uitdrukking van GvEcR. De Teb-gebonden GvEcR zal translocate in de kern en binden de 10xUAS cis-regulerende sequenties ter stimulering van de uitdrukking van de transgenic ingevoegd in de MCS-server handelt. (B) de volgorde informatie tussen de vierkante haken in (A) bevat de gehele effector sequenties van pEUI(+). Pijlen vertegenwoordigen de individuele restrictie-enzym erkenning sites opgenomen in de MCS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Enkelvoud gene GvEcR gebaseerde schakelaar reageert op de behandeling van Teb. HEK293 cellen werden transfected met de opgegeven DNA construeert. Na 24u van transfectie, werden de cellen gestimuleerd gedurende 24 uur met Teb op de aangegeven concentratie. EGFP transgenic activiteit werd waargenomen onder een fluorescente microscoop. Mock transfectants met pEUI(+) geen vertonen detecteerbare fluorescentie met (A) of zonder (B) Teb behandeling. (C--E) De fluorescerende intensiteit in pEUI (+)-EGFP-transfected cellen verhoogt in een Teb dosis-afhankelijke manier. Schaal bar, 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . HEK293 cellen stabiel herbergen pEUI (+) / vlag-ANKRD13A omkeerbaar inspelen op de administratie van Teb. VLAG epitoop-gelabeld ANKRD13A expressie werd veroorzaakt door Teb (1,5 µM) behandeling. Na 24 h behandeling met Teb, waren de cellen overgeschakeld naar Teb drop-out media voor de aangegeven hoeveelheid tijd. De relatieve hoeveelheid ANKRD13A werd gemeten door het westelijke bevlekken met Anti-Flag antilichaam. Het niveau van de endogene expressie van α-tubuline werd gemeten met anti-α-tubuline antilichaam als een besturingselement. Het witte sterretje geeft aan een niet-geïdentificeerde cross-reactive soorten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het grootste nadeel van een binaire gen expressie schakeloptie is de noodzaak om tegelijkertijd leveren twee aparte plasmiden (bestuurder en effector) in de doelcel. Dit kan leiden tot een ongelijke verdeling van plasmiden en leiden tot een inconsistente reactie van de overgang naar de inductoren1,2,3. Een andere tekortkoming van de twee-vector systeem is dat een minimum van twee rondes van antibiotica selectie moeten identificeren veelbelovende cellijnen. Een gen-afleidbare cassette, bestaande uit één eenheid is dus lang voor gebruik in biologische onderzoek aangevraagd. De pEUI(+) enkelvoud transgenic expressie switch bevindt zich in een enkele vector uitgerust met alle regelgevende eenheden vereist voor transgenic stimulatie. Het niveau van de inductie van de transgenic, subcloned in pEUI(+), is dus afhankelijk van de hoeveelheid DNA in de voorbijgaande transfectie experiment en de dosering van de chemische inductor transfected. Bovendien, we verder getest het gebruik van pEUI(+) vector door het genereren van een stabiele cellijn met een enkele kopie van de ANKRD13A transgenic15. De gevestigde cellijn toonde hoge gevoeligheid voor Teb behandeling (Figuur 3). Collectief maken haar hoge gevoeligheid, omkeerbaarheid en lage leakiness15, samen met beperkte variatie in expressie niveau pEUI(+) een waardevolle moleculaire en cellulaire tool voor het manipuleren van doel genexpressie.

Tussen verschillende afleidbare gene stelsels kozen we de GvEcR-afhankelijke gene inductie cassette. De GvEcR heeft diverse voordelen ten opzichte van andere systemen: ten eerste de lipofiele aard van verschillende ecdysone-analogen gebruikt als chemische inductoren (inclusief Teb) is gunstig voor efficiënte penetratie van cellulaire membranen21; Ten tweede, er zijn geen EcR orthologs in Vertebraten, zodat ecdysteroid agonisten hebben geen invloed op de functie van endogeen uitgedrukt nucleaire receptoren21,22; Ten derde, ecdysteroids zijn onschadelijk in gewervelden en snel gewist uit de circulatie systeem in vivo21,23; en ten vierde, aangezien talrijke ecdysone-agonisten zijn tot nu toe ontwikkeld door te kiezen voor optimaal middelgrote kleine molecules, onderzoekers Voorkom ongewenste complicaties13,22,24. Hoewel de pEUI(+) hoge gevoeligheid aan Teb toont, kan testen van het reactievermogen van pEUI(+) naar andere ecdysteroid-agonisten waardevolle blijken. Het bestaan van niet-steroïdale EcR-agonisten, zoals methoxyfenozide, die meer oplosbaar zijn in water dan Teb24 kan het verruimen van het toepassingsgebied van de toepassingen van pEUI(+). Hoewel de uitdrukking van transgenic in pEUI(+) relatief zwakker is dan die in een Tet-On systeem15 is, kan het niveau van transgenic inductie worden opgedreven door de toevoeging van een multicopy van het VP16 transactivation domein (gegevens niet worden weergegeven). Recente gen-therapie-toepassingen hebben gericht op de veilige levering van een target-gen in cellen of weefsels die gebrek aan het product van de respectieve functioneel gen als gevolg van genetische ziekte25,26,27. Echter, niet-gereguleerde transgenic onder de controle van weefsel-specifieke of virale constitutieve initiatiefnemers kan uitlokken hyper-expressie van het target-gen, die de mogelijkheid van lokale weefsel schade28,29verheft. Dus, kan de toepassing van een betrouwbare gene schakelaar voor gentherapie ongewenste complicaties vermijden. De vector pEUI(+) biedt een handige en krachtige tool om te regelen van transgenic expressie in biologische en klinische studies. Wij ontwikkelen momenteel een enkelvoud lentivirale vector gebaseerd op GvEcR om het bereik van de toepassing van ons systeem te verhogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen conflicten van belang aan dit verslag gerelateerde.

Acknowledgments

De auteurs bedanken S-Y Choi (Chonnam National University) voor waardevolle opmerkingen en grondige lezing van onze manuscript. Dit werk werd gesteund door een fonds voor onderzoek van de Chungnam National University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9, (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7, (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1, (1), 29 (2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68, (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366, (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60, (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97, (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39, (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5, (9), e367 (2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3, (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12, (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78, (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43, (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59, (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37, (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57, (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15, (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (4), a015149 (2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110, (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19, (3), 470-478 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics