En isoinokosterone reseptor-baserte entall Gene bryter for bevisst uttrykk for Transgene robusthet, Reversibilitet og ubetydelig Leakiness

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for modulering av transgene uttrykk bryteren pEUI(+) entall genet av tebufenozide behandling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Presis kontroll av transgene uttrykk er ønskelig i biologiske og kliniske studier. Men fordi funksjonen binær for tiden ansatt gen-svitsjer krever overføring av to terapeutiske uttrykk enheter samtidig i en enkelt celle, er praktisk anvendelse av systemet for genterapi begrenset. For å forenkle transgene uttrykk systemet, generert vi en genet bryter som pEUI(+) omfatter et komplett sett av transgene uttrykk moduler i en enkelt vektor. Bestående av GAL4 DNA-bindende domenet og endret EcR (GvEcR), et minimalt VP16 aktivisering domene smeltet sammen med en GAL4 DNA-bindende domene, samt en modifisert Drosophila isoinokosterone reseptor (EcR), bryteren nyutviklet entall genet er svært lydhør overfor administrasjonen av en kjemisk induser på en gang - og dosering-avhengige måte. PEUI(+) vektor er en potensielt mektig verktøy for bedre kontroll av transgene uttrykk i både biologiske og pre-kliniske studier. Her presenterer vi en detaljert protokoll for modulering av en forbigående og stabil transgene uttrykk med pEUI(+) vektor ved behandling av tebufenozide (Teb). I tillegg dele vi viktige retningslinjer for bruk av Teb som en kjemisk induser.

Introduction

Flere forskjellige genet brytere utforsket for sin evne til å regulere nettopp transgene uttrykk i cellekultur og dyr modeller, med varierende grad av suksess1,2,3. Potensielle genet bryteren systemer skal møte flere strenge kriterier, inkludert: presis retningsbestemt uttrykk av transgene, dosering - og tidsavhengige respons å indusere, ubetydelig leakiness til promoter, Reversibilitet av transgene aktivisering gjennom induser fjerning og induser toksisitet nivåer tålelig linjer og laboratoriet dyr1,2,3. Flere små molekyl indusere har vært utnyttet, inkludert tetracycline4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10, og isoinokosterone11,12,13,14. Generelt, disse systemene krever minst to plasmider som inneholder to eller tre separate uttrykk enheter, en eller to av som komponere et regulatorisk element (induser plasmider) som binder et lite molekyl induser å få transcriptional aktivitet. og en annen plasmider (effektor plasmider) som inneholder transgene under kontroll av en regulerende DNA region som gir tilgang til induser-bundet regulatoriske elementet. Det hovedavdeling ulempen av binære systemet er at det krever samtidig innføring av to vektorer (induser og effektor) i målcellen. I forbigående transgene uttrykk eksperimenter gir den samtidige transfection av to plasmider uunngåelig en populasjon av celler som enkeltvis transfekterte induser eller effektor eller co transfekterte ulikt. I tillegg krever det binære systemet minst to runder av antibiotikumet utvalg å etablere stabil cellelinjer, som er tidkrevende og arbeidskrevende. Dermed kombinere alle komponentene som kreves for transgene uttrykk og regulering i en enkelt vektor ville være ideelt å garantere samtidig uttrykk for alle de nødvendige elementene i en enkelt celle og tillate regulering av transgene uttrykk gjennom behandling med små molekyl indusere.

For å overvinne manglene ved binære genet brytere, utviklet vi nylig en entall genet bryter, bruker en Drosophila melanogaster EcR-baserte genet induserbart systemet15. Isoinokosterone formidler genuttrykk når det binder seg til EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer, som igjen medfører binding av EcR DNA regulatoriske elementer3,11. Virveldyr retinoid X reseptoren (RXR), en ortholog av insekt USP, rekrutter EcR for å danne en aktiv transcriptional aktivator16. Dermed for målrettet uttrykk for en transgene i virveldyr celler og vev må EcR og RXR co uttrykt samtidig før blitt stimulert av isoinokosterone eller dens agonister. Siden funksjonen heterodimeric i bryteren EcR-baserte genet kan være påvirket av endogene RXR nivå, Padidam et al. erstattet EcR DNA-bindende og aktivisering domener med heterologous GAL4 DNA-binding, herpes simplex virus protein vmw65 (VP16) aktivisering domener smeltet EcR ligand-bindende domenet, som deretter svarer til endogene RXR og dannet en homodimer få transcriptional aktivitet17. Bryteren EcR-baserte genet ble ytterligere forbedret ved å opprette et chimeric protein består av minimal VP16 aktivisering domene kombinert med GvEcR, som dannet en homodimer og lokalisert i stoffer i fravær av isoinokosterone Agonistiske, Teb16, 18. Ved binding til Teb, GvEcR endret beliggenheten subcellular fra stoffer til kjernen å gjenkjenne en hybrid promoter består av sebrafisk E1b minimal promoter kombinert med en ti tandem gjentatt oppstrøms aktivisering sekvenser (UASs) for å starte den transkripsjon av målet gen16.

For å forenkle tidligere rapportert EcR-baserte genet bytter16,18, kombineres binære funksjonene i systemet i en enkelt vektor utstyrt med alle de nødvendige elementene for stimulerende transgene uttrykket, og deretter utpekt den nyopprettede vektoren, pEUI(+) (GenBank tiltredelse nummer: KP123436, figur 1A)15. Effektor svarer på GvEcR-driver (heretter driver) består av ti tandem UAS gjentar ved en E1b minimal promoter etterfulgt av en flere kloning område (MCS) med EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI og AflII anerkjennelse sekvenser (figur 1B). I tillegg til lette valg av transfekterte celler, en SV40 promoter-drevet puromycin N-acetylen-transferase (PAC) genet ble plassert mellom regionene driveren og effektor å opprettholde stabil cellelinjer (figur 1).

Vi beskriver en detaljert protokoll for forbigående og stabil modulering av transgene uttrykk med pEUI(+). Dessuten, har vi detaljerte instrukser for vellykket bruk av Teb som en isoinokosterone Agonistiske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transgene Subcloning

  1. Velg en passende begrensning enzym anerkjennelse webområdet (eller nettstedene) i MCS av pEUI(+), og subclone genet av interesse i ønsket retning (figur 1).
    Merk: Den EGFP eller flagg epitope-merket ankyrin gjenta domene 13A (ANKRD13A) transgene ble subcloned i EcoRI for pEUI(+) vektoren bruker T4 DNA utvalg i en sekvens - og hemorroider-uavhengig klon metoden19.
  2. Linearize pEUI(+) med EcoRI 1t på 37 ° C. Mix 50 ng/µL av linearized pEUI(+) med 40 ng/µL av PCR-forsterket EGFP eller ANKRD13A, og reagerer med T4 DNA utvalg (1 U) i 1 min i romtemperatur (RT) før inkubasjon på is 10 min. legge 10 µL reaksjonsblandingen direkte til 100 µL av DH10B kompetent celler for følgende transformasjonen eksperimenter.
    Merk: Selv om flere begrensning enzym anerkjennelse nettsteder ble lagt til MCS av pEUI(+) (figur 1B), anbefaler vi subcloning målet genet inn i EcoRI-området, uavhengig av hemorroider kloning teknologi19,20.
  3. Bekrefte innsatsen ved sekvensering og deretter rense bruker en DNA rensing kit som passer for hva.

2. forbigående Transfection og Teb behandling

  1. Forberede fire celle kultur retter (60 mm diameter) som inneholder ferske passaged HEK293 celler i 5 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 5-10% fosterets bovin serum (FBS) og antibiotika (100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin). Heretter, representerer "celle kultur medium" eller bare "kultur medium" DMEM supplert med FBS og antibiotika. Opprettholde HEK293 cellene på 37 ° C.
  2. Transfect 1 µg renset DNA i de HEK293 cellene på 50-60% tetthet med 3 µL av transfection reagensen. Legge til hva reagensen 200 µL av fortynner (DMEM uten FBS og antibiotika) som inneholder DNA. Etter inkubasjon reaksjonsblandingen i 30 min på RT, legg blandingen til HEK-293 cellene på kultur parabolen. Bruke to retter for hva, og la de andre to ubehandlet som kontroller.
  3. Etter 12-24 h transfection, Legg Teb (siste konsentrasjoner, 0.2 - 10 µmol) en av de transfekterte prøvene og til en ikke-transfekterte kontrollene. La de andre to prøvene ubehandlet som eksperimentelle kontroller.
    Merk: Teb lager løsningen (50 mM oppløst i dimethyl sulfoxide) kan bli fortynnet i celle kultur medium, DMEM eller fosfat-bufret saltvann (PBS) i en passende konsentrasjon før du legger til kulturperler cellene avhengig av parameterne eksperimentelle. Imidlertid p.g.a. lav oppløselighet av Teb i vandig løsning, unngå forbereder en mester blanding med en høy konsentrasjon av Teb i medium; i stedet, ombytte komplett celle kultur medium med fersk medium som inneholder Teb på ønsket konsentrasjonen.
  4. Dyrke Teb-behandlet og ubehandlet celler for 12-48 h på 37 ° C.
  5. Hvis bruker EGFP sette inn, analysere EGFP uttrykk under fluorescerende mikroskop ( figur 2). Ellers høste celler for en immunoblotting analysen.
    1. Immunoblotting analysen, skyll cellene to ganger med iskald PBS og deretter skrape dem ut med en celle skraper.
    2. For spuntveggstål cellene, Nedspinning avlinger i et 15 mL konisk rør 21000 x g i 2 minutter ved 18-25 ° C (RT).
    3. Etter forkaster PBS helt, Legg til 0,5 mL av iskalde pattedyr protein utvinning reagensen (M-PER), sammen med protease hemmer (5 µL av 100 x protease hemmer cocktail), til pellet hvis cellene er kultivert i 60 mm parabol.
    4. Nytt suspendere cellene med flere runder med pipettering deretter ruge suspendert cellene i 15 min på 18-25 ° C (RT).
    5. Spin cellen lysate 21000 x g i 10 min på 4 ° C.
    6. Overføre vandig nedbryting i en fersk 1,5 mL microcentrifuge tube.
    7. Analysere nedbryting av immunoblotting, følgende standardprotokoller med passende antistoffer.

3. generasjon av stabile HEK293 linjer med Genomic integrering av pEUI(+) Gene Switch

  1. Transfect 5-10 µg av det renset pEUI(+) med transgene til HEK293 celler som er 50-60% confluent i en 90 mm diameter celle kultur parabol, med 15-30 µL av transfection reagensen. Legge til hva reagensen 500 µL av fortynner (DMEM uten FBS og antibiotika) som inneholder DNA. Etter inkubasjon reaksjonsblandingen i 30 min på RT, legg blandingen til HEK-293 celler i kultur parabolen.
  2. Etter hva, tillate transfectants å vokse og uttrykke puromycin-motstand genet produktene under ikke-selektive kultur medium (uten puromycin) 24-48 h på 37 ° C.
  3. Distansere cellene fra kultur retter av trypsinization. Etter forkaster kultur medium, skyll transfectants med forvarmes PBS (37 ° C), legge til 1 mL av 0,25% trypsin/ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og ruge for 1 min på 37 ° C. Etter slukke trypsin/EDTA ved å legge forvarmes kultur medium (10 mL, 37 ° C), høste celler ved hjelp av en celle skraper, etterfulgt av sentrifugering i et 15 mL konisk rør 21000 x g i 2 minutter på 18-25 ° C.
  4. Nytt avbryte transfectants 50 mL av forvarmes kultur medium (37 ° C), og Overfør 10 mL av cellene i 90 mm frisk celle kultur retter. Kultur cellene på 37 ° C til 50-60% confluency før puromycin behandling (generelt, dette tar ca 24-48 timer).
  5. Dyrke transfectants på 37 ° C i celle kultur medium supplert med 3 µg/mL puromycin i 3-4 uker. I utvalg perioden, kan du endre celle kultur medium med puromycin (3 µg/mL) hver 2-3 dager for å opprettholde utvalg press. Når cellene blir fullt confluent, dele dem følge fremgangsmåten i trinn 3.3-3.4, med puromycin inneholder kultur medium. Forkaste gjenværende cellene i kultur medium, hvis ikke er nødvendig.
    Merk: Puromycin utvalg betingelser må opprettes eksperimentelt for spesifikke celletyper. Vi brukte 3 µg/mL puromycin i celle kultur medium; Dette var nok til å indusere celledød i ikke-transfekterte HEK293.
  6. Høste celler fra enkelte koloniene, ved hjelp av en kloning sylinder, og følg produsentens instruksjoner.
    1. Kast celle kultur medium. Skyll platen to ganger med forvarmes (37 ° C) PBS å fjerne flytende celler.
    2. Bruker sterilt tang, sett kloning sylinderen over de enkelte koloniene.
    3. Legge til 0,2 mL 0,35% trypsin/EDTA i hver enkelt sylinder.
    4. Inkuber retten på 37 ° C i 1 min til cellene er koblet, og deretter legge til noen dråper forvarmes (37 ° C) kultur medium sylindere.
    5. Overføre cellene fra hver sylinder til individuelle brønner av en 6-vel plate, med 2 mL kultur medium og 1 µg/mL av puromycin i hver brønn.
      Merk: Når cellene blir confluent, skalere opp kulturen. Nå kan clone(s) opprettes.
  7. Opprettholde personlige kloner i celle kultur medium med 1 µg/mL av puromycin.
  8. Valider individuelle kolonier ved å teste deres følsomhet for Teb behandling (siste konsentrasjon, 10 µM) for 24 h. Test responsen kloner til Teb ved å analysere uttrykk nivået av transgene med immunoblotting. Velg en ønsket klone (eller kloner). Dyrke en Teb behandlet og en ubehandlet prøve kultur medium for 12-48 h på 37 ° C før analysere hvilket induksjon av transgene. Hvilket uttrykk transgene kan måles gjennom immunoblotting, følge fremgangsmåten i trinn 2.5.1 - 2.5.7.

4. uttømming av Teb

  1. Slukke Teb stimuli ved å erstatte Teb inneholder cellen kultur medium med Teb-fri medium.
    Merk: Det anbefales å erstatte vekst media uten første reseeding cellene til en ny kultur parabol. Gjenværende Teb synes å klamre seg til plast fatet og vil lokke fram en sterk bakgrunn uttrykk for transgene. Før reseeding cellene i en ny kultur plate, skyll høstet cellene flere ganger med kultur medium eller PBS.
    1. Distansere cellene fra kultur retter av trypsinization. Etter forkaster Teb som inneholder kultur medium, skyll Teb-stimulert cellene to ganger med forvarmes PBS (37 ° C), legge til 1 mL av 0,25% trypsin/EDTA og ruge for 1 min på 37 ° C. Etter slukke trypsin/EDTA ved å legge forvarmes Teb-fri kultur medium (10 mL, 37 ° C), høste celler ved hjelp av en celle skraper, etterfulgt av sentrifugering i et 15 mL konisk rør 21000 x g i 2 minutter på 18-25 ° C.
    2. Nytt suspendere cellene i 50 mL av forvarmes Teb-fri kultur medium (37 ° C) og overføring 5 mL av cellene i tre 60 mm frisk celle kultur retter. Kultur cellene på 37 ° C for 24, 48 og 72 h henholdsvis.
    3. Høste cellene på forskjellige tidspunkt og måle hvilket uttrykk av transgene ved hjelp av immunoblotting.
      Merk: Under disse eksperimentelle forhold, transgene uttrykket ble undetectable ca 3 dager etter kultur cellene i Teb-fri kulturell mediet (Figur 3). Hvilket uttrykk transgene kan måles ved immunoblotting, som per trinn 2.5.1 - 2.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bryteren GvEcR-baserte entall genet er avbildet i figur 1A. PEUI(+) vektoren var optimalisert for regulert transgene uttrykk av behandling med Teb. Effektor regionen pEUI(+) består av en 10xUAS og en E1b minimal promoter etterfulgt av en MCS som inneholder EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI og AflII begrensning enzym anerkjennelse nettsteder. Et SV40 poly(A) signal ble lagt bak MCS (figur 1B). En PAC -genet ble satt inn mellom regionene driveren og effektor av pEUI(+) å konferere motstand mot puromycin.

For å evaluere aktivitet og leakiness av pEUI(+), vi subcloned EGFP til EcoRI stedet for MCS (pEUI(+)-EGFP), transiently transfected plasmider Konstruer i HEK293 celler og administrert Teb i ulike konsentrasjoner 24 h ( ) Figur 2). Mens narr vektor transfectants ikke vise fluorescerende signaler uansett Teb behandling (figur 2A, B), pEUI (+)-EGFP transfectants ble gradvis oppmerksomme økte mengden Teb (figur 2C-F ). Enda viktigere, pEUI (+)-EGFP transfectants uten behandling av Teb ikke framprovosere noen synlig EGFP signaler under fluorescerende mikroskop (figur 2C).

Videre validere responsen til pEUI(+) til Teb, vi subcloned et flagg epitope-merket ANKRD13A gen i EcoRI stedet for pEUI(+), overført Konstruer i HEK293 celler, og deretter utsatt dem for puromycin utvalg for 3 uker å etablere ønsket celle linje med ANKRD13A transgene. Vi analyserte uttrykket av transgene ANKRD13A etter 24 h behandling med Teb og etablerte celle linjen svarte godt (Figur 3). Vi ytterligere demonstrert Reversibilitet pEUI(+) gene bryteren av nedbrytende Teb fra kulturelle media. Som vist i Figur 3, var ANKRD13A uttrykk ikke lenger synlig når vi kulturperler cellene i Teb-frie medier.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk diagram av pEUI(+). (A) vektorkart over pEUI(+) ble bygget. En CMV promoter stasjoner grunnleggende uttrykk for GvEcR. Teb-bundet GvEcR vil translocate til kjernen og binde 10xUAS cis-fungerende regulatoriske sekvenser for å stimulere uttrykket av transgene inn MCS. (B) sekvensen informasjon mellom klammeparentesene i (A) inneholder hele effektor sekvenser av pEUI(+). Piler Representer personlige begrensning enzym anerkjennelse nettsteder inkludert i MCS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . GvEcR-baserte entall genet bryter svarer til behandling av Teb. HEK293 celler var transfekterte med angitte DNA konstruksjoner. Etter 24 timer av transfection, ble cellene stimulert 24 h med Teb på den angitte konsentrasjonen. EGFP transgene aktivitet ble observert under fluorescerende mikroskop. Narr transfectants med pEUI(+) ikke viser noen synlig fluorescens med (A) eller uten (B) Teb behandling. (C--E) Fluorescerende intensiteten i pEUI (+)-EGFP-transfekterte celler øker i en Teb dose-avhengige måte. Skala bar, 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . HEK293 celler stabilt harboring pEUI (+) / flagg-ANKRD13A svare reversibel administrasjonen av Teb. FLAGG epitope-merket ANKRD13A uttrykket ble utløst av Teb (1,5 µM) behandling. Etter 24 h behandling med Teb, var cellene byttet til Teb frafallet media for den angitte tid. Relative ANKRD13A ble målt ved Western blotting med anti-flagg antistoff. Hvilket endogene uttrykk α-tubulin ble målt med anti-α-tubulin antistoff som en kontroll. Den hvite stjernen angir en uidentifisert cross-reactive art. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Viktigste ulempen med å bruke en binær gene expression bryter er behovet for å samtidig levere to separate plasmider (sjåfør og effektor) inn i målcellen. Dette kan føre til en ulik fordeling av plasmider og resultere i en inkonsekvent respons på bryteren til indusere1,2,3. En annen mangel av to-vector er at minst to runder av antibiotikumet utvalg er nødvendig å identifisere lovende linjer. Derfor har en gen-induserbart kassett med én enhet lenge blitt søkt for bruk i biologisk forskning. Bryteren pEUI(+) entall transgene uttrykk finnes i en enkelt vektor utstyrt med alle juridiske enheter kreves for transgene stimulering. Dermed er induksjon nivået av transgene, subcloned i pEUI(+), avhengig av mengden av DNA transfekterte i forbigående transfection eksperiment og dosering av den kjemiske induser. I tillegg testet vi videre bruk av pEUI(+) vektor ved å generere en stabil celle linje med én kopi av ANKRD13A transgene15. Etablerte celle linjen viste høy følsomhet for Teb behandling (Figur 3). Samlet gjør sin høy følsomhet, Reversibilitet og lav leakiness15, sammen med begrenset variasjon i uttrykket nivå pEUI(+) et verdifullt molekylære og mobilnettet verktøy for å manipulere målet genuttrykk.

Blant ulike induserbart genet systemer valgte vi GvEcR-avhengige genet induksjon kassetten. GvEcR har flere fordeler sammenlignet med andre systemer: først lipofile natur flere isoinokosterone analogs som kjemisk indusere (inkludert Teb) er en fordel for effektiv gjennomtrengning av mobilnettet membraner21; andre, det er ingen EcR orthologs i virveldyr, så ecdysteroid agonister ikke påvirker funksjon uttrykt endogenously kjernefysiske reseptorer21,22; tredje er ecdysteroid ufarlige i virveldyr og raskt ryddet fra sirkulasjon system i vivo21,23; og fjerde, siden mange isoinokosterone agonister har blitt utviklet så langt, ved å velge optimal størrelse små molekyler, forskere kan unngå uønskede komplikasjoner13,22,24. Selv om pEUI(+) viser høy følsomhet til Teb, kan teste responsen til pEUI(+) til andre ecdysteroid agonister være verdifull. Eksistensen av ikke-steroide EcR agonister, som methoxyfenozide, som er mer løselig i vann enn Teb24 kan utvide omfanget av programmene i pEUI(+). Selv om uttrykket av transgene i pEUI(+) er relativt svakere enn i en Tet påloggingssystemet15, kan nivået av transgene induksjon utvides med tillegg av en multi kopi av VP16 transactivation domenet (data ikke vist). Siste gene terapi programmer har fokusert på sikker levering med et mål i eller vev som mangler respektive funksjonelle gene produktet på grunn av genetisk sykdom25,26,27. Imidlertid kan ikke regulert transgene under kontroll av vev-spesifikke eller viral konstituerende arrangører framprovosere hyper-uttrykk for målet genet, som løfter muligheten for lokale vev skade28,29. Anvendelsen av en pålitelig genet bryter for genterapi kunne dermed unngå uønskede komplikasjoner. PEUI(+)-vektor gir en praktisk og kraftig verktøy for å kontrollere transgene uttrykk i biologiske og kliniske studier. Vi utvikler for tiden en entall lentiviral vektor basert på GvEcR til øker programmet vårt system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.

Acknowledgments

Forfatterne takker S-Y Choi (Chonnam National University) for verdifulle kommentarer og grundig lesning av våre manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en research fund av Chungnam National University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9, (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7, (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1, (1), 29 (2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68, (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366, (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60, (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97, (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39, (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5, (9), e367 (2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3, (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12, (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78, (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43, (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59, (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37, (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57, (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15, (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (4), a015149 (2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110, (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19, (3), 470-478 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics