만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Developmental Biology
 

Summary

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

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Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).

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Abstract

인간의 pluripotent 줄기 세포는 인간 조직의 재생 소스를 나타냅니다. 우리의 연구는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 인간의 간 조직 생성에 집중 하 고 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc). 현재 차별화 절차 생성 인간의 hepatocyte 같은 셀 (HLCs) 태아 및 성인 특성의 혼합을 표시 합니다. 세포 표현 형을 개선 하기 위해, 우리는 완전히 정의 우리의 차별화 절차 및 셀 틈새 향상 된 유전자 발현 및 기능을 표시 하는 세포 인구의 세대의 결과로. 이러한 연구 진행 상황 표시, 하는 동안 능력 심사에 대 한 멀티 잘 플레이트의 대량 생성을 노동 집약적인 절차와 일괄 배치에 의해 제한 되었습니다 했다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 HLCs 줄기 세포 시드로 만능 줄기 세포를 분화 하는 반 자동화 플랫폼을 개발 하 고 차별화 96 잘 접시 형태로 액체 처리 및 자동 pipetting 시스템을 사용 하 여 수행 했다. 차별화, 다음 셀 형 자동화 된 현미경 검사 법 및 멀티 잘 루미 노 사용 하 여 분석 했다.

Introduction

기본 인간 hepatocytes (PHHs) 간 생물 의학 연구에 대 한 현재 표준을 나타냅니다. 그들의 장점에도 불구 하 고 PHHs는 불안정 형1성숙 hepatocytes의 제한 된 소스를 나타냅니다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 제안 되었습니다 강력한 자원으로 서 생물 의학 연구, 약속의 간2,3,4 포함 하 여, 인간의 조직 재생 소스에 대 한 . 현재 hepatocyte 차별화 프로시저 생성 hepatocyte 마커, 유전자 및 PHHs3,,45,6,7, 유사한 기능을 표현 하는 셀 8,9,,1011. 더 최근에, 정의 된 재료 및 재조합 laminins 같은 행렬을 사용 하 여 향상 된 세포 표현 형 및 재현성 실험5,12,,1314있다.

전통적인 셀 문화 기술 의존 무 겁 게 수동 pipetting에 시간이 소모 및 오류가 발생 하기 쉬우며. 이 분석 결과 하나 작업할 수 있는 플레이트 포맷의 처리량을 제한 합니다. 날짜 하려면, 대부분 연구 HLCs의 생성을 설명 하는 노동 집약적인 자연과 크기15,,1617에 따라서 작은 규모에.

현재 액체 취급에서을 pipetting 시스템, 자동화 된 현미경 검사 법 및 실험실 해석기와 함께 만든 그것은 인간의 개입에 대 한 요구를 최소화 하는 절차를 개발할 수 합니다. 우리가 이러한 기술의 이용 및 많은 양의 기본에 대 한 인간의 간 조직 생성 하는 반자동된 차별화 시스템 개발 고 생물 의학 연구를 적용. 이 이렇게 인간의 ESC와 iPSC 라인 사소한 조정 셀 라인에 따라 필요한 수행할 수 있습니다. 이 시스템을 결합 하 여 높은 콘텐츠 분석, 적은 시간과 규모18,,1920,21에서 HLC 형질 수 설명 합니다.

요약, 여기에 설명 된 세포 문화 기술의 자동화 신뢰성, 실험 시간 관리 및 분석 결과 처리량 개선으로 이끌어 냈다.

Protocol

1. 시드 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에 96 잘 접시에 Hepatocyte 차별화

참고: 시 약 및 장비가이 프로토콜에 사용 된 표 1에 나열 되었습니다. 이 실험에 사용 된 미디어는 살 균과 세포 배양에 대 한 실 온에서 수 있어야 합니다. 프로토콜의이 부분에 설명 된 모든 시 약/솔루션 볼륨 기반으로 96 잘 접시의 단일 잘 명시 하지 않으면 합니다.

  1. 준비 laminin 코팅 96 잘 접시.
    1. 재조합 laminin 521 (100 µ g/mL)의 작은 유리병을 녹여 (LN-521) 4 ° c.에서 하룻밤에 2 h에 대 한
    2. Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (Ca2 +/Mg와2 +) x 얼음 1에 LN-521를 diluting 하 여 5 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다.
    3. 카세트를 분배 하는 표준 튜브 디스펜서를 처리 하는 자동 액체를 사용 하 여 50 µ L 당 96 잘 접시의 LN-521 솔루션의 추가.
      참고: 모든 볼륨 dispenses 표준 튜브를 별도로 지정 하지 않는 한 카세트를 분배는 자동 액체 처리 디스펜서와 함께 수행 됩니다. 프라임 솔루션, 카세트의 분배 끝에 도달할 때까지 다음 진행 하는 걸. 여러 96 잘 접시 필요에 따라 여러 번 절차를 반복 하 여 동일한 실험에서 준비 될 수 있습니다.
    4. 37 °C/5% CO2 2 ~ 4 h LN521 코팅 접시를 품 어.
      참고: LN521 코팅 접시 저장 될 수 있다 4 ° c.에 2 주를 격판덮개 증발 및 오염 방지 하기 위해 평평한 표면에 밀봉을 유지.
  2. 1 시간 30 분 동안 37 ° C에 미리 코팅된 접시의 필요한 숫자를 따뜻한.
  3. 8 채널 포부 어댑터를 사용 하 여 코팅된 표면의 나머지 LN-521 솔루션 발음
    참고: 그것은 코팅 저하를 방지 하는 코팅 표면 어떤 접촉을 피하기 위해 중요 한입니다.
  4. 즉시 보충 10 µ M로 관련 된 키 (바위) 억제 물 Y27632 mTeSR1 매체의 당 50 µ L을 추가 하 고 셀 37 °C/5% CO2시드까지 인큐베이터에 접시를 유지.
    참고: 건조 laminin 코팅 우물을 허용 하지 않습니다.
  5. 3 x 105 셀/ml mTeSR1 매체 10 µ M 바위 억제제 Y27632 보충에 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    참고: 각 셀 라인에 대 한 시드 밀도 최적화가 필요 합니다.
    1. 매체를 발음 hPSCs에 약 75% ~ 85%의 undifferentiated 문화 배양 접시에서 LN-521에 경작 하는 confluency 앞12에서 설명한.
      참고: hPSCs 교양 LN-521에 mTSER1에 모든 24 h 변경 하 고 정기적으로 셀 앞에서 설명한12confluency의 80%에 도달 되 면 passaged 매체.
    2. 실내 온도 1의 5 mL로 세포 세척 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) x DPBS 및 aspirate 버퍼.
    3. 셀에 부드러운 세포 분리 시 약 x 1의 5 mL을 추가 하 고 셀 분리에 대 한 6 ~ 8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: 반응을 중지, 검사 현미경 행렬에서 셀의 분리. 셀 접시에서 부분적으로 분리 해야 합니다. 그렇지 않은 경우에 추가로 1 ~ 2 분에 대 한 보육을 확장.
    4. 부드러운 세포 분리 시 발음 하 여 반응을 종료 하 고 10 µ M 바위 억제제 Y27632 세포를 보충 하는 신선한 mTeSR1 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 매트릭스를 섞어 여러 번 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 피 펫 셀 리프트.
    5. Trypan 블루 제외 방법 얼룩에 따라 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀 고 필요한 농도와 세포 현 탁 액을 준비.
    6. 살 균 15 mL 또는 50 mL 원심 분리기 튜브로 셀의 원하는 번호를 플라스틱 하 고 실 온에서 5 분 동안 115 x g 에서 centrifuging 의해 셀 아래로 회전.
      참고: 한 96 잘 접시 3 x 105 셀/mL를 포함 하는 mTeSR1 매체의 5 mL는 H9 셀 줄 필요 합니다.
    7. 상쾌한 발음 하 고 동종 솔루션 mTeSR1 매체 10 µ M 바위 억제제 Y27632 보충에 37 ° C에서 얻을 때까지 부드럽게 셀 펠 릿을 resuspend.
      참고: 바위 억제제의 사용은 권장 세포 생존 게시물 다시 도금 향상 시킵니다.
  6. 10 µ M 바위 억제제 Y27632와 mTeSR1의 50 µ L을 포함 하는 96 잘 접시에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 추가 합니다.
  7. 시드, 후 37 °C/5% CO2 연결할 셀 수 있도록 24 h에 대 한 셀 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
  8. 다음 날 셀을 검토 하 고 설정 된 셀에 셀 접촉 후 록 억제제를 철회. 40 %confluency 차별화 매체 (그림 1B)으로 전환 합니다.
    참고: 셀 confluency 40% 보다 높은 경우, 플레이트 사용은 H9 셀 라인 HLC 차별화에 적합 합니다.

2. 차별화 96 잘 접시에 재조합 Laminins Hepatocyte 같은 셀에 hPSCs

  1. 매체 및 성장 요인 분화를 준비 합니다.
    1. 살 균 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 있는 인간 Activin A 분말을 용 해 하 여 인간의 Activin A 재고 솔루션 (100 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1, 000에서 사용 합니다.
    2. 살 균 0.2 %BSA 마우스 Wnt3a 분말을 용 해 하 여 마우스 Wnt3a 재고 솔루션 (10 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1: 200에서 사용 합니다.
    3. 살 균 0.2 %BSA 인간 HGF 분말을 용 해 하 여 인간의 hepatocyte 성장 인자 (HGF) 재고 솔루션 (10 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1000에서 사용 합니다.
    4. 살 균 0.2 %BSA 분말을 용 해 하 여 Oncostatin M (OSM) 재고 솔루션 (20 µ g/mL)를 준비 합니다. 약 주식 수와-20 ° c.에 게 1:1, 000에서 사용 합니다.
    5. 확실 한 endoderm: endoderm 차별화 매체, 1% 페니실린/스 2 %B27 보충 (50 x, 인슐린 없이), 구성 된 준비 (최종 농도: 100 IU/mL와 100 µ g/mL, 각각) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (추가 RPMI 1640) 기저 매체. 4 ° C에서 저장 하 고 2 주 이내에 사용. 각 중간 변경 시 보충 필요한 볼륨 Activin A와 Wnt3a 100 ng/mL 및 50 ng/mL의 최종 농도에서 각각.
    6. Hepatoblast 차별화: 20% 녹아웃 혈 청 교체 (KSR), 0.5% 대체 보충 L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 0.1 m m 베타-mercaptoethanol, 1 %DMSO, 및 1%로 구성 된 hepatoblast 차별화 매체 준비 페니실린/스 (최종 농도 100 IU/mL와 100 µ g/mL, 각각) 녹아웃 DMEM (코-DMEM)에 추가. 진공에서 필터 및 4 ° c.에 저장 2 주 이내에 사용 합니다.
    7. Hepatocyte 차별화: hepatocyte 차별화 매체, 대안 1% 페니실린/스 10 µ M 날린 21 hemisuccinate 나트륨 소금 (HCC), L-글루타민을 보충 하는 1%로 구성 된 준비 (100 IU/mL에서 최종 농도 및 100 µ g/mL, 각각) HepatoZYME 매체에 추가. 4 ° C에서 주식을 저장 하 고 2 주 이내에 사용. 각 매체 변화에 대 한 보충 HGF와 OSM 필요한 볼륨 (최종 농도 10 ng/mL와 20 ng/mL, 각각).
  2. 24 시간 게시물 시드, 신중 하 게 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 신선한 endoderm 못쓰게 매체 100 ng/mL Activin A와 50 ng/mL Wnt3a 보충의 100 µ L를 추가.
    참고: 차별화 과정 개시 최종 endoderm 매체 추가 되었습니다. 일단 셀 시드 최적화 된 세포 분화는 일반적으로 24 시간 이내 시작 됩니다. 하지 않는 한 변경 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템과 매체를 제거 하 고 신선한 매체는 자동 액체 처리 디스펜서를 사용 하 여 표준의 100 µ L를 분배 하 여 수행 하는 모든 매체 분배 카세트 관 달리 지정합니다. 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템 96 300 µ L 팁을 사용 하 여 잘 머리와 함께 사용 되었다. 간단 하 게, 잘 피하는 세포로, 어떤 접촉 든 지에서 90 µ L 발음 했다 그리고 세포 스트레스를 줄이기 위해 중간 변경 하는 동안 셀을 건조 하지 하는 것이 중요 하다.
  3. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs), 3 일 동안 매일 endoderm 차별화 매체 변경. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에 대 한 차별화를 수행 하는 경우만 Activin A를 사용 하 여 2 추가 일에 대 한 확실 한 endoderm 무대를 확장 합니다.
  4. 결정적인 endoderm 유도 후 전환 hepatoblast 사양, KSR/DMSO 매체 하 고 매체를 5 일 동안 매 2 일 변경.
    참고: 연결 되지 않은 셀에는 잘 수 있다면 다음 중간 변경 하기 전에 한 번 세포를 씻어 비 보충 코 DMEM을 사용 합니다. 프로토콜 (5 일)의 2 단계 기간 때문 hepatoblast 규격의 마지막 날에 마지막 하나 3 중간 변경 될 것입니다.
  5. Hepatoblast 차별화에 따라 hepatocyte 성숙에 대 한 HepatoZYME 매체를 전환 합니다. KSR/DMSO 매체를 제거한 후 보충 없이 HepatoZYME 한번 셀을 세척 하 고 100 µ L HepatoZYME 성숙 매체 10 ng/mL HGF와 20 ng/mL OSM 보충의 추가.
  6. 7 ~ 10 일 동안 모든 48 h 매체를 변경 합니다. 차별화의 하루 18, 유전자 발현 및 CYP P450 대사 활동을 분석 하 여 HLCs 특징.

3. 특성화 Hepatocyte의 세포 분화에 재조합 Laminins

  1. Hepatocyte 특정 마커 및 분극 마커 immunostaining를 사용 하 여 식을 검색.
  2. Hepatocyte 대사 기능12전에 설명한 대로 P450 CYP 분석 실험을 사용 하 여 테스트 합니다.
  3. 접시 당 잘 당 세포의 총 수를 세 접시 변화를 확인 합니다.

4. 높은 처리량 Immunocytochemistry 및 이미지 수집

  1. 차별화의 18 일에 세 번 1 x DPBS와 함께 우물을 세척 하 고는 HLCs 4 %paraformaldehyde (PFA)의 분배 50 µ L에 의해 수정 15 ~ 30 분 동안 실 온에서 품 어. 고정, 후 PBST로 세 번 세척 (0.1% 트윈) (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) 자동 접시 세탁기를 사용 하 여.
    참고:이 섹션에서 모든 세척 별도로 지정 하지 않는 한 자동 접시 세탁기를 사용 하 여 수행 됩니다. 모든 세척 같은 프로토콜에 따라 수행 됩니다.
  2. (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBST의 분배 100 µ L에 의해 막 permeabilize 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 다음, PBST에서 10 %BSA 분배 100 µ L에 의해 차단 하는 단백질을 수행 하 고 판 통을 사용 하 여 부드러운 떨고에 1 시간에 대 한 품 어. 단백질 차단 후 1 차 항 체를 포함 하는 PBST에서 1 %BSA 50 µ L를 추가, 판 통을 사용 하 여 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    참고: 단백질 및 항 체 또한 사이 씻지 않는.
  3. 24 시간 후 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) 1 x DPBS로 세 번 세척 하 고 PBST에 1 %BSA 분배 50 µ L에 의해 이차 항 체를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h를 품 어.
  4. 이차 항 체 부 화 후 1 x DPBS 3 번 씻어. DAPI와 DPBS의 50 µ L 추가 (10 µ g/mL)와 어둠 속에서 실 온에서 5-10 분 동안 품 어.
  5. 마지막으로, DPBS로 3 번 세척 하 고 잘에서 1 x DPBS의 100 µ L를 떠나. 플레이트는 이미징에 대 한 준비가 되었습니다.
    참고: 접시 저장 되어야 한다 어둠 속에서 4 ° C에서 영상까지.
  6. 이 콘텐츠 이미징 시스템을 사용 하 여 접시를 이미지 하 고 우물의 좋은 표시를 잘 걸쳐 여러 필드를 확보. 콜럼버스 소프트웨어 (이 콘텐츠 이미징 분석 시스템 소프트웨어)를 사용 하 여 다른 표식은 HLCs에의 식을 계량.
    참고: 콜럼버스는 세포 형질에 대 한 셀 세분화 분석을 제공 하는 높은 콘텐츠 분석 소프트웨어. CellProfiler, 생물학 이미지22의 정량 분석을 위한 오픈-소스 소프트웨어를 사용 하 여 비슷한 결과 얻을 수 있습니다.

Representative Results

세포 분화 된 배아 줄기 세포 라인 (H9)를 사용 하 여 수행 되었다. 반자동된 플랫폼 차별화 하 고 세포 (그림 1A) 특성 사용 되었다. 자동 액체 처리 디스펜서 매트릭스 코트 단일 세포 씨앗을 사용 되었다. 세포질 감 별 법 세포에 도달 40 %confluency (0 일) 때 시작 되었다. 미디어 변화는 매체 및 매체 추가 (그림 1A)의 액체 처리 디스펜서를 제거 하는 자동 휴대용 전자 채널 피 펫 시스템을 사용 하 여 수행 되었습니다. 셀 고정 하 고 얼룩은 자동 액체 처리 디스펜서를 사용 하 여 자동 접시 세탁기와 함께에서 하는 것을 수행 했다. 이미징 및 정량화 높은 콘텐츠 이미징 시스템 및 콜럼버스 소프트웨어를 사용 하 여 수행 했다. 시 토 크롬 P450 활동 설립된 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 기판 부 화, 다음 셀 supernatants 수확 했다, 그리고 생물 발광 다중 모드 microplate 리더 (그림 1A)를 사용 하 여 기록. 또한, 기존의 단계 대조 현미경 검사 법 hepatocyte 차별화 (그림 1B) 동안 셀 형태학에 있는 변화를 측정 하기 위해 사용 되었다.

하루 18에 우물 사이 셀 수 있는 가변성 DAPI 얼룩 (그림 2A)에 따라 시험 되었다. 7 시야는 핵 계량 (그림 2A)의 수와 잘 당 점령 했다. 우리는 41,662 ± 3, 평균 우물 우물 (그림 2B) 당 366 셀 간에 통계 차이가 발견.

18 일에 HLCs 전형적인 hepatocyte 표식 (그림 3A-G)에 대 한 스테인드 및 CYP P450 활동에 대 한 테스트 고정 했다. HLCs 표현 HNF4α 같은 hepatocyte 마커 (89.2% ± 2 양수 세포), ALB (92.8% ± 6 긍정적인 세포), AFP (61.8% ± 2 양수 세포). 또한 HLCs CYP P450 단백질, CYP2D6 그리고 CYP3A4 표현 하 고 E Cadherin 단백질 식으로 같이 뚜렷한 다각형 모양을 표시. HLCs P450 CYP 활동 하루 18에서 측정 했다. HLCs 295,906 편각, 단백질의 828 RLU/mL/mg와 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg의 단백질 (그림 3 H)에서 CYP3A CYP1A2 활동 전시.

Figure 1
그림 1: 96에 Psc에서 Hepatocyte 차별을 잘 포맷. 반 자동화 세포질 감 별 법, 고정, 얼룩, 이미징 및 기능 활동 하는 데 사용 하는 장비 (A). 도표. (B). 대표 HLC 차별화 동안 세포 형태학 변화. 간단히, Psc는 최종 endoderm, hepatoblast 규격 취득 다각형 모양 세포와 조약돌 모양의 형태를 표시 하는 세포 그리고 hepatocyte 성숙 이전 특징 다음으로 끝났다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: HLCs 잘-투-잘 가변성의 평가. (A) 대표는 96 잘 접시 HLCs DAPI 스테인드의 보기. 눈금 막대 = 1 m m. (B) 잘 당 휴대폰 번호의 정량화. 잘 하 고 콜럼버스 소프트웨어를 사용 하 여 정량 뷰 7 분야에서 (아래), 행과 열 (위)에 우물 당 휴대폰 번호의 평균. 접시에 걸쳐 평균 휴대폰 번호 잘 당 41,662 ± 3,366 sem의 셀입니다. 웰 스 사이 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. Tukey의 게시물-특별 통계적 테스트와 단방향 ANOVA 고용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Hepatocyte 마커 표현과 P450 CYP 활동 측정 HLCs에서 하루 18. Hepatocyte 핵 요인 4 알파 비율 (A) (HNF4α) 식 ± SEM 잘 당 10 볼 필드 30 우물에 기반. (B) SEM, + 알 부 민 (장백의) 식의 비율 잘 당 10 시야와 3 별도 우물에 기반. (C) SEM + alpha fetoprotein (AFP)의 비율 잘 당 10 시야와 3 별도 우물에 기반. (D) 전자 cadherin 얼룩. (E) CYP2D6 얼룩입니다. (F) CYP3A4 얼룩입니다. (G). 면역 글로불린 G (IgG) 컨트롤을 얼룩. 눈금 막대 하루 18에서 50 µ m. (H) CYP P450 1A2 및 3A 대사 활동 HLCs에서 =. 6 생물 SEM. 활동 + 복제 데이터 나타내는 단백질의 1 밀리 그램 당 상대 빛 단위 (RLUs) /mL으로 인용 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

우리의 반자동된 절차는, 신뢰할 수 있는 효율적이 고 경제적인 규모 (그림 1)에서 HLCs의 생산을 허용 합니다. 하이 플랫폼 세포 기반 스크리닝 (그림 2)에 대 한 적절 한 접근 격판덮개 우물 사이 셀 수 상당한 차이 없었다. 또한, 반 자동화 워크플로우는 수동 프로세스5,12를 사용 하기 전에 가능 하지 않았다 많은 접시 한 번에 생산 사용자 수 있습니다.

중요 한 것은, 자동화 프로세스 HNF4α을 표현 하는 세포의 대다수와 차별화 수익률에 영향 하지 않았다 (89.2% ± 2) 및 ALB (92.8% ± 6) (그림 3). 또한 HLCs CYP P450 효소 CYP2D6 그리고 CYP3A4 표현 하 고 CYP1A2, CYP3A 신진 대사 활동 이전 보고 실험 (그림 3)5에 비해 표시. 프로토콜의 표준화에도 불구 하 고 분화 하기 전에 셀 confluency은 순수 HLC 차별화 중요 합니다. 따라서, 중요 한 고려 사항 (그림 1)은 잘 걸쳐 좋은 셀 배포를 보장. 이 종속 셀 라인 것을 입증 했다, 따라서 셀 시드 및 밀도 최적화 각 셀 라인 이전 확장에 대 한 필요 합니다.

그것의 현재 모양에서이 플랫폼은 임상 응용 프로그램에 대 한 HLCs의 대량 생산에 적합 하지 않습니다 그리고이 대부분 셀 공장 및 생물 반응 기의 사용을 통해 달성 될 것입니다. 그러나, 개발 방법론에서는 질병 모델링, 마약 검사 및 약물 연구를 재사용에 대 한 인간의 간 세포의 급속 한 세대 수 있습니다. 또한, 분석 결과 멀티플렉싱, 의무가 기계 분석에 대 한 multiparametric 데이터 집합 생성을 허용. 앞으로 고, 우리 또한이 기술을 좀 더 복잡 한 생체 외에서 시스템에 3D 차별화 또는 HLC 형에서 생체 외에서개선 하기 위해 플랫폼으로 적용 될 수 믿습니다.

결론적으로, 우리는 믿습니다 우리의 간단 하 고 반자동 시스템 실험 처리량을 증가 하 고 실험 편차를 줄이기 위해 생물 학적 데이터 세트와 인간의 생리 쪽으로 그들의 추정의 품질 향상.

Disclosures

교수 데이비드 C. 건초 공동 설립자 및 Stemnovate 제한의 감독 이다.

교수 데이비드 C. 건초 HigherSteaks 제한의 지도자 이다.

Acknowledgments

이 작품은 주요한 과학자의 사무실 (TCS/16/37)와 MRC 박사 장학금에서 상을 지원 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405 LS Washer Biotek
B27 supplement Life Technologies 12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
GripTips for VIAFLO 96 Integra 6434
HepatoZYME-SFM Life Technologies   17705021
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermoFisher 5840300
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Standard tube dispensing cassette ThermoFisher 24072670
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette Integra 6001
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1.00496 EMD MILLIPORE
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
DAPI Invitrogen D1306
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Abcam ab3980 1:500 (mouse)
CYP2D6 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
IgG DAKO 1:400
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) Life technologies A-11001 1:400
Anti-sheep 488 (secondary antibody) Life technologies A-11015 1:400
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) Life technologies A-11008 1:400

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References

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