Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से कोशिकाओं की तरह Hepatocyte के अर्द्ध स्वचालित उत्पादन

Developmental Biology
 

Summary

यह प्रोटोकॉल एक अर्द्ध स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatocyte की तरह कोशिकाओं का उत्पादन । इस प्रक्रिया को तेजी से और लागत प्रभावी, बुनियादी और लागू मानव अनुसंधान के लिए hepatocyte की तरह कोशिकाओं के गुणवत्ता आश्वासन बैचों के उत्पादन की अनुमति है ।

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Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).

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Abstract

मानव pluripotent स्टेम सेल मानव ऊतक के एक अक्षय स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । हमारे अनुसंधान मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) से मानव जिगर ऊतक पैदा करने पर ध्यान केंद्रित है । वर्तमान भेदभाव प्रक्रियाओं भ्रूण और वयस्क लक्षण का एक मिश्रण प्रदर्शित मानव hepatocyte की तरह कोशिकाओं (HLCs) उत्पन्न करते हैं । सेल phenotype में सुधार करने के लिए, हम पूरी तरह से हमारे भेदभाव की प्रक्रिया और सेल आला परिभाषित किया है, कोशिका आबादी जो बेहतर जीन अभिव्यक्ति और समारोह में प्रदर्शित की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि इन अध्ययनों की प्रगति के निशान, स्क्रीनिंग के लिए बहु अच्छी तरह से प्लेटों की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने की क्षमता श्रम गहन प्रक्रियाओं और बैच भिन्नता के लिए बैच द्वारा सीमित किया गया है. इस समस्या से निपटने के लिए, हमने pluripotent स्टेम सेल को HLCs में अंतरित करने के लिए एक अर्द्ध-स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म विकसित किया है । स्टेम सेल बोने और भेदभाव तरल हैंडलिंग और ९६ में स्वत: pipetting सिस्टम-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । भेदभाव के बाद, सेल phenotype स्वचालित माइक्रोस्कोपी और एक बहु अच्छी तरह से luminometer का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था ।

Introduction

प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (PHHs) जिगर जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए वर्तमान मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं । अपने फायदे के बावजूद, PHHs अस्थिर phenotype1के साथ परिपक्व हेपैटोसाइट्स के एक सीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली संसाधन के रूप में प्रस्तावित किया गया है, मानव ऊतक के एक अक्षय स्रोत का वादा, जिगर सहित2,3,4 . वर्तमान hepatocyte भेदभाव प्रक्रियाओं कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस hepatocyte मार्करों, जीन और PHHs3,4,5,6,7के समान कार्य उत्पंन 8,9,10,11. हाल ही में, इस तरह के रिकॉमबिनेंट laminins के रूप में परिभाषित सामग्री और मैट्रिक्स का उपयोग, सेल phenotype और प्रयोगात्मक reproducibility5,12,13,14में सुधार हुआ है ।

पारंपरिक सेल संस्कृति तकनीक मैनुअल pipetting, जो दोनों समय लेने और त्रुटि प्रवण है पर काफी भरोसा करते हैं । इस परख के प्रवाह और प्लेट प्रारूप एक के साथ काम कर सकते है सीमा । तारीख करने के लिए, सबसे HLCs की पीढ़ी का वर्णन अध्ययन प्रकृति में गहन श्रम कर रहे है और इसलिए आकार में छोटे पैमाने15,16,17

तरल हैंडलिंग और pipetting प्रणालियों में वर्तमान अग्रिमों, स्वचालित माइक्रोस्कोपी और प्रयोगशाला विश्लेषक के साथ संयोजन में, यह संभव प्रक्रियाओं जो मानव हस्तक्षेप के लिए आवश्यकता को कम करने के विकास के लिए बनाया है । हम इन प्रौद्योगिकियों का लाभ ले लिया है और एक अर्द्ध स्वचालित भेदभाव प्रणाली है जिसके साथ बुनियादी और लागू जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए मानव जिगर ऊतक की बड़ी मात्रा में उत्पंन करने के लिए विकसित की है । इस दृष्टिकोण दोनों मानव ESC और iPSC लाइनों के साथ छोटे समायोजन आवश्यक, सेल लाइन के आधार पर किया जा सकता है । उच्च सामग्री विश्लेषण के साथ इस प्रणाली के संयोजन, हम प्रदर्शित करते है कि एचएलसी phenotyping कम समय लगता है और पैमाने पर प्रदर्शन18,19,20,21हो सकता है ।

संक्षेप में, सेल संस्कृति तकनीकों के स्वचालन यहां वर्णित विश्वसनीयता में सुधार के लिए नेतृत्व किया गया है, प्रयोगात्मक समय प्रबंधन और परख प्रवाह ।

Protocol

1. सीडिंग मानव Pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) में ९६ अच्छी तरह से Hepatocyte भेदभाव के लिए प्लेटों

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए रिएजेंट और उपकरण तालिका 1में सूचीबद्ध किए गए हैं । मीडिया इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया और बाँझ होना चाहिए कक्ष संस्कृति के लिए कमरे के तापमान पर । प्रोटोकॉल के इस भाग में वर्णित सभी एजेंट/समाधान खंड एक ९६-well प्लेट की एक अच्छी तरह से जब तक अंयथा निर्दिष्ट पर आधारित हैं ।

  1. तैयार laminin लेपित ९६ अच्छी तरह से प्लेटें ।
    1. गल रिकॉमबिनेंट laminin ५२१ (१०० µ g/एमएल) (LN-५२१) की एक शीशी 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए ।
    2. एक 5 µ g/mL समाधान कमजोर LN-५२१ द्वारा आइस-कोल्ड 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) (Ca2 +/Mg2 +) के साथ तैयार करें ।
    3. एक मानक ट्यूब वितरण कैसेट के साथ एक स्वत: तरल हैंडलिंग मशीन का प्रयोग करें LN-५२१ एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से समाधान के ५० µ एल जोड़ने के लिए ।
      नोट: सभी मात्रा तिरस्कृत एक मानक ट्यूब के साथ एक स्वचालित तरल हैंडलिंग मशीन के साथ प्रदर्शन कर रहे है कैसेट वितरण जब तक अंयथा निर्दिष्ट । प्रधानमंत्री समाधान जब तक यह कैसेट के वितरण अंत तक पहुंचता है, तो वितरण के लिए आगे बढ़ना । एकाधिक ९६ अच्छी तरह से प्लेटें के रूप में कई बार की जरूरत के रूप में प्रक्रिया दोहरा द्वारा एक ही प्रयोग में तैयार किया जा सकता है ।
    4. ३७ ° c/5% 2 से 4 एच के लिए2 सह पर LN521 लेपित प्लेटें ।
      नोट: LN521-लेपित प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता है । वाष्पीकरण और संदूषण से बचने के लिए एक सपाट सतह पर प्लेटें सील रखें ।
  2. 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर पूर्व लेपित प्लेटों की आवश्यक संख्या को गर्म करें ।
  3. महाप्राण शेष LN-५२१ लेपित सतह का उपयोग कर एक 8 चैनल आकांक्षा अनुकूलक का समाधान ।
    नोट: यह कोटिंग क्षरण से बचने के लिए लेपित सतह के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. तुरंत mTeSR1 माध्यम से 10 µ एम Rho-एसोसिएटेड कळेनासे (रॉक) अवरोध करनेवाला Y27632 के साथ पूरक के प्रति अच्छी तरह से ५० µ एल जोड़ने और मशीन में थाली रखने तक सेल ३७ डिग्री सेल्सियस पर बोने/
    नोट: laminin-लेपित कुओं को सूखने की अनुमति न दें ।
  5. 10 µ m रॉक अवरोधक Y27632 के साथ पूरक mTeSR1 मध्यम में 3 एक्स 105 कोशिकाओं/एमएल के एक सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
    नोट: प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए सीडिंग घनत्व अनुकूलन की आवश्यकता होगी ।
    1. महाप्राण के बारे में ७५% पर hPSCs की एक विभेदित संस्कृति के साथ एक पेट्री पकवान से मध्यम ८५% से अधिक प्रभावित LN-५२१ पर कल्चरित के रूप में पहले वर्णित12
      नोट: hPSCs के साथ mTSER1 में LN-५२१ पर संस्कृति रहे है हर 24 ज बदल गया है, और नियमित रूप से पारित एक बार कोशिकाओं के प्रवाह के ८०% तक पहुंचने के रूप में पहले12वर्णित है ।
    2. कक्ष तापमान 1x DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो (बिना Ca2 +/Mg2 +) और बफर महाप्राण ।
    3. कोशिकाओं के लिए 1x कोमल सेल पृथक्करण रिएजेंट के 5 मिलीलीटर जोड़ें और सेल पृथक्करण के लिए 6 से 8 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, माइक्रोस्कोप के तहत मैट्रिक्स से कोशिकाओं की टुकड़ी की जांच. कोशिकाओं को प्लेट से आंशिक रूप से अलग किया जाना चाहिए । यदि नहीं, तो एक अतिरिक्त 1 से 2 मिनट के लिए गर्मी का विस्तार ।
    4. कोमल कोशिका पृथक्करण रिएजेंट aspirating द्वारा प्रतिक्रिया को समाप्त करने और कोशिकाओं को 10 µ एम रॉक अवरोधक Y27632 के साथ पूरक ताजा mTeSR1 माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । एक सेल खुरचनी का प्रयोग करने के लिए मैट्रिक्स से कोशिकाओं को उठा और पिपेट ऊपर और नीचे एक P1000 टिप कई बार मिश्रण करने के लिए उपयोग कर ।
    5. Trypan नीले दाग अपवर्जन विधि के आधार पर एक hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना और आवश्यक सांद्रता के साथ सेल निलंबन तैयार करते हैं ।
    6. पिपेट एक बाँझ 15 मिलीलीटर या ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं की वांछित संख्या में है और कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए उन्हें ११५ x g पर केंद्रापसारक द्वारा नीचे कोशिकाओं स्पिन ।
      नोट: के लिए १ ९६ खैर प्लेट, mTeSR1 मध्यम के 5 मिलीलीटर 3 x 105 कोशिकाओं से युक्त/एमएल H9 सेल लाइन के लिए आवश्यक है ।
    7. महाप्राण supernatant और धीरे से एक समरूप समाधान mTeSR1 मध्यम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त की है जब तक सेल गोली resuspend 10 µ एम रॉक अवरोधक Y27632 के साथ पूरक ।
      नोट: रॉक अवरोधक के उपयोग की सिफारिश की है के रूप में यह सेल अस्तित्व में सुधार पोस्ट फिर से चढ़ाना ।
  6. सेल निलंबन के ९६ अच्छी तरह से 10 µ एम रॉक अवरोधक Y27632 के साथ mTeSR1 के ५० µ एल युक्त प्लेट पर ५० µ एल जोड़ें ।
  7. बोने के बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल मशीन के लिए प्लेटें लौटाएं/5% सीओ2 24 ज के लिए कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति है ।
  8. सेल संपर्क करने के लिए सेल की स्थापना की गई है एक बार अगले दिन कोशिकाओं की जांच करें और रॉक अवरोधक वापस ले लो । ४०% पर प्रवाह, अंतर मध्यम करने के लिए स्विच (आंकड़ा 1b) ।
    नोट: यदि कोशिका प्रवाह ४०% से अधिक है, प्लेटें H9 सेल लाइन के साथ एचएलसी भेदभाव के लिए उपयुक्त नहीं हैं ।

2. ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में रिकॉमबिनेंट Laminins पर Hepatocyte की तरह कोशिकाओं को hPSCs अंतर

  1. विभेदक मध्यम और वृद्धि कारक तैयार करें ।
    1. मानव Activin पंजाब में बाँझ ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में एक पाउडर को भंग करके एक शेयर समाधान (१०० µ g/एमएल) Activin तैयार करें । Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर और स्टोर करें । 1:1000 पर उपयोग करें ।
    2. माउस Wnt3a स्टॉक समाधान तैयार करें (10 µ g/mL) को भंग करके Wnt3a पाउडर बाँझ में ०.२% BSA. Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर और स्टोर करें । 1:200 पर प्रयोग करें ।
    3. मानव एचजीएफ चूर्ण को बाँझ ०.२% BSA में भंग करके मानव hepatocyte वृद्धि कारक (एचजीएफ) स्टॉक सॉल्यूशन (10 µ g/एमएल) तैयार करें । Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर और स्टोर करें । 1:1000 पर प्रयोग करें ।
    4. Oncostatin मीटर (OSM) स्टॉक समाधान (20 µ g/एमएल) को बाँझ ०.२% BSA में पाउडर को भंग करके तैयार करें । Aliquot-20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर और स्टोर करें । 1:1000 पर उपयोग करें ।
    5. निश्चित अन्तः: अन्तः विभेद माध्यम तैयार करें, जिसमें 2% B27 अनुपूरक (50x, इंसुलिन के बिना), 1% पेनिसिलिन/streptomycin (अंतिम सांद्रता: १०० IU/एमएल और १०० µ g/एमएल, क्रमशः) को जोड़ा गया रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट १६४० ( RPMI १६४०) बेसल मध्यम । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें । प्रत्येक मध्यम परिवर्तन पर, क्रमशः १०० एनजी/एमएल और ५० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता में Activin ए और Wnt3a के साथ आवश्यक मात्रा पूरक ।
    6. Hepatoblast भेदभाव: Hepatoblast भेदभाव मध्यम तैयार, 20% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (KSR) से मिलकर, ०.५% एल के लिए एक वैकल्पिक पूरक-glutamine, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), ०.१ मिमी बीटा-mercaptoethanol, 1% DMSO, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin (१०० IU/एमएल और १०० µ जी/एमएल में अंतिम सांद्रता), क्रमशः पीटकर DMEM (KO-DMEM) को जोड़ा । शूंय के तहत फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । दो सप्ताह के भीतर प्रयोग करें ।
    7. Hepatocyte विभेदन: Hepatocyte विभेदन मध्यम तैयार करें, जिसमें 1% एक वैकल्पिक अनुपूरक है L-glutamine, 10 µ m hydrocortisone 21-hemisuccinate सोडियम साल्ट (HCC), 1% पेनिसिलिन/streptomycin (अंतिम सांद्रता १०० IU/ १०० µ जी/एमएल, क्रमशः) HepatoZYME माध्यम से जोड़ा गया । 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें । प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के लिए, एचजीएफ और OSM के साथ आवश्यक मात्रा के पूरक (10 एनजी/एमएल और 20 एनजी/एमएल, क्रमशः) में अंतिम सांद्रता ।
  2. 24 एच पोस्ट सीडिंग, ध्यान से एक स्वचालित हाथ से आयोजित इलेक्ट्रॉनिक चैनल पिपेट प्रणाली का उपयोग कर मध्यम निकालें और ताजा अन्तः भड़काना मध्यम के १०० µ एल जोड़ने के १०० एनजी/एमएल Activin एक और ५० एनजी/एमएल Wnt3a के साथ पूरक ।
    नोट: भेदभाव प्रक्रिया शुरू एक बार निश्चित अन्तः माध्यम जोड़ दिया गया है । एक बार सेल सीडिंग अनुकूलित है, सेलुलर भेदभाव सामांय रूप से 24 घंटे के भीतर शुरू की है । सभी मध्यम परिवर्तन एक स्वत: हाथ से आयोजित इलेक्ट्रॉनिक चैनल पिपेट प्रणाली के साथ माध्यम से निकाल कर रहे है और ताजा माध्यम के १०० µ एल वितरण एक मानक ट्यूब के साथ एक स्वचालित तरल हैंडलिंग मशीन का उपयोग कैसेट वितरण जब तक अंयथा निर्दिष्ट. एक स्वचालित हाथ से आयोजित इलेक्ट्रॉनिक चैनल पिपेट प्रणाली एक ९६ अच्छी तरह से सिर के साथ प्रयोग किया जाता था, ३०० µ एल सुझावों का उपयोग । संक्षेप में, ९० µ एल अच्छी तरह से कोशिकाओं के साथ किसी भी संपर्क से बचने से aspirated थे, और यह सेल तनाव को कम करने के लिए मध्यम परिवर्तन के दौरान कोशिकाओं सूखी नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के लिए, अन्तः भेदभाव मध्यम दैनिक तीन दिनों के लिए बदल जाते हैं । यदि भेदभाव मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के लिए किया जाता है, 2 अतिरिक्त Activin एक ही प्रयोग दिन के लिए निश्चित अन्तः चरण का विस्तार ।
  4. निश्चित अन्तः प्रेरण के बाद, hepatoblast विनिर्देश के लिए KSR/DMSO माध्यम के लिए स्विच, और 5 दिनों के लिए हर 2 दिनों के माध्यम बदल जाते हैं ।
    नोट: यदि अच्छी तरह से गैर-संलग्न कोशिकाओं की एक संख्या रहे हैं, अगले माध्यम से बदलने से पहले एक बार कोशिकाओं को धोने के लिए गैर-पूरक KO-DMEM का उपयोग करें. प्रोटोकॉल (5 दिन) के दूसरे चरण की अवधि के कारण, वहां hepatoblast विनिर्देश के अंतिम दिन पर पिछले एक के साथ 3 मध्यम परिवर्तन हो जाएगा ।
  5. hepatoblast विभेद के बाद, hepatocyte परिपक्वता के लिए HepatoZYME माध्यम के लिए स्विच । KSR/DMSO माध्यम को हटाने के बाद पूरक के बिना HepatoZYME के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और HepatoZYME परिपक्वता माध्यम के १०० µ एल जोड़ने के लिए 10 एनजी/एमएल एचजीएफ और 20 एनजी/एमएल OSM के साथ पूरक ।
  6. 7 से 10 दिनों के लिए मध्यम हर ४८ ज बदलें । भेदभाव के 18 दिन में, जीन अभिव्यक्ति और सिप P450 चयापचय गतिविधि का विश्लेषण करके HLCs की विशेषता ।

3. Hepatocyte-रिकॉमबिनेंट Laminins पर विभेदित कोशिकाओं की तरह लक्षण वर्णन

  1. immunostaining का उपयोग hepatocyte-विशिष्ट मार्करों और ध्रुवीकरण मार्करों की अभिव्यक्ति का पता लगाने.
  2. परीक्षण hepatocyte चयापचय समारोह सिप P450 परख के रूप में12से पहले वर्णित का उपयोग कर ।
  3. थाली भिंनता निर्धारित करते हैं, थाली प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या की गिनती ।

4. उच्च प्रवाह Immunocytochemistry और छवि अधिग्रहण

  1. भेदभाव के 18 दिन, कुओं धो 1x DPBS के साथ तीन बार, HLCs 4% paraformaldehyde (पीएफए) के ५० µ एल वितरण द्वारा ठीक है, और 15 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । निर्धारण के बाद, PBST के साथ तीन बार धो (०.१% के बीच) (Ca के बिना2 +/Mg2 +) एक स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर ।
    नोट: इस खंड में सभी बहाकर जब तक अंयथा निर्दिष्ट एक स्वत: प्लेट वॉशर का उपयोग किया जाता है । सभी धुल एक ही प्रोटोकॉल के बाद किया जाता है ।
  2. PBST के १०० µ l को तिरस्कृत करके झिल्ली Permeabilize (बिना सीए2 +/Mg2 +) और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन । अगले, PBST में 10% BSA के १०० µ एल के वितरण और कोमल मिलाते में 1 एच के लिए एक थाली शेखर का उपयोग करके प्रोटीन को अवरुद्ध प्रदर्शन करते हैं । प्रोटीन ब्लॉक करने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त PBST में 1% BSA के ५० µ एल जोड़ें, एक थाली शेखर का उपयोग कर कोमल झटकों के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    नोट: प्रोटीन ब्लॉक और एंटीबॉडी अलावा के बीच धोने मत करो ।
  3. 24 घंटे के बाद, 1x DPBS के साथ तीन बार धो (बिना Ca2 +/Mg2 +) और BSA में 1% PBST के ५० µ एल वितरण द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें । गर्मी अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 एच ।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी गर्मी के बाद, 1x DPBS के साथ 3 बार धो लें । DAPI के साथ DPBS के ५० µ एल जोड़ें (10 µ g/एमएल) और 5 के लिए मशीन-अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट ।
  5. अंत में, DPBS के साथ 3 बार धो और छोड़ १०० में 1x DPBS के µ एल अच्छी तरह से । प्लेट इमेजिंग के लिए तैयार हैं ।
    नोट: प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए इमेजिंग तक ।
  6. एक उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके थाली छवि है, और अच्छी तरह से एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए भर में कई क्षेत्रों का अधिग्रहण । कोलंबस सॉफ्टवेयर (उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण प्रणाली सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके HLCs में विभिन्न मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है ।
    नोट: कोलंबस एक उच्च सामग्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो सेल phenotyping के लिए सेल फॉल्ट विश्लेषण प्रदान करता है । इसी तरह के परिणाम CellProfiler, जैविक22छवियों का मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है ।

Representative Results

कोशिका विभेद एक भ्रूण स्टेम सेल लाइन (H9) का उपयोग किया गया था । अर्द्ध स्वचालित मंच के लिए अंतर और कोशिकाओं (आंकड़ा 1a) की विशेषता का इस्तेमाल किया गया था । एक स्वचालित तरल हैंडलिंग मशीन कोट मैट्रिक्स और बीज एकल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था । सेलुलर भेदभाव शुरू किया गया था जब कोशिकाओं ४०% तक पहुंच प्रवाह (0 दिन) । मीडिया परिवर्तन एक स्वत: हाथ से आयोजित इलेक्ट्रॉनिक चैनल पिपेट प्रणाली का उपयोग करने के लिए मध्यम और तरल हैंडलिंग मशीन मध्यम अतिरिक्त के लिए (1a आंकड़ा) को दूर किया गया । सेल निर्धारण और धुंधला स्वचालित प्लेट वॉशर के साथ संयोजन में स्वत: तरल हैंडलिंग मशीन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । इमेजिंग और ठहराव एक उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली और कोलंबस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया । Cytochrome P450 गतिविधि एक स्थापित परख का उपयोग कर मापा गया था । सब्सट्रेट मशीन के बाद, सेल supernatants काटा गया था, और bioluminescence एक बहुपद्वति microplate रीडर (आंकड़ा 1a) का उपयोग कर दर्ज की गई । इसके अलावा, पारंपरिक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी hepatocyte विभेदन (आंकड़ा 1b) के दौरान कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

18 दिन, कुओं के बीच कोशिका संख्या में परिवर्तनशीलता DAPI धुंधला (चित्रा 2a) के बाद जांच की थी । देखने के सात क्षेत्रों के प्रति अच्छी तरह से और नाभिक quantified (चित्रा 2a) की संख्या पर कब्जा कर लिया गया । हम कुओं के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर का पता लगाया ४१,६६२ ± ३,३६६ कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से (चित्रा बी) के एक औसत के साथ ।

18 दिन में, HLCs तय कर रहे थे और ठेठ hepatocyte मार्करों के लिए दाग (चित्रा 3ए जी) और सिप P450 गतिविधि के लिए परीक्षण किया । HLCs जैसे HNF4α (८९.२% ± 2 सकारात्मक कोशिकाओं), ALB (९२.८% ± 6 सकारात्मक कोशिकाओं), एएफपी (६१.८% ± 2 सकारात्मक कोशिकाओं) के रूप में hepatocyte मार्करों व्यक्त की है । HLCs भी सिप P450 प्रोटीन, CYP2D6 और CYP3A4 व्यक्त की है और ई-Cadherin प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए के रूप में एक अलग बहुभुज उपस्थिति प्रदर्शित । 18 दिन में HLCs सिप P450 गतिविधि मापी गई । HLCs पर CYP1A2 गतिविधि का प्रदर्शन किया २९५,९०६ ± ४५,८२८ RLU/एमएल/मिलीग्राम प्रोटीन और CYP3A १,०६६,११२ ± १७७,४१६ RLU/एमएल/मिलीग्राम प्रोटीन (चित्रा 3H) ।

Figure 1
चित्रा 1:९६ अच्छी तरह से प्रारूप में पीएससी से Hepatocyte भेदभाव । (क). अर्द्ध स्वचालित सेलुलर विभेद, निर्धारण, धुंधला, इमेजिंग और कार्यात्मक गतिविधि के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के आरेख । (ख) एचएलसी विभेद के दौरान सेलुलर आकृति विज्ञान में प्रतिनिधि परिवर्तन. संक्षेप में, पीएससी निश्चित अन्तः की ओर प्रधानमंत्री हैं, hepatoblast विनिर्देशन cobblestone की तरह आकृति विज्ञान और hepatocyte परिपक्वता के लिए कोशिकाओं बहुभुज आकार प्राप्त करने के साथ पहले प्रदर्शित की विशेषता द्वारा पीछा किया । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: अच्छी तरह से अच्छी परिवर्तनशीलता HLCs का आकलन । (एक) DAPI के साथ सना हुआ HLCs के एक ९६ अच्छी तरह से थाली देखने का प्रतिनिधित्व । स्केल बार = 1 mm. (B) प्रति ठहराव कक्ष संख्या । स्तंभों में कुओं के प्रति सेल संख्या का औसत (ऊपर) और पंक्तियों (नीचे), अच्छी तरह से प्रति दृश्य के सात क्षेत्रों से और कोलंबस सॉफ्टवेयर का उपयोग quantified. प्लेट में औसत सेल संख्या ४१,६६२ ± ३,३६६ SEM कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से है । कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद कुओं के बीच मनाया गया । Tukey के पद पर एक-एक कर ANOVA के साथ-साथ हॉक सांख्यिकीय परीक्षण कार्यरत था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:18 दिन में HLCs में Hepatocyte मार्कर अभिव्यक्ति और सिप P450 गतिविधि माप. (क) hepatocyte नाभिकीय कारक 4 अल्फा (HNF4α) अभिव्यक्ति ± SEM का प्रतिशत प्रति अच्छी तरह से देखने के दस क्षेत्रों के साथ तीस कुओं पर आधारित है । (ख) एल्ब्युमिन का प्रतिशत (ALB) अभिव्यक्ति +/SEM, 3 अलग कुओं के प्रति अच्छी तरह से देखने के दस क्षेत्रों के साथ आधारित है । (ग) अल्फा भ्रूणप्रोटीन (एएफपी) के प्रतिशत +/SEM प्रति अच्छी तरह से देखने के दस क्षेत्रों के साथ 3 अलग कुओं पर आधारित है । (घ) ई-cadherin धुंधला । (ङ) CYP2D6 दाग । (च) CYP3A4 दाग । (छ). Immunoglobulin जी (आईजीजी) दाग पर नियंत्रण । स्केल बार = ५० µm. (ज) सिप P450 1A2 और 3 सी चयापचय गतिविधि HLCs में 18 दिन में । डेटा छह जैविक प्रतिकृति + का प्रतिनिधित्व करता है SEM. गतिविधि रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLUs)/mL प्रति 1 मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में उद्धृत किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हमारे अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया कुशल, विश्वसनीय और किफायती है, पैमाने पर HLCs के उत्पादन की अनुमति (चित्रा 1) । प्लेट में कुएँ के बीच की कोशिकाओं की संख्या के मामले में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था, जिससे यह मंच कोशिका आधारित स्क्रीनिंग (चित्रा २) के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण अपनाता है. इसके अलावा, अर्द्ध स्वचालन कार्यप्रवाह उपयोगकर्ता एक बार में बड़ी संख्या में प्लेटों का उत्पादन करने के लिए सक्षम बनाता है, जो मैन्युअल प्रक्रियाओं का उपयोग करने से पहले संभव नहीं था5,12.

महत्वपूर्ण बात, स्वचालन प्रक्रिया भेदभाव पैदावार पर असर नहीं किया, HNF4α (89.2% ± 2) और ALB (92.8% ± 6) (चित्रा 3) व्यक्त कोशिकाओं के बहुमत के साथ । HLCs भी सिप P450 एंजाइमों CYP2D6 और CYP3A4 व्यक्त की और CYP1A2 और CYP3A चयापचय गतिविधि पिछले रिपोर्ट प्रयोगों के तुलनीय (चित्रा 3)5. प्रोटोकॉल के मानकीकरण के बावजूद, कोशिका प्रवाह विभेद से पहले शुद्ध एचएलसी भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, अच्छी तरह से भर में एक अच्छा सेल वितरण सुनिश्चित करने के एक महत्वपूर्ण विचार है (चित्रा 1) । यह सेल लाइन पर निर्भर साबित हो गया है, इसलिए सेल सीडिंग और घनत्व अनुकूलन प्रत्येक सेल लाइन के लिए आवश्यक है स्केल अप करने से पहले ।

अपने वर्तमान रूप में, इस मंच नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए HLCs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, और यह सबसे अधिक संभावना सेल कारखानों और प्रतिक्रिया के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जाएगा । हालांकि, विकसित पद्धति रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और/या दवा repurposing अध्ययन के लिए मानव जिगर कोशिकाओं की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, परख मल्टीप्लेक्सिंग के लिए उत्तरदाई है, यंत्रवत विश्लेषण के लिए multiparametric डेटासेट की पीढ़ी की अनुमति । आगे जा रहे हैं, हम यह भी विश्वास है कि इस तकनीक को इन विट्रो प्रणालियों में और अधिक जटिल 3 डी भेदभाव के रूप में या एक मंच के रूप में एचएलसी phenotype में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता इन विट्रो

अंत में, हम मानते है कि हमारे सरल और अर्द्ध स्वचालित प्रणाली प्रयोगात्मक प्रवाह में वृद्धि, और प्रयोगात्मक भिंनता को कम करने, जिससे जैविक डेटासेट की गुणवत्ता में सुधार होगा और मानव शरीर क्रिया विज्ञान की ओर उनके एक्सट्रपलेशन ।

Disclosures

प्रो डेविड सी घास एक सह संस्थापक और Stemnovate लिमिटेड के निदेशक है ।

प्रो डेविड सी घास HigherSteaks लिमिटेड के एक निदेशक है ।

Acknowledgments

यह काम मुख्य वैज्ञानिक के कार्यालय (टीसीएस/16/37) और एक MRC पीएचडी छात्रवृत्ति से पुरस्कारों के साथ समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405 LS Washer Biotek
B27 supplement Life Technologies 12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
GripTips for VIAFLO 96 Integra 6434
HepatoZYME-SFM Life Technologies   17705021
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermoFisher 5840300
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Standard tube dispensing cassette ThermoFisher 24072670
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette Integra 6001
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1.00496 EMD MILLIPORE
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
DAPI Invitrogen D1306
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Abcam ab3980 1:500 (mouse)
CYP2D6 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
IgG DAKO 1:400
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) Life technologies A-11001 1:400
Anti-sheep 488 (secondary antibody) Life technologies A-11015 1:400
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) Life technologies A-11008 1:400

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References

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