Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

Developmental Biology
 

Summary

Dit protocol beschrijft een semi-automatische aanpak voor de productie van de hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen in de indeling van een 96 goed plaat. Dit proces is snelle en kostenefficiënte, waardoor dat de productie van kwaliteit verzekerd batches van hepatocyte-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast menselijke onderzoek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen vertegenwoordigen een vernieuwbare bron van menselijk weefsel. Ons onderzoek is gericht op het genereren van menselijke leverweefsel van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Huidige differentiatie procedures genereren menselijke hepatocyte-achtige cellen (HLCs) een mengsel van foetale en volwassen eigenschappen weer te geven. Om te verbeteren cel fenotype, hebben we volledig gedefinieerd onze differentiatie-procedure en de cel niche, resulterend in de generatie van cel populaties die verbeterde genexpressie en functie weergegeven. Terwijl deze studies mark vooruitgang, heeft de mogelijkheid om het genereren van grote hoeveelheden multi goed platen voor screening door arbeid intensieve procedures en charges variatie beperkt gebleven. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een semi-geautomatiseerde platform te differentiëren pluripotente stamcellen in HLCs. stam cel zaaien en differentiatie werden uitgevoerd met behulp van liquid handling en automatische pipetting systems in 96-wells-plaat formaat. Naar aanleiding van de differentiatie, cel fenotype werd geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde microscopie en een goed multi-luminometer.

Introduction

Primaire menselijke hepatocyten (PHHs) vertegenwoordigen de huidige standaard voor lever biomedisch onderzoek. Ondanks hun voordelen vertegenwoordigen PHHs een beperkte bron van volwassen hepatocyten met unstable fenotype1. Menselijke embryonale stamcellen (SER's) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn voorgesteld als een krachtige bron voor biomedisch onderzoek, belooft een vernieuwbare bron van menselijk weefsel, met inbegrip van lever2,,3,4 . Huidige hepatocyte differentiatie procedures genereren cellen die uitdrukking geven aan hepatocyte markeringen, genen en functies vergelijkbaar met PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Meer recentelijk heeft het gebruik van bepaalde materialen en matrices zoals recombinante laminins, verbeterde cel fenotype en experimentele reproduceerbaarheid5,12,13,14.

Traditionele cel cultuur technieken afhankelijk sterk zijn van handmatige pipetteren, die is zowel tijdrovend en foutgevoelig. Dit beperkt de doorvoer van de bepaling en de indeling van de plaat men met werken kan. Tot op heden, zijn de meeste studies beschrijven de generatie van HLCs arbeidsintensief in de natuur en dus kleine schaal in grootte15,16,17.

Huidige vooruitgang in liquid handling en pipetting systems, in combinatie met geautomatiseerde microscopie en laboratorium analysers, hebben het mogelijk gemaakt om procedures die de behoefte aan menselijke tussenkomst minimaliseren te ontwikkelen. We hebben geprofiteerd van deze technologieën en een semi-automatische differentiatie systeem waarmee u voor het genereren van grote hoeveelheden van menselijke leverweefsel voor basic ontwikkeld en toegepast biomedisch onderzoek. Deze aanpak kan worden uitgevoerd met zowel menselijke ESC en iPSC lijnen met kleine aanpassingen die nodig zijn, afhankelijk van de cellijn. Dit systeem te combineren met hoge inhoudsanalyse, we laten zien dat HLC fenotypering minder tijdrovend en uitgevoerd op schaal18,19,20,21 kunnen.

Kortom, heeft de automatisering van cel cultuur technieken hierin beschreven geleid tot verbeteringen in betrouwbaarheid, experimentele timemanagement en assay doorvoer.

Protocol

1. het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 96 goed platen voor Hepatocyte differentiatie

Opmerking: Reagentia en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol is opgenomen in tabel 1. Voor dit experiment gebruikte media moet steriel en bij kamertemperatuur voor celkweek. Alle volumes van de reagens/oplossing beschreven in dit deel van het protocol zijn gebaseerd op een enkel putje van een 96-wells-plaat, tenzij anders aangegeven.

  1. Voorbereiden laminin gecoat 96 goed platen.
    1. Ontdooi een flesje van recombinante laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) voor 2 h naar girale bij 4 ° C.
    2. Bereid een 5 µg/mL oplossing door LN-521 verdunnen in ijskoude 1 x Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (met Ca2 +/Mg2 +).
    3. Gebruik een automatische vloeistof dispenser verwerken met een standaard buis toedieningseenheden cassette te voegen 50 µL van de LN-521 oplossing per putje van een 96 goed plaat.
      Opmerking: Alle volume opleidingscyclus worden uitgevoerd met een automatische liquid handling dispenser met een standaard buis cassette verstrekking, tenzij anders aangegeven. Prime de oplossing tot het einde van de cassette verstrekking is bereikt, dan gaat u verder met het afzien. Meerdere 96 goed platen kunnen bereid worden in hetzelfde experiment door de procedure zo vaak als nodig te herhalen.
    4. Incubeer de platen van LN521-coating op 37 °C/5% CO2 gedurende 2 tot 4 uur.
      Opmerking: LN521 beklede platen kunnen worden opgeslagen tot twee weken bij 4 ° C. Houd de platen verzegeld op een vlakke ondergrond om verdamping en besmetting te voorkomen.
  2. Het vereiste aantal vooraf gecoate platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten tot 1 uur opwarmen.
  3. De resterende LN-521 oplossing van het gecoate oppervlak met behulp van een 8-kanaals aspiratie adapter gecombineerd.
    Opmerking: Het is essentieel om te voorkomen dat elk contact met het gecoate oppervlak om te voorkomen dat de aantasting van de coating.
  4. Onmiddellijk Voeg 50 µL per putje van mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer Y27632 en houden van de plaat in de incubator tot cel zaaien op 37 °C/5% CO2.
    Opmerking: De laminin-gecoate putten te drogen niet toegestaan.
  5. Bereid een celsuspensie van 3 x 105 cellen/mL in mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632.
    Opmerking: De seeding dichtheid voor elke cel regel zal optimalisatie nodig.
    1. Gecombineerd het medium van een petrischaal met een ongedifferentieerde cultuur van hPSCs op ongeveer 75% tot 85% confluentie gekweekt op LN-521 zoals eerder beschreven12.
      Opmerking: hPSCs worden gekweekt op LN-521 in mTSER1 met het medium veranderd elke 24 uur per dag, en regelmatig zodra de cellen bij 80% van confluentie als eerder beschreven12gepasseerd.
    2. Wassen van de cellen met 5 mL kamertemperatuur 1 x DPBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) en aspirate de buffer.
    3. Voeg 5 mL 1 x zacht cel dissociatie reagens aan de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 tot 8 minuten voor cel dissociatie.
      Opmerking: Om te stoppen met de reactie, onderzoeken het detachement van de cellen van de matrix onder de Microscoop. De cellen moeten worden gedeeltelijk los van de plaat. Als dat niet het geval is, breiden de incubatie gedurende een extra 1 tot 2 minuten.
    4. Beëindigen van de reactie door de zachte cel dissociatie reagens aspirating en voeg 5 mL van verse mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632 aan de cellen. Gebruik een cel schraper tot opheffing van de cellen uit de matrix en de pipet op en neer met behulp van een P1000 tip meerdere malen te mengen.
    5. Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer gebaseerd op Trypan blauw kleuring uitsluiting methode en voorbereiden van de celsuspensie met vereiste concentraties.
    6. Pipetteer van het gewenste aantal van de cellen in een steriele 15 mL of 50 mL centrifugebuis en draaien de cellen naar beneden door centrifugeren hen bij 115 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Voor een 96 goed plaat, 5 mL van mTeSR1 medium met 3 x 105 cellen/mL is vereist voor de cellijn H9.
    7. De bovendrijvende substantie gecombineerd en zachtjes resuspendeer de pellet cel totdat een homogene oplossing wordt verkregen bij 37 ° C in mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632.
      Opmerking: Het gebruik van ROCK-remmer wordt aanbevolen als het verbetert cel overleving post opnieuw plating.
  6. Voeg 50 µL van de celsuspensie op de 96 goed bord met 50 µL van mTeSR1 met 10 µM ROCK remmer Y27632.
  7. Na het zaaien, terugkeren u de platen naar de cel incubator op 37 °C/5% CO2 gedurende 24 uur om de cellen te koppelen.
  8. Onderzoekt de cellen de volgende dag en ROCK-remmer te trekken zodra de contactpersoon van cel naar cel is vastgesteld. Bij 40% confluentie, overschakelen naar differentiatie medium (figuur 1B).
    Opmerking: Als cel confluentie hoger is dan 40%, de platen zijn niet geschikt voor HLC differentiatie met de cellijn H9.

2. differentiëren hPSCs naar Hepatocyte-achtige cellen in Recombinant Laminins in 96 goed platen

  1. Bereiden de differentiatie medium en groei factoren.
    1. Menselijke Activin A-stockoplossing (100 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van menselijke Activin A poeder in steriele 0,2% bovien serumalbumine (BSA) in PBS. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1, 000.
    2. Muis Wnt3a stockoplossing (10 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van de muis Wnt3a poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:200.
    3. Menselijke hepatocyte groeifactor (HGF) stockoplossing (10 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van menselijke HGF poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1000.
    4. Oncostatin M (OSM) stockoplossing (20 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van het poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1, 000.
    5. Definitieve endoderm: bereiden endoderm differentiatie medium, bestaande uit 2% B27 supplement (50 x, zonder insuline), 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties: 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan het Roswell Park Memorial Instituut 1640 () RPMI 1640) Basaal medium. Bewaren bij 4 ° C en binnen twee weken gebruiken. Bij iedere middelgrote wijziging, aanvulling op het vereiste volume met Activin A en Wnt3a op de eindconcentratie van 100 ng/mL en 50 ng/mL, respectievelijk.
    6. Hepatoblast differentiatie: bereiden van hepatoblast differentiatie medium, bestaande uit 20% knockout serum vervanging (KSR), 0,5% alternatief aanvulling op L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0.1 mM bèta-mercaptoethanol, 1% DMSO en 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties op 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan de knock-out DMEM (KO-DMEM). Filtreer onder drukvermindering door en bewaren bij 4 ° C. Binnen twee weken gebruiken.
    7. Hepatocyte differentiatie: voorbereiden van de hepatocyte differentiatie medium, bestaande uit 1% alternatief aanvulling op L-glutamine, 10 µM hydrocortison 21-hemisuccinate natriumzout (HCC), 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) aan HepatoZYME medium toegevoegd. Slaan de voorraad bij 4 ° C en binnen twee weken gebruiken. Voor elke middelgrote wijziging, aanvulling op het vereiste volume met HGF en OSM (eindconcentraties op 10 ng/mL en 20 ng/mL, respectievelijk).
  2. 24 h post zaaien, zorgvuldig verwijderen van het medium met behulp van een automatische hand-held elektronisch kanaal Pipetteer systeem en voeg 100 µL van verse endoderm-priming medium aangevuld met 100 ng/mL Activin A en 50 ng/mL Wnt3a.
    Opmerking: De differentiatie proces begint zodra het definitieve endoderm medium is toegevoegd. Zodra de cel zaaien is geoptimaliseerd, wordt normaal gesproken de celdifferentiatie gestart binnen de 24u. Alle medium wijzigingen zijn uitgevoerd door het verwijderen van het medium met een systeem van automatische hand-held elektronisch kanaal pipet en verstrekking van 100 µL van verse medium met behulp van een automatische liquid handling dispenser met een standaard tube verstrekking cassette, tenzij anders opgegeven. Een automatische hand-held elektronisch kanaal Pipetteer systeem werd gebruikt met een goed hoofd, met behulp van 300 µL tips 96. In het kort, 90 µL waren aanzuiging van de goed het vermijden van alle contact met de cellen, en het is belangrijk om de cellen niet te droog tijdens middellange verandering cel stress te verminderen.
  3. Voor menselijke embryonale stamcellen (hESCs), wijzigt u het endoderm differentiatie medium dagelijks voor drie dagen. Als de differentiatie wordt uitgevoerd voor menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), verlengen de definitieve endoderm fase 2 extra dagen met behulp van Activin A alleen.
  4. Overschakelen naar KSR/DMSO medium voor hepatoblast specificatie na definitieve endoderm inductie, en wijzig het medium om de 2 dagen voor 5 dagen.
    Opmerking: Als er een aantal niet-ingeschrevenen cellen in de put, gebruiken niet-aangevuld KO-DMEM te wassen de cellen eenmaal vóór de volgende middellange verandering. Als gevolg van de duur van de tweede fase van het protocol (5 dagen), zullen er 3 middelgrote veranderingen met de laatste op de laatste dag van de hepatoblast-specificatie.
  5. Na de hepatoblast differentiatie, overschakelen naar HepatoZYME medium voor hepatocyte rijping. Spoel de cellen een keer met HepatoZYME zonder het supplement na het verwijderen van KSR/DMSO middellange en voeg 100 µL van HepatoZYME rijping medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM.
  6. Wijzig het medium elke 48u voor 7 tot 10 dagen. Op dag 18 van de differentiatie, HLCs wordt gekenmerkt door het analyseren van de genexpressie en CYP P450 metabole activiteit.

3. karakterisering van de Hepatocyte-achtige cellen gedifferentieerd op Recombinant Laminins

  1. De uitdrukking van de hepatocyte-specifieke markers en polarisatie markeringen met behulp van immunokleuring detecteren.
  2. Test hepatocyte metabole functie met behulp van CYP P450 assays zoals beschreven voor12.
  3. Het bepalen van de variatie van de plaat, tellen het totale aantal cellen per putje per plaat.

4. hoge-doorvoer immunocytochemie en beeldacquisitie

  1. Op dag 18 van differentiatie, was de putjes drie keer met 1 x DPBS, los van de HLCs door verstrekking 50 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten. Na de fixatie, wassen drie keer met PBST (0,1% tween) (zonder Ca2 +/Mg2 +) met behulp van een automatische plaat wasmachine.
    Opmerking: Alle wasbeurten in deze sectie worden uitgevoerd met behulp van een automatische plaat wasmachine, tenzij anders aangegeven. Alle wast zijn gedaan naar aanleiding van hetzelfde protocol.
  2. Permeabilize van het membraan door verstrekking 100 µL PBST (zonder Ca2 +/Mg2 +) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens uitvoeren eiwit worden geblokkeerd door verstrekking 100 µL van 10% BSA in PBST en incubeer gedurende 1 h in zacht schudden met behulp van een shaker plaat. Na het eiwit blokkeren, voeg 50 µL van 1% BSA in PBST met de primaire antilichamen, bij 4 ° C na een nacht bebroeden met zacht schudden met behulp van een shaker plaat.
    Opmerking: Niet wassen tussen blok en antilichaam toevoeging van eiwit.
  3. Na 24u, Spoel driemaal met 1 x DPBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) en voeg het secundaire antilichaam door verstrekking 50 µL van 1% BSA in PBST. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Na de incubatie van secundair antilichaam, 3 keer te wassen met 1 x DPBS. Voeg 50 µL van DPBS met de DAPI (10 µg/mL) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  5. Ten slotte, 3 keer wassen met DPBS en laat 100 µL van 1 x DPBS in de put. Platen zijn klaar voor de beeldvorming.
    Opmerking: Platen moeten worden bewaard bij 4 ° C in het donker tot imaging.
  6. Beeld van de plaat met behulp van een high-inhoud imaging systeem, en het verwerven van meerdere velden in de put te verkrijgen van een goede vertegenwoordiging van de put. Kwantificeren van de expressie van de verschillende markers in de HLCs door Columbus software (High-Content Imaging systeem analysesoftware) te gebruiken.
    Opmerking: Columbus is een hoge inhoudsanalyse software, die de analyse van de segmentatie van de cel voor cel fenotypering biedt. Vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt met behulp van CellProfiler, een open-source software voor kwantitatieve analyse van biologische beelden22.

Representative Results

Celdifferentiatie werd uitgevoerd met behulp van een lijn van embryonale stamcellen (H9). De semi-geautomatiseerde platform werd gebruikt om te onderscheiden en karakteriseren van de cellen (figuur 1A). Een automatische liquid handling dispenser gewend was jas matrix en zaad van afzonderlijke cellen. Celdifferentiatie werd ingeleid wanneer de cellen 40% confluentie (dag 0 bereikt). Media wijzigingen werden uitgevoerd met behulp van een automatische hand-held elektronisch kanaal Pipetteer systeem om medium en de liquid handling dispenser voor middellange toevoeging (figuur 1A) te verwijderen. Cel fixatie en kleuring werden uitgevoerd met behulp van de automatische liquid handling dispenser in combinatie met de automatische plaat wasmachine. Beeldvorming en kwantificering werden uitgevoerd met behulp van een high-inhoud imaging systeem en Columbus software. Cytochroom P450-activiteit werd gemeten met behulp van een vastgestelde bepaling. Na incubatie substraat, cel supernatant zijn geoogst en bioluminescentie opgenomen met behulp van een multimode microplate-lezer (figuur 1A). Bovendien, werd conventionele fase contrast microscopie gebruikt voor het meten van de veranderingen in de morfologie van de cel tijdens de hepatocyte differentiatie (figuur 1B).

Op dag 18, werd de variabiliteit in cel getal tussen putten onderzocht na DAPI kleuring (figuur 2A). Zeven gezichtsveld werden gevangen per goed en het aantal kernen gekwantificeerd (figuur 2A). We ontdekt geen statistische verschillen tussen putten met een gemiddelde van 41,662 ±3, 366 cellen per putje (figuur 2B).

Op dag 18, werden HLCs vastgesteld en gekleurd voor typische hepatocyte markeringen (Figuur 3A-G) en getest voor CYP P450-activiteit. HLCs uitgedrukt hepatocyte markeringen zoals HNF4α (89.2% ±2 positieve cellen), ALB (92,8% ±6 positieve cellen), AFP (±2 61,8% positieve cellen). HLCs ook uitgedrukt CYP P450 eiwitten, CYP2D6 en CYP3A4 en een aparte veelhoekige verschijning weergegeven, zoals blijkt uit E-cadherine eiwit expressie. HLCs CYP P450 activiteit werd gemeten op dag 18. HLCs tentoongesteld CYP1A2 activiteit op 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg van eiwit en CYP3A op 1,066,112 ±177, RLU/mL/mg van de 416 van eiwit (Figuur 3 H).

Figure 1
Figuur 1: Hepatocyte differentiatie van PSC's in de 96 goed opmaken. (A). schema van de apparatuur gebruikt voor semi-automatiseren celdifferentiatie, fixatie, kleuring, imaging en functionele activiteit. (B). vertegenwoordiger verandert in cellulaire morfologie tijdens HLC differentiatie. Kort, PSC's worden gevuld naar definitieve endoderm, gevolgd door hepatoblast specificatie gekenmerkt door cellen weergeven geplaveide-achtige morfologie en voorafgaand aan de rijping van de hepatocyte met cellen verwerven veelhoekige-vorm. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: beoordeling van HLCs goed-te-goed variabiliteit. (A) vertegenwoordiging van een 96 plaat goed uitzicht op HLCs gekleurd met DAPI. Schaal bar = 1 mm. (B) kwantificering van celaantal per putje. Gemiddelde van celaantal per wells in kolommen (boven) en rijen (onder), uit zeven velden van weergaven per goed en gekwantificeerde Columbus softwarematig. Gemiddelde cel nummer over de plaat is 41,662 ± 3,366 SEM cellen per putje. Geen statistisch significante verschillen werden waargenomen tussen putten. Een One-way ANOVA met de Tukey post hoc statistische toetsen werkte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Hepatocyte marker expressie en CYP P450 activiteitsmeting in HLCs op dag 18. (A) het percentage van de hepatocyte nucleaire factor 4 alpha (HNF4α) expressie ± SEM is gebaseerd op de dertig putjes met tien gezichtsveld per putje. (B) het percentage van albumine (ALB) meningsuiting +/-SEM, is gebaseerd op 3 aparte putjes met tien gezichtsveld per putje. (C) het percentage van Alfa fetoprotein (AFP) +/-SEM is gebaseerd op 3 aparte putjes met tien gezichtsveld per putje. (D) E-cadherine kleuring. (E) CYP2D6 kleuring. (F) CYP3A4 kleuring. (G). immunoglobuline G (IgG) kleuring van controle. Schaal bar = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 en 3A metabole activiteit in HLCs op dag 18. De gegevens vertegenwoordigt zes biologische repliceert +/-SEM. activiteit wordt genoteerd als relatieve licht eenheden (RLUs) /mL per 1 mg van eiwit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Onze semi-geautomatiseerde procedure is efficiënt, betrouwbaar en zuinig, waardoor de productie van HLCs duurzaame (Figuur 1). Er was niet een significant verschil in termen van het aantal cellen tussen de putjes in de plaat, maken van dit platform een geschikte benadering voor cel-gebaseerde screening (Figuur 2). Bovendien, kan de semi-automatisering-werkstroom de gebruiker voor de productie van grote aantallen platen tegelijk, hetgeen niet mogelijk was voordat u handmatige processen5,12.

Nog belangrijker is, het proces automatisering heeft geen invloed hebben op differentiatie opbrengsten, met de meerderheid van de cellen, uiting van HNF4α (89.2% ±2) en ALB (92,8% ±6) (Figuur 3). HLCs ook uitgedrukt CYP P450 enzymen CYP2D6 en CYP3A4 en CYP1A2 en CYP3A metabole activiteit vergelijkbaar met vorige gemelde experimenten (Figuur 3)5weergegeven. Ondanks de standaardisatie van het protocol is cel confluentie voorafgaand aan de differentiatie essentieel voor zuivere HLC differentiatie. Daarom zorgen voor een goede cel distributie over de put is een belangrijke overweging (Figuur 1). Dit heeft bewezen cellijn afhankelijk worden, daarom cel zaaien en dichtheid optimalisatie is vereist voor elke cel lijn voorafgaand aan schaal-up.

Dit platform is niet geschikt voor de productie van grote hoeveelheden HLCs voor klinische toepassingen in zijn huidige vorm, en dit zal waarschijnlijk worden bereikt door middel van cel fabrieken en bioreactoren. Echter staat de ontwikkelde methodologie voor de snelle generatie van menselijke cellen van de lever ziekte modellering, drug screening en/of drug herbestemming studies. Bovendien, de bepaling is vatbaar voor multiplexing, de generatie van multiparametric datasets mechanistische p.a. toelaat. Doorgaand, wij zijn ook van mening dat deze technologie zou kunnen worden toegepast op complexere in vitro systemen zoals 3D differentiatie of als een platform om HLC fenotype in vitro.

Kortom, wij zijn van mening dat onze eenvoudige en semi-geautomatiseerde systeem zal verhogen van experimentele doorvoer, en verminderen van experimentele variatie, waardoor de kwaliteit van biologische datasets en hun extrapolatie naar de menselijke fysiologie.

Disclosures

Prof. David C. Hay is een mede-oprichter en directeur van Stemnovate Limited.

Prof. David C. Hay is een directeur van HigherSteaks Limited.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund met awards van de Chief Scientist Office (TCS/16/37) en een MRC PhD scholarship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405 LS Washer Biotek
B27 supplement Life Technologies 12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
GripTips for VIAFLO 96 Integra 6434
HepatoZYME-SFM Life Technologies   17705021
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermoFisher 5840300
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Standard tube dispensing cassette ThermoFisher 24072670
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette Integra 6001
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1.00496 EMD MILLIPORE
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
DAPI Invitrogen D1306
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Abcam ab3980 1:500 (mouse)
CYP2D6 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
IgG DAKO 1:400
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) Life technologies A-11001 1:400
Anti-sheep 488 (secondary antibody) Life technologies A-11015 1:400
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) Life technologies A-11008 1:400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62, (1, Supplement), S157-S169 (2015).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 170-182 (2016).
  3. Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5, (6), 764-772 (2016).
  4. Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
  5. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5, (6), 1250-1262 (2015).
  6. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20, (4), 478-489 (2017).
  7. Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16772-16777 (2014).
  8. Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34, (7), 1781-1789 (2013).
  9. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26, (4), 894-902 (2008).
  10. Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9, (1), e86372 (2014).
  11. Chen, Y. -F., Tseng, C. -Y., Wang, H. -W., Kuo, H. -C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55, (4), 1193-1203 (2012).
  12. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
  13. Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1, (4), 322-335 (2013).
  14. Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 86-100 (2016).
  15. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3, (2), 141-148 (2014).
  16. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, (Supplement C), 1-9 (2017).
  17. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120, (9), 3127-3136 (2010).
  18. Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13, (9), 529-546 (2015).
  19. Bray, M. -A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. (2017).
  20. Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
  21. Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12, (2), 201-211 (2017).
  22. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics