Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Cancer Research

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Summary

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l'uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è caratterizzata dall'espansione di cloni di cellule B maligne e rappresenta la leucemia più comune nei paesi occidentali. La maggior parte dei pazienti affetti da LLC Mostra un corso indolent della malattia così come un fenotipo anergic delle loro cellule di leucemia, riferendosi a un recettore delle cellule B non risponde a stimoli esterni. Abbiamo recentemente dimostrato che il fattore di trascrizione NFAT2 è un regolatore cruciale di anergy in CLL. Una sfida importante nell'analisi del ruolo del fattore di trascrizione in diverse malattie è l'identificazione dei suoi geni bersaglio specifico. Questo è di grande importanza per la delucidazione dei meccanismi patogenetici e gli interventi terapeutici potenziali. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA e può, pertanto, essere utilizzato per identificare i geni bersaglio diretto di fattori di trascrizione nelle cellule dei mammiferi. Qui, ChIP è stata usata per identificare LCK come un gene bersaglio diretto di NFAT2 in cellule CLL umane. DNA e proteine associate sono reticolati con formaldeide e successivamente Tosato di sonicazione in frammenti di DNA di circa 200-500 paia di basi (bp). Reticolato frammenti di DNA associati NFAT2 sono quindi selettivamente immunoprecipitata da detriti cellulari usando un anticorpo di αNFAT2. Dopo la purificazione, frammenti di DNA associati vengono rilevati tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Sequenze di DNA con evidente arricchimento rappresentano regioni del genoma che sono mirate per NFAT2 in vivo. Tosatura appropriato del DNA e la selezione dell'anticorpo richiesto sono particolarmente cruciale per la riuscita applicazione di questo metodo. Questo protocollo è ideale per la dimostrazione di interazioni dirette di NFAT2 con geni bersaglio. Il suo limite principale è la difficoltà di impiegare ChIP nelle analisi su larga scala, analizzando i geni bersaglio di più fattori di trascrizione negli organismi intatti.

Introduction

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) rappresenta la leucemia più comune negli adulti nei paesi occidentali, che esibiscono distinto accumulo di CD19, CD23 e CD5 esprimendo maturo B cellule1. Maggior parte dei pazienti mostrano un decorso indolente, che non necessitano di un trattamento specifico per molti anni. Al contrario, alcuni pazienti mostrano progressione rapida che richiedono immediati interventi terapeutici con immunitario-chemioterapia o altre terapie mirate2,3. Fattore nucleare delle cellule di T attivate (NFAT) è una famiglia di fattori di trascrizione che controllano vari inerente allo sviluppo e processi di attivazione in numerose cellule tipi4,5,6. Recentemente abbiamo dimostrato la sovraespressione e attivazione costituzionale di NFAT2 in cellule di CLL da pazienti con malattia indolente7. Qui, regola uno stato non rispondono alla stimolazione del recettore delle cellule B chiamato anergy7. Per dimostrare che NFAT2 si lega al promotore del linfocita specifico proteina tirosina chinasi (LCK) e regola l'espressione di LCK in cellule umane di CLL, un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina specifici (ChIP) è stato sviluppato e impiegato.

ChIP è una delle diverse tecniche per studiare il ruolo dei fattori di trascrizione genica espressione8. Espressione genica è strettamente orchestrato in un modo molto complesso da parecchi regolatori con fattori di trascrizione prendendo una parte insostituibile in questo processo9,10,11,12. Fattori di trascrizione che regolano l'espressione genica in un contesto spaziale e temporale sono state identificate in numerose specie (ad es., per lo sviluppo ed il differenziamento)13,14,15, 16,17,18. Errori nei meccanismi di controllo intricato che coinvolgono fattori di trascrizione possono condurre ad una varietà di processi patologici compreso cancro19,20. Quindi, identificazione dei fattori di trascrizione e i rispettivi obiettivi potrebbe offrire nuove vie terapeutiche21,22. Per studiare questo campo intrigante diversi metodi sono disponibili come ChIP, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA), vari saggi di pull-down di DNA e reporter-saggi8,11,12, 23 , 24.

Per dimostrare che un certo fattore di trascrizione interagisce con regioni specifiche del genoma in vivo ChIP è una tecnica ideale25. Per questo scopo, DNA e proteine associate in cellule viventi sono reticolate mediante irradiazione UV o formaldeide (ChIP con collegamenti incrociati, XChIP). Questo passaggio viene omesso per ottenere migliore DNA e proteina recupero nel cosiddetto nativo ChIP (NChIP)26. I complessi della DNA-proteina sono successivamente tranciati di sonicazione in frammenti di circa 200-500 paia di basi (bp) e immunoprecipitati dai detriti cellulari utilizzando un anticorpo specifico contro il fattore di trascrizione di interesse. I frammenti di DNA associati sono quindi purificati e caratterizzati da PCR, clonazione molecolare e sequenziamento. Tecniche alternative utilizzano microarrays (ChIP-on-Chip) o il sequenziamento di nuova generazione (ChIP-Seq) per analizzare il DNA immunoprecipitato.

ChIP è stato introdotto da Gilmour e Lis nel 1984 quando usati UV luce a legame covalente del DNA cross-link e associato a proteine in vita batteri27. Dopo la lisi cellulare e immunoprecipitazione della RNA polimerasi batterica, sonde specifiche di geni noti sono state usate per mappare la distribuzione in vivo e la densità della RNA polimerasi. Il metodo è stato successivamente utilizzato dai ricercatori stessi per analizzare la distribuzione della polimerasi II del RNA eucariotica su geni di proteina shock termico in Drosophila28. Il dosaggio di XChIP fu ulteriormente perfezionato da Varshavsky e colleghe che usò il formaldeide cross-linking per studiare l'associazione dell'istone H4 con heat shock protein geni29,30. L'approccio di NChIP, che porta il vantaggio di un migliore recupero di DNA e proteine a causa di epitopi naturalmente intatti e, pertanto, una maggiore specificità dell'anticorpo, in primo luogo è stato descritto da Hebbes e colleghi nel 198831.

Il vantaggio del ChIP rispetto ad altre tecniche per analizzare le interazioni della DNA-proteina è, infatti, che l'interazione effettiva di un fattore di trascrizione può essere studiato in vivo e senza sonde o condizioni artificiali create da buffer o gel sono impiegato8,11,12. Combinando il ChIP con sequenziamento di nuova generazione, obiettivi multipli possono essere identificati simultaneamente.

Principali limitazioni di questa tecnica sono sua applicabilità limitata ai saggi su larga scala in organismi intatto25. L'analisi dei pattern di espressione genica differenziale può anche essere impegnativo utilizzando tecniche di ChIP se le rispettive proteine sono espresse solo a livelli bassi o finestra temporale stretto. Un altro fattore potenzialmente limitante è la disponibilità di un anticorpo appropriato adatto per ChIP11.

Il protocollo di ChIP qui presentato possa essere impiegato per l'identificazione in vivo dei geni bersaglio di un fattore di trascrizione mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). In particolare, l'obiettivo era di identificare nuovi target geni di NFAT2 in CLL. ChIP è stato scelto per il suo potenziale per dimostrare direttamente l'associazione di NFAT2 per le regioni promotrici dei geni bersaglio diverse condizioni naturali in cellule umane del paziente di CLL.

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Protocol

Tutti gli esperimenti condotti con materiale umano sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Tübingen e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno contribuito campioni a questo studio.

1. isolamento e stimolazione di Jurkat cellule

Nota: Per ottimizzare il protocollo, utilizzare la linea cellulare Jurkat che è noto che esprimono alti livelli di NFAT2. Tutti i passaggi sono eseguiti sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare 50 mL di RPMI 1640, completato con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina da riscaldandola a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Per 1-2 d in un matraccio di cultura cellulare a 37 ° C e 5% di CO2 in 20 mL di RPMI 1640 completati con 10% di FCS e 1% di penicillina/streptomicina ad una densità di circa 2 x 106 cellule/mL della coltura le cellule Jurkat (celle vengono conteggiate con Trypan blu colorazione e un Camera di Neubauer al microscopio) e raccoglierle mediante centrifugazione per 5 min a 200 x g.
  3. Rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI 1640 completati con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina. Successivamente, contare le celle con una colorazione blu di trypan convenzionale e una camera di Neubauer sotto il microscopio.
  4. Centrifugare le cellule dal passaggio 1.3 per 5 min a 200 x g ed eliminare il surnatante tramite aspirazione. Quindi, risospendere le cellule ad una densità di 2 x 107 cellule/mL in RPMI 1640 completati con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina e trasferire 1 mL in un nuovo tubo 5ml convenzionale di pipettaggio.
  5. Stimolano le cellule aggiungendo 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e ionomicina 1 µM. Incubare le cellule per 16 h a 37 ° C e 5% di CO2 con il coperchio del tubo aperto (per evitare la contaminazione, può essere utilizzata una pellicola sigillante permeabile all'aria).

2. isolamento e stimolazione delle cellule CLL primarie da pazienti umani

Nota: I campioni dei pazienti erano acquistati e stimolati come descritto in precedenza7. Tutti i passaggi sono eseguiti sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare l'attrezzatura necessaria per prelevare il sangue dai pazienti ed eseguire una separazione di gradienti di densità: aghi 21G, laccio emostatico, NH4-eparina-sangue siringhe di raccolta (ad es., S-monovettes), 1x PBS e medio gradiente di densità (densità 1,077 g/mL) .
  2. Al momento del prelievo venoso, prelevare il sangue da pazienti affetti da LLC (ca. 40 mL di sangue per paziente) nelle siringhe. Quindi trasferire il sangue in provette coniche da 50 mL. Lavare la siringa con 10 mL di PBS e piscina il sangue-PBS-sospensione nei tubi 50 mL (regolare il numero di tubi per il volume di sangue).
  3. Preparare 15 mL di terreno densità gradiente in un tubo conico di fresca 50 mL. Successivamente, strato 35 mL di sangue-PBS-sospensione attentamente sul supporto di gradienti di densità. A tal fine, tenere il tubo ad angolo piatto e pipettare lentamente il sangue-PBS-sospensione contro la parete di fondo della provetta conica 50 mL. Come più di sangue-PBS-sospensione sta accumulandosi nella provetta conica da 50 mL, aumentare l'angolo del tubo fino a un angolo retto. Ripetere questo passaggio in base al volume di sangue-PBS-sospensione.
  4. Eseguire centrifugazione a 560 x g per 20 min (senza freno), quindi estrarre la fase delle cellule mononucleari che contiene le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs). A tale scopo, raccogliere l'interfase bianco della separazione gradienti di densità con una pipetta sierologica di 5ml e trasferirlo in una nuova provetta conica 50 mL.
  5. Riempire la sospensione cellulare a 50 mL con PBS e centrifugare per 5 min a 360 x g. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Ripetere questo passaggio con centrifugazione per 5 min a 275 x g. Quindi, piscina le cellule di un paziente in 5-10 mL di PBS in una provetta conica da 50 mL.
  6. Contare le celle come descritto al punto 1.3.
    Nota: Dipende la proporzione di cellule CLL nei PBMCs isolato, se le cellule possono essere usate direttamente per questa procedura o un isolamento delle cellule di B deve essere condotta, per esempio, via magnetico cella ordinamento (MACS). L'isolamento delle cellule di B è consigliata ma può essere omesso se la proporzione di cellule CLL è superiore al 95% dei linfociti totali (determinati tramite citometria a flusso). Pazienti di sangue di CLL è fisso e lisate secondo le istruzioni del produttore. Una colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE viene eseguita secondo le istruzioni del produttore, quindi le cellule vengono analizzate tramite flusso cytometry. Un paziente esemplare è illustrato nella Figura 1, in cui la proporzione di cellule CLL è 89.03%. Così, un isolamento delle cellule di B deve essere effettuato in questo paziente. La proporzione di cellule B fisiologiche è trascurabile (3,72% nell'esempio).
  7. Lavare le cellule con 10 mL di pre-riscaldato (37 ° C) RPMI 1640 completati con 10% FCS, 1% di penicillina/streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 100 mM, 1 mM sodio piruvato e 50mm β-mercaptoetanolo per 5 min a 200 x g ed eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  8. Regolare le cellule a 2 x 107 cellule/mL in RPMI 1640 completati con 10% FCS, 1% di penicillina/streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 100 mM, 1 mM sodio piruvato e 50mm β-mercaptoetanolo (37 ° C) e riempimento 1 mL di sospensione cellulare in una provetta da 5 mL.
    Nota: La ß-mercaptoetanolo è impiegato per contrastare lo stress ossidativo.
  9. Stimolano le cellule aggiungendo 32,4 nM PMA e ionomicina 1 µM. Incubare le cellule per 16 h a 37 ° C e 5% di CO2 con il coperchio del tubo aperto (per evitare la contaminazione, può essere utilizzata una pellicola sigillante permeabile all'aria).
    Nota: Per ridurre il livello di stress le cellule possano essere riposate per 1h a 37 ° C e 5% di CO2 nell'incubatrice prima la 16h di stimolazione.

3. fissazione, lisi cellulare e cromatina tosatura

Nota: Campioni dei pazienti e cellule Jurkat sono fissi e lisate con un kit disponibile in commercio ChIP secondo le istruzioni del produttore con le modifiche come descritto in precedenza7. La fissazione avviene sotto cappa a flusso laminare.

  1. Preparare una provetta da 1,5 mL con 1 mL di formaldeide al 37%, una provetta da 1,5 mL con 1 mL di 1,25 M glicina, una provetta da 5 mL con 4 mL di 1X PBS e una scatola con ghiaccio per la fissazione delle cellule.
  2. Dopo stimolazione delle cellule per il tempo di incubazione rispettivi nel passaggio 1.5 o 2.9, spin le provette da 5 mL a 200 x g per 5 min e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS nei tubi da 5 mL.
  3. Aggiungere 340 formaldeide µM (13,5 µ l di formaldeide al 37%) per le cellule. Dopo la breve miscelazione pipettando attentamente su e giù Incubare la sospensione per 2,5 min (cellule Jurkat) o a 5 min (campione) a temperatura ambiente.
    Nota: Fissazione prolungata tempo è necessario per cellule primarie assicurare il taglio ottimale.
  4. Aggiungere glicina 125 mM (57 µ l di 1,25 M glicina) per arrestare la fissazione e incubare per un altro 5 minuti mettere le celle su ghiaccio subito dopo e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  5. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ghiacciata a 200 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
    Nota: Dopo la fissazione, il protocollo può essere sospesa. Celle fisse devono essere conservate a-80 ° C. Per verificare, se l'epitopo dell'anticorpo destinato a utilizzare nel seguente protocollo non è mascherato tramite la fissazione, i campioni supplementari possono essere utilizzati per l'analisi tramite l'elettroforesi del gel di SDS-PAGE e Western blot. Questi passaggi vengono eseguiti con 100 µ g di proteina secondo le istruzioni del produttore. Tutti gli anticorpi di αNFAT2 sono utilizzati ad una diluizione di 1: 1000, l'anticorpo GAPDH ad una diluizione di 1: 10000. Un'immagine esemplare di campioni fissati dalle cellule Jurkat con anticorpi opportuno e inopportuno è illustrata nella Figura 2.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi commercialmente disponibile 1 pipettando su e giù. Posizionare i campioni sul ghiaccio in uno shaker, quindi li Incubare per 10 minuti agitando.
    Nota: Prima della lisi, le cellule possono essere disintegrate per 10 s in azoto liquido. Ciò è utile per le cellule Jurkat ma deve essere evitato nei campioni primari. Per la disintegrazione, posizionare le provette da 5 mL per 5 s in 5-10 mL di azoto liquido in un contenitore specifico. Indossare occhiali e guanti di sicurezza adeguati.
  7. Successivamente, centrifugare le provette a 500 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con attenzione di pipettaggio.
  8. Omogeneizzare le cellule in 5 mL di tampone di lisi commercialmente disponibili 2 pipettando su e giù e incubare per 10 minuti in ghiaccio mentre si stringono. Centrifugare le provette a 500 x g per 5 min a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante con attenzione di pipettaggio.
  9. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l (cellule Jurkat) o 140 µ l (campioni) di tosatura tampone 1 contenente 1 x inibitore della proteasi (5 µ l o 1,4 µ l, rispettivamente) ed incubare la miscela per 10 minuti in ghiaccio.
  10. Per la cromatina tosatura, trasportare 140 µ l della sospensione delle cellule dal passaggio 3.9 nelle provette di sonicatore (evitare la produzione di bolle d'aria e ripetere questo passaggio se necessario a causa del volume di campione). Posizionare i tubi in ultra-sonicatore mirato ad una temperatura di 7 ° C e taglio per 10 min (linea cellulare) o 7,5 min (campioni) con una potenza media di incidente di 9,375 W per ottenere frammenti di DNA di 200-500 bp.
  11. Infine, centrifugare a 15700 x g per 10 min a 4 ° C nella piccola centrifuga e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
  12. Per verificare le dimensioni del frammento appropriato, è necessario analizzare 20 µ l della cromatina tranciata tramite elettroforesi in gel di agarosio 1.5% TBE. Un'immagine esemplare della cromatina tranciata da cellule Jurkat di qualità buone e cattive è illustrata nella Figura 3. A questo punto, il protocollo può essere potenzialmente messo in pausa. Tranciate cromatina deve essere conservata a-80 ° C.

4. immunoprecipitazione della cromatina

Nota: L'immunoprecipitazione della cromatina è stato effettuato con un kit disponibile in commercio ChIP secondo le istruzioni del produttore con modifiche7.

  1. Calcolare il numero di immunoprecipitazione (70 µ l (cellule Jurkat) o 15 µ l (campioni) di cromatina tranciata plus un anticorpo) e preparare 20 µ l di proteina A rivestito perline per precipitazione in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle in 40 µ l di 1 x ChIP tampone 1 per precipitazione pipettando su e giù, lasciare le perline riposare in un rack magnetico per 1 min e rimuovere il surnatante pipettando. Eseguire questo passaggio quattro volte in totale. Alla fine, risospendere le perle del volume originale con tampone ChIP 1x 1.
  2. Per immunoprecipitazione in sé, è possibile utilizzare 10 µ g dell'anticorpo αNFAT2 (7A6) per acquisire NFAT2 con relative sequenze di destinazione associata. Utilizzare 2,5 µ g di un anticorpo di IgG di coniglio (DA1E) come un controllo di IgG. Preparare le reazioni in provette fresco 1,5 mL come indicato nella tabella 1.
    Nota: È importante utilizzare un anticorpo monoclonale con alta affinità cui epitopo non è mascherato durante la fissazione per questo protocollo. Gli anticorpi policlonali di introducono un ulteriore livello di variazione che lo rende molto più difficile da interpretare in modo appropriato i risultati ricevuti.
  3. Incubare la miscela dalla fase 4.2 durante la notte a 4 ° C su una ruota rotante a 6 giri/min.
  4. Il prossimo giorno girare le provette per 5 s a 7.000 x g nella piccola centrifuga, li Incubare in un rack magnetico per 1 min ed eliminare il surnatante tramite aspirazione. Lavare le perle una volta con ciascuno dei buffer di lavaggio 1, 2, 3 e 4 consecutivamente.
  5. A tale scopo, risospendere le sfere in 350 µ l di tampone di lavaggio e li Incubare per 5 min a 4 ° C su una ruota rotante a 6 giri/min.
  6. Da allora in poi, girare i tubi per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola. Poi, li posto per 1 min in un rack magnetico, rimuovere il supernatante e aggiungere il tampone di lavaggio successivo.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, eliminare il surnatante pipettando, prendere le perle in 100 µ l di tampone di eluizione 1 e li Incubare 30 min su una ruota rotante a 6 giri/min.
  8. Girare i tubi poco (5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga) e metterli in un rack magnetico per 1 min.
  9. Quindi trasferire il surnatante pipettando in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 4 µ l di tampone di eluizione 2.
  10. Per creare il controllo di input, mescolare 1 µ l della cromatina tranciata con 99 µ l di eluizione buffer 1 e 4 µ l di tampone di eluizione 2 (in questa configurazione, ci sono tre tubi al paziente: un ingresso di controllo, un IgG-Controllo e un campione di αNFAT2).
  11. Incubare i campioni per 4 h a 65 ° C e 1300 giri/min in uno shaker di tubo da 1,5 mL. Aggiungere 100 µ l di 100% isopropanolo, vortice e spin i campioni per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola.
  12. Risospendere le microsfere magnetiche disponibili accuratamente nel Vortex, aggiungere 10 µ l di perline per ogni campione e incubare per 1 h a temperatura ambiente su una rotella di rotazione a 6 giri/min.
  13. Dopo l'incubazione, girare le provette per 5 s a 7000 x g nel piccolo centrifugare e li posto per 1 min in un rack magnetico. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
  14. Risospendere le sfere in 100 µ l di tampone di lavaggio 1. Invertire i tubi per miscelare e incubare per 5 min a temperatura ambiente su una rotella di rotazione a 6 giri/min.
  15. Girare i tubi per 5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga, li posto per 1 min in un rack magnetico e rimuovere il surnatante di pipettaggio. Ripetere i passaggi 4.13-4.14 con tampone di lavaggio 2.
  16. Successivamente, rimuovere il tampone di lavaggio dall'aspirazione, risospendere le sfere in 55 µ l di tampone di eluizione e incubare per 15 min a temperatura ambiente sulla ruota rotante a 6 giri per eluire il DNA precipitato. Infine, girare le provette per 5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga, li posto per 1 min in un rack magnetico e trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 mL.
    Nota: Qui il protocollo può essere potenzialmente messo in pausa. Il DNA eluito quindi deve essere conservato a-20 ° C.

5. rilevazione dei geni bersaglio NFAT in cellule di CLL.

  1. Condurre la reazione di qRT-PCR in duplicato per ogni campione come indicato nella tabella 2.
    Nota: Per la rilevazione dei geni target di un Real-Time PCR quantitativa (qRT-PCR) è condotto utilizzando un Mix di commercialmente disponibile qRT-PCR con uno strumento di Real-Time PCR.
  2. Utilizzare bianco 96 pozzetti reazione piastre per le reazioni e lo strumento di RT-PCR. Le condizioni in bicicletta sono come segue: 95 ° C per 30 s, [95 ° C per 5 s, 60 ° C per 30 s] x 40 cicli.
    Nota: Una diluizione seriale dell'input (puro o diluito 01:10, 1: 100 e 1: 1000 in acqua priva di nucleasi) viene utilizzata per calcolare il relativo arricchimento. In cellule Jurkat, IL-2 è stato usato come un controllo positivo32. CD40L, una destinazione ben nota di NFAT2 in cellule di B, è stato utilizzato come controllo positivo nelle cellule CLL e LCK come esempio per un gene di nuovi target di NFAT2 in CLL33,34. I primers per la regione del promotore CD40L, il -2 e LCK sono descritti nella tabella di reagenti specifici e attrezzature.

6. normalizzazione e analisi dei dati

Nota: Relativo arricchimento per le regioni promotrici di interesse (il-2, CD40L o LCK) viene calcolato utilizzando il controllo di IgG per la normalizzazione.

  1. In primo luogo, determinare i valori di Ct (ciclo soglia) per la diluizione seriale input, IL-2, CD40L e regione del promotore LCK tramite il software di valutazione dai dati qRT-PCR.
  2. Definire una curva standard per le concentrazioni tramite la diluizione seriale dell'input. Con questa curva standard calcolare la concentrazione per il IL-2, CD40L e regione del promotore LCK per ogni duplicato di ogni campione.
  3. Successivamente, calcolare la media dei duplicati. Quindi, impostare il campione di immunoprecipitazione di IgG come riferimento. Definire il relativo arricchimento di questo esempio come 1.0 e confronta l'altro campione (dall'immunoprecipitazione di NFAT2) a questo riferimento.
  4. Infine, è possibile calcolare l'arricchimento relativo dividendo la concentrazione dei campioni dalla concentrazione del riferimento IgG.

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Representative Results

La figura 1 Mostra un'analisi di citometria a flusso esemplare di un paziente CLL eseguita dopo colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a Mostra il gating dei linfociti, che rappresentano la maggioranza delle cellule nel sangue di pazienti affetti da LLC. Figura 1b Mostra la proporzione del CD19+/CD5+ CLL cellule, che rappresentano 89.03% dei linfociti in questo esempio. La proporzione di CD19+/CD5 cellule di B di è 3,72% nel rispettivo paziente.

Nella figura 2 vengono illustrati esempi di prestazioni dell'anticorpo in cellule Jurkat fissate per periodi di tempo diversi, come valutato da SDS-PAGE e Western Blot. Sono stati analizzati diversi anticorpi da produttori diversi. La figura 2a Mostra le prestazioni del αNFAT2-anticorpo (clone 7A6) di diversi produttori rilevati con un anticorpo di anti-topo verde fluorescente. L'anticorpo del produttore 1 ha mostrato associazione a suo epitopo senza fissazione (fascia A) e anche quando le cellule Jurkat fissate per min 2,5 o 5 min (banda B o C, rispettivamente). il αNFAT2-anticorpo (clone 7A6) del produttore 2, d'altra parte, ha mostrato una performance più debole anche in cellule Jurkat non fissa (gruppo D). Al momento di fissazione, l'anticorpo di questo produttore ha raggiunto risultati ancora più debole (bande E (2,5 min fissazione) e F (5min fissazione)). Figura 2b Mostra l'andamento del αNFAT2-anticorpo (clone D15F1) da un altro produttore rilevato con un anticorpo di anti-coniglio rosso fluorescente. Questo anticorpo anche debolmente a campioni non fissati (fascia A) e l'assenza di una banda indica il mascheramento del suo epitopo di fissazione (bande B (min 2,5 fissazione) e C (5 min fissazione)).

Nella figura 3 vengono illustrati esempi di cromatina tranciata da cellule Jurkat ottenute dopo diversa fissazione e tosatura volte di buona e di scarsa qualità, come valutato da elettroforesi del gel. Bande A e B (0 min fissazione o fissazione 2,5 min, rispettivamente) Visualizza buona qualità Tosato della cromatina, che è caratterizzata da una dimensione del frammento di DNA di 200-500 bp, che può essere rilevato su un gel di agarosio come uno striscio tipico. Tranciate cromatina di scarsa qualità, d'altra parte, può essere riconosciuta dalla quasi completa o completa assenza dello striscio di DNA previsto (banda C), come pure una sbavatura in un più grande o più piccolo di intervallo di grandezza del frammento previsto (bande D-F). La completa assenza dello striscio indica l'utilizzo di quantità insufficienti di materiale di partenza. La rilevazione di DNA più piccolo frammenti suggerimenti per eccessivo DNA tosatura (band E) mentre più grande suggerimento di frammenti DNA per tosatura insufficiente.

La figura 4 Mostra i risultati di un tipico esperimento con cellule Jurkat. LCK è stato analizzato come un potenziale target di NFAT2. IL-2 che è un gene target ben definito di NFAT2 in cellule di T è stato utilizzato come controllo positivo. Un anticorpo di IgG-controllo è stato utilizzato per la normalizzazione. Figura 4a Mostra un esperimento con ottimi risultati documentati da arricchimento significativo del controllo positivo IL-2 . Da questo esperimento, si può concludere che esiste un arricchimento significativo di LCK sequenze del DNA precipitato dimostrando che LCK è un bersaglio diretto di NFAT2 in cellule di Jurkat. Figura 4b Mostra un esperimento effettuato con scarsa qualità del DNA dovuto mancanza di fissazione o una procedura di taglio suboptimale causando un basso grado di arricchimento nel controllo positivo IL-2 .

La figura 5 Mostra i risultati di un esperimento effettuato con cellule CLL umane primarie. CD40L , che è una destinazione nota NFAT2 in cellule di B servito come controllo positivo e LCK è stato analizzato come destinazione sperimentale. Figura 5a Mostra un esperimento con un notevole livello di arricchimento di CD40L del DNA nel controllo positivo. Dall'arricchimento ancora più forte di LCK DNA, potrebbe essere concluso che LCK è anche un obiettivo diretto di NFAT2 in cellule CLL umane primarie. Figura 5b Mostra un esperimento eseguito con scarsa qualità del DNA molto probabilmente a causa di inadeguata tosatura. Nessuna sostanza arricchimento di CD40L DNA potrebbe essere rilevato nel controllo positivo i dati sperimentali di rendering senza senso.

Figure 1
Figura 1: analisi di citometria a flusso esemplare dei pazienti CLL. (a) campioni di pazienti affetti da LLC sono stati analizzati tramite flusso cytometry dopo colorazione con anticorpi CD19-FITC e CD5-PE e linfociti erano gated. (b) successivamente, la proporzione di CD19+/CD5+ CLL cellule e CD19+/CD5 le cellule di B sono state determinate. Qui, CD19+/CD5+ CLL cellule 89.03% di linfociti, mentre CD19+/CD5 B cellule rappresentano 3,72% dei linfociti. Viene mostrato un paziente esemplare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: esempi di prestazioni di anticorpo in cellule Jurkat fisse valutato da SDS-PAGE e Western-Blot. (a) cellule Jurkat sono state fissate per 0 min (gruppi A e D), 2,5 min (bande B ed E), o 5 min (C e F) e l'anticorpo αNFAT2 (clone 7A6) di diversi produttori (bande A-C = Produttore 1, bande D-F = 2) è stato confrontato produttore. L'anticorpo del produttore 1 ha mostrato una migliore performance complessiva, associazione con la maggiore affinità anche per campioni fissati (confrontare A-C e bande D-F). (b) la αNFAT2-anticorpo (clone D15F1) da un altro produttore è stato utilizzato. Questo anticorpo ha mostrato solo una prestazione scadente in campioni non fissati (fascia A) e l'epitopo è stato mascherato al momento di fissazione. Di conseguenza, nessun legame dell'anticorpo potrebbe essere rilevato dopo la fissazione (bande B e C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: esempi di cromatina di buona e scarsa qualità di taglio dalle cellule Jurkat valutati mediante elettroforesi in gel. Le cellule Jurkat erano fissi e tosate per periodi di tempo diversi. La fissazione è stato fatto per 0 min (gruppi A e D), 2,5 min (bande B ed E), o 5 min (C e F). Tosatura è stato effettuato per 10 min (bande A-C) o 20 min (bande D-F). Cromatina di buona qualità di taglio è caratterizzata da una dimensione del frammento di DNA di 200-500 bp, che può essere rilevata come una sbavatura nella rispettiva regione (bande A e B). Cromatina di scarsa qualità può essere riconosciuta che sia da un'assenza quasi completa o completa del DNA striscio a causa di una quantità insufficiente del materiale utilizzato (banda C) base o di uno striscio in una regione di dimensioni più piccole o più grandi a causa taglio condizioni inappropriato ( bande di D-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ChIP di cellule Jurkat valutati mediante qRT-PCR. (a) NFAT2 si lega al LCK e il promotore di IL-2 in cellule di Jurkat. Il relativo arricchimento di LCK e il-2 regioni promotore precipitato con l'anticorpo NFAT2 è indicato come analizzato tramite qRT-PCR. Tre ChIP-esperimenti indipendenti sono mostrati come media ± SEM (test t di Student, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0,001). (b) DNA da campioni con scarsa qualità Tosato cromatina è stato usato. Non vincolanti di NFAT2 alle sequenze di destinazione potrebbero essere rilevato. Un quadro simile può essere rilevato se non c'era nessuna fissazione o il tempo di incubazione con l'anticorpo NFAT2 era insufficiente. Tre ChIP-esperimenti indipendenti sono mostrati come media ± SEM (test t di Student, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: ChIP di cellule CLL umane primarie valutate mediante qRT-PCR. (a) NFAT2 si lega specificamente ai promotori LCK e CD40L in cellule CLL umane primarie da pazienti con un corso indolent della malattia. Il diagramma mostra il relativo arricchimento di regioni promotrici LCK e CD40L precipitato con l'anticorpo NFAT2 come analizzato tramite qRT-PCR. Tre ChIP-esperimenti indipendenti sono mostrati come media ± SEM (test t di Student, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0,001). (b) DNA da campioni di pazienti con scarsa qualità Tosato cromatina è stato usato. Nessuna associazione di NFAT2 per le sequenze di rispettiva destinazione potrebbe essere osservata. Tre ChIP-esperimenti indipendenti sono mostrati come media ± SEM (test t di Student, * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0,001) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

elemento volume (µ l) per ogni IP
5% BSA 6
100 x inibitore della proteasi 3
ChIP buffer 1 5x 56
cromatina tranciata x (15 µ l o 70 µ l)
Proteina A rivestito biglie magnetiche 20
Acqua di grado di chIP seq 185-x-y
anticorpo (IgG-controllo o αNFAT2) y (1,09 µ l o 1 µ l)
totale 270

Tabella 1: pianificazione per pipettaggio l'immunoprecipitazione della cromatina. L'immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita elaborando le reazioni, come indicato nella tabella.

elemento volume (µ l) per ogni qRT-PCR
immunoprecipitated DNA 9
qRT-PCR Mix 10
primer in avanti (LCK/CD40L/IL-2) 0,5
Primer reverse (LCK/CD40L/IL-2) 0,5
totale 20

Tabella 2: pianificazione per pipettaggio qRT-PCR. La qRT-PCR è stata effettuata preparando le reazioni, come indicato nella tabella.

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Discussion

I passaggi critici di esecuzione di un test di ChIP successo sono la selezione di un anticorpo appropriato e l'ottimizzazione della cromatina tosatura processo25. La selezione dell'anticorpo αNFAT2 ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo durante lo sviluppo del presente protocollo. Mentre ci sono parecchi anticorpi αNFAT2 disponibili in commercio e la maggior parte di questi funziona bene per macchiarsi occidentale e altre applicazioni, clone 7A6 era l'unico anticorpo che potrebbe essere utilizzato con successo per ChIP7. Anche presumibilmente identica 7A6 anticorpi da diversi produttori hanno esibito differenze significative rispetto alle loro prestazioni in ChIP. Una sfida importante è la rottura potenziale degli epitopi di proteine bersaglio tramite il processo di fissazione utilizzato in XChIP protocolli25.

La cromatina tosatura procedura è anche fondamentale per l'acquisizione di risultati appropriati in XChIP. Una dimensione del frammento di 200-500 bp come valutata tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi è stata trovata per essere ottimale in questo ChIP NFAT2 protocollo7. Condizioni inadeguate di taglio con conseguente carenza di DNA a partire materiale o frammenti di DNA di dimensioni maggiori o minori in genere portano a risultati non ottimali durante l'esecuzione di questo test. Tosatura suboptimale inoltre è stato osservato quando si utilizza congelato e rethawed PBMCs. quindi, scongelamento di PBMCs ha provocato una minore resa di DNA dalle cellule come pure un aumento eccessivo di tosatura dei frammenti di DNA.

La disponibilità di una vasta gamma di kit di ChIP e ChIP-grado anticorpi è impegnativo, ma offre anche la possibilità di utilizzare la tecnica in un contesto ampio. Così, una diversità di fattori di trascrizione possa essere studiata in diversi tipi cellulari. Ad esempio, altri membri della famiglia NFAT (NFAT1 e NFAT4) sono state studiate recentemente utilizzando ChIP35,36,37.

Il kit di ChIP usato qui doveva anche essere modificato per soddisfare le nostre esigenze. In primo luogo, il tempo di fissazione è stato adeguato per evitare il mascheramento dell'epitopo riconosciuto dall'anticorpo usato e per consentire di taglio ottimale. Il volume di buffer utilizzati per lisi e tosatura è stato anche modificato per ridurre la perdita di cellule durante le fasi differenti di lavaggio. Inoltre, le condizioni di taglio sono state ottimizzate per ottenere frammenti di DNA nel range di 200-500 bp. L'inibitore di proteasi e l'anticorpo di IgG-controllo sono stati scambiati con altri reagenti disponibili in commercio, come hanno dimostrato di essere comparabili e più conveniente. Il passo che coinvolgono il vettore fornito dal produttore è stato omesso come esso ha interferito con la precipitazione del DNA. Alla fine, la quantità di buffer utilizzato per eluire il DNA è stata adattata per produrre un volume sufficiente per essere utilizzato in qRT-PCR.

Ci sono diversi altri kit disponibili da varie aziende e c'è anche la possibilità di effettuare il ChIP senza un kit. Tuttavia, test e stabilimento sono molto impegnativi, come ci sono molti fattori da considerare, come la compatibilità delle cellule analizzate e proteine con differente fissazione e metodi di taglio. Il kit accennato era utilizzato come fosse ben consolidata nel nostro laboratorio.

Una limitazione importante di questo metodo è sua applicabilità limitata alle indagini su larga scala in organismi modello intatto perché gli anticorpi adatti devono essere identificati o generati per ogni fattore di trascrizione individuali. L'analisi dei geni che sono espressi solo a bassi livelli, in un piccolo numero di cellule o durante un intervallo di tempo limitato può essere difficile anche utilizzando ChIP.

Mentre ChIP è il gold standard per dimostrare un'interazione diretta del fattore di trascrizione specifico con suoi geni bersaglio rispettivi in cellule eucariotiche intatte25, c'è un numero di altre tecniche per studiare un'interazione tra proteine e DNA . EMSA è un metodo utile per rilevare le proteine che legano il DNA basso-abbondanza in cella lystates24. Può anche essere utilizzato per caratterizzare l'affinità di legame di una particolare proteina attraverso una sistematica analisi mutational di sonda di DNA. Dei principali vantaggi dell'EMSA rispetto al ChIP è il fatto che è generalmente sostanzialmente meno dispendio di tempo stabilire il dosaggio rispettivo. Saggi di pull-down di DNA, micropiastre cattura e rilevamento saggi e saggi di reporter sono altre tecniche per l'analisi di interazioni proteina-DNA23.

Gli sviluppi più recenti hanno permesso di applicare l'analisi del ChIP ad approcci di genoma tramite la sua combinazione con microarray tecnologia (ChIP-on-chip)38,39,40 o sequenziamento di nuova generazione (ChIP-Seq )41,42,43.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal DFG concedere MU 3340/1-1 e la Deutsche Krebshilfe concedere 111134 (sia assegnato a lollo). Ringraziamo Elke Malenke per l'eccellente assistenza tecnica).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

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