Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Cancer Research

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Summary

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

Leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la expansión de clones de células B malignas y representa la leucemia más común en los países occidentales. La mayoría de los pacientes CLL muestra un curso indolente de la enfermedad, así como un fenotipo anérgico de sus células de la leucemia, refiriéndose a un receptor de la célula de B no responde al estímulo externo. Recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción NFAT2 es un regulador crucial de anergia en CLL. Un desafío importante en el análisis de la función de un factor de transcripción en diferentes enfermedades es la identificación de sus genes diana. Esto es de gran importancia para la elucidación de los mecanismos patogénicos y posibles intervenciones terapéuticas. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica clásica para demostrar las interacciones DNA proteína y puede, por tanto, utilizarse para identificar los genes objetivo directo de factores de transcripción en células de mamíferos. Aquí, el ChIP se utilizó para identificar LCK como gene del objetivo directo de NFAT2 en células humanas de la CLL. ADN y las proteínas asociadas son reticuladas con formaldehído y posteriormente cortado por sonicación en fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de ADN asociados con NFAT2 son entonces selectivamente immunoprecipitated de restos celulares usando un anticuerpo αNFAT2. Después de la purificación, se detectan asociadas fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Secuencias de ADN con evidente enriquecimiento representan regiones del genoma que están dirigidas por NFAT2 en vivo. Corte adecuado de la DNA y la selección de los anticuerpos requeridos son particularmente cruciales para la exitosa aplicación de este método. Este protocolo es ideal para la demostración de interacciones directas de NFAT2 con genes de la blanco. Su principal limitación es la dificultad para emplear viruta en ensayos a gran escala, análisis de los genes diana de múltiples factores de la transcripción en organismos intactos.

Introduction

Leucemia linfocítica crónica (CLL) representa la leucemia más común en adultos en países occidentales, exhibiendo distinta acumulación de CD19, CD23 y CD5 expresando B madura las células1. Mayoría de los pacientes presentan un curso indolente de la enfermedad, que no es necesario tratamiento específico durante muchos años. Por el contrario, algunos pacientes demuestran progresión rápida que requieren las intervenciones terapéuticas inmediatas con inmune-quimioterapia o terapias dirigidas2,3. Factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción que controla varios desarrollo y procesos de activación en numerosas células tipos4,5,6. Recientemente hemos demostrado sobreexpresión y activación constitucional de NFAT2 en las células CLL de los pacientes con enfermedad indolente7. Aquí, regula un estado insensible a la estimulación de receptores de células B llamado anergia7. Para demostrar que NFAT2 se une al promotor linfocitos proteína tirosina quinasa (LCK) y regula la expresión de LCK en las células CLL humanas, un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina específicos (ChIP) fue desarrollado y empleado.

ChIP es una de las varias técnicas para investigar el papel de factores de transcripción en el gene expresión8. Expresión génica es bien orquestada de manera muy compleja por varios reguladores con factores de transcripción tomando parte insustituible en este proceso9,10,11,12. Factores de transcripción que regulan la expresión génica en un contexto espacial y temporal se han identificado en muchas especies (por ejemplo, para el desarrollo y diferenciación)13,14,15, 16,17,18. Errores en los mecanismos de control complejas que involucran factores de transcripción pueden conducir a una variedad de procesos patológicos incluyendo cáncer19,20. Por lo tanto, la identificación de factores de transcripción y sus respectivos objetivos podría ofrecer nuevas vías terapéuticas21,22. Para investigar este intrigante campo varios métodos están disponibles como ChIP, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), varios ensayos de pull-down de ADN y ensayos reportero8,11,12, 23 , 24.

Para demostrar que un cierto factor de transcripción interactúa con regiones específicas del genoma en vivo, ChIP es una técnica ideal25. Para ello, ADN y proteínas asociadas en las células vivas son reticuladas utilizando radiación UV o formaldehído (ChIP reticulado, XChIP). Este paso se omite para obtener ADN mejor y la recuperación de proteína en el supuesto nativo ChIP (NChIP)26. Posteriormente, los complejos DNA-proteína se esquilan por sonicación en fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (PB) y immunoprecipitated de la ruina de la célula usando un anticuerpo específico contra el factor de transcripción de interés. Los fragmentos de ADN asociados son entonces purificados y caracterizados por PCR, clonación molecular y secuenciación. Técnicas alternativas utilizan micromatrices (ChIP-on-Chip) o la secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq) para analizar la immunoprecipitated ADN.

ChIP fue introducido por Gilmour y Lis en 1984 cuando utilizan UV de luz al ADN de reticulación covalente y enlazado a proteínas en la vida de las bacterias27. Lisis celular y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, se utilizaron sondas específicas de genes conocidos para mapear la distribución en vivo y la densidad de la ARN polimerasa. El método fue utilizado posteriormente por los mismos investigadores a analizar la distribución de la eucariota ARN polimerasa II en genes de proteínas de choque térmico en Drosophila28. El ensayo XChIP fue perfeccionado por Varshavsky y compañeros de trabajo que utilizan por primera vez formaldehído Cross-linking para estudiar la Asociación de la histona H4 con calor choque proteína genes29,30. El enfoque NChIP, que lleva la ventaja de una mejor recuperación de DNA y proteínas debido a epitopos naturalmente intacto y, por lo tanto, una mayor especificidad de anticuerpo, primero fue descrito por Hebbes y colegas en 198831.

La ventaja del ChIP en comparación con otras técnicas para analizar las interacciones DNA-proteína es en realidad, que la interacción real de un factor de transcripción puede ser investigado en vivo y sin sondas o condiciones artificiales creadas por tampones o geles son empleado8,11,12. Mediante la combinación de ChIP con secuenciación de próxima generación, pueden identificarse múltiples objetivos simultáneamente.

Principales limitaciones de esta técnica son su limitada aplicabilidad a los ensayos a gran escala en organismos intactos25. El análisis de patrones de expresión génica diferencial también pueden ser difícil usando técnicas de ChIP si las proteínas respectivas se expresan sólo en niveles bajos o durante las ventanas de tiempo estrecho. Otro factor potencialmente limitante es la disponibilidad de un anticuerpo apropiado para ChIP11.

El protocolo ChIP presentado aquí puede ser empleado para la identificación en vivo de genes diana de un factor de transcripción por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Específicamente, el objetivo era identificar los genes de la nueva diana de NFAT2 en CLL. ChIP fue elegido debido a su potencial para demostrar directamente el enlace de NFAT2 a las regiones promotoras de genes diferentes en condiciones naturales en células humanas del paciente CLL.

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Protocol

Todos los experimentos realizados con material humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Tübingen y se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes que contribuyeron las muestras para este estudio.

1. aislamiento y estimulación de Jurkat células

Nota: Para optimizar el protocolo, utilice la línea de células Jurkat que conoce para expresar los niveles de NFAT2. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar 50 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina por calentamiento a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Cultura para 1-2 d en un frasco de cultivo celular en 37 ° C y 5% de CO2 en 20 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% penicilina/estreptomicina a una densidad de aproximadamente 2 x 106 células/mL de células Jurkat (las células se cuentan con Trypan coloración azul y una Cámara Neubauer al microscopio) y cosechar por centrifugación durante 5 min a 200 x g.
  3. Quite el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células en 10 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina. Posteriormente, contar las células con una tinción azul de trypan convencional y una cámara de Neubauer al microscopio.
  4. Centrifugar las células en el paso 1.3 por 5 min a 200 x g y eliminar el sobrenadante por aspiración. Entonces, resuspender las células en una densidad de 2 x 107 células/mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina y transferir 1 mL en un tubo de 5 mL convencional nuevo mediante pipeteo.
  5. Estimular las células añadiendo 32,4 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y ionomycin 1 μm. Luego Incube las células de 16 h a 37 ° C y 5% de CO2 con la tapa del tubo abierto (para evitar la contaminación, una película permeable al aire puede ser utilizada).

2. aislamiento y estimulación de las células CLL principal de pacientes humanos

Nota: Las muestras del paciente se adquirió y estimuladas como se describió anteriormente7. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar el equipo necesario para extraer la sangre de los pacientes y realizar una separación del gradiente de densidad: agujas de 21 G, torniquete, NH4-heparina-sangre jeringas de colección (p. ej., S-monovettes), 1 x PBS y medio de gradiente de densidad (densidad 1,077 g/mL) .
  2. Sobre venopunción, extraer la sangre de pacientes CLL (ca. 40 mL de sangre por paciente) en las jeringas. Luego transferir la sangre en tubos cónicos de 50 mL. Lavar la jeringa con 10 mL de PBS y piscina de la sangre-PBS-suspensión en los tubos de 50 mL (ajustar el número de tubos para el volumen de sangre).
  3. Preparar 15 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mL fresco. Posteriormente, capa 35 mL de la suspensión de sangre PBS con cuidado en el medio de gradiente de densidad. Para ello, sujete el tubo en un ángulo plano y pipeta lentamente la sangre-PBS-suspensión contra la pared inferior del tubo cónico de 50 mL. Como más de la sangre-PBS-suspensión está acumulando en el tubo cónico de 50 mL, aumentar el ángulo del tubo hasta un ángulo recto. Repita este paso según el volumen de la sangre-PBS-suspensión.
  4. Realizar la centrifugación a 560 x g durante 20 min (sin freno), a continuación extraer la fase de células mononucleares que contiene las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Para ello, recoger la interfase blanca de la separación del gradiente de densidad con una pipeta serológica de 5 mL y transferir a un tubo cónico de 50 mL nuevo.
  5. Llene la suspensión de células a 50 mL con PBS y centrifugar durante 5 min a x 360 g. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Repita este paso con centrifugación durante 5 min a x 275 g. Entonces, la piscina las células de un paciente en 5-10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 mL.
  6. Contar las células como se describe en 1.3.
    Nota: Depende de la proporción de células de CLL en el PBMCs aislados, si las células se pueden utilizar directamente para este procedimiento o un aislamiento de la célula de B debe llevarse a cabo, por ejemplo, por medio magnético celular clasificación (MACS). El aislamiento de la célula de B se recomienda pero puede omitirse si la proporción de células de la CLL es superior al 95% de linfocitos totales (determinados mediante citometría de flujo). Sangre de CLL pacientes es fijo y lisis según las instrucciones del fabricante. Entonces una coloración con los anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE se realiza según las instrucciones del fabricante y las células se analizan mediante citometría de flujo. Un paciente ejemplar se muestra en la figura 1, en el que la proporción de células de la CLL es 89.03%. Así, un aislamiento de la célula de B deberá llevarse a cabo en este paciente. La proporción de células B fisiológicas es insignificante (3.72% en el ejemplo).
  7. Lavar las células con 10 mL de precalentado (37 ° C) RPMI 1640 complementado con 10% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, 100 mM no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio 1 mM y 50 mM de β-mercaptoetanol durante 5 minutos a 200 x g y eliminar el sobrenadante por aspiración.
  8. Ajuste las células a 2 x 107 células/mL en RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales de 100 mM, 1 mM sodio piruvato y 50 mM β-mercaptoetanol (37 ° C) y relleno 1 mL de la suspensión de células en un tubo de 5 mL.
    Nota: El ß-mercaptoetanol se emplea para contrarrestar el estrés oxidativo.
  9. Estimular las células añadiendo 32,4 nM PMA y ionomycin 1 μm. Luego Incube las células de 16 h a 37 ° C y 5% de CO2 con la tapa del tubo abierto (para evitar la contaminación, una película permeable al aire puede ser utilizada).
    Nota: Para reducir el nivel de estrés las células pueden ser descansadas por 1 h a 37 ° C y 5% de CO2 en la incubadora antes de la 16 h de la estimulación.

3. fijación, lisis celular y corte de cromatina

Nota: Las muestras del paciente células Jurkat fijo y lisis con un kit de ChIP disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante con modificaciones como se describe previamente7. La fijación se realiza bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar un tubo de 1,5 mL con 1 mL de formaldehído al 37%, un tubo de 1,5 mL con 1 mL de glicina de 1,25 M, un tubo de 5 mL con 4 mL de 1 x PBS y una caja con hielo para la fijación de las células.
  2. Después de la estimulación de las células para el tiempo de incubación respectivo en el paso 1.5 o 2.9, gira los tubos de 5 mL a 200 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 500 μl de PBS en los tubos de 5 mL.
  3. Añadir formaldehído μm 340 (13,5 μl de formaldehído al 37%) a las células. Después de breve mezclar mediante pipeteo con cuidado hacia arriba y hacia abajo incubar la suspensión durante 2,5 minutos (células de Jurkat) o 5 minutos (muestra del paciente) a temperatura ambiente.
    Nota: Se necesita tiempo de fijación prolongada de pilas asegurar óptima de corte.
  4. Añadir glicina 125 mM (57 μl de 1,25 M glicina) para detener la fijación e incubar otro 5 minutos poner las células en hielo inmediatamente después y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  5. Lavan las células dos veces con 1 mL de PBS helado a 200 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante cada vez por aspiración.
    Nota: Después de la fijación, el protocolo puede pausarse. Las células fijas deben ser almacenadas a-80 ° C. Para comprobar, si el epítopo del anticuerpo diseñado para su uso en el siguiente protocolo no se enmascara a través de la fijación, pueden utilizarse muestras adicionales para el análisis mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE y Western blot. Estos pasos se realizan con 100 μg de proteína según las instrucciones del fabricante. Todos los anticuerpos αNFAT2 se utilizan a una dilución de 1: 1000, el anticuerpo de la GAPDH en la dilución de 1:10000. Una imagen ejemplar de muestras fijadas de células Jurkat con anticuerpos apropiados e inapropiados se muestra en la figura 2.
  6. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de lisis disponibles comercialmente 1 transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Luego, coloque las muestras en el hielo en una coctelera e incúbelos durante 10 minutos agitando.
    Nota: Antes de la lisis, las células pueden ser desintegradas por 10 s en nitrógeno líquido. Esto es útil para las células de Jurkat pero debe evitarse en las muestras primarias. Para la desintegración, coloque los tubos de 5 mL durante 5 s en 5-10 mL de nitrógeno líquido en un contenedor específico. Use gafas de seguridad y guantes de seguridad apropiados.
  7. Posteriormente, centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.
  8. Homogeneizar las células en 5 mL de tampón de lisis disponibles comercialmente 2 transfiriendo hacia arriba y hacia abajo e incubar por 10 min en hielo agitando. Luego centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.
  9. Resuspender el precipitado de células en 500 μl (células de Jurkat) o 140 μl (muestras) de corte tampón 1 que contiene 1 x inhibidor de la proteasa (5 μl o 1,4 μL, respectivamente) e incubar la mezcla por 10 min en hielo.
  10. Para el corte de la cromatina, trasvasar 140 μl de la suspensión de células de paso 3.9 tubos sonicador (evitar la producción de burbujas de aire y repita este paso si es necesario debido al volumen de la muestra). Colocar los tubos en el ultra-sonicador enfocado a una temperatura de 7 ° C y de corte de 10 minutos (línea celular) o 7,5 minutos (muestras) con una potencia media incidente de 9.375 W para obtener fragmentos de ADN de 200-500 bp.
  11. Finalmente, centrifugar a 15700 x g durante 10 min a 4 ° C en la centrifugadora pequeña y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
  12. Para comprobar los tamaños de fragmento correspondiente, analizar 20 μl de la cromatina esquilada mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5% TBE. Una imagen ejemplar de esquilado cromatina de las células de Jurkat de buena y de mala calidad se muestra en la figura 3. En este punto, el protocolo puede ser potencialmente hizo una pausa. Cromatina esquilada debe almacenarse a-80 ° C.

4. inmunoprecipitación de cromatina

Nota: La inmunoprecipitación de cromatina se realizó con un kit de ChIP disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante con modificaciones7.

  1. Calcular el número de immunoprecipitations (70 μl (células de Jurkat) o 15 μl (muestras) de cromatina esquilada más un anticuerpo) y preparar 20 μl de perlas de proteína A cubierto por precipitación en un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos en 40 μl de 1 x buffer ChIP 1 por precipitación mediante pipeteo arriba y abajo, dejó las cuentas descansa en un estante magnético durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante por pipeteo. Realizar este paso cuatro veces en total. Finalmente, vuelva a suspender las cuentas en el volumen original con el tampón de viruta de 1 x 1.
  2. Para la inmunoprecipitación de sí mismo, usar 10 μg de anticuerpo αNFAT2 (7A6) para capturar NFAT2 con sus secuencias diana encuadernado. Utilizar 2,5 μg de un anticuerpo de IgG de conejo (DA1E) como un control de IgG. Preparar las reacciones en tubos de 1,5 mL fresco como se indica en la tabla 1.
    Nota: Es importante utilizar un anticuerpo monoclonal con alta afinidad cuya epitopo no es enmascarado durante la fijación de este protocolo. Anticuerpos policlonales introducen un nivel adicional de variación, lo que es significativamente más difícil de interpretar adecuadamente los resultados recibidos.
  3. Incubar la mezcla del paso 4.2 durante la noche a 4 ° C en un disco giratorio a 6 rpm.
  4. En el siguiente día girar los tubos durante 5 s a x 7.000 g en la centrífuga pequeña, incubar en un estante magnético durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante por aspiración. Lavar los granos una vez con cada uno de la tampones de lavado 1, 2, 3 y 4 consecutivamente.
  5. Para ello, vuelva a suspender las cuentas en 350 μl de tampón de lavado e incubar por 5 min a 4 ° C en un disco giratorio a 6 rpm.
  6. Después de eso, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña. Luego, colocarlos durante 1 min en una rejilla magnética, quite el sobrenadante y agregar el siguiente tampón de lavado.
  7. Después el último paso del lavado, retirar el sobrenadante mediante pipeteo, tomar los granos en 100 μl de tampón de elución 1 e incubar por 30 min en un disco giratorio a 6 rpm.
  8. Girar los tubos poco (5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña) y colocarlos en un estante magnético durante 1 minuto.
  9. Transfiera el sobrenadante mediante pipeteo a un nuevo tubo de 1,5 mL y agregar 4 μL de tampón de elución 2.
  10. Para crear el control de entrada, mix 1 μl de la cromatina esquilada con 99 μl de elución buffer 1 y 4 μL de tampón de elución 2 (en esta configuración, hay tres tubos por paciente: una entrada de control, un control de IgG y una muestra de αNFAT2).
  11. Incubar las muestras durante 4 horas a 65 ° C y 1300 rpm en un agitador de tubo de 1,5 mL. Añada 100 μl de isopropanol al 100%, vortex y vuelta las muestras durante 5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña.
  12. Suspender las bolas magnéticas disponibles por fondo Vortex, añadir 10 μl de los granos a cada muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un disco giratorio a 6 rpm.
  13. Después de la incubación, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la pequeña centrífuga y colocarlos durante 1 min en una rejilla magnética. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  14. Resuspender los granos en 100 μl de tampón de lavado 1. Invierta los tubos para mezclar e incubar 5 min a temperatura ambiente en un disco giratorio a 6 rpm.
  15. Girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, coloque durante 1 min en una parrilla magnética y quite el sobrenadante mediante pipeteo. Repita los pasos 4.13-4.14 con tampón de lavado 2.
  16. Posteriormente, retirar el tampón de lavado por aspiración, suspender los granos en 55 μl de tampón de elución e incubar por 15 min a temperatura ambiente en la rueda giratoria a 6 rpm a fin de eluir el ADN precipitado. Finalmente, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, colocar durante 1 min en una rejilla magnética y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mL.
    Nota: Aquí el protocolo puede ser potencialmente una pausa. El ADN eluído entonces debe almacenarse a-20 ° C.

5. detección de genes de la blanco NFAT en las células CLL.

  1. Llevar a cabo la reacción de qRT-PCR por duplicado para cada muestra como se indica en la tabla 2.
    Nota: Para la detección de genes de la blanco una PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) se lleva a cabo empleando una mezcla de qRT-PCR comercialmente disponibles con un instrumento de PCR en tiempo real.
  2. Utilice las placas blancas de 96 pocillos de reacción para las reacciones y el instrumento de RT-PCR. Las condiciones de ciclismo son las siguientes: 95 ° C por 30 s, [95 ° C durante 5 s, 60 ° C para 30 s] x 40 ciclos.
    Nota: Una dilución seriada de la entrada (sin diluir o diluido 1:10, 1: 100 y 1: 1000 en agua libre de nucleasas) se utiliza para calcular el enriquecimiento relativo. En células Jurkat, IL-2 fue utilizado como un control positivo de32. CD40L, un objetivo bien conocido de NFAT2 en las células de B, se utilizó como control positivo en las células CLL y LCK como ejemplo para un gene de la novela destino de NFAT2 en CLL33,34. Los cebadores para la región del promotor CD40L, la IL-2 y LCK se describen en la tabla de reactivos específicos y equipos.

6. normalización y análisis de datos

Nota: El enriquecimiento relativo de las regiones promotoras de interés (IL-2, CD40L o LCK) se calcula usando el control de IgG para la normalización.

  1. En primer lugar, determinar valores de Ct (ciclo umbral) para la dilución serial entrada, IL-2, CD40L y la región del promotor LCK mediante el software de evaluación de datos de qRT-PCR.
  2. Definir una curva estándar de las concentraciones por dilución seriada de la entrada. Con esta curva estándar calcule la concentración de IL-2, CD40L y la región del promotor LCK por cada duplicado de cada muestra.
  3. A continuación, calcular la media de los duplicados. A continuación, establezca la muestra de la inmunoprecipitación de IgG como referencia. Definir el enriquecimiento relativo de este ejemplo como 1.0 y comparar la muestra (de la inmunoprecipitación NFAT2) a esta referencia.
  4. Por último, calcular el enriquecimiento relativo dividiendo la concentración de las muestras por la concentración de la referencia de IgG.

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Representative Results

La figura 1 muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar de un paciente CLL realizado después de la tinción con anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE. Figura 1a muestra la compuerta de los linfocitos, que representa a la mayoría de las células en la sangre de los pacientes CLL. Figura 1b muestra la proporción de CD19+/CD5+ CLL las células, que representan el 89.03% de los linfocitos en este ejemplo. La proporción de CD19+/CD5 las células de B es de 3.72% en el paciente respectivo.

La figura 2 muestra ejemplos del funcionamiento de anticuerpo en células Jurkat fijadas para diferentes períodos de tiempo según lo determinado por SDS-PAGE y Western Blot. Se analizaron los diferentes anticuerpos de distintos fabricantes. Figura 2a muestra el funcionamiento de los anticuerpos αNFAT2 (clon 7A6) de distintos fabricantes detectadas con un anticuerpo de anti-ratón fluorescente verde. El anticuerpo de fabricante 1 demostrado a su epítopo sin fijación (banda A) e incluso cuando las células Jurkat fueron fijadas para 2,5 min o 5 min (banda B o C, respectivamente). El αNFAT2-anticuerpo (clon 7A6) del fabricante 2, por el contrario, mostró un comportamiento más débil incluso en células Jurkat no fijo (banda D). Sobre la fijación, el anticuerpo de este fabricante logró resultados aún más débiles (bandas E (fijación de 2,5 min) y F (fijación de 5 min)). Figura 2b muestra el funcionamiento de los anticuerpos αNFAT2 (clon D15F1) de un diverso fabricante detectado con un anticuerpo de anti-conejo fluorescente rojo. Este anticuerpo también realiza débilmente en muestras no fijadas (banda A) y la ausencia de una banda indica el enmascaramiento de su epitopo por la fijación (bandas B (fijación de 2,5 min) y C (5 min fijación)).

La figura 3 muestra ejemplos de esquilado cromatina de las células de Jurkat obtenidas después de fijación diferentes y a veces de buena y mala calidad de corte según lo determinado por electroforesis del gel. Bandas A y B (0 min fijación o fijación de 2,5 min, respectivamente) ver buena calidad cortado la cromatina, que se caracteriza por un tamaño de fragmento de ADN de 200-500 PB que puede ser detectado en un gel de agarosa como un borrón de transferencia típica. Cromatina esquilada de mala calidad, por el contrario, puede ser reconocida por casi completa o completa ausencia de la esperada borrón de transferencia de ADN (banda C), así como un frotis en un más grande o más pequeño que la gama del tamaño del fragmento esperado (bandas de D-F). La ausencia completa del borrón de transferencia indica el uso de una cantidad insuficiente de material de partida. La detección de ADN más pequeños fragmentos de notas excesiva ADN esquila (banda E) mientras mayor sugerencia de fragmentos ADN para corte insuficiente.

La figura 4 muestra los resultados de un experimento típico con células Jurkat. LCK se analizó como un objetivo potencial de NFAT2. IL-2 que es un gen de objetivo bien definido de NFAT2 en células de T se utilizó como control positivo. Se utilizó un anticuerpo IgG-control para la normalización. Figura 4a muestra un experimento con resultados óptimos por enriquecimiento significativo del control positivo IL-2 . De este experimento, se puede concluir que existe un enriquecimiento significativo de LCK secuencias en el ADN precipitado demostrando que LCK es un objetivo directo de NFAT2 en células Jurkat. Figura 4b se muestra un experimento realizado con baja calidad de ADN debido a la falta de fijación o un procedimiento de corte subóptimo que causa un bajo grado de enriquecimiento en el control positivo de IL-2 .

La figura 5 muestra los resultados de un experimento realizado con células humanas primarias de CLL. CD40L que es un conocido destino de NFAT2 en células B sirvió como control positivo y LCK se analizó como el objetivo experimental. Figura 5a se muestra un experimento con un considerable nivel de enriquecimiento de CD40L ADN en el control positivo. Desde el enriquecimiento aún mayor de ADN LCK , se podría concluir que LCK es también un objetivo NFAT2 directo en las células CLL humanas primarias. La figura 5b muestra un experimento realizado con baja calidad de ADN probablemente debido a la inadecuada de corte. No hay enriquecimiento substancial de CD40L ADN pudo detectarse en el control positivo de representar los datos experimentales sin sentido.

Figure 1
Figura 1: Análisis de citometría de flujo ejemplar de pacientes CLL. (a) muestras de los pacientes CLL se analizaron mediante citometría de flujo después de la tinción con anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE y linfocitos fueron bloqueados. (b) posteriormente, la proporción de CD19+/CD5+ CLL células y CD19+/CD5 las células de B se determinaron. Aquí, CD19+/CD5+ CLL células 89.03% de linfocitos, mientras que CD19+/CD5 de células B representan el 3,72% de linfocitos. Se muestra un paciente ejemplar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ejemplos de funcionamiento de anticuerpo en las células de Jurkat fijadas determinado por SDS-PAGE y Western-Blot. (a) células Jurkat se fijaron para min 0 (grupos A y D), (grupos B y E), de 2,5 min o 5 min (C y F) y el anticuerpo αNFAT2 (clon 7A6) de distintos fabricantes (bandas A-C = fabricante 1, bandas de D-F = 2) se comparó con la fabricante. El anticuerpo de fabricante 1 mostraron un mejor rendimiento general, vinculante con la afinidad más alta incluso a muestras fijadas (Comparar bandas A-C y bandas D-F). (b) el anticuerpo αNFAT2 (clon D15F1) de un fabricante diferente fue utilizado. Este anticuerpo demostró solamente un pobre rendimiento en muestras no fijadas (banda A) y el epitopo fue enmascarado con fijación. Por lo tanto, no se pudo detectar ningún atascamiento del anticuerpo después de la fijación (grupos B y C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ejemplos de cromatina de buena y pobre calidad de corte de células Jurkat evaluados por electroforesis en gel de. Las células Jurkat fueron fijos y esquiladas para diferentes períodos de tiempo. La fijación se realizó para min 0 (grupos A y D), 2,5 minutos (grupos B y E), o 5 minutos (C y F). Esquila se realizó durante 10 min (bandas A-C) o 20 minutos (bandas de D-F). Cromatina de buena calidad de corte se caracteriza por un tamaño de fragmento de ADN de 200-500 PB que puede ser detectado como un borrón de transferencia en la región respectiva (bandas A y B). Cromatina de mala calidad puede ser reconocida que bien por una ausencia casi completa o completa de la DNA borrón de transferencia debido a una cantidad insuficiente de material utilizado (banda C) de partida o por un frotis en una región de tamaño más pequeño o más grande debido a inadecuado corte (condiciones) bandas de D-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: ChIP de células Jurkat evaluados por qRT-PCR. (a) NFAT2 se une a LCK y la promotora IL-2 en células Jurkat. El enriquecimiento relativo de LCK y IL-2 regiones promotoras precipitado con el anticuerpo NFAT2 aparece como analizados por qRT-PCR. Independiente tres ChIP-experimentos se muestran como media ± SEM (prueba t de Student, * P < 0.05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). (b) ADN de muestras con baja calidad cromatina esquilada fue utilizada. No vinculantes pertinentes de NFAT2 a las secuencias blanco podrían ser detectado. Un cuadro similar se puede detectar si no hubo ninguna fijación o el tiempo de incubación con el anticuerpo NFAT2 era insuficiente. Independiente tres ChIP-experimentos se muestran como media ± SEM (prueba t de Student, * P < 0.05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: ChIP de células CLL humanas primarias evaluada por qRT-PCR. (a) NFAT2 específicamente se une a los promotores de LCK y CD40L en las células CLL humanas primarias de pacientes con un curso indolente de la enfermedad. El diagrama muestra el enriquecimiento relativo de LCK y CD40L promotor regiones precipitado con el anticuerpo NFAT2 como analizados por qRT-PCR. Independiente tres ChIP-experimentos se muestran como media ± SEM (prueba t de Student, * P < 0.05; ** P < 0.01 *** P < 0,001). (b) ADN de muestras de pacientes con mala calidad cromatina esquilada fue utilizada. No se pudo observar ningún atascamiento de NFAT2 a las secuencias blanco respectivo. Independiente tres ChIP-experimentos se muestran como media ± SEM (prueba t de Student, * P < 0.05; ** P < 0.01 *** P < 0.001) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

artículo volumen (μL) por IP
5% DE BSA 6
100 x inhibidor de la proteasa 3
5 x buffer ChIP 1 56
esquilado de la cromatina x (15 μl o 70 μl)
Proteína cubierta de bolas magnéticas 20
Agua de grado chIP seq 185-x-y
anticuerpo (IgG-control o αNFAT2) y (1.09 μl o 1 μl)
total 270

Tabla 1: lista para el pipeteo de la inmunoprecipitación de cromatina. La inmunoprecipitación de cromatina se realizó mediante la preparación de las reacciones como se indica en la tabla.

artículo volumen (μL) por qRT-PCR
immunoprecipitated ADN 9
Mezcla de qRT-PCR 10
primer avance (LCK/CD40L/IL-2) 0.5
primer revés (LCK/CD40L/IL-2) 0.5
total 20

Tabla 2: lista para el pipeteo de la qRT-PCR. QRT-PCR fue realizada mediante la preparación de las reacciones como se indica en la tabla.

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Discussion

Los pasos críticos de realizar un exitoso análisis de ChIP son la selección de un anticuerpo apropiado y la optimización de la cromatina corte proceso25. La selección de los anticuerpos αNFAT2 demostrado para ser especialmente difícil durante el desarrollo de este protocolo. Aunque existen varios anticuerpos de αNFAT2 disponibles en el mercado y la mayoría de estos funciona bien para western blot y otras aplicaciones, 7A6 clon fue el único anticuerpo que podría utilizarse con éxito para ChIP7. Incluso supuestamente 7A6 idénticos anticuerpos de distintos fabricantes exhiben diferencias significativas con respecto a su desempeño en el ChIP. Un desafío importante es el potencial de epítopos de proteínas de destino por el proceso de fijación utilizado en protocolos de XChIP25.

La cromatina procedimiento de corte también es crítica para la adquisición de resultados apropiados en XChIP. Un tamaño de fragmento de 200-500 bp según lo determinado por electroforesis en gel de agarosa fue encontrado para ser óptima en este ChIP NFAT2 protocolo7. Inadecuado condiciones corte dando por resultado una escasez de ADN a partir de material o fragmentos de ADN de tamaño más pequeño o más grande por lo general conducen a resultados subóptimos al realizar este ensayo. Subóptima de corte también se observó al utilizar congelados y rethawed PBMCs. por lo tanto, descongelación de PBMCs resultó en un menor rendimiento de la DNA de las células, así como un aumento excesivo de corte de fragmentos de ADN.

La disponibilidad de una amplia variedad de kits de ChIP y viruta-grado anticuerpos es difícil, pero también ofrece la posibilidad de utilizar la técnica en un contexto amplio. Así, una diversidad de factores de transcripción puede ser investigada en diferentes tipos celulares. Por ejemplo, otros miembros de la familia NFAT (NFAT1 y NFAT4) han sido investigados recientemente usando ChIP35,36,37.

El kit de ChIP utilizado aquí también tuvo que ser modificado para adaptarse a nuestras necesidades. En primer lugar, se ajustó el tiempo de fijación para evitar enmascaramiento del epitopo reconocido por el anticuerpo utilizado y óptima de corte. El volumen de búferes para lisis y esquila también fue cambiado para reducir la pérdida de células durante las etapas de lavado diferente. Además, se optimizaron las condiciones de corte para obtener fragmentos de ADN en el rango de 200-500 bp. El inhibidor de proteasa y el anticuerpo de IgG-control fueron intercambiados con otros reactivos comercialmente disponibles como demostraron para ser comparables y más rentable. El paso que implica al operador suministrado por el fabricante fue omitido como interfirió con la precipitación del ADN. Al final, la cantidad de buffer utilizado a fin de eluir el ADN se adaptó para producir un volumen suficiente para ser utilizado en la qRT-PCR.

Hay varios otros kits disponibles de varias compañías y también existe la posibilidad de realizar el ChIP sin un juego. Sin embargo, pruebas y establecimiento son muy difíciles, ya que hay muchos factores a considerar, como la compatibilidad de las células analizadas y proteínas con fijación diferentes y métodos de corte. El kit mencionado fue utilizado como fue establecido en nuestro laboratorio.

Una restricción importante de este método es su aplicabilidad limitada a las investigaciones a gran escala en organismos modelo intacto porque anticuerpos apropiados deben ser identificados o generadas para cada factor de transcripción individual. El análisis de los genes que se expresan sólo en niveles bajos, en un pequeño número de células o durante un período restringido de tiempo también puede ser difícil con ChIP.

Mientras que ChIP es el estándar de oro para demostrar una interacción directa de un factor de transcripción dada con sus genes diana respectivos en las células eucarióticas intactas25, hay un número de otras técnicas para investigar la interacción entre proteínas y DNA . EMSA es un método útil para detectar proteínas de unión de ADN de baja abundancia en el celular lystates24. También puede utilizarse para caracterizar la afinidad de una proteína particular a través de un sistemático análisis mutacional de ADN sonda. Una ventaja importante de EMSA en comparación con el ChIP es el hecho de que es generalmente substancialmente menos desperdiciador de tiempo establecer el análisis respectivo. Análisis de ADN desplegable, microplaca de captura y análisis de detección y ensayos reportero son otras técnicas de análisis de las interacciones DNA proteína23.

Desarrollos más recientes han hecho posible aplicar el ensayo de ChIP genoma enfoques por su combinación con microarray tecnología (ChIP-on-chip)38,39,40 o secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq )41,42,43.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el DFG concesión MU 3340/1-1 y el Deutsche Krebshilfe conceden 111134 (ambos a MRM). Agradecemos a Elke Malenke excelente asistencia técnica).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

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