5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

Developmental Biology
 

Summary

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

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Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).

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Abstract

Epigenetics 망막 개발의 다양 한 인간의 망막 퇴행 성 질병의 메커니즘에 대 한 이해의 새로운 수준을 약속 새로운 치료 접근을 정확 하 게 잘 공부 연구 분야 이다. 마우스 망막의 핵 아키텍처는 두 개의 서로 다른 패턴 구성: 전통과 반전. 기존의 패턴은 동안 활성 euchromatin 핵 내부에 있는 섬으로, 핵의 주변에 지역화는 보편적 이다.입니다. 반면, 거꾸로 핵 패턴은 섬으로 localizes 핵 센터 및 euchromatin 핵 주변에 있는 성인 봉 포토 리셉터 세포 핵에 고유 합니다. DNA 메 틸 화는 chromocenters에서 주로 관찰 된다. DNA 메 틸 화 CpG 디 많은 유전자의 발기인 지구에 풍성 하 게 하는 시 토 신 잔류물 (5-methylcytosine, 5mC)에 동적 공유 수정입니다. 3 DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A와 DNMT3B) 개발 중 DNA의 메 틸 화에 참여합니다. Immunohistochemical 기술로 검출 5mC은 매우 도전, 결과, 다양성에 기여 하는 5mC 수정 기지를 포함 하 여 모든 DNA 기초는 이중 가닥 DNA 나선 안에 숨겨져 있습니다. 그러나, 개발 하는 동안 5mC 배포의 상세한 묘사 매우 유익 하지 않습니다. 여기, 우리 5mC와 다른 후 성적인 DNA 마커 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 개발에 "오픈", transcriptionally 활성화 chromatin와 colocalizes는 강력한 immunohistochemical 감지에 대 한 재현 기법을 설명 하 고 postmitotic 마우스의 망막

Introduction

개발의 후 성적인 규정 및 마우스 망막의 postmitotic 항상성 retinogenesis 및 세포 운명 결정 제어 생물 학적 메커니즘에 대 한 새로운 이해를가지고 어떤 약속 셀 형식 관련 연구의 흥미로운 영역입니다. 신진 대사 기능, 세포 병 리, 세포 죽음 및 중생1,2,3,,45,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 스트레스, 대사 또는 세포 죽음 자극6,,1415, chromatin 가변 외부 신호에 대 한 응답에서 뿐만 아니라 개발, 동적 변화를 겪 습 16 , 17 , 18. 마우스 핵 chromatin 활성 euchromatin 및 비활성 섬으로6,,1920으로 분할 된다. Interphase 핵에 euchromatin 섬으로 라인 핵 주변 및 핵소체 반면 핵의 내부 영역에 상주 합니다. 이 패턴은 기존의 불리고 진핵생물에서 고도로 보존. 반면, 마우스와 쥐 같은 야행성 동물에 막대 핵 핵 섬으로 둘러싸인 euchromatin 바깥쪽 껍질6,18, 형성 하는 센터에 의해 점유 된다 패턴 거꾸로 있다 20. 출생 시, 로드 핵 기존의 핵 건축이 있다. 막대 핵의 반전 기존의 핵 건축 리 모델링 하 여 개발 하는 동안 발생 합니다. 이 과정 동안, 주변 섬으로 핵 주변에서 분리 하 고 chromocenters 융합 센터에서 단일 chromocenter 형태의 핵6,18.

게놈 DNA 메 틸 화 제어 로컬 chromatin 구조21에 참여 합니다. DNA 메 틸 화는 5' 풍성 하 게 CpG 디의 시 토 신 잔류물의 마우스 게놈22,23,,2425,26 에 많은 유전자의 발기인 지구에 있는 위치에서 발생 뿐만 아니라 intergenic intron 지역, 규제 요소27을 수행. 근 위 발기인21,24 에 CpG 섬 및 유전자 증강27,28 CpG 시퀀스의 메 틸 화는 포함 하는 많은 chromatin의 동적 상태를 조절에 중요 한 발달 유전자/녹음 방송 요인 개발, 암 및 노화29,30,31,32,,3334 에서 중요 한 역 . 3 DNA methyltransferases (DNMTs) 마우스 개발35동안 DNA 메 틸 화에 참여합니다. 모든 3 개의 DNMTs 마우스 망막 개발36Dnmt 유전자 영향 망막 개발2,7망막 특정 변화 하는 동안 표시 됩니다. Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) demethylation의 산화 제품 이다. 3 10-11 전 (TET) 효소 5mC demethylation37,,3839에 참여. Hydroxymethyl C 수정 발기인, 유전자 몸과 유전자 부자와 적극적으로 베낀된 지역27,40intergenic 게놈 시퀀스에 농축입니다.

다양 한 방식의 설명 셀41,,4243,44,45,46에서 DNA 메 틸 화 패턴 변화를 결정 하는 데, 그들 중 일부는 사용 DNA 메 틸 화 CpG 풍부한 지역 발기인과 증강에에서 정확한 변화에 초점을 맞추고 다른 사람들의 세계적인 변화 측정 검색 및 5hmC의 정량화 방법 또한 보고 된47, immunohistochemistry13포함 했다. 5mC와 5hmC 변화에 핵 개발의 강력한 모니터링 활성화 Immunohistochemical 기법, postmitotic 세포, chromatin 역학에서 제자리에서 외부 또는 내부 변화에 대응 묘사에 대 한 매우 유익 하지 않습니다 셀4,13,,4849에 영향을. 그러나,이 접근은 DNA 메 틸 화 및 조직학 준비에서 시 토 신 수정 감지와 관련 된 기술적인 어려움 때문에 hydroxymethylation 변화를 과소 평가 하는 경향이 있다. 이 때문에 비 극성 DNA 기초, 5mC 5hmC 수정 시 토 신 등은 이중 가닥 DNA 나선50의 센터에서 숨겨지고 unmasking 필요. 이것은 가혹한 치료 적용 되 면 원래 조직의 유익한 조직을 잃을 수 있습니다 급속 하 게 냉동된 조직학 준비에서 특히 도전적 이다.

마우스 망막 신경 개발 및 postmitotic 항상성 DNA 메 틸 화에의 기여를 해 부하는 우수한 모델입니다. 뉴런의 6 종류만 있다 (막대와 콘 대뇌, amacrine, 바이 폴라, 수평 및 신경 절 세포), glial 세포 유형 (뮬러 명과) 및 한 neuroepithelial 세포 유형 (망막 안료 상피)51. 망막 세포 유형 DNA 메 틸 화18,19, 최근 단일 기본 해상도1,,59,12공부는의 명백한 본을 보고 했다. 우리는 최근 immunohistochemistry 응용 프로그램 묘사 5mC 성인 마우스 망막, 조건부 타겟팅 하 여 제거 된 모든 3 개의 DNA methyltransferases의 핵의 망막 세포 핵 내에서 분포의 패턴을 보고 7. 보고서, 망막 세포에서 DNA 메 틸 화의 존재는 긍정적 으로만 볼 수 또는 hypermethylated에서 부정적인 신호 겪고 apoptosis 세포의 수에 비해 우리의 접근 활성화 감지 특정 chromatin 우리 여러 그룹 보고 하 고 앞에서 설명한 망막 세포 핵 내 배열5,6,7,,1819,36 , 52. 여기, 우리 뿐만 아니라 우리의 원래 보고서7에서에서 재현 수 있었습니다 데이터 설명 단원의 냉동 paraformaldehyde 고정 조직학 세부 사항에 5mC 및 5hmC를 감지 immunohistochemical (IHC) 기술을 설명 .

Protocol

아동 병원 오클랜드 연구소 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 및 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 문에서 연구 협회 준수 프로토콜에 따라 마우스와 모든 절차 수행 했다 안과에서 동물의 연구 비전 및.

1. 조직 준비 Immunostaining

  1. C57 BL/6J 생쥐 배아 하루 (E) 16, 산 후 (P)에서 안락사 0, P15와 p90 받게 이산화탄소 (CO2) 잘린 (E16와 P0 쥐)에 의해 다음에 의해.
  2. 즉시 enucleate 마우스 눈 29G 1/2는 눈의 등 쪽에 바늘으로 구멍. 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) ph 8.0 실 온에서 5 분 (최소) 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL에 품 어.
  3. 눈 컵 P0, P15, p90 받게, 각 막을 밖으로 해 부와 눈이 4%에 있는 동안 좋은 안과 위 렌즈 PFA.
    참고: 건너뛰기 E16 눈은 눈으로이 단계는 너무 작은.
  4. 수정 눈 컵 (P0, P15와 p90 받게)와 전체 눈 (E16) 4 %PFA에서 실 온에서 20 분. 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS의 1 mL에 두 번 눈 컵 및 전체 눈을 씻어.
  5. Cryoprotect 눈 컵 그리고 1xPBS, pH 8.0 포함 10% 자당 1 시간 동안에 전체 눈. 1 시간 동안 20% 자당 1 x PBS에 유지 하 고 4 ° c.에 하룻밤 1 x PBS에서 30% 자당 포화
  6. 다음 날, 최적의 절삭 온도 화합물에 (10 월), (500 µ L) cryomolds에서 눈 컵 및 전체 눈을 포함, 스냅-동결 드라이 아이스/에탄올 목욕에서과-80 ° c.에 저장
  7. -80 ° C에서 임베디드 눈 컵 및 전체 눈 금형 제거과 cryosectioning 전에 1 시간 동안-20 ° C에 equilibrate 수 있습니다.
  8. 잘라 망막 횡단면 (12 µ m 두께) 축에 평행 temporonasal-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 시 신경 머리를 통해
  9. 현미경 슬라이드53 -80 ° c.에가 게에 망막 섹션을 탑재

2. Immunostaining 5-엠씨 및 5-hmC 항 체와

  1. 소수 성 장벽 펜으로 슬라이드에 장착 된 망막 섹션을 둘러싸십시오 소수 성 장벽을 펜 얼룩 조직 하는 데 필요한 항 체의 볼륨을 줄일 수 있습니다.
  2. 10 분의 1 x PBS의 200 µ L 한번 망막 섹션을 씻어.
  3. 0.1%의 200 µ L로 망막 섹션 permeabilize 실 온에서 10 분의 1 x PBS (PBS-T)에 트라이 톤 X-100.
  4. 변성 망막 섹션의 200 µ L 30 분 동안 37 ° C 배양 기에서 1 x PBS에 갓 2 N (HCl) 염 산을 만든.
    참고: HCl 치료의 주의 적정 5mC 신호를 최적화 하기 위해 필요 합니다.
  5. 항상 5mC 신호54를 최적화 하는 동안 생물 복제 (3-4)를 포함 합니다.
    참고: 우리가 4 시간 포인트 (15 분, 30 분, 1 시간 및 2 시간)에서 항 원 검색 그리고 발견된 30 분 인큐베이션 5mC 신호에 대 한 최적입니다. HCl 가진 더 긴 외피 5mC 신호는 핵을 지역화 하는 무 능력으로 이어지는 핵의 구조 저하 됩니다.
  6. 변성, 후 중화 망막 섹션 0.1의 100 µ L을 추가 하 여 10 분 동안 망막 부분에 트리 스-HCl (pH 8.3) M.
  7. 차단 하는 솔루션의 500 µ L에 섹션을 품 어 (0.1%에서 5 %preimmune 정상 염소 혈 청 1 x PBS에 Triton X-100) 습도 챔버에 실 온에서 1 h.
  8. 차단, 추가 안티-5mC; 안티-5hmC 항 체 희석 망막 섹션에 솔루션을 차단에 1: 500.
  9. 망막 섹션 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤을 품 어.
  10. 다음 날 세척, 망막 섹션 3 0.1% (10-15 분 각 시간) 시간 PBS-T 다음 해당 보조 항 체와 함께 솔루션을 차단에 품 어 고 (염소 안티 토끼와 염소 반대로 마우스 IgG, 희석; 1:1000), DAPI (4', 6-를 포함 하 diamidino-2-phenylindole) 솔루션 (1 µ g/mL) 솔루션을 차단에 1 시간을 위한 실내 온도에.
    참고: 섹션의 immunodetection의 모든 단계 동안 건조 하지 마십시오.
  11. 씻어 슬라이드 1 mL의 0.1%와 3 시간 PBS.
  12. 마지막 세척 후 수성 장착 매체는 coverslip 아래 섹션을 탑재 하 고 무색 매니큐어와 함께 인감.

3. confocal Immunohistochemistry

  1. 항상 한 가지 방법 (예를 들어, 최대), 일관성에 대 한 직면 시 컵의 망막 색소 상피 면을 섹션을 방향을 정하십시오.
  2. Immunostained 망막 섹션 63 X에서 (대물 렌즈의 배율) 2 X의 이미지 캡처를 수행 또는 3 배 줌.
  3. 각 선택 된 이미지의 여러 광학 섹션 생성 (z-스택) 모든 3 채널 (빨강, 녹색 및 파랑 RGB)에 0.35 µ m 단계를 사용 하 여.
    참고: 견본 10-20 X에서 시각의 최종 배율 (대물 렌즈의 배율) 될 것입니다 63 X, 각각, (일반적으로 사용 되는) 10 배 눈 렌즈와 함께.
    5mC와 5hmC 신호를 찾으려고 압축된 광학 스택을 시각화합니다

Representative Results

Postmitotic 망막 및 망막 개발 하는 동안 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 분포를 결정 하기 위해 우리 immunostained C57BL/6J 마우스 망막 섹션 E16, P0, P15, p90 받게에서 특정 항 체와 5mC와 5hmC.

E16 5mC 얼룩 했다 세포 핵의 chromocenters에서 강한 동안 전체 세포 핵 (그림 1a)에서 관찰 되었다 약한 얼룩. 세포 핵에 국한 되었다 5hmC 얼룩이 지 고 결 석 했다 chromocenters (그림 1b)에서.

P0 망막 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 2a, 화살표 및 화살표)의 chromocenters에 지역화 되었습니다. 우리는 또한 세포 핵의 chromocenters 사이 5mC의 약한 얼룩이 관찰. 5hmC 신호 chromocenters (그림 2b) 제외한 세포 핵에 강력 하 게 존재 했다. 우리는 더 많은 핵 5mC와 5hmC 내부 neuroblast 레이어 (INBL) (그림 2 c, 점선)에 묻은 게 있다 발견

P15 망막에서 우리는 5mC와 외부 핵 층 (ONL), 안 핵 층 (INL)와 신경 절 세포 층 (GCL) (그림 3)에서 5hmC의 강한 얼룩 다는 것을 발견. ONL (로드 대뇌), 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 3a-3 c, 3 세대)의 chromocenters에 존재 했다. 5hmC 신호는 chromocenters (그림 3-3 층)를 제외한 전체 세포 핵에 발견 되었다. P15 망막에 전송 전자 현미경 검사 법 5mC 항 체 신호 (그림 3 h3i) 발견 비슷한 막대 세포 핵에 heterochromatic 도메인의 분포를 보여줍니다.

INL 및 GCL 5mC 얼룩 세포 핵의 chromocenters에 강한 고 약한 얼룩 전체 세포 핵 (수치 3j-3 l3t 3r)에서 또한 관찰 되었다. 5mC, 반면 5hmC 신호 했다 INL 및 GCL (그림 3 m-3o3u 3w)에서 chromocenters 제외한 전체 세포 핵에 지역화 됩니다. 우리는 강한 관찰 GCL 세포 핵의 주변에서 5hmC 신호.

성인 봉 대뇌에서 5mC 신호 5hmc 신호는 핵 주변 (그림 4 d-4 층)에 국한 되었다 하는 동안 chromocenter 및 세포 핵 (그림 4a-4 c)의 핵 주변에 제한 되었습니다.

Figure 1
그림 1입니다. 지 배아 일 16에 방화 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine
5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunostaining (빨강) 및 5hmC (녹색, b). E16, 5mC 신호 세포 핵의 chromocenters에 매우 강하고 또한 훨씬 낮은 수준에서 전체 세포 핵에 존재입니다. 5hmC 얼룩 세포 핵에 독점적으로 수감 했다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. Immunohistochemical 출생 후 하루 0에서 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine의 얼룩.
5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunolabeling (빨강) 및 5hmC (녹색, b). P0 망막 5mC와 5hmC에서는 외부 neuroblast 레이어 (ONBL)와 내부 neuroblast 레이어 (INBL)에 있습니다. 5mC) 신호는 chromocenters (화살표)과 셀 핵 (화살촉)의 핵 주변에 강력 하 게 존재. 5mC의 약한 얼룩 세포 핵의 chromocenters 사이 관찰 됩니다. b) 5hmC 얼룩은 세포 핵에 국한 하 고 강한 신호는 INBL (패널 c에서 점선)에서 관찰 됩니다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 마우스 망막에서 출생 후 하루 15에서.
안티-5mC와 5hmC 항 체 (a-g, j-y)와 함께 C57BL/6J 망막의 Immunostaining. 외부 핵 층 (ONL) (막대 대뇌) 5mC 신호에에서 (빨강, 셀 핵 (화살촉, b)의 chromocenters와 일치 한) 일반적으로 고도 (화살표, b) 핵 주변에 localizes. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 신호 (녹색, d)는 chromocenters 제외 하 고 전체 셀 핵에 국한 됩니다. 패널 (녹색)와 f (회색) g 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 패널 h와 나는 heterochromatic 도메인의 산 후 하루 15 보여주는 배포에서 포토 리셉터 핵의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 패널 h에 검은 화살표 빨간색 화살표 핵 주변에 있는 섬으로 가리킨 동안 로드 포토 리셉터 핵 내의 heterochromatic 도메인을 가리킨 패널에 빨간 화살촉 단일 로드 포토 리셉터 핵 패널 i. 확대를 가리킵니다. INL (j-q), GCL 세포 핵 (r-y) 5mC 신호 (적색) 주변에 chromocenters를 지역화 하 고 약한 얼룩 감지 세포 핵의 나머지에서. 패널 k 씨 (빨간색)와 (회색) 이미지 j에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 5hmC 얼룩 (녹색) INL 및 GCL 세포 핵에 전체 세포 핵에 국한 됩니다. Note 강한 5hmC GCL 셀의 핵 주변에 얼룩. 패널 p와 x 패널 q 및 y 각각 이미지 p와 x에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 하는 동안 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 로드 포토 리셉터 핵에 C57BL/6J 마우스 망막의 산 후 하루 90에서.
5mC 얼룩 (빨강, 한) 핵 주변에 있는 세포 핵 및 또한 약하게 현재 chromocenter에 강력 하 게 존재 하는. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 얼룩 (녹색, d)은 독점적으로 핵 주변 패널 e (녹색)에 국한 하 고 g 병합된 5mC와 패널 h 동안 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 된 영역의 f (회색) 대표 확대 표시 영역의 확대 g. 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는 이미지에 별표. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

DNA 메 틸 화와 hydroxymethylation는 역동적이 고 가역 DNA 수정, modulatethe는 개발 뿐만 아니라 postmitotic 세포에서 생물 학적 메커니즘의 다양 한 범위. 여기, 우리가 설명 하는 단원의 paraformaldehyde 고정 냉동 마우스 망막의 immunohistochemical 기술 (안티-5mC와 안티-5hmC 항 체를 사용 하 여)에 의해 5mC와 5hmC DNA 수정에서 제자리에서 탐지 하기 위한 재현 기법 제공 개선 하 고 여러 다른 견본을 비교 하는 경우에 특히, 결과 표준화 지침. 우리 이전 5mC 변경 Dnmt1, Dnmt3aDnmt3b DNA methyltransferase 유전자를 망막 특정 프로세서용으로 마우스 망막에 윤곽을 그리 다이 메서드를 사용 하 고 보고 그들의 망막7에에서 5mC 마크 (예상된) 고갈 .

5mC immunohistochemical 감지에 중요 한 단계는 HCl 조직학 섹션의 처리의 최적화: HCl와 과도 한 치료는 핵을 파괴 하는 반면 15 분 전처리 재현성 결과 생산 하지 예상 보다 적은 아키텍처입니다. 우리는 HCl과 30 분 부 화 후 최상의 결과 발견. 우리는 항상 DNA 변성 및 망막 조직 고정을 위한 갓 희석된 HCl와 갓 만든된 4 %PFA 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다.

결과 해결 하려면 5mC 신호를 최적화 하는 동안 3 ~ 4 생물 복제를 포함 하도록 권장 합니다. 각각의 설정 하는 동안 immunohistochemical 얼룩 생성할 수 있습니다 약간 다른 결과 (다소 밝은 heterochromatic 지구를), 개별 집합 내의 immunohistochemical 방법, 5mC 및 5hmC 핵 분포에 예상 되는 섹션의 프로토콜 다음으로 재현성에 대 한 것으로 예상 된다.

이 기술은 또한 있다 제한 우리가 일관 되 게 동일한 섹션 포토 리셉터 세포 핵에 5mC 유통에서 변화 관찰. 우리는 인접 한 세포 핵 보였다 5mC 신호 하는 동안 강한 5mC 신호를 보여 일부 핵을 발견. 이것은 냉동된 섹션에서 HCl 처리에 의해 unmasking 5mC 항 한계 때문 이다.

이 기술의 중요성 DNase 및 가수분해 K 치료 chromocenters의 더 나은 보존을 선도 하지 않고 5mC 지역화를 수 있습니다. 이 기술은 모든 척추 동물의 조직, 운반 5mC, 5hmC 마크에서 어떤 섹션에 견고 하 게 작동 하는 것으로 예상 하 고 프로토콜 다음으로 뿐만 아니라 마우스 망막, 비슷한 방식으로 처리.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 지원 SBIR 교부 금 (1R44EY027654-01A1)에 의해.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss

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References

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