Combinate le modifiche genetiche e chimiche del Capsid di vettori basati su Adenovirus Gene Transfer per schermatura e Targeting

Biology

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Summary

Il protocollo descritto qui consente ai ricercatori di modificare specificamente capsidi adenovirus su siti selezionati dalla chimica semplice. Schermato adenovirus vettori particelle e gene bersagliamento trasferimento vettori possono essere generati, e interazioni ospite vettoriale possono essere studiati.

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Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

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Abstract

L'adenovirus vettori sono potenti strumenti per Oncolitica di vaccinazione e oncolytic genetica. Tuttavia, sono inclini a più interazioni indesiderate vettore-ospite, soprattutto dopo la consegna in vivo . È un consenso che i limiti imposti dalle interazioni indesiderate vettore-ospite possono solo essere superata se vengono eseguite modifiche definite della superficie vettoriale. Tali modifiche includono targeting tramite l'introduzione di nuovi ligandi e schermatura delle particelle da interazioni indesiderate. L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di consentire al lettore di generare schermato e, se lo si desidera, reindirizzati adenovirus umano gene transfer vettori o virus oncolitici. Il protocollo consentirà ai ricercatori di modificare la superficie di capsidi vettoriale dell'adenovirus da allegato specifico chimica di polimeri sintetici, carboidrati, lipidi o altre molecole biologiche o chimiche. Esso descrive la tecnologia all'avanguardia di modifiche combinato del capsid genetica e chimica, che sono stati indicati per facilitare la comprensione e il superamento delle barriere per la consegna in vivo di vettori dell'adenovirus. Viene fornita una descrizione dettagliata e commentata delle fasi cruciali per l'esecuzione di specifiche reazioni chimiche con virus biologicamente attivi o vettori derivati dal virus. La tecnologia descritta nel protocollo si basa sull'introduzione genetica della cisteina (naturalmente assente) residui in solvente-esposti cicli di vettori derivati dell'adenovirus. Questi residui di cisteina forniscono una specifica reattività chimica che, dopo la produzione dei vettori per gli alti titoli, è utilizzabile per altamente specifico ed efficiente accoppiamento chimico covalente di molecole da una vasta gamma di classi di sostanze al vettore particelle. D'importanza, questo protocollo può essere facilmente adattato per eseguire un'ampia varietà di differenti modificazioni chimiche (non-tiolo-base) di capsidi vettoriale dell'adenovirus. Infine, è probabile che vettori di trasferimento non capsulati genica basati su virus diverso da quello dell'adenovirus può essere modificato dalla base del presente protocollo.

Introduction

Adenovirus (annuncio), membri della famiglia Adenoviridae, sono virus a DNA senza involucro di cui più di 70 tipi finora sono stati identificati (http://hadvwg.gmu.edu). Seconda hemaglutination proprietà, struttura del genoma e risultati di sequenziamento, i tipi di 70 annunci possono essere diviso in sette specie (Adenovirus umano A G)1,2. Il genoma umano di annuncio è di 38 kb e incapsulato da un nucleocapside icosahedral3. A causa della loro abbondanza, il hexon di proteina del capside, penton base e fibra sono tutti appresso proteine del capside principali. Il hexon di proteine più abbondanti e più grande capside forma 20 sfaccettature del capsid, ciascuno composto da 12 hexon homotrimers4,5. Penton, situato su ogni bordo icosahedral (vertice), si compone di pentameri di una base di penton e rappresenta la base per il picco di vertice che è costruito di glicosilata fibra trimeri5,6. La voce di cella Ad nativa è sostanzialmente composto da due fasi principali. In primo luogo, la manopola di fibra si lega al recettore primario. In tipi di annunci da specie A, C, E e F, questo è il recettore di coxsackie e adenovirus (auto). Questa interazione porta il virione in prossimità spaziale della superficie delle cellule, facilitando in tal modo le interazioni tra le integrine cellulare e RGD-motivo nel penton base e di conseguenza l'induzione delle risposte cellulari. In secondo luogo, cambiamenti nel citoscheletro conducono alla interiorizzazione del virione e trasporto alla endosoma7. Su smontaggio parziale nell'endosoma, il virione è rilasciato al citoplasma und viaggia in definitiva al nucleo per la replica.

Mentre l'annuncio possa essere recapitato localmente (ad es., per la vaccinazione genetica), sistemica consegna attraverso il flusso sanguigno come richiesto per onco-Oncolitica deve affrontare diversi ostacoli. Mentre circolano nella circolazione sanguigna, iniettati virioni ritrovarvi con il sistema di difesa del sistema immunitario dell'ospite, che porta alla rapida neutralizzazione dei vettori basati su virus e vettori basati su annuncio di rendering estremamente inefficiente in applicazioni sistemiche. Inoltre, la hepatotropism naturale dell'annuncio interferisce con la consegna sistematica e devono essere risolti per reindirizzare Ad a sue nuove cellule bersaglio.

Germinale-codificato gli anticorpi di IgM naturali del sistema immunitario innato rapidamente riconoscono e legano strutture altamente ripetitive sulla superficie del virione8,9. Questi complessi immuni quindi attivano le vie di classiche e non classica del sistema del complemento, che conduce velocemente complemento-mediata di neutralizzazione di una gran parte dei virioni8. Una seconda via conseguente rimozione principali dei virions di annuncio è mediata dai macrofagi10 e connessi con acuta tossica ed emodinamici effetti collaterali11,12. Nel caso di annuncio in particolare, Kupffer cellule residenti nel fegato associare a e phagocytically occupano l'annuncio virioni tramite specifici recettori scavenger, quindi eliminarli dal sangue13,14,15 . Recettori scavenger specifiche sono stati identificati anche su cellule endoteliali sinusoidali del fegato (cellule di LSE)16, e le cellule LSE sembrano anche contribuire al vettore eliminazione17, ma a che punto ha ancora bisogno di chiarimenti. Inoltre, alcuni tipi di annunci e dei loro vettori derivate in modo efficiente sono sequestrati da eritrociti umani18 a cui si legano tramite auto o il recettore del complemento CR119. Di nota, questo meccanismo sequestrante non può essere studiato nel sistema modello del mouse come in contrasto con gli eritrociti umani, gli eritrociti del mouse non esprimono auto.

Anticorpi specifici anti-annuncio generati dal sistema immunitario adattativo dopo l'esposizione a questo annuncio a causa di precedenti infezioni con l'annuncio o dopo la prima consegna in applicazioni sistemiche sollevare un ulteriore ostacolo all'efficace uso di vettori Ad, ed essi dovrebbero essere eluso in consegna efficiente e sistematica.

Infine, il forte hepatotropism di alcuni tipi di annunci (compresi Ad5) gravemente ostacola applicazione dell'annuncio in terapia sistemica. Questo tropismo conseguente trasduzione dell'epatocita è dovuto l'alta affinità del virione annuncio per il fattore di coagulazione di sangue X (FX), mediato dall'interazione di FX con l'annuncio del hexon proteina20,21,22. FX colma il virione di eparina solfato glicani (HSPGs) sulla superficie di epatociti20,23,24,25. Un fattore cruciale per questa interazione sembra essere la misura specifica di N - e O-solfatazione di HSPGs in cellule di fegato24, che è distinta da HSPGs su altri tipi di cellule. Oltre a questa via FX-mediata, gli studi recenti suggeriscono ulteriori percorsi non ancora identificati che si traducano in trasduzione di annuncio di epatociti26,27,28.

Recentemente, risulta che FX non è solo coinvolto nella trasduzione degli epatociti dell'annuncio, ma anche dall'associazione, il virione scudi la particella virale contro neutralizzazione dal sistema complemento26. Riduzione della trasduzione dell'epatocita impedendo l'associazione FX, pertanto, creerebbe l'effetto collaterale indesiderato di crescente annuncio neutralizzazione tramite il sistema immunitario innato.

Una profonda conoscenza delle complesse interazioni tra vettori e organismi ospite è quindi necessaria sviluppare vettori più efficiente per le applicazioni sistemiche che aggirare gli ostacoli imposti dall'organismo dell'ospite.

Una strategia che è stato originariamente utilizzata per le proteine terapeutiche è stata adattata per i vettori Ad almeno parzialmente superare le barriere descritte sopra. Antigenicità ed immunogenicità dei composti di proteine terapeutiche potrebbe essere ridotto dall'accoppiamento di polietilenglicole (PEG)29,30. Quindi, l'accoppiamento covalente di polimeri quali PEG o poli [N-(2-idrossipropil) methacrylamid] (pHPMA) per le proteine del capside superficie protegge il vettore da interazioni indesiderate vettore-ospite. Comunemente, polimero gruppi ε-amminici obiettivi di accoppiamento da residui di lisina laterali che sono distribuite in modo casuale sulla superficie del capside. Particelle di vettore in soluzione sono, a causa della natura idrofila dei polimeri allegati, circondate da un guscio di acqua stabile che riduce il rischio di riconoscimento delle cellule immuni o degradazione enzimatica. Inoltre, vettori di PEGylated annuncio sono stati indicati per eludere la neutralizzazione di anticorpi anti-hexon in vitro e in topi pre-immunizzati in vivo31. In contrasto con le modifiche genetiche del capsid, accoppiamento chimico dei polimeri viene eseguita dopo la produzione e purificazione, permettendo non solo per l'uso di convenzionale produttore cellule e produzione delle scorte di alto titolo vettoriale, ma anche per simultanea modifica di migliaia di aminoacidi sulla superficie del capside. Tuttavia, ammina-regia di schermatura si verifica in modo casuale su tutta la superficie intera del capsid, alta eterogeneità e non consentendo per la modifica di specifici capsomers. Inoltre, le moiety polimero grande necessarie per gli effetti benefici compromettere virus bioattività32.

Per superare queste limitazioni, Kreppel et al. 33 ha introdotto un concetto di geneti-chimiche per re - vettore e de-targeting. Cisteine geneticamente sono stati introdotti il capside del virus alle posizioni esposte al solvente come fibra HI-ciclo33, proteina IX34e hexon35,36. Anche se non naturale, cisteina-cuscinetto vettori di annuncio possono presentarsi ad alti titoli in cellule normali produttore. D'importanza, inserimento delle cisteine in determinate capsomers e in diverse posizioni all'interno di un singolo capsomer consente di effettuare modifiche altamente specifiche di moiety gruppo reattivo del tiolo. Questo approccio geneti-chimica ha dimostrato di superare numerosi ostacoli nel disegno vettoriale di annuncio. La combinazione di base ammina PEGilazione tiolo-basato di accoppiamento della transferrina alla manopola fibra che Hi-ciclo è stato provato con successo reimpostare per volta vettori di annuncio per auto-carenti cellule33e detargeting. Dal hexon è coinvolto nelle interazioni più indesiderati (neutralizzando gli anticorpi, FX di fattore di coagulazione del sangue), strategie di modificazione del tiolo-base vengono applicate anche ad hexon. Piccolo PEG moiety di accoppiamento a HVR5 del hexon ha impedito le particelle di vettore di annuncio per trasdurre cellule SKOV-3 in presenza di FX, mentre grande PEG moiety aumentato dell'epatocita trasduzione14,35. Particelle di vettore di annuncio che trasportano le mutazioni nella manopola fibra inibendo il legame auto e HVR7 legame d'inibizione della FX (e cuscinetto inserito cisteine in HVR1 per posizione-specifiche PEGilazione) sono state indicate per eludere la neutralizzazione degli anticorpi e complemento-mediata, così come assorbimento di mediata dal recettore scavenger senza perdita di infettività. È interessante notare che, malgrado una mancanza dello scudo naturale FX, PEGilazione nuovamente migliorato trasduzione degli epatociti in funzione della PEG dimensioni36. Tuttavia, è stato dimostrato che la schermatura covalente hanno un impatto sui processi di traffici intracellulari. Prill et al. rispetto irreversibile contro scudi bioresponsive basato su pHPMA e ha dimostrato che né la modalità di carica schermatura né co-polimero ha avuto un impatto su immissione di cella ma ha colpito la particella traffico al nucleo. Impiegando uno scudo bioresponsive con carica positiva pHPMA co-polimeri ammessi per traffico di particelle nel nucleo, mantenendo l'efficienza di trasduzione alta dell'annuncio vettori in vitro e in vivo37.

In sintesi, questi dati indicano che, anche sotto l'ipotesi che tutte le interazioni-ospite-vettore erano conosciute e considerate, capside eccessiva superficie sono necessarie modifiche per superare gli ostacoli connessi con consegna sistemica vettoriale.

Qui forniamo un protocollo per eseguire modifiche chimiche site-specifiche di capsidi vettoriale dell'adenovirus per schermatura e/o di retargeting di particelle di vettore dell'adenovirus e virus oncolitici basati sull'adenovirus. Il concetto di questa tecnologia è descritta nella Figura 1. Permette la schermatura di alcune regioni del capsid da interazioni indesiderate dal legame covalente di polimeri sintetici. Allo stesso tempo, fornisce anche un mezzo per collegare ligandi e combinare schermatura e targeting. Utilizzando chimica semplice, sperimentatori sarà in grado di modificare covalentemente superficie vettoriale dell'adenovirus con una grande varietà di molecole tra cui peptidi e proteine, carboidrati, lipidi e altre piccole molecole. Inoltre, il protocollo prevede un concetto generale per la modificazione chimica di vettori di virus-derivati biologicamente attivi sotto mantenimento della loro integrità biologica e attività.

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Protocol

Nota: In seguito, un protocollo per la PEGilazione geneti-chimico di un annuncio di vettore è descritto al dettaglio. Per attivare specifico accoppiamento della parte di PEG, un vettore di Ad5 in anticipo era geneticamente modificato dall'introduzione di un residuo di cisteina nella proteina hexon al loop ipervariabili 5 come descritto in una precedente pubblicazione36e un piolo maleimide-attivato composto è utilizzato come composto di accoppiamento.

1. preparazione del buffer per la purificazione di vettore dai gradienti di CsCL passo

  1. Preparare 400 mL di buffer di Adenovirus (annuncio-buffer) aggiungendo 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) e 150 mM NaCl (3,504 g/400 mL) di acqua bidistillata (ddH2O). 350 mL di questo buffer è necessaria per preparare le seguenti tre varianti di annuncio-buffer.
    1. Variante a: regolare 150ml di annuncio-tampone a pH 7,6 con NaOH.
    2. Variante b: aggiungere una concentrazione finale di 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] a 50 mL e regolare a pH di 7,2 con HCl.
    3. Variante c: aggiungere una concentrazione finale di 0,5 mM TCEP (0,022 g) 150 mL e regolare a pH di 7,2 con HCl.
    4. Preparare i buffer in ddH2O e prodotti chimici puri per analisi. Utilizzare 100 mL ciascuno di variante A e variante C per preparare i buffer di CsCl (Vedi punti 1.2 e 1.3; 50 mL di ciascuno) necessarie per le pendenze di passaggio di CsCl (vedere i passaggi 3.2.6. e 3.2.18).
  2. Preparando il buffer gradiente di CsCl passo (ρCsCl = 1,41 g/cm3) nel buffer di annuncio
    Nota: Sarà necessario questo buffer in due diverse varianti:
    1. Pesare le due aliquote di esattamente 27,42 g di CsCl in provette da 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1,41/TCEP buffer: risolvere CsCl in 40 mL di variante C del annuncio-buffer.
    3. ΡCsCl = 1,41 buffer: risolvere CsCl in 40 mL di variante A del annuncio-buffer.
    4. Controllare e se necessario, regolare il pH con HCl. riempimento fino a esattamente 50 mL con la variante di annuncio-buffer corrispondente. Per ottenere i migliori risultati di separazione, l'esatta concentrazione di CsCl e pH sono cruciali.
    5. Controllare la densità (CsCl contenuto) da 1 mL (1,41 g) di pesatura di ogni sfumatura buffer.
  3. Preparando il buffer gradiente di CsCl passo (ρCsCl = 1,27 g/cm3) nel buffer di annuncio
    Nota: È necessario questo buffer in due diverse varianti:
    1. Pesare due aliquote di esattamente 18,46 g di CsCl in provette da 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1.27/TCEP buffer: risolvere CsCl in 40 mL di variante C del annuncio-buffer.
    3. ΡCsCl = 1,27 buffer: risolvere CsCl in 40 mL di variante A del annuncio-buffer.
    4. Controllare e se necessario, regolare il pH con HCl. Infine, riempire fino a esattamente 50 mL con la variante di annuncio-buffer corrispondente. Per ottenere i migliori risultati di separazione, l'esatta concentrazione di CsCl e pH sono cruciali.
    5. Controllare la densità (CsCl contenuto) da 1 mL (1,27 g) di pesatura di ogni sfumatura buffer.
  4. Sterilizzare tutti i buffer (buffer di annuncio e buffer gradienti di CsCl passo) di filtrazione (con dimensione dei pori di 0.45 µm mesh) in bottiglie sterili.
  5. Dopo la sterilizzazione, per prevenire l'ossidazione del TCEP, saturare e sovrapporre i buffer contenente TCEP con argon di sparging i buffer con gas argon per circa 30 s. Fare attenzione a utilizzare solo dispositivi sterili (ad es., sterile puntali per pipette) quando si applica il gas argon e bottiglie di uso abbastanza grande da permettere il blubber di argon.
    Nota: Tutti i buffer deve essere pretrattati fresco e al riparo dalla luce e può essere conservati a 4 ° C per diversi giorni (soprattutto il CsCl passo gradiente buffer che deve essere tenuto solo per pochi giorni).

2. accoppiamento moiety: Conservazione e preparazione

Nota: Moeities utilizzato per l'accoppiamento con cisteine deve tenere gruppi tiolo-reattive. Maleimide-attivato composti formeranno legami tioetere stabile con le cisteine geneticamente introdotte. In alternativa, ortho-pyridyldisulfide (OPSS)-attivati composti possono essere usati, che formano bioresponsive ponti disolfuro tra le particelle di vettore e la frazione di accoppiamento. Liofilizzato malPEG-750, come pure la maggior parte altri reagenti di accoppiamento sono sensibili all'idrolisi e devono essere conservati a secco in forma di polveri liofilizzate a-80 ° C.

  1. Per evitare l'accumulo di condensa acqua dopo lo scongelamento delle fiale, conservare i flaconi in tubi di dimensioni maggiori (ad es., provette da 50 mL) riempito con un cuscino di perline di gel di silice. Conservare questi tubi in un adeguato contenitore più grande riempito anche con un cuscino di perlina di gel di silice.
  2. Prima di chiudere ermeticamente ogni tubo e contenitore, scambiare aria con gas argon. Ciò può essere ottenuto inserendo i tubi aperti e i contenitori in un essiccatore, seguito da rimozione e sostituzione dell'aria con gas argon. Poiché il gas argon è più pesante dell'aria, tubi e recipienti vengono riempite con gas argon e ora possono essere posizionati in ogni altro, con ogni coperchio ben chiuso.
  3. Conservare i contenitori a-80 ° C.
  4. Quando si scioglie, mettere i contenitori su perle di silice in un essiccatore e lentamente scaldarle fino a temperatura ambiente, quindi aprire il contenitore.
  5. Quando si esegue una reazione di accoppiamento, appena risolvere la quantità di substrato necessaria in solvente appropriato di accoppiamento. Fare attenzione a non per aggiungere più di 10% di soluzione di accoppiamento per la reazione di accoppiamento finale, soprattutto se DMF o DMSO è usato come solvente per il substrato di accoppiamento.

3. amplificazione, purificazione e modificazione chimica di vettori di annuncio:

  1. Amplificazione di vettori di annuncio
    Nota: La procedura seguente deve essere eseguita utilizzando un armadietto di sicurezza secondo le norme di sicurezza biologica locale.
    1. Transfect un vettore di annuncio ∆E1 carenti di replica contenente residui di cisteina geneticamente introdotto uno (o più) in cellule HEK 293 come descritto da Kratzer e Kreppel38.
    2. Secondo il protocollo38, amplificare il vettore di reinfezioni sequenziale fino a un finale infezione preparativa di 15-20 piastre per colture cellulari grande (15 cm) (circa 1-2 x 107 cellule/piastra).
      Nota: In modo ottimale, la reinfezione ultimo dovrebbe essere cronometrato affinché le cellule mostrano effetto pieno citopatico (CPE) la mattina di purificazione e la modifica delle prestazioni (Vedi Figura 2).
    3. Dopo la fase di amplificazione finale, le cellule risospese in annuncio buffer + 10mm TCEP (variante B) possono essere congelate a-80 ° C; Tuttavia, per resa ottimale delle particelle di vettore, è consigliabile un follow-up immediato di purificazione di lisi e vettore di cella e modifica.
  2. Modifica di purificazione e chimico di vettori di annuncio
    Nota: Purificazione di vettori viene eseguita secondo il protocollo di purificazione adenovirus descritto in38ma in condizioni non ossidanti. La raccolta e la lisi delle cellule così come modifica di purificazione e chimico vettoriale può essere eseguita entro un giorno. Raccolto e lisare le cellule infette secondo il protocollo descritto in precedenza38.
    1. Raccogliere le cellule raschiando le piastre e trasferendo il surnatante per provette di centrifugazione di 200-500 mL.
    2. Girare la soluzione di cella per 10 min a 400 x g.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di buffer di annuncio + 10mm TCEP (pH 7,2) (variante B) e trasferirlo in una provetta sterile da 50 mL. Se il rendimento delle celle è bassa o solo un debole CPE è stata indotta, e risospendere in 2 mL.
    4. Salvare il vettore di 3 cicli di congelamento (in azoto liquido) e scongelamento (in bagnomaria a 37 ° C).
    5. Centrifugare per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C.
    6. Durante la centrifugazione, preparare due uguali CsCl pendenze:
      1. In primo luogo, come la fase inferiore, aggiungere 3 mL di 1,41 g/cm3 ρCsCl in annuncio-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variante C) nei tubi ultracentrifuga. Contrassegnare il livello della fase più bassa sul tubo prima di caricare la fase superiore.
      2. Impilare accuratamente la fase superiore di 5 mL di 1,27 g/cm3 ρCsCl in annuncio-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variante C) pipettando molto lentamente il volume di 5 mL lungo le pareti del tubo sulla fase inferiore.
        Nota: Dal durante l'accoppiamento un'alta concentrazione di TCEP potrebbe reagire con il residuo di maleimide di malPEG-750 e portare ad efficienza di accoppiamento ridotto, purificazione di CsCl gradiente di passaggio deve essere eseguita già sotto una ridotta concentrazione di TCEP.
    7. Caricare il surnatante sulla sfumatura CsCl [sia ugualmente dividere il surnatante su entrambe le sfumature o, nel caso di un rendimento basso vettoriale (Vedi sopra), caricare il surnatante in una sola colonna] e riempire entrambe le sfumature ugualmente verso l'alto con annuncio buffer + 10mm TCEP (pH 7 .2, variante B).
    8. Regolare il peso dei tubi opposti ad una differenza di peso 0.0 g.
    9. Ultracentrifuga per 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
    10. Con un morsetto, fissare il tubo di ultracentrifugazione di uno stand, lasciando l'area intorno al contrassegno del livello fase inferiore accessibile. Posizionare la lampada a collo di cigno sopra il tubo. Intorno al marchio, al confine tra le fasi inferiore e superiore, una fascia distinta (i virions vettoriale) dovrebbe essere visibile (Figura 3A-3 C).
    11. Raccogliere i vettori di puntura il tubo con un ago e aspirando la band vettoriale in una siringa. Trasferimento virioni vettoriale raccolti in una provetta da 15 mL.
      Nota: Più deboli bande sopra la banda di vettore Ad contengono particelle vettoriale incompleto e dovrebbero essere evitati per aspirazione. I detriti cellulari e verde proteina fluorescente (EGFP) di annuncio-vettori che esprimono EGFP raccoglierà nella parte superiore dell'ultracentrifuga tubo (Vedi Figura 3A e 3B). Questa e le seguenti operazioni fino a accoppiamento (passo 3.2.16) devono essere eseguite rapidamente, come i vettori sono ora sensibili al bisolfuro incollaggio a causa della bassa concentrazione di TCEP.
    12. Per calcolare la quantità di substrato di accoppiamento necessarie per un legame completo efficiente del substrato di tutti i residui di cisteina nella preparazione vettoriale, misurare OD260:
      1. Secondo il protocollo descritto da Kratzer e Kreppel38, vortice una miscela di 10 µ l dei virions raccolti vettoriale, 89 µ l di tampone di annuncio e 1 µ l di 10% SDS. Come una sonda in bianco, il vortice 99 µ l di buffer di annuncio e 1 µ l di 10% SDS.
      2. Per denaturare i virions, incubare entrambi a 56 ° C per 10 min.
      3. Determinare OD260.
      4. Calcolare il titolo fisica vettoriale per µ l utilizzando la seguente equazione: OD260 x fattore di diluizione x coefficiente di estinzione empiricamente risoluto di annuncio (1.1 x 10 particelle di vettore9 = 1 OD260 unità / µ l). Di conseguenza, una misura OD260 di 1,36 di un vettore diluito 01:10, calcolerebbe a: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = 1,5 x 1010 vettoriale particelle / µ l.
        Nota: Questo titolo è solo una stima approssimativa; Tuttavia, è abbastanza accurata per i calcoli stechiometrici descritti di seguito.
    13. A seconda della proteina modificata dall'introduzione di una cisteina, determinare la quantità di substrato di accoppiamento (in grammi) per una reazione di accoppiamento efficiente, secondo la seguente equazione generale: titolo del Virus x Volume x numero di cisteine x eccesso di frazione x Molecolare peso della frazione / 6.022 x 1023 = grammi di substrato di accoppiamento.
      Nota: In questa equazione: titolo del virus 1) è il titolo / µ l, determinato dal OD260 come descritto sopra, conti 2) volume per il volume in µ l di aspirato vettore utilizzato nella reazione di accoppiamento, 3) il numero di cisteine è il numero di proteine in cui la cisteina residuo è stato introdotto per particella di vettore, 4) eccesso di frazione è il fattore della necessaria in eccesso di frazione per una reazione di accoppiamento efficiente (50x) e 5) il peso molecolare della molecola deve essere introdotto come Da (non kDa).
    14. Appena risolvere la quantità del composto (o quantità fattibile) necessaria nel solvente appropriato.
      Nota: Come la quantità di substrato di accoppiamento necessarie è basso e molto difficile da pesare ma costoso, pesare la quantità minima di possibili composti e dissolverlo in una concentrazione appropriata per l'applicazione per la reazione di accoppiamento.
    15. Trasferire la soluzione di vettore in un tubo di dimensioni appropriate (ad esempio, provetta da 2 mL) e aggiungere la quantità calcolata di soluzione stock composto di accoppiamento al vettore.
    16. Mescolare delicatamente la soluzione di rotazione testa per 1 h a temperatura ambiente.
    17. Riempire con la soluzione di vettore per il volume totale 6 mL con annuncio-tampone (pH 7,6, variante A).
      Nota: Questo passaggio deve essere eseguita prima che la soluzione è applicata alla sfumatura passo per garantire che la soluzione di vettore, che contiene ancora CsCl dal primo gradiente di passaggio, ha una densità inferiore a 1,27 g/mL.
    18. In una seconda fase di banding CsCl, purificare il vettore da parte dell'accoppiamento non reagito:
      1. Preparare due uguali CsCl pendenze attenendosi alla procedura seguente per ciascuno: fase 1) inferiore: 3 mL di 1,41 g/cm3 ρCsCl in annuncio-tampone (pH 7,6, variante A), 2) segnare livello di fase inferiore sul tubo prima di caricare la fase superiore e fase 3) superiore : 5 mL di 1,27 g/cm3 ρCsCl in annuncio-tampone (pH 7,6, variante A).
        Nota: Dopo l'accoppiamento ha avuto luogo, buffer senza TCEP vengono utilizzati, come nessun gruppi tiolici liberi dovrebbero essere presenti sui capsidi vettoriale.
      2. Caricare il surnatante sulla sfumatura CsCl e riempire entrambi gradienti ugualmente verso l'alto con il annuncio-tampone (pH 7,6, variante A).
      3. Regolare i pesi dei tubi opposti ad una differenza di peso 0.0 g.
    19. Ultracentrifuga per 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
    20. Poco prima della fine di ultracentrifugazione, equilibrare una colonna PD-10 5 volte con 5 mL di annuncio-tampone (pH 7,6, variante A).
    21. Come fatto nel passaggio 3.2.10, fissare il tubo di ultracentrifugazione di stare lasciando la zona intorno al contrassegno del livello fase inferiore accessibile. Posizionare la lampada a collo di cigno sopra il tubo. Ancora una volta, intorno al confine tra le fasi inferiore e superiore, una fascia distinta (i virions vettoriale) dovrebbe essere visibile (Figura 3).
    22. Raccogliere i vettori di puntura il tubo con un ago e aspirando la band vettoriale in una siringa e trasferire il vettore in una provetta da 15 mL. Fate attenzione a raccogliere i virions di entrambi i tubi sfumati insieme come un volume totale di 2,5 mL o meno. Se un più piccolo volume è raccolti, riempire per ottenere un volume totale di 2,5 mL con tampone di annuncio (variante A).
    23. Caricare il 2,5 mL equilibrata PD-colonna. Scartare il flusso continuo.
    24. Aggiungere 3 mL di tampone di annuncio (variante A) sulla colonna e raccogliere il flusso continuo (contenente i virions purificata vettoriale).
    25. Aggiungere glicerolo (333 µ l) per ottenere una concentrazione finale di 10% e dividere in aliquote adatte (ad es., 400 µ l ciascuna) e includere un'aliquota di 20 µ l per la determinazione del titolo di misura260 OD.
    26. Conservare la soluzione di vettore a-80 ° C.
    27. Determinare il titolo di vettore misurando il OD260 di 20 µ l di soluzione di vettore, µ l 79 del annuncio-buffer (variante A) e 1 µ l di 10% SDS come descritto nel passaggio 3.2.12. Come un vuoto, utilizzare µ l 79 del annuncio-buffer (variante A), 10 µ l di 10% glicerolo e 1 µ l di 10% SDS.
    28. Calcolare il titolo vettoriale come: OD260 x fattore di diluizione x 1,1 x 109 vettoriale particelle / µ l.
      Come preparato nel passaggio 3.2.27, calcolare: OD260 x 5 x 1,1 x 109 vettoriale particelle / µ l

4. Verifica dell'accoppiamento da SDS-PAGE:

Nota: Se composti con sufficientemente alti pesi molecolari sono usati per l'accoppiamento con i virions di annuncio, accoppiamento può essere verificata mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Accoppiamento riuscito quindi dovrebbe comportare uno spostamento della band proteina corrispondente per la proteina di virion annuncio modificata, rispetto alla proteina nel virione di annuncio non modificato (Vedi Figura 4).

  1. Secondo il titolo calcolato del vettore (passo 3.2.28), separare 1-2 x 1010 particelle di vettore da SDS-PAGE (8%).
  2. Sviluppare il gel dalla macchiatura d'argento del gel39 per rilevare fasce della proteina anche deboli:
    1. Preparare buffer per la macchiatura d'argento (tra parentesi sono indicati gli importi necessari per 100 mL di tampone):
      1. Preparare il tampone 1 mescolando 38 mL di ddH2O, 50% MeOH (50 mL di MeOH 100), 12% AcOH (12 mL di 100% AcOH) e 0.0185% HCHO (50 µ l di 37% HCHO).
      2. Preparare il tampone 2 aggiungendo 50% EtOH (50 mL del 100% EtOH) a 50 mL di ddH2O.
      3. Preparare il tampone 3 aggiungendo 0,127 g/L Na2S2O3 (12,744 mg) per 100 mL di ddH2O.
      4. Preparare il tampone 4 con l'aggiunta di 2 g/L AgNO3 (0,2 g) e 0.0185% HCHO (50 µ l di 37% HCHO) per 100 mL di ddH2O.
      5. Preparare il tampone 5 aggiungendo 60g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µ l di 37% HCHO) e 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) per ddH2O di ottenere un volume finale di 100 mL.
      6. Preparare il tampone di 6 mescolando 38 mL di ddH2O, 50% MeOH (50 mL del 100% MeOH) e il 12% AcOH (12 mL di 100% AcOH).
      7. Preparare il tampone 7 mescolando 60 mL di ddH2O, 30% MeOH (30 mL del 100% MeOH) e 10% glicerina (10 mL di glicerina al 100%).
      8. Preparare buffer 8 mescolando glicerina al 10% (10 mL di glicerina al 100%) con 90 mL di ddH2O.
  3. Esecuzione di macchiatura d'argento
    1. Difficoltà il gel in tampone 1 per 30 min.
    2. Lavare il gel in tampone 2 per 15 min.
    3. Pretrattare il gel in tampone 3 per 1 min.
    4. Lavare il gel 3 volte in ddH2O per 20 s.
    5. Impregnare il gel in tampone 4 per 20 min.
    6. Lavare il gel 2 volte in ddH2O per 20 s.
    7. Sviluppare il gel in tampone di 5 fino a quando le bande sono visibili (10 s a 10 min).
    8. Lavare il gel 2 volte in ddH2O per 2 min.
    9. Fermare lo sviluppo nel buffer 6 per 5 min.
    10. Conservare il gel in tampone 7 per 20 min.
    11. Conservare il gel in tampone 8.
      Nota: L'efficienza di accoppiamento può essere determinato mediante la quantificazione densitometrica delle bande modificate e non modificate del Capsomero mirato.

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Representative Results

Nella figura 2 vengono illustrati esempi dell'effetto citopatico (CPE) su 293 cellule (HEK 293) che indica la produzione di successo vettoriale. Le cellule dovrebbero mostrare morfologia (Figura 2) 40-48 ore dopo l'inoculazione con il vettore di virus. Timepoint giusto per la raccolta è fondamentale per non perdere le particelle del virus di lisi cellulare e impedendo l'ossidazione dei gruppi tiolici geneticamente introdotto. Se vettore particelle vengono rilasciate nel mezzo di lisi delle cellule, i tioli geneticamente introdotti quasi immediatamente saranno diventato ossidati e diventerà difficile purificare e modificarli chimicamente.

La figura 3 Mostra esemplare bande di CsCl. Lo scopo di discontinuo CsCl bendaggio prima modificazione chimica è quello di rimuovere i detriti cellulari da particelle del virus. La modifica stessa può quindi avvenire in CsCl. Il secondo banding dopo modificazione chimica serve a rimuovere un eccesso di frazione di accoppiamento (che non ha reagito). Della nota, una riuscita modifica del virus non può essere visto nella sfumatura e richiede ulteriori analisi molecolare, idealmente da SDS-PAGE.

La figura 4 Mostra tipici esempi di modifiche del capsid di successo. Maggior parte moiety accoppiati a specifici capsomeri modificherà il comportamento di esecuzione dei rispettivi capsomeri in SDS-PAGE. Dal confronto diretto con un controllo non modificato, il successo di accoppiamento può essere verificato, e l'analisi densitometrica può aiutare a determinare nel complesso accoppiamento efficienza (la percentuale delle bande spostati e unshifted per il Capsomero modificato).

Figure 1
Figura 1: le modifiche del capsid combinato di genetica e chimica di capsidi vettoriale dell'adenovirus abilitare legame covalente di polimeri di schermatura e targeting ligandi. Residui di cisteina sono geneticamente introdotto presso loop selezionato, esposte al solvente del capsid di capsidi vettoriale dell'adenovirus di dotare le particelle vettoriale con nuova reattività chimica. I vettori possono essere prodotti utilizzando i protocolli e le celle convenzionali produttore. Dopo la produzione, i residui di cisteina geneticamente introdotte sono specificamente e covalentemente modificati con accoppiamento tiolo-reattive moiety (ligandi, schermatura carboidrati, coloranti fluorescenti, piccole molecole, polimeri, ecc.). Per l'accoppiamento, composti maleimide-attivato (che formano legami tioetere stabile con superficie della particella di vettore) o derivati di pyridyldisulfide (che formano ponti disolfuro di bioresponsive) possono essere impiegate. Dopo l'accoppiamento, i vettori sono purificati da discontinuo CsCl banding per rimuovere moiety accoppiamento in eccesso che non ha reagito. PEG, polietilene glicole (schermatura del polimero); L, ligandi (derivati da un'ampia varietà di classi di sostanze); -SH, funzionalità del tiolo dei residui di cisteina geneticamente introdotto. Utilizzando questa tecnologia, un numero definito di molecole possa essere accoppiato in modo covalente i capsidi vettoriale e una selezione precisa del sito accoppiamento è fattibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: effetto citopatico durante la produzione vettoriale. Cellule di produttore convenzionale (qui, le cellule HEK-293) possono essere utilizzate per la produzione dei vettori geneticamente modificati prima della modificazione chimica. La comparsa di CPE indica timepoint migliori per raccogliere le cellule. (A) cellule due ore dopo l'infezione, (B) 24 ore dopo l'infezione e (C) cellule 40 ore dopo l'infezione prima della raccolta. Scala bar = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: esemplare risultati di gradienti di CsCl. Gradienti di CsCl prima (A, B) e dopo la modifica (C) chimica. (A) un vettore dell'adenovirus è fasciato da discontinuo CsCl centrifugazione in gradiente di densità. La fase superiore compare verde dal vettore indicato cassetta di espressione orsi hCMV-promotore-guidato per EGFP. Il virione di vettore è fasciato come un singolo, white band nel terzo inferiore del tubo. Le due bande più piccole (Vedi sopra) derivano da particelle incomplete, che non devono essere raccolti. (B) un vettore di annuncio che esprimono EGFP cisteina-cuscinetto prima modificazione chimica. (C) il vettore stesso dopo la modifica. La band nel terzo inferiore del tubo sarà raccolti e purificata da una colonna di dissalazione. Il segno di penna in B e C etichette al confine delle due densità e consente di identificare la posizione della band vettoriale che verranno raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: tinto SiIver SDS-PAGE per valutare l'efficienza di accoppiamento. Marcatore di MW nel vicolo 1. Un vettore con cisteine introdotte il penton capsomeri base e hexon è stato lasciato invariato (lane 2) o modificate con maleimide-attivato PEG (polietilenglicole) con un peso molecolare di 5 kDa (corsia 3). Hexon sia penton base esibiscono uno spostamento durante SDS-PAGE, che indica la riuscita modifica di > 90% dei monomeri a capside. Un vettore con un residuo di cisteina in hexon è stato lasciato invariato (vicolo 4), modificato con 5 kDa PEG (vicolo 5) o con 20 kDa PEG (vicolo 6). Si noti che il cambiamento più grande della band hexon è dovuto il più alto peso molecolare del kDa 20 PEG, rispetto ai 5 kDa PEG (vicolo 5). Il gel viene illustrato la specificità e l'efficienza dell'accoppiamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'efficienza con cui le cisteine geneticamente introdotte possono essere modificate chimicamente è in genere 80-99%, e determinate variabili influenzano questa efficienza. In primo luogo, è fondamentale che le cisteine geneticamente introdotte non subiscono l'ossidazione prematura. Pur essendo ben protetto in ambiente riducente delle cellule del produttore, è obbligatorio fornire un ambiente non ossidativo dopo rilasciando particelle di vettore dalle cellule di produttore e durante la modificazione chimica. A tal fine, riducendo i reagenti possa essere usata alle concentrazioni da 0,1-10 mM, ed è necessario usare reagenti riducenti non contenenti gruppi tiolici, che avrebbero reagito prontamente con maleimide-attivato composti. In secondo luogo, quando si utilizza composti maleimide-attivato, pH durante la reazione di accoppiamento non deve superare 7.35, poiché un pH superiore a 7,4 può diminuire la specificità della reazione. In terzo luogo, in ogni caso, privo di ammine buffer (ad es., HEPES, PBS) dovrebbero essere utilizzati per la reazione. Della nota, particelle di vettore di cisteina-cuscinetto possono essere purificate dalla doppia CsCl banding come descritto, quindi conservati in glicerolo HEPES/10% prima modificazione chimica. In questo caso, 0.1-1 mM TCEP dovrebbe essere utilizzato un reagente riducente, o preferibilmente, i vettori devono essere conservati in un'atmosfera di argon. Barattoli di plastica riempita di argon con coperchi possono essere utilizzati per questo scopo. Inoltre, modifica efficienza è influenzata dal diametro idrodinamico del composto accoppiato con i capsidi e il sito a cui è accoppiato. Molti capsomeri che possono servire come bersagli per la modifica di geneti-chimici specifica sono presenti nel capside come trimeri (fibra, hexon) o pentameri (penton base). Pertanto, a seconda della posizione della cisteina geneticamente introdotta, una molecola di frazione accoppiata ad un monomero stericamente potrebbe ostacolare l'accoppiamento di un'altra molecola di monomero vicino. Questo dovrebbe essere considerato quando si seleziona siti ideali per le modifiche del capsid geneti-chimiche.

Per facilitare la risoluzione dei problemi, alcuni problemi possono sorgere quando seguendo il protocollo descritto. Rendimenti di vector prime, basso (inferiore a particelle di 10.000 vettoriale per cella produttore) possono derivare dall'infezione non ottimale delle cellule di produttore. Idealmente, MOI 100-300 deve essere utilizzato per l'infezione delle cellule di produttore. Siete pregati di notare che entrambi gli importi vettore troppo alto e troppo basso per l'inoculo generano rendimenti non ottimali. È ideale per passaggio del produttore delle cellule il giorno prima dell'infezione. In secondo luogo, untuosa bande nei gradienti di CsCl possono apparire. Il motivo più frequente per apparenza untuosa di bande nei gradienti di CsCl è un pH delle soluzioni CsCl che è troppo acido. Il reagente riducente TCEP è molto acido, e cura deve essere presa per aggiustare il pH prima di caricare il vettore sulla sfumatura, dal momento che i vettori dell'adenovirus si disintegrano facilmente in ambiente acido. In terzo luogo, basso accoppiamento efficienze (< 80% di accoppiamento) sono il risultato più frequente delle preparazioni impuro vettore e/o ossidazione prematura dei gruppi tiolici sulla superficie del vettore. Le impurità possono essere rilevate da SDS-PAGE e macchiatura d'argento. Nel caso in cui si verificano impurezze significative, produzione di vettore deve essere riavviato. Inoltre, l'efficienza di accoppiamento basso può essere causato da liberi non vettoriale tioli nella reazione. Pertanto, è consigliabile non utilizzare ß-mercaptoetanolo o ditiotreitolo come i reagenti, poiché entrambi contengono gruppi tiolici liberi. Della nota, selezionare siti accessibili da solvente per introdurre i residui di cisteina che possono essere facilmente modificati, devono essere utilizzate strutture cristalline; in caso contrario, le cisteine potrebbero non essere accessibili al partner di accoppiamento. L'ossidazione prematura dei tioli sulla superficie vettoriale può essere evitato mediante l'uso rigoroso di argon e/o TCEP.

Infine, errori nei calcoli stechiometrici può anche portare a basso accoppiamento efficienze. Nell'esempio seguente è destinata a illustrare la formula generica presentata sopra e facilitare i calcoli stechiometrici. Nell'esempio, una cisteina viene introdotta la hexon di Capsomero. 1.5 x 10 particelle di vettore10 / µ l e come parte di accoppiamento, malPEG-750 è utilizzato, si determina il titolo delle particelle di vettore dopo il CsCl primo passo gradiente purificazione. Ogni capside del vettore contiene 720 hexon proteine (240 trimeri), così il titolo di cisteine per µ l di conseguenza riassume in 720 x 1,5 x 1010 = 1.08 x 1013 cisteine / µ l. Al fine di modificare 1,5 mL di particelle vettoriale, un totale di 1.62 x 1016 cisteine devono essere reagiti con la frazione di accoppiamento. Per raggiungere accoppiamento efficiente, è consigliabile un 50 x eccesso molare dell'accoppiamento composto per il totale dei residui di cisteina: 1.62 x 1016 x 50 = 8,1 x 1017 molecole di malPEG-750 è necessario accoppiare in modo efficiente per il 1.5 x 1016 cisteine di 1,5 mL di soluzione di vettore purificato mediante il primo gradiente di passaggio di CsCl. MalPEG-750 esibisce un peso molecolare di 750 Da; quindi, 6.022 x 1023 molecole di malPEG-750 pesano 750 g. Pertanto, per accoppiamento efficiente di 1.62 x 1016 residui di cisteina in 1,5 mL di soluzione di vettore con un eccesso di 50 x di malPEG-750, 8.1 x 1017 molecole di malPEG-750 = (750 x 8,1 x 1017) / (6.022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 sono necessari.

Il metodo presentato integra e supera il metodo del vettore PEGilazione. Convenzionale, ammina-regia vector PEGilazione non consente per fissaggio site-specific di schermatura o targeting moiety, mentre la tecnologia di accoppiamento geneti-chimiche qui presentata può essere utilizzata per collegare precisamente moiety al vettore dell'adenovirus superfici in posizioni definite e in numeri di copia definito. Pertanto, è adatto sia per schermatura e targeting delle particelle di vettore dell'adenovirus.

Della nota, il presente protocollo è utilizzabile anche per un convenzionale PEGilazione ammina-regia di vettori annuncio menzionato sopra. In tal caso, il reagente riducente TCEP può essere omesso dai buffer. Per calcoli stechiometrici, 18.000 può essere considerato il numero di gruppi amminici accessibile per particella ed eccessi tipici molari di accoppiamento ammina-reattivo moiety sono 20-100 volte.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

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