Genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen der Gentransfer Adenovirus-basierte Vektoren kombiniert für Abschirmung und Targeting

Biology

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Summary

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Forschern speziell Adenovirus Capsids an ausgewählten Standorten durch einfache Chemie ändern. Geschirmte Adenovirus Vektoren Partikel Targeting-gen Übertragung Vektoren erzeugt werden können und Vektor-Wirt-Interaktionen untersucht werden können.

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Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

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Abstract

Adenovirus-Vektoren sind mächtige Werkzeuge für genetische Impfung und onkolytische Virotherapie. Jedoch sind sie anfällig für mehrere unerwünschte Vektor-Wirt Interaktionen, vor allem nach Lieferung in Vivo . Es ist ein Konsens, dass die Beschränkungen durch unerwünschte Vektor-Wirt Interaktionen können nur überwunden werden, wenn definierte Modifikationen der Vektor Oberfläche durchgeführt werden. Diese Änderungen umfassen Abschirmung der Teilchen aus unerwünschten Wechselwirkungen und gezielt durch die Einführung des neuen Liganden. Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll den Leser zu generieren abgeschirmt und, falls gewünscht, umleiten, menschliche Adenovirus gen Übertragung Vektoren oder onkolytische Viren. Das Protokoll ermöglicht es Forschern, die Oberfläche des Adenovirus-Vektor-Capsids von bestimmten chemischen Anlage von synthetischen Polymeren, Kohlenhydrate, Lipide oder anderen biologischen oder chemischen Moieties zu ändern. Es beschreibt die Spitzentechnologie der kombinierten genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen, die gezeigt worden, um das Verständnis und die Überwindung der Barrieren für in Vivo Lieferung von Adenovirus Vektoren zu erleichtern. Eine ausführliche und kommentierte die entscheidenden Schritte für die Durchführung von bestimmter chemischer Reaktionen mit biologisch aktiven Viren oder Virus-abgeleitete Vektoren ist beschrieben. Im Protokoll beschriebene Technik basiert auf der genetischen Einführung (natürlich abwesend) Cystein Rückstände in Lösungsmittel ausgesetzt Schleifen von Adenovirus-abgeleitete Vektoren. Diese Cystein-Reste bieten eine spezifische chemische Reaktivität, die nach der Produktion der Vektoren, hohe Titer für sehr gezielt und effizient kovalente chemische Kopplung der Moleküle aus den unterschiedlichsten Substanzklassen zum Vektor ausgenutzt werden kann, Partikel. Wichtig ist, kann dieses Protokoll leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von verschiedenen (nicht-Thiol-basierten) chemische Modifikationen des Adenovirus-Vektor-Capsids durchzuführen. Schließlich ist es wahrscheinlich, dass unbehüllte Viren Gene Transfer Vektoren anders als Adenovirus auf der Basis dieses Protokolls geändert werden kann.

Introduction

Adenoviren (Ad), Mitglieder der Familie Adenoviridae, sind unbehüllte DNA-Viren, von denen mehr als 70 Arten bisher identifizierten (http://hadvwg.gmu.edu) gewesen sein. Je nach Hemaglutination Eigenschaften, Genom-Struktur und Sequenzierung Ergebnisse können sieben Arten (menschliche Adenoviren A bis G)1,270 n. Chr. Typen unterteilt werden. Das menschliche Genom Ad 38 kb groß ist und von einem ikosaedrischen Nukleokapsid3eingekapselt. Aufgrund ihrer Fülle sind das Kapsid Protein Hexon, Penton Basis und Faser alle großen Kapsid-Proteine genannt. Die häufigste und größte Kapsid Protein Hexon bildet 20 Kapsid Facetten, jeweils bestehend aus 12 Hexon Homotrimers4,5. Penton, befindet sich auf jeder ikosaedrischen Kante (Scheitelpunkt), besteht aus Pentamers aus einer Penton-Basis und stellt die Basis für den Scheitelpunkt Spike, der glykosylierten Faser Trimere5,6integriert ist. Die native Ad Zelleintrag besteht im Grunde aus zwei wesentliche Schritte. Erstens bindet der Faser-Regler an den primären Rezeptor. Dies ist in Anzeigentypen von Sorte A, C, E und F Coxsackie und Adenovirus-Rezeptor (Auto). Diese Interaktion bringt das Virion in räumlicher Nähe der Zelloberfläche, wodurch es Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrine und RGD-Motiv in der Penton Basis und folglich induzieren zelluläre Reaktionen. Zweitens führen Änderungen in das Zellskelett, Internalisierung der Virion und des Verkehrs auf das Endosom-7. Bei teilweiser Demontage in das Endosom, das Virion freigegeben Und reist nach Zytoplasma letztlich auf den Kern für die Replikation.

Während Ad lokal zugestellt werden kann (zB., für genetische Impfung), systemische Lieferung durch den Blutstrom nach Bedarf für Onko-Virotherapie steht vor mehreren Hindernissen. Während in der Blutbahn zirkulierenden begegnen injizierte Virionen die Abwehrkräfte des Immunsystems des Wirts, führt zur schnellen Neutralisation der Virus-basierte Vektoren und rendering-Ad-basierte Vektoren in systemische Anwendungen äußerst ineffizient. Darüber hinaus die natürliche Hepatotropism des Ad stört systemische Lieferung und Ad in seine neue Zielzellen umleiten gelöst werden.

Keimbahn-codierte natürliche IgM-Antikörper des angeborenen Immunsystems schnell erkennen und binden stark repetitive Strukturen auf der Oberfläche des Virion8,9. Diese Immunkomplexe aktivieren dann die klassische und nicht-klassische Wege des Komplementsystems, führt zur schnellen Ergänzung-vermittelten Neutralisation eines großen Teils der Virionen8. Ein zweiten Weg, was große Entfernung von Ad Virionen ist durch Makrophagen10 vermittelt und akute toxische und hämodynamische Nebenwirkungen11,12zugeordnet. Im Falle von Ad insbesondere Beseitigung Kupffer Zellen mit Wohnsitz in der Leber binden und phagocytically nehmen die Ad Virionen über spezifische Scavenger-Rezeptoren, damit deren aus dem Blut13,14,15 . Spezifische Scavenger-Rezeptoren auch auf Leber sinusförmigen endothelial Zellen (LSE)16identifiziert worden, und LSE Zellen scheinen auch beitragen, Vektor Beseitigung17, sondern inwieweit noch der Klärung bedarf. Darüber hinaus sind einige Ad-Arten und ihre abgeleiteten Vektoren effizient durch menschliche Erythrozyten18 abgesondert, die sie per Auto oder Komplement-Rezeptor CR119binden. Der Hinweis Diese Kompensierung Mechanismus kann nicht in das Maus-Modell-System im Gegensatz zu menschlichen Erythrozyten untersucht, Maus Erythrozyten nicht ausdrücklich Auto.

Spezifische Anti-Ad-Antikörper erzeugt durch das adaptive Immunsystem nach Exposition gegenüber Ad entweder aufgrund von früheren Infektionen mit Ad oder nach der ersten Lieferung in systemische Anwendungen erhöhen eine weitere Barriere für effektive Verwendung von Ad-Vektoren, und sie sollten umgangen werden, in effiziente systemische Lieferung.

Schließlich behindert die starke Hepatotropism einiger Ad Arten (einschließlich Ad5) stark Anwendung von Ad in der systemischen Therapie. Dieses Ergebnis in Hepatozyten Transduktion Tropismus ist aufgrund der hohen Affinität des Ad Virion an Blutgerinnungsfaktor X (FX), vermittelt durch das Zusammenspiel von FX mit dem Ad Hexon Protein20,21,22. FX überbrückt das Virion zu Heparin Sulfat Glykoproteinen (HSPGs) auf der Oberfläche von Hepatozyten20,23,24,25. Ein entscheidender Faktor für diese Interaktion scheint den spezifischen Umfang von N und O-Sulfatierung von HSPGs in Leberzellen24, die unterscheidet sich von HSPGs auf andere Zelltypen. Neben dieser FX-vermittelten Weg deuten den letzten Studien weitere Wege noch nicht dazu führen, dass Ad Transduktion von Hepatozyten26,27,28identifiziert.

Vor kurzem hat sich gezeigt, dass FX sich nicht nur in Hepatozyten Transduktion von Ad engagiert, aber auch durch die Bindung, das Virion die Viruspartikel gegen Neutralisation schirmt von Ergänzung System26. Reduzierung der Hepatozyten Transduktion durch die Verhinderung FX Bindung, würde daher die unerwünschte Nebenwirkung der zunehmenden Ad Neutralisation über das angeborene Immunsystem erstellen.

Ein profundes Wissen um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Vektoren und Wirtsorganismen ist daher notwendig, eine effizientere Vektoren für systemische Anwendungen zu entwickeln, die die Hindernisse auferlegt durch den Wirtsorganismus zu umgehen.

Eine Strategie, die ursprünglich für therapeutische Proteine verwendet wurde wurde angepasst für Ad-Vektoren, zumindest teilweise die oben beschriebenen Barrieren zu überwinden. Antigenität und Immunogenität der therapeutischen Eiweißverbindungen konnte durch Kopplung an Polyethylenglykol (PEG)29,30reduziert werden. Daher die kovalente Kopplung von Polymeren wie PEG oder Poly [N-(2-Hydroxypropyl) Methacrylamid] (pHPMA), das Kapsid Oberfläche schützt den Vektor von unerwünschten Vektor-Wirt Interaktionen. Allgemein, Zielgruppen Polymer Kupplung ε-Amin aus Lysin Seite Rückstände, die nach dem Zufallsprinzip auf der Kapsid Oberfläche verteilt sind. Vektor-Partikel in Lösung sind, aufgrund der hydrophilen Natur der beigefügten Polymere, eine stabile Wasserhülle umgeben, die reduziert das Risiko von Immunzellen Anerkennung oder enzymatischen Abbau. Darüber hinaus zeigten die pegylierten Ad Vektoren Neutralisation von Anti-Hexon Antikörper in-vitro- und in Pre-immunisierten Mäusen in Vivo31entziehen. Im Gegensatz zu genetischen Kapsid Modifikationen erfolgt die chemische Kopplung von Polymeren nach Produktion und Reinigung, so dass nicht nur für die Verwendung von konventionellen Hersteller Zellen und Produktion hohe Titer Vektor Bestände, sondern auch für die gleichzeitige Änderung von Tausenden von Aminosäuren auf der Oberfläche Kapsid. Jedoch erfolgt unter der Regie von Amin Abschirmung nach dem Zufallsprinzip während der ganze Kapsid Oberfläche, was zu hohen Heterogenitäten und nicht zulassend Änderung des spezifischen Capsomers. Darüber hinaus beeinträchtigen der großen Polymer Moieties für wohltuende Wirkung erforderlichen Virus Bioaktivität32.

Zur Überwindung dieser Einschränkungen, Kreppel Et Al. 33 ein Geneti-chemischen Konzept für Vektor Rück- und de-targeting eingeführt. Cysteine wurden genetisch in die Virus-Kapsid an Lösungsmittel-exponierten Positionen wie Faser HI-Schleife33, Protein IX34und Hexon35,36eingeführt. Obwohl nicht natürlich vorkommenden, Cystein tragenden Ad Vektoren zu hohe Titer in den normalen Produzent Zellen erzeugt werden können. Wichtig ist, ermöglicht Einfügen von Cysteine in bestimmten Capsomers und in verschiedenen Positionen innerhalb eines einzigen Capsomer für hoch spezifische Änderungen der Thiol-Gruppe-reaktive Moieties. Dieser Geneti-chemischen Ansatz hat sich gezeigt, Ad-Vektor-Design zahlreiche Hindernisse zu überwinden. Die Kombination von Amin-basierte Pegylierung für Umfang und Thiol-basierte Kopplung von Transferrin, die Faser-Knopf, die, den Hi-Schleife bewährt hat, erfolgreich neu ausrichten Ad Vektoren auf Auto-defizienten Zellen33geändert. Da meist unerwünschte Wechselwirkungen (neutralisierenden Antikörpern, Blutgerinnungsfaktor FX) Hexon beteiligt ist, waren Thiol-basierte Modifikation Strategien auch auf Hexon angewendet. Kupplung kleine PEG Moieties an den HVR5 der Hexon verhindert Ad Vektor Partikel um transduzieren SKOV-3 Zellen in Anwesenheit von FX, während große PEG Moieties Hepatozyten Transduktion14,35erhöht. N. Chr. Vektor Partikel tragen Mutationen in der Faser-Knopf Hemmung Auto Bindung und HVR7 hemmende Bindung von FX (und Lager eingefügt Cysteine in HVR1 für Position-spezifischen Pegylierung) erwiesen sich als Antikörper und Komplement-vermittelten Neutralisation zu entziehen, ebenso wie Scavenger Rezeptor-vermittelte Aufnahme ohne Verlust der Infektiosität. Interessant ist, trotz eines Mangels an natürlichen FX Schutzschild verbessert Pegylierung nochmals Transduktion von Hepatozyten als Funktion der PEG Größe36. Jedoch zeigte sich, dass kovalente Abschirmung auf intrazelluläre Menschenhandel Prozesse auswirken. Prill Et Al. gegenüber irreversiblen versus Bioresponsive Schilde basierend auf pHPMA und gezeigt, dass weder die Art der Abschirmung noch Co-Polymer kostenlos Zelleintrag beeinflusste aber auf Partikel des Menschenhandels in den Zellkern. Mit einem Bioresponsive Schild mit positiv geladenen pHPMA Copolymere erlaubt für Partikel des Menschenhandels in den Zellkern, Aufrechterhaltung der hohen Transduktion Wirkungsgrade von Ad Vektoren in Vitro und in Vivo37.

Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen diese Daten, dass selbst unter der Annahme, dass alle Vektor-Wirt-Interaktionen bekannt und angesehen wurden, übermäßige Kapsid Oberflächenmodifikationen notwendig, die mit systemischen Vektor Lieferung verbundenen Hürden zu überwinden sind.

Hier bieten wir ein Protokoll, um ortsspezifische chemische Modifikationen des Adenovirus-Vektor-Capsids für Abschirmung und/oder retargeting Adenovirus-Vektor-Partikel und Adenovirus-basierte onkolytische Viren durchführen. Das Konzept dieser Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Es ermöglicht die Abschirmung bestimmter Kapsid Regionen von unerwünschten Wechselwirkungen durch kovalente Bindung von synthetischen Polymeren. Gleichzeitig bietet es auch eine Möglichkeit zu befestigen Liganden und Abschirmung und targeting zu kombinieren. Verwenden einfache Chemie, können Experimentatoren Adenovirus-Vektor-Oberfläche mit einer Vielzahl von Molekülen einschließlich Peptide/Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und andere kleine Moleküle kovalent ändern. Darüber hinaus sieht das Protokoll ein Gesamtkonzept für die chemische Modifizierung von biologisch aktiven Virus abgeleitet Vektoren unter Wartung ihrer biologische Integrität und Aktivität.

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Protocol

Hinweis: im folgenden wird ein Protokoll für Geneti-chemische Pegylierung einer Werbeanzeige Vektor zum Detail beschrieben wird. Um bestimmte Kopplung von PEG glyko-zu ermöglichen, wurde ein Ad5-Vektor vorher genetisch modifiziert durch die Einführung eines Cystein-Rückstands in der Hexon-Protein bei der hypervariablen Loop 5, wie in einer früheren Publikation36und eine Maleimide-aktivierte PEG beschrieben Verbindung wird als zusammengesetzte Kupplung verwendet.

1. Vorbereitung der Puffer für Vektor-Reinigung durch Schritt CsCL-Gradienten

  1. Bereiten Sie 400 mL Adenovirus Puffer (Ad-Puffer) durch Zugabe von 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) und 150 mM NaCl (3,504 g/400 mL) mit bidestilliertem Wasser (DdH2O). 350 mL dieses Puffers ist erforderlich, um die folgenden drei Ad-Puffer Varianten vorzubereiten.
    1. Variante A: Stellen Sie 150 mL Ad-Puffer pH 7.6 mit NaOH.
    2. Variante B: 50 mL eine Endkonzentration von 10 mM DÄMMUND [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] hinzu und passen Sie es auf pH 7,2 mit HCl.
    3. Variante C: 150 mL eine Endkonzentration von 0,5 mM DÄMMUND (0,022 g) hinzu und passen Sie es auf pH 7,2 mit HCl.
    4. Bereiten Sie die Puffer in DdH2O und analysenrein Chemikalien. 100 mL Variante A und Variante C verwenden, um die CsCl-Puffer vorzubereiten (siehe Schritte jeweils 1,2 und 1,3; 50 mL) für die CsCl-Gradienten Schritt notwendig (siehe Schritte 3.2.6. und 3.2.18).
  2. Vorbereitung des CsCl Schritt Gradienten Puffers (ρCsCl = 1,41 g/cm3) Ad-Puffer
    Hinweis: Dieser Puffer wird in zwei verschiedenen Varianten erforderlich sein:
    1. Wiegen Sie zwei Aliquote genau 27,42 g CsCl in 50 mL Röhrchen.
    2. ΡCsCl = 1,41/DÄMMUND Puffer: CsCl in 40 mL Variante C des Ad-Puffer zu lösen.
    3. ΡCsCl = 1,41 Puffer: CsCl in 40 mL Variante A Ad-Puffers zu lösen.
    4. Überprüfen Sie, und passen Sie ggf. den pH-Wert mit HCl. Füllung bis zu genau 50 mL mit der entsprechenden Ad-Puffer-Variante. Um die besten Ergebnisse der Trennung zu erreichen, sind die genaue CsCl-Konzentration und pH-Wert entscheidend.
    5. Überprüfen Sie die Dichte (CsCl Inhalt) durch Wägung jeder Farbverlauf Puffer 1 mL (1,41 g).
  3. Vorbereitung des CsCl Schritt Gradienten Puffers (ρCsCl = 1,27 g/cm3) Ad-Puffer
    Hinweis: Dieser Puffer wird in zwei verschiedenen Varianten benötigt:
    1. Wiegen Sie zwei Aliquote genau 18,46 g CsCl in 50 mL-Tuben.
    2. ΡCsCl = 1,27/DÄMMUND Puffer: CsCl in 40 mL Variante C des Ad-Puffer zu lösen.
    3. ΡCsCl = 1,27 Puffer: CsCl in 40 mL Variante A Ad-Puffers zu lösen.
    4. Überprüfen Sie, und passen Sie ggf. den pH-Wert mit HCl. Zu guter Letzt füllen Sie bis genau 50 mL mit der entsprechenden Ad-Puffer-Variante. Um die besten Ergebnisse der Trennung zu erreichen, sind die genaue CsCl-Konzentration und pH-Wert entscheidend.
    5. Überprüfen Sie die Dichte (CsCl Inhalt) durch Wägung jeder Farbverlauf Puffer 1 mL (1,27 g).
  4. Sterilisieren Sie alle Puffer (Ad-Puffer und CsCl Schritt gradient Puffer) durch Filtration (mit 0,45 µm Maschenweite Pore) in sterile Flaschen.
  5. Nach der Sterilisation, zur Vermeidung von Oxidation von DÄMMUND sättigen und überlagern die Puffer mit DÄMMUND mit Argon durch sparging die Puffer mit Argon-Gas für ca. 30 s. Achten Sie darauf, nur sterile Geräte verwenden (zB., sterilen pipette Tipps) bei der Anwendung der Argon-Gas und Nutzung Flaschen groß genug, um Argon Tran zu ermöglichen.
    Hinweis: Alle Puffer sollten bereit sein, frisch und vor Licht geschützt und können für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden (vor allem die CsCl Schritt gradient Puffer, die nur für ein paar Tage aufbewahrt werden sollte).

(2) Kupplung Moieties: Lagerung und Zubereitung

Hinweis: Moeities zur Ankopplung an Cysteine Thiol-reaktiven Gruppen tragen müssen. Maleimide-aktiviert Verbindungen bilden stabile Thioether Anleihen mit gentechnisch eingeführte Cysteine. Alternativ, ortho-Pyridyldisulfide (OPSS)-aktivierte Verbindungen eingesetzt werden, bilden Bioresponsive Disulfidbrücken zwischen dem Vektor Partikel und Kupplung glyko-. Lyophilisierten MalPEG-750 sowie die meisten anderen Kupplung Reagenzien sind empfindlich gegen Hydrolyse und sollte in Form von gefriergetrockneten Pulvern bei-80 ° c trocken gelagert werden

  1. Um den Aufbau von kondensiert Wasser auf Ampullen Auftauen zu verhindern, speichern Sie die Fläschchen in größeren Rohren (zB., 50 mL Tuben) mit einem Kissen von Kieselgel Perlen gefüllt. Speichern Sie diese Rohre in einem angemessenen größere Behälter auch mit einem Kieselgel Perlen Kissen gefüllt.
  2. Bevor Sie dicht schließen jedes Rohr und Container, Austausch von Luft mit Argon-Gas. Dies kann erreicht werden, indem man die offenen Rohre und Behälter in den Exsikkator gestellt, gefolgt von entfernen und ersetzen die Luft mit Argon-Gas. Da Argon-Gas schwerer als Luft ist, Rohre und Behälter sind mit Argon-Gas gefüllt und können jetzt ineinander gelegt werden, mit jeder Deckel fest verschlossen.
  3. Shop-Container bei-80 ° C.
  4. Beim Auftauen, legen Sie die Container auf Kieselsäure Perlen in den Exsikkator gestellt und langsam bis Raumtemperatur zu wärmen Sie, dann öffnen Sie den Container.
  5. Wenn Sie eine Kupplung Reaktion durchführen, frisch lösen Sie die Höhe der Kupplung Substrat in der geeigneten Lösungsmittel benötigt. Achten Sie darauf, nicht mehr als 10 % der Kupplung Lösung der letzten Kupplung Reaktion hinzufügen, vor allem wenn DMF oder DMSO als Lösungsmittel für die Kupplung Substrat verwendet wird.

3. Verstärkung, Reinigung und chemische Modifikation von Ad Vektoren:

  1. Verstärkung des Ad-Vektoren
    Hinweis: Die folgenden Schritte müssen mit einem Sicherheitsschrank nach lokalen biologische Sicherheitsregeln durchgeführt werden.
    1. Transfizieren Sie Replikation mangelhaft ∆E1 Ad Vektor mit einem (oder mehreren) genetisch eingeführten Cystein Residue(s) in HEK 293 Zellen wie Kratzer und Kreppel38beschrieben.
    2. Verstärken Sie nach dem Protokoll38den Vektor durch sequentielle Reinfektionen bis zu einer endgültigen präparative Infektion von 15-20 (15 cm) große Kultur Zellplatten (ca. 1-2 x 107 Zellen/Platte).
      Hinweis: Optimal, die letzten Reinfektion sollte zeitgesteuert werden damit Zellen voll zytopathischer Effekt (CPE) am Morgen des Reinigung und Änderung Leistung zeigen (siehe Abbildung 2).
    3. Nach dem letzten Verstärkung Schritt können Zellen in Ad Puffer + 10 mM DÄMMUND (Variante B) Nukleinsäuretablette bei-80 ° C eingefroren werden; jedoch empfiehlt sich für optimale Ausbeute an Vektor Teilchen, ein erster Schritt der Zelle Lysis und Vektor Reinigung und Änderung.
  2. Reinigung und chemische Modifikation von Ad Vektoren
    Hinweis: Reinigung von Vektoren wird nach dem Adenovirus-Reinigung-Protokoll beschrieben durchgeführt.38aber nicht oxidierenden Bedingungen. Handy-Ernte und Lyse sowie Reinigung und chemische Modifikation Vektor kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden. Ernte und lösen Sie die infizierten Zellen nach dem zuvor beschriebenen Protokoll38.
    1. Sammeln Sie Zellen Schaben der Platten und des Überstands in 200-500 mL Zentrifugation Röhren.
    2. Drehen Sie die Zelle Lösung für 10 min bei 400 X g.
    3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 4 mL Ad-Puffer + 10 mM DÄMMUND (pH 7,2) (Variante B) und Transfer zu einem sterilen 50 mL-Tube. Wenn Zellausbeute niedrig ist oder nur eine schwache CPE induziert wurde, in 2 mL aufzuwirbeln.
    4. Den Vektor von 3 Zyklen (in flüssigem Stickstoff) Einfrieren und Auftauen (im Wasserbad 37 ° C) zu retten.
    5. Spinnen Sie für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C.
    6. Bereiten Sie beim Zentrifugieren zwei gleiche CsCl Schritt Gradienten:
      1. Fügen Sie zunächst als die untere Phase 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer + 0,5 mM DÄMMUND (pH 7,2, Variante C) in der Ultrazentrifuge Röhren. Markieren Sie die Ebene die untere Phase auf das Rohr vor dem Laden der oberen Phase.
      2. Stapeln Sie sorgfältig die obere Phase von 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer + 0,5 mM DÄMMUND (pH 7,2, Variante C) von 5 mL Volumen entlang der Wände des Rohres auf die untere Phase sehr langsam pipettieren.
        Hinweis: Seit während Kupplung eine hohe Konzentration von DÄMMUND könnte reagieren die Maleimide Rückstände des MalPEG-750 und führen zu reduzierten Kupplung Effizienz, Reinigung von CsCl Schritt Steigung bereits unter einer reduzierten DÄMMUND Konzentration durchgeführt werden muss.
    7. Laden den Überstand auf die CsCl-Gradienten [entweder gleichmäßig teilen den Überstand auf beiden Steigungen oder im Falle einer niedrigen Vektor-Ausbeute (siehe oben), laden den Überstand auf nur eine Spalte], und füllen Sie beide Gradienten gleich an die Spitze mit Ad Puffer + 10 mM DÄMMUND (pH 7 .2, Variante B).
    8. Stellen Sie das Gewicht der gegenüberliegenden Rohre zu einem 0,0 g Gewichtsunterschied.
    9. Ultrazentrifugen für 2 h bei 176.000 x g bei 4 ° C.
    10. Fixieren Sie mit einer Klammer Ultrazentrifugation Rohr zu einem Standplatz, verlassen das Gebiet um die untere Phase Markierung zugänglich. Legen Sie die Schwanenhals-Lampe über das Rohr. Rund um die Marke, an der Grenze zwischen den unteren und oberen Phasen sollte eine ausgeprägte Band (Vektor-Virionen) sichtbar (Abb. 3A-3 C).
    11. Sammeln Sie die Vektoren durch das Rohr mit einer Nadel punktieren und aufstrebende Vektor-Band in eine Spritze. Übertragen Sie gesammelten Vektor Virionen auf eine 15 mL-Tube.
      Hinweis: Schwächere Bands über die Ad-Vektor-Band unvollständig Vektor Partikel enthalten und für die Aspiration vermieden werden. Die Zellenrückstand und grün fluoreszierendes Protein (EGFP) EGFP exprimierenden Ad-Vektoren im oberen Teil der Ultrazentrifuge sammeln Rohr (siehe Abbildung 3A und 3 b). Dies und die folgenden Schritte bis zur Kupplung (Schritt 3.2.16.) sollte rasch durchgeführt werden, wie die Vektoren sind jetzt vernünftig zu Disulfid Bindung aufgrund der geringen Konzentration DÄMMUND.
    12. Zur Berechnung der Höhe der Kupplung Substrat benötigt für effiziente vollständige Bindung des Substrats an alle Cystein-Reste in der Vektor-Vorbereitung messen Sie OD260:
      1. Nach dem Protokoll von Kratzer und Kreppel38, Wirbel eine Mischung aus 10 µL der gesammelten Vektor Virionen und 89 µL Puffer Ad 1 µL 10 % SDS beschrieben. Als leere Sonde, Wirbel 99 µL Ad-Puffer und 1 µL 10 % SDS.
      2. Um die Virionen zu denaturieren, inkubieren Sie sowohl bei 56 ° C für 10 min.
      3. OD260zu bestimmen.
      4. Die physische Vektor-Titer pro Mikroliter unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: OD260 x Faktor der Verdünnung x empirisch ermittelten Aussterben Koeffizient von Ad (1.1 x 109 Vektor Partikel = 1 OD260 Einheit/µL). Daher einen gemessenen OD260 von 1,36 eines Vektors 01:10 verdünnt, würde zu berechnen: 1,36 x 10 x 1,1 x 109 = ca. 1,5 x 1010 Vektor Partikel/µL.
        Hinweis: Dieser Titer ist nur eine grobe Schätzung; Es ist jedoch genau genug für die stöchiometrischen Berechnungen, die im folgenden beschrieben.
    13. Je nach das Protein verändert durch Einführung einer Cystein, bestimmen die Menge der Kupplung Substrat (in Gramm) für eine effiziente Kopplung Reaktion nach der folgenden allgemeinen Gleichung: Virustiter x Volumen x Anzahl der Cysteine x Überschreitung der Abstimmungsunterlagen X Molekularen Gewicht von glyko- / 6.022 x 1023 = Gramm Kupplung Substrat.
      Hinweis: In dieser Gleichung: (1) Virustiter ist der Titer/µL, durch OD260 bestimmt, wie beschrieben, 2) Volumen-Accounts für das Volume in µL des angestrebten Vektor in die Kupplung Reaktion verwendet, (3) die Anzahl der Cysteine ist die Zahl der Proteine in die die Cystein Rückstand wurde eingeführt, pro Vektor Partikel, 4) Überschreitung der Verbindungsgruppe ist der Faktor des Glyko-überschüssige notwendig für eine effiziente Kopplung Reaktion (50 X) und 5) das Molekulargewicht der Abstimmungsunterlagen muss Da (nicht kDa) eingeführt werden.
    14. Frisch lösen die Menge der Verbindung (oder möglich) in den geeigneten Lösungsmittel benötigt.
      Hinweis: Da die Höhe der Kupplung Substrat benötigt gering und schwer zu wiegen, aber teuer ist, wiegen Sie die minimale Menge an zusammengesetzten möglich und in einer entsprechenden Konzentration für die Anwendung auf die Kupplung Reaktion auflösen.
    15. Übertragen Sie die Vektor-Lösung auf eine geeignete Größe Rohr (z. B. 2 mL-Tube) und fügen Sie den berechneten Betrag der Kupplung zusammengesetzte Stammlösung auf den Vektor.
    16. Vorsichtig mischen der Lösung durch obenliegende Rotation für 1 h bei Raumtemperatur.
    17. Füllen Sie die Vektor-Lösung für 6 mL Gesamtvolumen mit Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).
      Hinweis: Dieser Schritt muss ausgeführt werden, bevor die Lösung, um den Farbverlauf Schritt angewendet wird um sicherzustellen, dass die Vektor-Lösung, die immer noch CsCl aus den ersten Schritt Farbverlauf enthält, eine Dichte unter 1,27 g/mL hat.
    18. In einem zweiten Schritt CsCl Streifenbildung Reinigen des Vektors aus der glyko-nicht umgesetztes Kupplung:
      1. Bereiten Sie zwei gleiche CsCl Schritt Gradienten durch Ausführen der folgenden Schritte für jede: (1) untere Phase: der untere Phase auf das Rohr vor dem Laden obere Phase, und (3) obere Ebene 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A), (2) markieren : 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).
        Hinweis: Nach Kupplung stattgefunden hat, werden Puffer ohne DÄMMUND verwendet, da keine freien Thiol-Gruppen nun auf den Vektor Capsids vorhanden sein sollte.
      2. Laden Sie den Überstand auf die CsCl-Gradienten zu und füllen Sie beide Gradienten gleich an die Spitze mit Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).
      3. Passen Sie die Gewichte der gegenüberliegenden Rohre zu einem 0,0 g Gewichtsunterschied.
    19. Ultrazentrifugen für 2 h bei 176.000 x g bei 4 ° C.
    20. Kurz vor dem Ende der Ultrazentrifugation equilibrate eine PD-10 Spalte 5 Mal mit 5 mL Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).
    21. Wie in Schritt 3.2.10, beheben Sie die Ultrazentrifugation Röhre stehen, verlassen die Gegend um die untere Phase Markierung zugänglich. Legen Sie die Schwanenhals-Lampe über das Rohr. Rund um die Grenze zwischen den unteren und oberen Phasen sollte eine ausgeprägte Band (Vektor-Virionen) wiederum sichtbar (Abbildung 3).
    22. Sammeln Sie die Vektoren durch das Rohr mit einer Nadel punktieren und aufstrebende Vektor-Band in eine Spritze, und übertragen Sie den Vektor auf eine 15 mL-Tube. Achten Sie darauf, um die Virionen beider Gradienten Röhren zusammen als ein Gesamtvolumen von 2,5 mL oder weniger zu sammeln. Wenn ein kleineres Volumen gesammelt wird, füllen Sie, um ein Gesamtvolumen von 2,5 mL mit Ad-Puffer (Variante A) zu erhalten.
    23. Laden Sie die 2,5 mL auf die äquilibriert PD-Säule. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    24. Fügen Sie 3 mL Ad Puffer (Variante A) auf die Säule und die Durchströmung (mit gereinigtem Vektor Virionen) sammeln.
    25. Fügen Sie Glycerin (333 µL) um eine Endkonzentration von 10 % erhalten und teilen Sie in geeigneten Aliquote (z. B. 400 µL jeder) und beinhalten Sie eine Aliquote von 20 µL für Titer-Bestimmung von OD260 Messung.
    26. Speichern Sie die Vektor-Lösung bei-80 ° C.
    27. Bestimmen Sie die Titer des Vektors durch Messung der OD-260 20 µL Vektor-Lösung, 79 µL Ad-Puffer (Variante A) und 1 µL 10 % SDS wie in Schritt 3.2.12 beschrieben. Verwenden Sie als eine leere 79 µL Ad-Puffer (Variante A), 10 µL 10 % Glycerin und 1 µL 10 % SDS.
    28. Berechnen Sie den Vektor-Titer als: OD260 x Faktor der Verdünnung x 1.1 x 109 Vektor Partikel/µL.
      Da im Schritt 3.2.27. zubereitet, zu berechnen: OD260 X 5 x 1.1 x 109 Vektor Partikel/µL

4. Überprüfung der Kupplung durch SDS-PAGE:

Hinweis: Wenn Verbindungen mit ausreichend hoher Molekulargewichte für die Kopplung zu Ad Virionen verwendet werden, kann Kupplung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) überprüft werden. Erfolgreiche Kopplung sollte dann eine Verschiebung der Protein-Band entsprechend modifizierten Ad Virion Proteins, im Vergleich mit dem Protein in der unveränderten Ad Virion führen (siehe Abbildung 4).

  1. Entsprechend der berechneten Titer des Vektors (Schritt 3.2.28.) trennen Sie 1-2 x 1010 Vektor Partikel durch SDS-PAGE (8 %).
  2. Silber-Färbung der Gel39 , auch schwache Protein Bänder zu erkennen, um das Gel zu entwickeln:
    1. Bereiten Sie Puffer silberne Färbung (für 100 mL Puffer benötigten Mengen sind in Klammern angegeben):
      1. Bereiten Sie Puffer 1 durch Mischen 38 mL DdH2O, 50 % MeOH (50 mL 100 MeOH), 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH), und 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO).
      2. Bereiten Sie Puffer 2 durch Zugabe von 50 % EtOH (50 mL 100 % EtOH) bis 50 mL DdH2O.
      3. Bereiten Sie Puffer 3 durch Zugabe von 0,127 g/L Na2S2O3 (12,744 mg) auf 100 mL DdH2O.
      4. Bereiten Sie Puffer 4 durch Zugabe von 2 g/L AgNO3 (0,2 g) und 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO) auf 100 mL DdH2O.
      5. Bereiten Sie Puffer 5 durch Zugabe von 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO), und 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) DdH2O zu einem Endvolumen von 100 mL zu erhalten.
      6. Bereiten Sie Puffer 6 durch Mischen 38 mL DdH2O, 50 % MeOH (50 mL 100 % MeOH), und 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH).
      7. Bereiten Sie Puffer 7 durch das Mischen von 60 mL DdH2O, 30 % MeOH (30 mL 100 % MeOH), und 10 % Glycerin (10 mL 100 % Glycerin).
      8. Bereiten Sie Puffer 8 durch 10 % Glycerin (10 mL 100 % Glycerin) mischen mit 90 mL DdH2O.
  3. Ausführung Silber Färbung
    1. Fixieren Sie das Gel im Puffer 1 für 30 min.
    2. Waschen Sie das Gel in Puffer 2 für 15 Minuten.
    3. Das Gel im Puffer 3 für 1 min vorbehandeln.
    4. Waschen Sie das Gel 3mal in DdH2O für 20 s.
    5. Imprägnieren Sie das Gel im Puffer 4 für 20 Minuten.
    6. Waschen Sie das Gel 2 Mal in DdH2O für 20 s.
    7. Das Gel im Puffer 5 zu entwickeln, bis die Bänder sichtbar werden (10 s, 10 min).
    8. Waschen Sie das Gel in DdH2O 2 min 2 Mal.
    9. Entwicklung im Puffer 6 für 5 min zu stoppen.
    10. Schonen Sie das Gel in Puffer 7 für 20 min.
    11. Speichern Sie das Gel im Puffer 8.
      Hinweis: Kupplung Effizienz kann durch densitometrische Quantifizierung der modifizierten und unmodifizierten Bands der gezielten Capsomere bestimmt werden.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die zytopathischer Effekt (CPE) 293 (HEK 293) Zellen, die erfolgreich Vektor Produktion angibt. Zellen sollten Morphologie (Abbildung 2) 40-48 Stunden nach der Impfung mit dem Virus Vektor zeigen. Die richtige Timepoint für die Ernte ist entscheidend für Viruspartikel durch Lyse der Zelle nicht zu verlieren und Oxidation von gentechnisch eingeführte Thiol-Gruppen zu verhindern. Wenn Vektor Partikel in das Medium von Lyse der Zelle freigesetzt werden, die gentechnisch eingeführte Thiole werden fast sofort oxidiert werden und wird es schwieriger zu reinigen und zu chemisch verändern.

Abbildung 3 zeigt beispielhaft CsCl-Bänder. Der Zweck der diskontinuierlichen CsCl Streifenbildung, bevor chemische Modifikation Zelltrümmer vom Virus-Partikel zu entfernen soll. Die Änderung selbst kann dann in CsCl stattfinden. Die zweite Streifenbildung nach chemische Modifikation dient dazu, ein Übermaß an (umgesetztes) Kupplung glyko-entfernen. Der Hinweis eine erfolgreiche Änderung des Virus nicht im Verlauf gesehen werden und erfordert weitere molekulare Analyse, im Idealfall durch SDS-PAGE.

Abbildung 4 zeigt typische Beispiele für erfolgreiche Kapsid Modifikationen. Die meisten Moieties gekoppelt an bestimmte Capsomeres ändert sich das Laufverhalten des jeweiligen Capsomeres im SDS-PAGE. Durch direkten Vergleich mit einer unveränderten Steuerung, der Erfolg der Kupplung überprüft werden kann, und densitometrische Analyse kann helfen, festzustellen, insgesamt Kupplung Effizienz (Prozent von verschoben und unshift Bands für die modifizierte Capsomere).

Figure 1
Abbildung 1: kombinierte genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen des Adenovirus-Vektor-Capsids ermöglichen kovalente Befestigung der Abschirmung Polymere und targeting Liganden. Cystein-Reste sind genetisch auf ausgewählten, Lösungsmittel ausgesetzt Kapsid Schleifen von Adenovirus-Vektor-Capsids, die Vektor-Partikel mit neuen chemischen Reaktivität auszustatten eingeführt. Die Vektoren können mit konventionellen Hersteller Zellen und Protokolle hergestellt werden. Nach der Produktion werden die Rückstände gentechnisch eingeführte Cystein speziell und kovalent mit Thiol-reaktive Kupplung Moieties (Liganden, Abschirmung, Polymere, Kohlenhydrate, kleine Moleküle, fluoreszierende Farbstoffe) geändert. Für Kupplung, können Maleimide aktiviert Verbindungen (die stabile Thioether Anleihen mit der Partikeloberfläche Vektor bilden) oder Pyridyldisulfide-Derivate (bilden Bioresponsive Disulfidbrücken) eingesetzt werden. Nach der Kopplung, sind die Vektoren durch diskontinuierliche CsCl Streifenbildung nicht umgesetztes überschüssige Kupplung Moieties entfernen gereinigt. PEG, Polyethylenglykol (Abschirmung Polymer); L, Liganden (abgeleitet von unterschiedlichsten Substanzklassen); -SH, Thiol-Funktionalität der gentechnisch eingeführte Cystein Rückstände. Mit dieser Technologie eine definierte Anzahl von Molekülen, die Vektor-Capsids kovalent koppelbar und eine präzise Auswahl des Standortes Kupplung ist möglich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: zytopathischen Effekt während der Vektor Produktion. Konventionelle Erzeuger Zellen (hier: 293-HEK Zellen) können für die Produktion der gentechnisch veränderten Vektoren vor chemische Modifikation verwendet werden. Das Erscheinen der CPE zeigt die besten Timepoint um die Zellen zu ernten. (A) Zellen zwei Stunden nach der Infektion, (B) Zellen 24 Stunden nach der Infektion, und (C) Zellen 40 Stunden nach der Infektion vor der Ernte. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: beispielhafte Ergebnisse von CsCl Gradienten. CsCl-Gradienten vor (A, B) und nach (C) chemische Modifikation. (A) ein Adenovirus-Vektor ist durch diskontinuierliche CsCl Dichte Gradienten Zentrifugation gebändert. Die obere Phase erscheint seit der Vektor gezeigt Bären eine hCMV-Promotor-orientierte Expressionskassette für EGFP grün. Das Vektor Virion ist als eine einzelne, weiße Band im unteren Drittel des Rohres gebändert. Die beiden kleineren Bands (siehe oben) ergeben sich aus unvollständigen Teilchen, die nicht gesammelt werden sollten. (B) ein Cystein-Lager EGFP exprimierenden Ad Vektor vor chemische Modifikation. (C) der gleichen Vektor nach der Modifizierung. Die Band im unteren Drittel des Rohres werden gesammelt und gereinigt durch eine Entsalzung Spalte. Der Stift Mark in B und C kennzeichnet die Grenze zwischen zwei dichten und ermöglicht die Lokalisierung einer Vektor-Band, die gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: SiIver gebeizt SDS-PAGE Kupplung Effizienz bewerten. MW-Marker in Spur 1. Ein Vektor mit Cysteine in der Capsomeres Penton Basis eingeführt, und Hexon blieb unverändert (Bahn 2) oder mit Maleimide-aktivierte PEG (Polyethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 5 kDa (Bahn 3) geändert. Hexon und Penton Basis weisen eine Verschiebung während der SDS-PAGE, erfolgreiche Änderung von > 90 % aus den Monomeren pro Kapsid angibt. Ein Vektor mit Cystein Rückstände in Hexon blieb unverändert (Bahn 4), mit 5 kDa PEG (Bahn 5) oder mit 20 kDa PEG (Bahn 6) geändert. Es sei darauf hingewiesen, dass die größeren Verlagerung der Hexon Band aufgrund der höheren Molekulargewicht von 20 kDa PEG, im Vergleich zu den 5 kDa PEG (Bahn 5). Das Gel zeigt Spezifität und Effizienz der Kupplung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Effizienz durch die gentechnisch eingeführte Cysteine chemisch verändert werden können ist in der Regel 80-99 %, und bestimmte Variablen beeinflussen diese Effizienz. Erstens ist es sehr wichtig, dass die gentechnisch eingeführte Cysteine nicht vorzeitige Oxidation unterzogen werden. Gut geschützt in der reduzierenden Umgebung der Produzent Zellen ist, es zwingend erforderlich, um eine nicht-oxidativen Umgebung zu bieten, nach der Veröffentlichung von Vektor-Partikel aus den Hersteller-Zellen und während chemische Modifikation. Zu diesem Zweck Verringerung der Reagenzien in Konzentrationen von 0,1-10 mM eingesetzt werden, und es ist notwendig, reduzierende Reagenzien zu verwenden, die keine Thiol-Gruppen, die leicht mit Maleimide aktiviert Verbindungen reagieren würde. Zweitens sollten bei der Verwendung von Maleimide aktiviert Verbindungen pH-Wert während der Koppelung Reaktion nicht überschreiten 7,35, seit einem pH-Wert von mehr als 7,4 die Spezifität der Reaktion abnehmen können. Drittens sollte in jedem Fall Amin-freie Puffer (z. B. HEPES, PBS) für die Reaktion verwendet werden. Der Hinweis können Cystein-Lager Vektor Partikel durch doppelte CsCl Streifenbildung wie beschrieben, dann in HEPES/10% Glycerin vor chemische Modifikation gespeicherten gereinigt werden. In diesem Fall, 0,1-1 mM DÄMMUND sollte verwendet einen reduzierenden Reagenzien, oder bevorzugt, sollte die Vektoren in einer Argon-Atmosphäre gelagert werden. Argon-gefüllten Plastikdosen mit Deckel können für diesen Zweck verwendet werden. Darüber hinaus ist Änderung Wirksamkeit beeinflusst durch den hydrodynamischen Durchmesser der Verbindung gekoppelt an die Capsids und die Website, mit der es gekoppelt ist. Viele Capsomeres, die als Ziele für die gezielte Geneti-chemische Modifizierung dienen kann sind in das Kapsid als Trimere (Faser, Hexon) oder Pentamers (Penton Basis). Daher könnte ein glyko-Molekül gekoppelt an ein Monomer standortabhängig gentechnisch eingeführte Cystein die Kopplung von einem anderen Molekül, das benachbarte Monomer sterisch behindern. Dies ist bei Auswahl der ideale Standorte für Geneti-chemische Kapsid Änderungen berücksichtigen.

Zur Erleichterung der Fehlersuche können einige Probleme entstehen, wenn das Protokoll beschrieben. Erste, niedrige Vektor Erträge (unter 10.000 Vektor Partikel pro Produzent Zelle) können aus suboptimalen Infektion Produzent Zellen führen. Im Idealfall sollte die 100-300 MOI für die Infektion von Produzent Zellen verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass beide zu hoher und zu niedriger Vektor Beträge für das Inokulum suboptimale Renditen generieren. Es ist ideal, um Durchgang der Hersteller am Vortag Infektion Zellen. Zweite, schmierig-Bands in der CsCl-Gradienten können angezeigt werden. Der häufigste Grund für schmierig Aussehen der Bands in der CsCl-Gradienten ist ein pH-Wert von CsCl-Lösungen, der zu sauer ist. Das reduzierende Reagenz DÄMMUND ist sehr sauer, und muss darauf geachtet werden, pH-Wert einzustellen, bevor der Vektor auf den Farbverlauf, laden, da Adenoviren Vektoren in einer sauren Umgebung leicht zerfallen. Drittens: niedrige Kupplung Wirkungsgrade (< 80 % der Kupplung) sind das häufigste Ergebnis unreine Vektor Zubereitungen und/oder vorzeitige Oxidation der Thiol-Gruppen auf der Vektor-Oberfläche. Verunreinigungen können durch SDS-PAGE und silberne Färbung erkannt werden. In dem Fall, den erhebliche Verunreinigungen auftreten, sollte Vektor Produktion neu gestartet werden. Darüber hinaus können geringe Kopplung Wirkungsgrade von freien nicht-Vektor-Thiole in der Reaktion verursacht werden. Daher ist es ratsam, nicht mit ß-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol als Reagenzien, reduzieren, da beide freie Thiol-Gruppen enthalten. Der Hinweis, Lösungsmittel-zugänglichen Websites, Cystein Rückstände einzuführen, die leicht geändert werden kann wählen, sollte Kristallstrukturen verwendet werden; Andernfalls können die Cysteine nicht der Koppelpartner zugänglich. Vorzeitige Oxidation der Thiole auf der Vektor-Oberfläche kann durch die stringente Verwendung von Argon und/oder DÄMMUND vermieden werden.

Schließlich können falsche stöchiometrische Berechnungen auch zu niedrigen Kupplung Effizienz führen. Im folgende Beispiel soll veranschaulichen die generische Formel oben dargestellten und der stöchiometrischen Berechnungen zu erleichtern. Im Beispiel wird ein Cystein in der Hexon Capsomere eingeführt. Der Titer von Vektor-Teilchen nach der ersten CsCl Gradienten Reinigung Schritt richtet sich als 1,5 x 1010 Vektor Partikel pro Mikroliter sowie Kupplung glyko-, MalPEG-750 verwendet wird. Jeder Vektor Kapsid enthält 720 Hexon Proteine (240 Trimere), so dass der Titer von Cysteine pro Mikroliter daher bis 720 x 1,5 x 10 fasst10 = 1,08 x 1013 Cysteine/µL. Um 1,5 mL Vektor Partikel, insgesamt 1,62 x 10 ändern müssen16 Cysteine mit Kupplung glyko-reagiert werden. Um effiziente Kopplung zu erreichen, empfiehlt sich ein 50 x Molaren Überschuss an der Kupplung Verbindung der Summe der Cystein-Reste: 1,62 x 1016 x 50 = 8,1 x 1017 Moleküle des MalPEG-750 wird benötigt, um effizient an die 1.5 x 1016 Cysteine der koppeln 1,5 mL Vektor-Lösung, die durch die ersten CsCl Schritt Steigung gereinigt. MalPEG-750 stellt ein Molekulargewicht von 750 Da; Daher wiegen 6,022 x 1023 Moleküle des MalPEG-750 750 g. Daher für effiziente Kopplung von 1,62 x 1016 Cystein Rückstände in 1,5 mL Vektor-Lösung mit einem Überschuss von 50 X MalPEG-750, 8,1 x 1017 Moleküle des MalPEG-750 = (750 x 8,1 x 1017) / (6.022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg MalPEG-750 sind erforderlich.

Die vorgestellte Methode ergänzt und die Methode des Vektors Pegylierung überschreitet. Konventionelle, unter der Regie von Amin Vektor Pegylierung erlaubt keine ortsspezifische Befestigung der Abschirmung oder targeting Moieties, während die hier vorgestellten Geneti-chemische Kopplung-Technologie verwendet werden kann, genau Moieties Adenovirus-Vektor zuordnen Oberflächen an definierten Positionen und in bestimmten Heftnummern. Daher ist es geeignet für Abschirmung und Ausrichtung der Adenovirus-Vektor-Partikel.

Der Hinweis kann dieses Protokoll auch für eine konventionelle unter der Regie von Amin Pegylierung Ad-Vektoren, die oben genannten verwendet werden. In diesem Fall kann die Verringerung Reagenz DÄMMUND aus dem Puffer weggelassen werden. Für stöchiometrische Berechnungen die Anzahl der zugänglichen Amin Gruppen pro Partikel kann werden als 18.000, und typische molare Exzesse der Amin-reaktive Kupplung Moieties sind 20-100 fache.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

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