전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

Cancer Research

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Summary

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

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Canale, M., Marisi, G., Passardi, A., Scarpi, E., Ulivi, P. Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (145), e58615, doi:10.3791/58615 (2019).

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Abstract

거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.

K-RASN-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습1에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.

miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링2에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.

52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 "이탈리아 재판에 고급 대 장 암" (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.

문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.

순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5'과 3 ' 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.

방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.

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Protocol

참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.

1. 플라즈마 수집 및 저장

  1. 3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.
  2. 1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심
  3. 450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.
  4. 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
    참고: 말 초 혈 관 컬렉션의 2 시간 안에 처리 합니다. 튜브에서 플라즈마를 복구할 때 림프 구 레이어를 방해 하지 마십시오.

2. 플라즈마 샘플 (자료 테이블)에서 miRNAs 순환의 추출

  1. 모든 필요한 솔루션을 준비 하 고 녹여 추출 단계에 대 한 샘플.
    1. 2 x denaturating 솔루션 2-mercaptoethanol의 375 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.
    2. 추가 ACS 학년 100% 에탄올의 21 mL 미르 세척 솔루션에 어 믹스 잘 합니다.
    3. 세척 솔루션 2/3를 ACS 학년 100% 에탄올 40 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
    4. 플라즈마 aliquot 실 온에서 해 동 하 여 다음 추출 단계를 시작 하실 수 있습니다.
  2. 유기 추출
    1. RNase 무료 2 mL 튜브에 플라즈마 샘플의 400 µ L를 전송 합니다.
    2. 2 x denaturating 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
    3. 1 nM 스파이크에서의 4 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
    4. 산 페 놀-클로 프롬의 800 µ L를 추가 합니다.
    5. 60 s를 15 분에 대 한 최대 속도 (≥10, 000 x g)에서 원심 분리기와 동.
    6. 신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다. Interphase는 방해 하지 마십시오. 참고 볼륨 복구 및 폐기 비 acqueous 단계를 포함 하는 관.
      참고: 솔루션을 변성 시키기 x 2는 4 ° C에 저장 되며이 온도에서 응고 될 수 있습니다. 사용 하기 전에 따뜻한 37 ° c, 10-15 분 위해 때때로 agitating 솔루션 조심 포함 하는 산 성 페 놀-클로 프롬, 혼합물의 위에 속 인 다 acqueous 버퍼 하지 아래 단계를 철회 하는 것. 차입 솔루션 또는 95 ° c 물 nuclease 무료 예 열 열 솔루션 (샘플 + 10% 초과 당 100 µ L)의 적절 한 볼륨을 주의 해야 합니다.
  3. 작은 RNA 농축
    1. 2.2.6 단계에서 수성 단계로 에탄올 100%의 1/3 볼륨을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
    2. 각 샘플에 대 한 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 넣으십시오.
    3. 필터 카트리지 및 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기로 단계 2.3.1과 에탄올에서 lysate의 최대 700 µ L를 전송 s.
    4. 경우 > 왼쪽, 혼합물의 700 µ L는 filtrate에 신선한 튜브 고 반복 단계 2.3.3; 모든 혼합 필터 카트리지 통과 될 때까지 반복 합니다.
    5. 통해 흐름의 전체 볼륨을 측정 합니다.
    6. 여과 하 여 철저 하 게 혼합 에탄올 100%의 2/3 볼륨을 추가 합니다.
    7. 신선한 수집 관에서 두 번째 필터 카트리지를 놓습니다.
    8. 카트리지에 샘플 볼륨의 최대 700 µ L를 전송 하 고 흐름 통해 30 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 원심.
    9. 2.3.8 단계를 반복 하 여 모든 혼합 필터 카트리지를 통과 했다.
    10. 필터 카트리지를 미르 세척 솔루션 1의 700 µ L을 적용 하 고 흐름 통해 15 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 필터 카트리지를 원심. 동일한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 놓습니다.
    11. 통해 흐름 필터 카트리지 및 분리기 필터 카트리지 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 세척 솔루션 2/3의 500 µ L 15 미 삭제 신청. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다.
    12. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓고 세척 솔루션 2/3의 2.3.11 500 µ L 단계를 반복 합니다. 통해 흐름 무시 하 고 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 전송.
    13. 1 분 동안 10000 x g 에서 필터 카트리지와 튜브 원심
    14. 신선한 1.5 mL 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송 하 고 데워 (95 ° C) 차입 솔루션 또는 nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다.
    15. 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기 miRNAs 복구-80 ° c.에 저장 하는 s
      참고: 흰색 침전 세척 솔루션 2/3에에서 형성 수 있습니다. 이것은 초과 EDTA 솔루션에서 출시입니다. Pipetting 단계 동안 이러한 결정을 그리기 하지 마십시오.

3. 수행 반전 녹음 방송 그리고 미르 사전 증폭 (자료 테이블)

  1. Polyadenylation 반응 수행
    1. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 아래 내용을 다음 얼음, 모든 시 약을 녹여. 또한, 해 동 50% 말뚝 8000, 실내 온도 도달할 수 있도록.
    2. 0.5 mL 원심 분리기 튜브, 반응 각 샘플에 대 한 칵테일의 3 µ L의 최종 볼륨을 얻는 반응 혼합을 준비 합니다. 다음 볼륨 플러스 10% 초과 볼륨을 사용 하 여 각 시 약에 대 한.
    3. 추가 RNase 무료 물 1.7 µ L, 10 배 많은 버퍼의 0.5 µ L, 0.5 µ L의 10mm ATP, 그리고 마지막으로 0.3 µ L 5 U / µ L PolyA 효소.
    4. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
    5. 반응 판 또는 반응 관의 각 음에 2 µ L의 샘플을 전송 하 고 칵테일 반응의 3 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 다운과 내용을.
    6. 열 cycler에 접시/튜브를 놓고 다음 단계를 수행 합니다.
    7. 45 분 (polyadenylation 단계) 37 ° C에서 품 어.
    8. 10 분 (정지 반응), 65 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
  2. 결 찰 반응을 수행 합니다.
    1. 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
    2. RNase 무료 물 0.4 µ L, DNA 리가 버퍼, 결 찰 어댑터 x 25의 0.6 µ L, 50%의 4.5 µ L x 5의 3 µ L 추가 말뚝 8000 그리고 RNA 리가의 마지막 1.5 µ L.
    3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 콘텐츠.
    4. 많은 미행 제품에 포함 된 각 잘/반응 관에 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
    5. 다음 설정 가진 열 cycler에 접시/반응 관 장소: 부 화 다음으로 60 분 동안 60 ° C에서 4 ° c.에서 개최
      참고: 50% 말뚝 8000 높은 점성 이다. 실내 온도에, 발음 하 고 천천히 분배 사용 합니다. 각 포부와 분배 단계 후 10 plugger 잡고 아래로 흐름에 시 약을 허용 하는 s.
  3. 반전 녹음 방송 반응을 수행 합니다.
    1. 원심 분리기 튜브, 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨에에서 반응 혼합을 준비 합니다.
    2. 3.3 µ L의 RNase 무료 물, RT 버퍼, dNTP 믹스 (각 25 mM)의 1.2 µ L, 보편적인 RT 뇌관, x 20의 1.5 µ L x 5의 6 µ L RT 효소 혼합 x 10의 마지막 3 µ L를 추가 합니다.
    3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
    4. 각 잘/반응 관 결 찰 제품을 포함 하 게 믹스의 15 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
    5. 다음 설정 사용 하 여 열 cycler에 접시/반응 튜브를 배치 합니다.
    6. 15 분 (반전 녹음 방송) 42 ° C에서 품 어.
    7. 5 분 (정지 반응), 85 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
      참고: RT 제품-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 하 고 최대 2 개월까지 안정적으로 유지 됩니다.
  4. 미르-앰프 반응 (자료 테이블)을 수행 합니다.
    1. 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
    2. RNase 무료 물 17.5 µ L, 2 x 미르 앰프 마스터 믹스의 25 µ L 및 미르 앰프 뇌관 믹스 x 20의 2.5 µ L를 추가 합니다.
    3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
    4. 각 샘플에 대 한 새로운 반응 플레이트 또는 반응 관의 각 음에 반응 혼합의 45 µ L을 전송 합니다. 각 잘 반응 관에 RT 제품의 5 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
    5. 열 cycler에 접시/반응 튜브를 놓고 표 1에서 같이 실행 합니다.

4. 실시간 PCR을 수행

  1. 각 cDNA 샘플 1:10 0.1 x TE 버퍼에 희석.
  2. 각 샘플에 대 한 웰 스/복제의 수를 계산 합니다. 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합 초과에서 볼륨의 10%를 추가 하는 각 샘플에 대 한 준비.
  3. RNase 무료 물 4 µ L, 2 x 빠른 고급 마스터 믹스 (자료 테이블)의 10 µ L와 희석된 cDNA의 마지막으로 5 µ L를 추가 합니다.
  4. Vortexing에 의해 혼합 하 고 간단히 내용을 아래로 회전 원심.
  5. 각 잘 밀봉 하는 접시 고 짧게 원심 반응 혼합의 19 µ L를 전송 합니다.
  6. RT-PCR 시스템에 열 프로토콜 (표 2)를 수행 합니다.

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Representative Results

진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단계에서 특히 요구 하는 몇 가지 수정만 우리가 성공적으로 우리의 모든 대상 환자 인구 (그림 2)를 평가 한다.

특히, 우리 2 분석 플라즈마 샘플/환자, 기준선과 치료 수정 미르 식 환자 결과와 연관.

우리가 cel-미르-39 0.05의 직렬 희석 수행, 0.5 nM, 5nM 및 플라즈마의 800 µ L에 5 오후에 (플라즈마의 400 µ L 더하기 2 x denaturating 솔루션의 400 µ L) 사용 하 여 스파이크에 농도 결정 하기 위해 샘플. 그림 4에서처럼 exogenous 제어 임계값 사이클 전체 프로토콜 (즉, 추출, 반전 녹음 방송 및 qRT-PCR 평가)의 견고성을 나타내는 직렬 희석 일치 했다 (코네티컷) 값을 보여주었다. 또한, 이러한 직렬 희석 사용 스파이크-농도 모든 대상 miRNAs의 반전 녹음 방송 방해 하지 것입니다를 선택 하.

이 메서드를 사용 하 여 임상 병리학 특징 기준 miRNAs 연관 수 있었습니다. 특히, 우리는 발견 했다-미르-199a-5 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-520 d-3 p 크게 upregulated에 왼쪽 오른쪽 양면 병 변 기준 면 (p = 0.03, p = 0.006, p = 0.008, 각각). 반대로, 있다-미르-21-5 p는 크게 downregulated RAS 변이 환자에서 (K-RAS, p 0.01 N-RAS, p = 0.008 =)-미르-221-3 p upregulated 반면, (p = 0.05, p = 0.01, K 및 N RAS, 각각).

우리는-미르-155-5 p 식 레벨 증가 짧은 PFS와 관련 되었다 관찰 기준선 사이의 첫 번째 임상 평가 miRNA의 식 수준을 비교, (p = 0.04) 및 OS (p = 0.02). 특히, 환자에서 있다-미르-155-5 p에서 ≥30% 증가, PFS 9.5 개월 (95 %CI, 6.8-18.7) 이었고, OS 22.3 개월 (95 %CI, 10.2 25.5) 및 42.9 개월 (95 %CI, 24.8-아니 도달)에 비해 15.9 개월 (95 %CI, 8.4-아니 도달) 그는 < 30% 증가 (그림 3). 케이스 시리즈 (30%)에서의 중간 값 컷오프 지점으로 설정 했다. MiRNAs의 순환 기초 수준 "높음" 또는 "낮은" 중간 값9에 따르면 dichotomized 했다.

Figure 1
그림 1: 사용자 지정 접시 레이아웃의 디자인. 프로브에 각 잘 미리 목격 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: qRT-PCR 증폭 플롯의 예. (A) 증폭 단일 qRT-PCR 사용자 지정 접시의 플롯. 모든 마커 evaluable 둘 다 단일 플레이트 샘플에 있었다. (B) qRT-전반적인 케이스 시리즈에는 미르-17-5 p의 레이디얼 승용차 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 실험 및 임상 결과-미르-155-5 피 기준으로 (A) Ct 값은-미르-155-5 p. 전반적으로 케이스 시리즈에는 미르-155-5 p의 증폭 줄거리. (B) PFS 및 환자의 ≥30 %의 운영 체제 또는 < 있다-미르-155-5 p 순환에 30% 증가. PFS는 종양 진행, 마지막 종양 평가 또는 질병 진행의 부재에서 죽음의 첫 번째 문서화 된 증거의 날짜에 랜덤의 날짜에서 시간으로 계산 되었다. 운영 체제는 어떤 원인 또는 마지막 속 행에서 죽음의 날짜에 랜덤의 날짜에서 시간으로 계산 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 실험 결과 forcel-미르-39 직렬 희석. (A) qRT-PCR 희석 Cts. (B) 상대와 cel-미르-39, 직렬 희석에 대 한 5에서 수행한 nM, 0.5 nM, 0.05 nM와 같은 환자에서 혈장 샘플에 5 오후. 이러한 분석 결과 선형성은 전체 케이스 시리즈에 사용 하 여 최고의 농도 선택 하 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단계 온도 기간 사이클
효소 활성화 95 ° C 5 분 1
변성 95 ° C 3 s 14
Anneal/확장 60 ° C 30 s
반응을 중지합니다 99 ° C 10 분 1
보류 4 ° C 보류

표 1: 미르 앰프 반응의 열 프로토콜.

단계 온도 기간 사이클
효소 활성화 95 ° C 20 s 1
변성 95 ° C 3 s 40
Anneal/확장 60 ° C 30 s
보류 4 ° C 보류

표 2: qRT-PCR의 열 프로토콜.

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Discussion

miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 타 액, 임상 연습10에 그들의 잠재적인 유용성에 성장 관심사를 주도하 고 있다 같은 생물 학적 체액에서 안정적 형태로 존재 한다.

그럼에도 불구 하 고, 순환 miRNAs의 평가 과제 이며 샘플 수집, 대상 추출, 플랫폼 선택 및 글로벌 표준화에 관한 어려움은 과학 지역 사회 내에서 뜨겁게 논쟁된 주제.

샘플 수집 및 저장에 대 한 사전 분석 변수는 플라즈마 처리 및 처리 밀접 하 게 연결 됩니다. 응고 과정10,11,12 동안 이러한 분자의 출시로 인해 아마도 후자에 더 높은 miRNA 농도의 충분 한 증거가 있다 그 주어진 우리 플라즈마 보다는 혈 청 샘플에 집중 . 혈액 세포 세포의 용 해에서 파생 하는 세포 핵 산의 분리의 문제를 해결 하려면 우리 혈액 컬렉션의 2 h 이내 샘플을 centrifuged. 우리는 또한 다른 안티 coagulants 증폭 단계 (즉, 헤 파 린)을 방해으로 알려져 있으며 혈 (즉, 시트르산)를 실행할 수 있기 때문에 K3E EDTA 튜브 사용. 그것은 사전 분석 단계에서 혈소판 및 림프 구 오염 방지에 중요 한, 우리 아주 천천히 튜브에서 플라스마를 제거 하 고 튜브에서 샘플의 마지막 ~ 50 µ L를 발음 하지 않았다.

다양 한 연구 열 기반 추출 방법의 우월 guanidine/페 놀/클로 프롬 기반 프로토콜11,13, 이상 하지만 Khoury 외. 효과적으로 격리 좋은 품질 등을 사용 하 여 혈 청에서 작은 RNAs 오염14없이 시 약. 순차적으로 사용 하는 상용 키트 스파이크 농도 면에서 적합 한 미르 수확량을 허용 두 추출 방법을 수행 합니다. 우리만 즉, 제조업체의 지침에 관하여 1 개의 수정 수행, 신선한 컬렉션 튜브 항상 각 필터 카트리지 세척 단계 후를 사용한 시 약 오염 위험 제거/감소. 우리의 샘플에 최고의 스파이크에 농도 식별 하 고 따라서 후속 반응 간섭을 유발 하지 않도록, 우리가 먼저 수행 전체 프로토콜의 중간 식 수준을 평가 하는 추출 단계 동안 cel-미르-39를 추가 하지 않고 우리의 목표입니다. 우리는 다음 드 노 보 미르 추출 플라즈마 샘플에서 우리의 케이스 시리즈 (그림 4)의 플라즈마 샘플을 추가 하려면 같은 환자 cel-미르-39의 직렬 희석을 사용 하 여 최고의 농도 식별 하기 위해 수행 합니다. 그러나 그것은,, 해야 밑줄이 그 최적의 cel-미르-39 농도, 하나의 샘플에 대 한 식별 않을 수 있습니다 반드시 전체 케이스 시리즈에 대 한 최고의 농도 내부 변수, 나이, 성별, 생활 습관 등의 시리즈는 혈액 내에서 절대 미르 식 영향을 미칠 수 있습니다.

miRNA 반전 녹음 방송 및 증폭 2 중요 한 단계를 나타냅니다. MiRNA 탐지 (즉., qRT-PCR 및 microarray)에 대 한 두 가지 주요 방법 중 우리 qRT-PCR의 높은 감도 우리의 필요 (이 방법의 주요 한계는 그것의 낮은 처리량) miRNAs의 선택한 패널만 평가 하 선택15. 우리가 성숙한 miRNA를 확장 하 고 보편적인 RT 뇌관의 어 닐 링 허용 반전 녹음 방송 화학 3' polyA 미행 및 5' 결 찰 어댑터 시퀀스에 따라 사용. 단일 기지-쌍 인식에 따라, 결 찰 어댑터 5' 5' 불일치에 연결 되어 같은 일반적인 편견을 피하기 위해 도울 수 있었다. 이 키트는 또한 낮은 수익률 샘플, 플라즈마 등에 필요한 사전 증폭 단계를 포함 한다. 비록 필요한이 단계 검색 단계 전에 일부 증폭 편견을 소개 수 있습니다.

이 프로토콜에서 우리는 신생 연관 24 선택한 miRNAs의 패널 분석. 특히, 우리는 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 선택 하 고 qRT-PCR 실행에 대 한 제조업체의 지침을 따 랐 다. MiRNA qRT-PCR에 관련 된 주요 문제는 참고 유전자 및 그들의 연속적인 데이터 분석 정규화의 선택 이다.

정규화에 사용할 최고의 miRNA를 식별 하기 위해 수많은 연구를 실시 했습니다, 하지만 아무 균일 한 합의 도달 했습니다. 이 한계를 해결 하기 위해 우리는 우리의 케이스 시리즈에 참조 유전자로 사용 될 수 있는 순환 miRNAs 식별 하 문학 검색 실시.

우리는 또한 mCRC 환자에서 혈장 샘플에 안정적인 식의 강한 증거 4 miRNAs를 선택 하 고 우리의 케이스 시리즈의 작은 부분에서 그들을 테스트. 2 가장 안정적인 miRNAs는 하우스키핑 유전자를 참조 GeNorm 분석에 의해 확인 되었다.

결론적으로, miRNAs 주변 혈액 샘플에서 순환의 평가 알려진된 어려움의 여러. 그러나, 우리가 믿고 우리가 사용 하는 방법론은 안정적이 고 강력한, 대 장 암에 대 한 처리 시나리오를 바꿀 가능성이 있는 이러한 생체의 깊이 정확한 연구에 대 한 허용.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

이 연구로 기존과 이탈리아 약 기관 (AIFA)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes Eppendorf 0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips Starlab S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips Starlab S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips Starlab S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit Thermo Fisher AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher A28007
100% ethanol anidrous ACS grade Carlo Erba Reagents 414605
2-mercapto-ethanol Sigma-Aldrich M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher 4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays Thermo Fisher A25576
7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes

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