Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта статья показывает мощный метод количественного определения митохондрий или лизосом в живых клетках. Сочетание конкретных Лизосома или митохондрии красители с дневно конъюгированных антител против поверхностных маркеров позволяет количественная оценка этих органеллы в смешанных клеточных популяций, как первичной клетки заготавливаемым от образцов тканей, с использованием многоцветная проточной цитометрии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Т-клетки используют различные обменные программы их функциональным потребностям во время дифференциации и пролиферации. Митохондрии являются важнейших клеточных компонентов, отвечающих за энергоснабжения клеток; Однако избыток митохондрии также производят реактивнооксигенных видов (ров), которые могут привести к смерти клетки. Таким образом количество митохондрий должны постоянно корректироваться в соответствии с потребностями клеток. Это динамическое регулирование достигается частично через функцию лизосомы, которые удаляют излишки/поврежденных органеллы и макромолекул. Следовательно сотовой митохондриальных и лизосомальных содержание являются основные показатели для оценки метаболической перестройки клеток. С развитием зонды для органеллы, хорошо изученных Лизосома или митохондрии конкретных красители стали доступны в различных форматах для обозначения сотовой лизосом и митохондрии. Многоцветная проточной цитометрии является общим инструментом для профиль клеток фенотипов и имеет возможность быть интегрированы с другими анализов. Здесь мы представляем подробный протокол о том, как совместить органеллы конкретных красители с поверхностных маркеров, окрашивание измерить количество лизосом и митохондрий в популяциях различных Т-клеток на проточный цитометр.

Introduction

Активация и пролиферацию клеток T являются важнейшие шаги для монтажа успешных иммунных реакций. Последние достижения показывают, что тесно связано с развитием и функции клеток T клеточный метаболизм. К примеру наивно T клетки полагаются в основном на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения спроса на энергию во время рециркуляции среди средних лимфоидных органов. После активации наивно T клетки претерпевают радикальные метаболических перепрограммирования, включая индукцию аэробного гликолиза для увеличения производства АТФ и выполнить огромную метаболические требования во время дифференцировки клеток и распространения. Клетки, которые не в состоянии следовать через метаболические потребности умирают апоптоза на1,2. В ходе метаболических перепрограммирование, митохондрии играют важную роль, поскольку они являются органеллы, значительной степени ответственность за производство АТФ для поставлять энергию для ячейки, и содержание сотовой митохондрий колеблется в ходе метаболических переключатели на протяжении Т-клеток развития и активации3. Однако накоплением лишних или повреждения митохондрий могут производить избыток рос, что повреждения липидов, белков и ДНК и в конечном итоге может привести к смерти4 ячейки

Чрезмерное или повреждения митохондрий, результатом метаболические изменения удаляются специализированной формой autophagy5, известный как mitophagy. Митохондрии окружены autophagosomes и затем сливается с лизосомы для деградации. Закрыть эти связи между митохондрии и лизосом вызвали большой интерес в6,7. К примеру, оксидативный стресс стимулирует митохондрии составить производными митохондрий везикулы (MDVs), которые предназначены для лизосомы деградации в фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN)-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) и Паркин (E3 убиквитин лигаза) 8зависимым образом. Было также установлено, что mitophagy имеет важное значение для перехода бежево белый Адипоцит9,10. Что еще более важно лизосомы являются не просто деградации отсек, но и регулятор клеточных сигналов. Накопление чрезмерного субстрат из-за недостатков фермента приводит к лизосомальных дисфункции, нарушая лизосомальных мембран проницаемости и влияет на Ca2 + гомеостаза11. Т-клеток функциональных дефектов в лизосомальных кислоты липаза (Лал)12 или лизосомальных метаболит транспортер нокаут мыши модель13 далее показали важность лизосом в поддержании гомеостаза Т-клеток. Митохондрии и лизосом являются неотъемлемой частью клеточной регуляции метаболизма. Таким образом измерение содержания клеточных митохондриальной был решающую показателем для оценки состояния обмена веществ и функциональных Т-клеток.

Анализы, обычно используется для количественного определения сотовой митохондриальной или лизосомальных содержимое включают immunoblot, электронная микроскопия, immunofluorescent окрашивание (КРП) и ПЦР-анализа митохондриальной ДНК копировать номера14,15, 16. Эти анализы, хотя immunoblot можно количественно сравнить уровни белка через различных образцов и электрон или если микроскопии можно визуализировать морфологические признаки эти органеллы17, несут определенные технические недостатки. Например это много времени приобрести достаточное количество клеток изображений с высоким увеличением и резолюции или сравнить уровни выражения протеина через десятки образцов, что делает эти анализы, считается низкой пропускной способности методы. Кроме того эти анализы может применяться только населению однородных клеток, таких как клеточных линий, но не для образцов тканей, которые состоят из смешанного населения.

Это также трудно применять эти анализы редких населения, для которых требование о минимальной ячейки чисел от 106 -108 невозможно соблюсти. Наконец клетки обычно лизированы или фиксированной во время процесса, что делает их несовместимыми с другими методами для получения дальнейшей информации. По сравнению с традиционными методами, на основе люминесцентных проточной цитометрии имеет относительно высокую пропускную способность - информация из всех клеток в образце состоит из смешанных клеточных популяций могут быть проанализированы и собранные одновременно. Кроме того можно обнаружить более 10 параметров на той же клетке и Сортировка ячеек, основанных на желаемый фенотипы для дальнейших анализов. Реактивная флуоресцентных зондов были использованы для обозначения лизосом и митохондрий в живых клеток и может быть обнаружен поток цитометрии18,19. Эти зонды органеллы конкретных клеток проницаемых и физико химические характеристики, которые позволяют им быть сосредоточены в определенных местах субцеллюлярные или органеллы. Удобно эти датчики доступны в различных форматах флуоресцентные, таким образом позволяя их применение для многоцветного анализа.

Этот протокол описывает подробно как совместить поверхности маркер, окрашивание красками Лизосома или митохондрии специфичные для метки лизосомы или митохондрий в живой клетки. Это особенно полезно для образцов, созданных из основной ткани и органы, которые часто состоят из гетерогенных клеточных популяций. Исследователи могут определить клеточных популяций интерес выражением их поверхности маркер и конкретно измерить лизосомальных или митохондриальной содержимое через органеллы конкретных красителей в этих клетках. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру анализа гранулярных потока, который оценивает лизосомальных или митохондриальной массы в основных селезеночной Т-клеточной субпопуляций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Описанную здесь процедуру сбора ткани мыши был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) национального университета Ян-мин.

1. Подготовка лимфоцитов подвеска из лимфоидных органов

  1. Усыпить мыши утвержденным методом как CO2 ингаляции в камере Прозрачный акриловый, следуют шейки матки дислокации для обеспечения смерти.
    Примечание: Держите скорость потока CO2 20% при перемещении в минуту палаты и не выше 5 psi (фунт на квадратный дюйм). Она занимает 2-3 мин для мыши потерять сознание. CO2 поток поддерживать по крайней мере за 1 мин после животного остановилось дыхание (5-7 мин общая).
  2. Поместите курсор мыши на его обратно на чистой доске (например полистирол пластиковые доски) и исправить конечностей клейкой лентой. Промойте с 70% этиловом спирте.
  3. Урожай селезенки, вырезать и открыть брюшной полости с 11-см рассечения ножницы (селезенка находится ниже желудка и выше левой почки). Удаление селезенки с щипцами и очистить от соединительной ткани (при необходимости используйте ножницы).
  4. Урожай тимуса, вырежьте диафрагмы и грудная клетка с обеих сторон с рассечения ножницы. Используйте щипцы для поднимания грудины раскрыть весь грудной полости. Отделить тимуса тщательно от окружающих тканей с ножницами и удалять любые остаточные соединительной ткани на бумажным полотенцем, смоченным с PBS.
  5. Механически отделить ткани с поршень шприца в 6-см блюдо, содержащих 5 мл ледяной СУИМ буфера (PBS дополнены с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм ЭДТА). Передача одной ячейки подвеска пластиковых 15 мл пробирок; мыть 6см блюдо с еще 2 мл СУИМ буфера и объединить мыть с суспензию клеток, а также.
  6. Центрифуга суспензию клеток (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Вновь приостановите лепешка с 2 мл аммония хлорид калия (ACK) лизировать буфер (155 мм NH4Cl, KHCO 10 мм3 и 0,1 мм Na2ЭДТА) за 1 мин при комнатной температуре (RT) лизируют красных кровяных клеток. Нейтрализовать буфере ACK, добавив СУИМ буфер 10 мл суспензии клеток.
  7. Центрифуга суспензию клеток (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Вновь приостановить клетки в 5 мл полного RPMI среднего (средне RPMI 1640, дополняется 44 мм NaHCO3, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мг/мл, 2 мм L-глютамин, пируват натрия 1 мм, 1% MEM несущественные аминокислот и 10% FBS).
  8. Суспензию клеток в фильтр через стрейнер ячейки (порами размером 70 мкм), чтобы удалить Купы ячейки. Подсчет количества ячеек с Горяева или счетчик автоматизированных клеток.

2. Количественная оценка митохондрии и лизосом

Примечание: Выполните органеллы конкретных краситель, окрашивание сначала, потому что оптимальное окрашивание условие для этих красителей инкубации при температуре 37 ° C. Пятнать поверхности маркер может быть значительно снижено ввиду антитела укупорки и интернализации при этой температуре.

  1. Добавьте 1 х 106 клеток раунд нижней трубы СУИМ, центрифуга клетки (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант.
  2. Разбавить зонд фондовых решения окончательные рабочие концентрации (100 Нм MitoTracker зеленый или LysoTracker зеленый; отныне митохондрии Лизосома конкретных или красителя, соответственно) в подогретым 37 ° C сыворотки свободной культуры среднего. Это рабочий раствор для конкретных Лизосома или митохондрии красителя.
    Примечание: Тест несколько концентрации, включая диапазон рабочей концентрации, предложенная производителем (20-200 Нм для митохондрии конкретных краситель) и 50-75 Нм для Лизосома конкретных краситель, используемый здесь для получения лучших пятнать эффективности. Выберите популяции клеток, как известно, имеют хорошее выражение окрашивания цели (например , лизосомы) как позитивный элемент управления (например человека CD14+ моноцитов). Выберите рабочие концентрации, основанные на хорошее разделение между отрицательный и положительный пятнать, а также жизнеспособность клеток хорошо.
  3. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл Лизосома - или митохондрии определенного рабочего раствора красителя и инкубировать в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C за 15 минут или 30 мин, соответственно.
  4. Добавьте 1 mL ледяной СУИМ буфера для остановки реакции. Пелле клетки центрифугированием (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C) и удалить супернатант. Клетки теперь готовы для пятнать поверхности маркер.

3. поверхность маркер пятнать

  1. Блок Fc рецепторов с 100 мкл предварительно титруемая 2.4G2 гибридомной супернатанта на льду для 10 минут вымыть клетки с 1 мл буфера СУИМ и центрифуги (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант.
  2. Инкубируйте клетки с 50 мкл предварительно титруемая флуоресценции конъюгированных антител комбинации в СУИМ буфера на льду на 20 мин Избегите света.
    Примечание: Подготовить единый цвет окрашенных клеток, которые включают все представить в флуоресцентных антител в антитела комбинации и клетки лечат только с органеллы конкретных краситель для определения напряжения каждого флуоресценции детектор и компенсации регулировки потока цитометр. Аналогичным образом подготовьте флуоресценции минус один (FMO) как фон элементов управления с помощью клеток окрашенных с антителами, но без окрашивания красками органеллы специфичные.
  3. Вымойте клетки, добавив 1 мл буфера СУИМ и Пелле центрифугированием (300 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант.
  4. Ресуспензируйте клетки в 300 мкл буфера СУИМ, содержащий пропидий йодидом 1 мкг/мл (PI) и сразу же анализировать образцы на проточный цитометр.

4. образец коллекции на проточный цитометр

  1. Включите компьютер, проточный цитометр, СУИМ приобретение программного обеспечения и любых других аксессуаров устройств в зависимости от платформы машины. Запустите PBS для около 1 мин для обеспечения линии потока заполняется с PBS и оболочкой и буфера. Убедитесь, что поток поток проходит гладко.
  2. Открыть новый эксперимент и выберите команду Параметры (флуоресцентные детекторы) цитометр согласно инструкции производителя. Фильтр клетки через сито ячейки 70 мкм и вихревой до приобретения каждого образца, чтобы избежать скопления и формирования Дуплет.
  3. Сделайте точка участков вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC), которые представляют размер ячейки и гранулярности, соответственно. Оптимизируйте напряжений FSC и SSC, чтобы убедиться, что клетки интереса появляются в участках. Сделать точки участков FSC-A против FSC-W (или FSC-H) и нарисуйте ворота для одной ячейки.
  4. Сделайте точка участки каждого флуоресцентные параметра. Использование неокрашенных клетки для определения фонового сигнала и использовать один цвет окрашенных элементов управления для регулировки напряжения каждого параметра, флуоресцентный, так что положительные и отрицательные клеточных популяций четко различимым и внутри динамического диапазона приобретения.
  5. После того, как заданы все напряжения, используйте auto компенсации при наличии, или вручную настроить компенсации с неокрашенных одного цвета окрашенных элементов управления и исправить спектральных распространения. Применить компенсацию на образцы.
  6. Сделать сюжет точка каждого параметра и составить ворота согласно экспериментальный набор. К примеру, FSC-A против FSC-H (или FSC-W) исключить Дуплеты, следуют FSC-A против SSC-A для лимфоцитов стробирования; SSC-A vs. Пи (живые клетки) и CD4 и CD8 (рис. 1).
  7. Соберите достаточно события (всего мобильный номер) для осмысленного сравнения между населением. Как правило по меньшей мере 1000 события в населения интереса должны быть получены20.
  8. После того, как все образцы приобретаются, экспорт потока данных для анализа потока cytometry анализ программного обеспечения. Эксперимента сохраните как шаблон для сохранения цитометр настройки и параметры для применения подобных экспериментов в будущем.

5. анализ данных

Примечание: Существует много инструментов для анализа потока данных гранулярных, коммерческое и свободное программное обеспечение. Приобретение программного обеспечения цитофлуориметрами поток может также работать для анализа данных. Здесь мы использовали FlowJo в качестве примера.

  1. Запустите программное обеспечение и перетащите ФТС файлы в рабочей области. Нажмите на образец, чтобы открыть окно графического. Выберите параметры, которые будут представлены на оси X и Y, щелкнув по осям X и Y. Используйте панель инструментов рисовать ворота по данным дифференциально выразили маркеры или определенных фенотипов клеточных популяций.
  2. Добавьте ворота каждого параметра, как показано на рисунке 1. Перетащите ворота для всех образцов в рабочей области, так что они получают идентичные стробирования.
  3. Перетащите участки макет редактор для создания графических отчетов.
  4. Отображение означает флуоресценции интенсивности (MFI) для каждого населения интереса, щелкнув кнопку Статистика (Σ) в окно графического и выбрав «Означает» и соответствующий параметр, например, канал, используемый для обнаружения органеллы конкретных краситель. Нажмите кнопку «Добавить».
  5. Щелкните значок Редактор таблицы и перетащите МФО в редактор таблиц для создания статистических отчетов. Сохраните как Excel, текстовый или CSV файл для вычисления Дельта МФО (ΔMFI) как МФО (органеллы специфичные красители) - МФО (FMO).
    Примечание: Не вычислить МФО между образцами, приобретенных с различными цитометр параметры (напряжения, флуоресцентный каналы или компенсации). Сравнение значений, полученных от экспериментов с различными параметрами смысла и предвзятым.
  6. Экспортируйте все значения из рабочей области и сюжеты из редактор макетов для создания таблиц и рисунков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Идентификация основных Т-клеток подмножеств селезенки и вилочковой железы

Вкратце Одноячеистый суспензий из селезенки и вилочковой железы были лизированы красных кровяных клеток, инкубировали с 2.4G2 супернатанта, следуют органеллы конкретных краситель и поверхности маркер, окрашивание с флуоресцентным конъюгированных антител (Таблица 1). Развития прогрессирование тимоцитов можно описать с помощью антител к совместно рецепторов CD4 и CD8. Наиболее незрелых тимоцитов не выражают CD4 и CD8 и называются двойное отрицание (DN). Затем они вверх регулировать CD4 и CD8 и стать двойной положительный (DP). Наконец они вниз регулировать CD4 и CD8 и стать Зрелые одного позитивные клетки (SP) готовы оставить орган. Ранних стадиях развития клеток T, когда клетки не выражают Сопредседатель рецепторов CD4 и CD8, могут быть далее классифицированы на основе CD44 и CD25 выражение. Ранние прародители, CD44+ CD25 (DN1), и затем они начинают, выражая CD25 и стать CD44+CD25+ (DN2) клетки. После этого, вниз регулировать CD44 клетки и стать CD44CD25+ (DN3) клетки и, наконец, они вниз регулировать CD25, а для того, чтобы стать CD44CD25 (DN4) клетки, которые находятся на пути к выражая CD4 и CD8 и становится Двухместный положительных клеток (DP).

В селезенке, Т-клетки можно разделить цитотоксических CD8+ и вспомогательные CD4+ T клетки. Оба этих групп населения можно подразделить наивными, эффекторные и памяти подмножеств, основанный на CD62L и CD44 пятнать. Подробная стратегия стробирования показан на рисунке 1.

Количественная оценка массы митохондрий в разных Т-клеток подмножеств

Митохондрии конкретных красители использовались для измерения количества митохондрий в популяции клеток T. Мы обнаружили, что митохондриальной содержимое были самыми низкими в DN1, достиг DN2-DN3 и затем слегка уменьшилась в DN4 и DP тимоцитов и были даже ниже в CD4 и CD8 SP тимоцитов (рисA). Однако CD4 и CD8 SP тимоцитов были высшего митохондрий, окрашивание МФО чем splenic клетки CD4 и CD8 T (рис. 2B). Эти наблюдения предполагают, что митохондриальной содержание колеблется во время разработки Т-клеток с незрелых тимоцитов, содержащие больше митохондрий, чем их зрелые коллеги, и наивно T-клетки, которые рециркуляции в богатой кислородом крови имеют даже ниже митохондриальной массы. Интересно, что это сокращение митохондриальной содержимое было более заметным в CD8, чем линии CD4 T (рис. 2B), и активации клеток T дальнейшее снижение его. Среди активация Т-клеток, CD4+ клетки памяти T было чуть больше митохондрий, по сравнению с эффекторов; Однако, наоборот был случай для CD8+ T клетки: CD8+ клетки памяти T имел низкий митохондриальной массы среди всех подмножеств Т-клеток (рис. 2B).

Лизосомальных содержимого измерения в различных субпопуляций Т-клеток

С помощью Лизосома конкретных краситель, мы наблюдали относительно низкий, но обнаружить, лизосомальных содержимое всех Т-клеточных популяций, с более заметным присутствием лизосом в DN1 тимоцитов (рисA). Никакого существенного различия был обнаружен среди тимоцитов подмножеств от DN1 вперед. В периферии, относительно большое количество лизосомы был найден в памяти и эффекторных CD8+ T клетки. Это явление соответствует предыдущего исследования, показывающие, активированные CD8+ T клетки увеличилось их выражение лизосомальных связанные мембранный белок 1 (лампа-1)21,22, отражающие их владение лизосомальных цитотоксических гранулы (рис. 3B)

Figure 1
Рисунок 1 : Стробирования стратегия splenic лимфоцитах и тимоцитов. Клетки были предварительно воротами на FSC/SSC и PI для получения живых фуфайки. (A) общая тимоцитов от мышей были окрашенных с CD4 и CD8, CD44, CD25. CD4 и CD8 выражения были использованы для различения CD4+CD8 SP, CD4CD8+ SP, CD4+CD8+ DP и CD4CD8 подмножеств DN . CD4CD8 DN подмножество далее разделены CD44+CD25 DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44CD25+ DN3 и CD44CD25 субпопуляций DN4 . (B) всего splenocytes от мышей окрашивали TCRβ, CD4, CD8, CD44 и CD62L. TCRβ+ клетки были разделены на CD4+ и CD8+ T клетки, которые были разделены наивный (CD44CD62L+), память (CD44+CD62L+) и эффектор (CD44+CD62L -) населения. Результаты являются представитель трех независимых экспериментов с n = 3-4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель гистограммы, показаны митохондрий, пятнать в каждой популяции клеток. Клетки окрашивали митохондрии конкретных краситель для 15 мин при 37 ° c, после окрашивания поверхности маркер. Флуоресцентный сигнал окрашенных клеток была приобретена проточный цитометр и проанализированы на. (A) митохондрий пятнать DN и DP тимоцитов. (B) митохондрий окрашивание CD4SP и CD8SP тимоцитов и селезеночной T клеточных популяций. ΔMFI = МФО (митохондрии окрашивание) - МФО (FMO). Сплошная красная линия представляет митохондрий, окрашивание, сплошной синей линией показан FMO управления, и пунктирная красная линия представляет собой среднее флуоресценции интенсивности митохондрий, пятнать в каждой популяции. Результаты являются представитель трех независимых экспериментов с n = 3-4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель гистограммы, показаны Лизосома пятнать в splenic лимфоцитах и тимоцитов. Клетки окрашивали Лизосома конкретных краситель для 30 мин при 37 ° c, после окрашивания поверхности маркер. Флуоресцентный сигнал окрашенных клеток была приобретена проточный цитометр и проанализированы. (A) Лизосома пятнать DN и DP тимоцитов. (B) Лизосома окрашивание CD4SP и CD8SP тимоцитов и селезеночной T клеточных популяций. ΔMFI = МФО (Лизосома окрашивание) - МФО (FMO). Сплошной зеленой линией представляет Лизосома окрашивание, сплошной синей линией показывает FMO, и пунктирная красная линия представляет собой среднее флуоресценции интенсивность Лизосома пятнать в каждой популяции. Результаты являются представитель одного эксперимента с n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: Многоцветный потока цитометрии группа образцов. Флюрохром и концентрации антитела/органеллы красителей в окрашивание смеси перечислены здесь. Настоятельно рекомендуется к Титруйте и проверить каждое антитело, при настройке нового окрашивания панелей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол сочетает в себе органеллы специфичные красителей и поверхности маркер окрашивания для количественного определения количество митохондрий или лизосом в популяциях различных Т-клеток. Этот метод был разработан для преодоления ограничения ячейки номер и однородности требования для традиционных методов, таких как электронная микроскопия и анализ immunoblot. Это особенно полезно при анализе редких клеточных популяций и одновременно изучения несколько типов клеток, в то же время.

Продолжительность процедуры и температура инкубации являются наиболее важными факторами в этом протоколе. Надлежащего органеллы маркировки требует точной титрования органеллы специфичные красителей. Также клетки строго следует на льду для повышения жизнеспособности и избежать антитела укупорки и интернализации. Кроме того флуоресценции эти органеллы конкретных красители уязвим для света воздействия и температурным изменениям. Таким образом очень важно немедленно анализ образцов после завершения процедуры окрашивания. Мы постоянно были в состоянии завершить всего эксперимента в течение 2 часов.

Поскольку этот протокол основывается на возможности обнаружения многоцветной флуоресценции проточный цитометр оценить внутриклеточных компонентов, приобретение параметры (например , PMT напряжений) и компенсации спектров пересекаются (разрастание флуоресценции в соседних каналов) может сильно влияние интенсивности сигнала. Это особенно актуально, когда поверхностных маркеров, необходимо определить типы соответствующих клеток увеличивается выше шести. В этой ситуации опыт в проектировании многоцветной потока цитометрии эксперименты становится очень важным для получения высокого качества данных.

Иммунная система защищает организм от патогенных оскорбления и инфекции, и активация Т-клеток имеет ключевую роль в предоставлении необходимых сигналов другие иммунные клетки. Последние исследования показывают, что различные T клеточных популяций имеют уникальные обменные программы, и митохондриальных и лизосомальных содержание важнейших показателей метаболических изменений. Однако это явление не является уникальным для Т-клеток. Дифференциация и активации innate иммунных клеток, такие как макрофаги и дендритные клетки, также тесно связаны с их метаболический статус23,24. Преимуществом этого протокола является, что она может быть адаптирована для изучения любых клеточных популяций интерес с использованием антител против линии специфических маркеров. Кроме того в сочетании с другими органеллы конкретных красителей, например ER - или Цито-ID, он имеет потенциал, чтобы оценить различные органеллы или сотовой отсеков в различных типах клеток.

Создание этого митохондрий или Лизосома метод количественной оценки не только инструментальные для изучения метаболизма клеток T, но также имеет большой потенциал в интересах исследования, которая сосредоточена на метаболические изменения в настройках болезни, как рак или аутоиммунные заболевания25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конфликты интересов.

Acknowledgments

В разработке этого протокола был поддержан грантов из Тайваня министерства науки и технологии (большинство) NSC103-2320-B-010-002-MY2 и MOST104-2628-B-010-002-MY4 C.L. Hsu. К.В Вэй является получателем отличные тезис награду от Института микробиологии и иммунологии, национального университета Ян-мин.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212, (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136, (4), 363-369 (2012).
  3. Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182, (7), 4046-4055 (2009).
  4. Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
  5. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (1), 9-14 (2011).
  6. Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500, (1), 87-93 (2018).
  7. Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
  8. McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33, (4), 282 (2014).
  9. Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (10), 607 (2016).
  10. Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24, (3), 402-419 (2016).
  11. Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (5), 283-296 (2013).
  12. Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174, (3), 944-956 (2009).
  13. Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23, (8), 2330-2341 (2018).
  14. Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22, (3), 485-498 (2015).
  15. Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281, (1), 324-333 (2006).
  16. Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (20), 7681-7686 (2004).
  17. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393, (7), 547-564 (2012).
  18. van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (35), 14336 (2013).
  19. Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85, (2), 169-178 (2013).
  20. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
  21. Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175, (7), 4392-4399 (2005).
  22. Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199, (7), 925-936 (2004).
  23. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17, (3), 684-696 (2016).
  24. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15, (1), 18-29 (2015).
  25. Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
  26. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17, (1), 29 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics