इंट्रा-ओमेंटल टाप ट्रांसप्लांटेशन एच-ओमेंटल मैट्रिक्स टाप फॉम (होमिंग) का उपयोग करके

Bioengineering
 

Summary

यहां, हम के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है वीवो वैधीकरण के hydrogel आधारित सेल थेरेपी, टाप प्रत्यारोपण के उदाहरण से सचित्र । एच-ओमेंटल मैट्रिक्स टाप फिलिंग (होमिंग) प्रत्यारोपण एक उचित चयापचय वातावरण में engraftment को अधिकतम करने के लिए, रक्त वाहिकाओं के पास, Omental परतों के बीच एक सेल-हाइड्रोगेल मिश्रण के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है ।

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Schaschkow, A., Mura, C., Pinget, M., Bouzakri, K., Maillard, E. Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING). J. Vis. Exp. (145), e58898, doi:10.3791/58898 (2019).

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Abstract

पुनर्योजी चिकित्सा कोशिका चिकित्सा पर आधारित रोग के इलाज के लिए एक नई आशा का प्रतिनिधित्व करता है. वर्तमान बाधाओं चिकित्सा की दक्षता के vivo सत्यापन में उचित शामिल हैं । प्राप्तकर्ता के शरीर में स्थानांतरण के लिए, कोशिकाओं को अक्सर बायोटेरियल्स, विशेष रूप से हाइड्रोजैल के साथ संयोजित करने की आवश्यकता होती है । हालांकि, इस तरह के एक भ्रष्टाचार की प्रभावकारिता के सत्यापन सही वातावरण, सही hydrogel, और सही प्राप्तकर्ता साइट की आवश्यकता है । ओमेंटूम इस तरह के एक साइट हो सकता है । टाप ट्रांसप्लांटेशन के उदाहरण के आधार पर, हम homing विकसित (एच Omental मैट्रिक्स टाप भरने) तकनीक, जो ऊतक के अंदर भ्रष्टाचार के इंजेक्शन के होते हैं, Omental परतों के बीच में, टाप प्रत्यारोप और अस्तित्व में सुधार करने के लिए । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, आइलेट्स को एक चिपचिपापन के साथ एक हाइड्रोजेल में एम्बेडेड किया जाना चाहिए जो एक एटार्मेटिक सुई का उपयोग करके इंजेक्शन को सक्षम बनाता है । सिरिंज हाइड्रोजेल और islets के संयोजन के साथ भरी हुई हैं । विभिन्न प्रवेश बिंदुओं पर omental ऊतक के अंदर कई इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं, और टाप/हाइड्रोगेल मिश्रण का जमाव एक लाइन के साथ किया जाता है । हम डेक्सट्रान मोती का उपयोग कर इस अभिनव दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का परीक्षण किया । मोती पूरी तरह से रक्त वाहिकाओं के करीब निकटता में, omental ऊतक भर में फैले हुए थे । graft की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम मधुमेह चूहों में islets प्रत्यारोपित और दो महीने से अधिक एक चयापचय अनुवर्ती प्रदर्शन. प्रत्यारोपित islets पुनः के एक उच्च दर का प्रदर्शन-आसपास और islets के अंदर vascularization, और रिवर्स मधुमेह । homing तकनीक हाइड्रोजेल या सेल थेरेपी के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, उच्च चयापचय गतिविधि के साथ कोशिकाओं के लिए ।

Introduction

कोशिका चिकित्सा एक गर्म विषय है, के रूप में यह पुनर्योजी दवा के आधार पर रोगों का इलाज करना है । जैविक सामग्री की सहायता से सेल चिकित्सा हाल के वर्षों में तेजी से अध्ययन किया गया है, खासकर इसलिए कि सेल प्रत्यारोपण अक्सर संस्कृति डिश से प्राप्तकर्ता के लिए कोशिकाओं के हस्तांतरण के लिए एक वाहक की आवश्यकता है । बायोमेट्रिक मचानों संभावित मूल्यवान सेल वाहक है कि कई भूमिकाओं को पूरा कर रहे हैं1. एक सक्षम वाहक यांत्रिक तनावों से कोशिकाओं की रक्षा करना चाहिए और अनुकूल विकास की स्थिति प्रदान करना चाहिए, जैसे आवश्यक वृद्धि कारकों, चयापचय अपशिष्ट उत्सर्जन, पोषक तत्वों का विनिमय, और ऑक्सीजन2.

सेल थेरेपी में इस्तेमाल किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के बायोटेरियल्स के अलावा, हाइड्रोजैल में कई फायदे हैं । वे biocompatible हैं, biodegradable, संभाल करने के लिए आसान है, और ऑक्सीजन प्रसार3की सुविधा । इसके अलावा, वर्तमान प्रौद्योगिकी hydrogels के उपयोग की अनुमति देता है कोशिकाओं को जीवित और engraft के साथ, उदाहरण के लिए, वृद्धि कारकों या अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन4के साथ पूरकता ।

स्टेम सेल युक्त हाइड्रोजेल वाहक उपचार, जैसे, अस्थि पुनर्जनन5 और तंत्रिका तंत्र रोग6के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है । metabolically सक्रिय कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की जरूरत है. जबकि विट्रो में दृष्टिकोण का सत्यापन संभव है, उपकरण और तकनीक के लिए vivo सत्यापन में परिष्कृत रहने के लिए रहते हैं ।

सेल और हाइड्रोजेल ट्रांसप्लांटेशन को आसानी से उपचर्म इंजेक्शन द्वारा किया जा सकता है जब biocompatibility परीक्षण आयोजित किए जाते हैं । हालांकि, जब इसराईल कोशिकाओं को उनके चयापचय कार्रवाई द्वारा प्रणालीगत कारकों को विनियमित करने के लिए होती हैं, इस चमड़े के नीचे स्थानीयकरण इष्टतम नहीं है, अनिवार्य रूप से शिरापरक जल निकासी के मामले में7. इसलिए, जल्दी से, सुरक्षित रूप से, और कुशलता से एक hydrogel के लाभकारी प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए कोई मौजूदा उपकरण हैं । टाप ट्रांसप्लांटेशन के उदाहरण के आधार पर, जिसमें यह आवश्यक है कि हार्मोन रक्त शर्करा के स्तर के जवाब में भ्रष्टाचार से खून में जारी किया जाए, हमने विवो में सेल/हाइड्रोगेल प्रत्यारोपण के लिए एक नई विधि विकसित की ।

पहले कदम के लिए एक ग्राही प्रत्यारोपण साइट है, जो कोशिकाओं के साथ एक हाइड्रोजेल स्वीकार कर सकते है की पहचान थी । ओमेन्टम प्रत्यारोपण के लिए एक बड़ी जगह प्रदान करता है, अत्यधिक प्लास्टिक है, और intraperitoneal सेटिंग के साथ संयुक्त इसकी सघन वाहियात उच्च चयापचय गतिविधि8वाले कोशिकाओं के अध्ययन के लिए दिलचस्प है । हम अगले एक शल्य चिकित्सा कोशिकाओं के हस्तांतरण और ओमेंटम में हाइड्रोजेल की अनुमति तकनीक की स्थापना की जरूरत है । प्लास्टिक सर्जरी9में इस्तेमाल किया lipofilling से प्रेरित होकर, हम एच omental मैट्रिक्स टाप भरने (homing) दृष्टिकोण विकसित की है । आइलेट्स हाइड्रोजेल में एम्बेडेड omental ऊतक के अंदर इंजेक्शन रहे हैं । तकनीक भी omental ऊतक है, जहां रक्त वाहिकाओं की बड़ी संख्या में भी भ्रष्टाचार oxygenation में सुधार में सेल और हाइड्रोजेल मिश्रण के कई जमाव का उपयोग करके अधिकतम engraftment प्रदान करने के उद्देश्य से ।

वर्तमान अध्ययन में, हम omental चादरें के बीच टाप प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और अभिनव तकनीक का वर्णन, वसा ऊतक रक्त वाहिकाओं के निकटतम के अंदर. यह सूक्ष्म इनवेसिव सर्जरी के होते हैं, जो लेप्रोस्कोपी के तहत पूरा किया जा सकता है, वसा ऊतक में एक हाइड्रोजेल में निहित islets के इंजेक्शन के साथ । यह तकनीक आसानी से सभी हाइड्रोजेल और सेल संयोजनों है कि एक में एक metabolically कार्यात्मक वातावरण में परीक्षण करने की आवश्यकता के लिए लागू है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों स्वास्थ्य दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था, प्राधिकरण संख्या के साथ: अल/

1. प्राप्तकर्ता तैयारी

  1. रासायनिक प्राप्तकर्ता चूहों में मधुमेह को प्रेरित ।
    1. ७५ मिलीग्राम/किग्रा स्ट्रेप्टोजोटोसिन (एसटीजेड, बाँझ ०.१ मीटर साइट्रेट बफर, पीएच 4) में इंयूटररoneally10चूहों के लिए सुई ।
      नोट: प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए, 6 सप्ताह पुराने लुईस तनाव चूहों, वजन 150-190 ग्राम इस्तेमाल किया गया ।
    2. पहले चार दिनों के दौरान दैनिक रक्त शर्करा माप द्वारा मधुमेह की स्थिति की जांच करें । जब तक इंसुलिन गोली प्रत्यारोपण जब तक मधुमेह जटिलताओं और वजन घटाने को रोकने के लिए 2 जी/एल से अधिक glycemia प्रदर्शन जब चूहों इंजेक्शन लंबे समय से अभिनय इंसुलिन 6 U/
    3. सहगण में चूहों को शामिल करें जब पूंछ शिरा रक्त ग्लूकोज के दो उपाय लगातार 2 दिनों के लिए 4-5 g/L > हैं, और सी-पेप्टाइड स्तर 200 pM < है । एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (elisa) द्वारा एक ग्लूकोमीटर और सी-पेप्टिडेमिया का उपयोग कर ग्लाइसीमिया को मापने ।
    4. प्रत्यारोपण त्वचा के नीचे इंसुलिन छर्रों (१.२ देखें) ।
      नोट: क्रोनिक इंसुलिन थेरेपी बेहतर glycemia विनियमन की अनुमति देता है और मधुमेह जटिलताओं से बचा जाता है (जो प्रत्यारोपण साइट पर ऑक्सीडेटिव तनाव बढ़ा)11. इसके अलावा, चिकित्सा एक सामांय विकास वक्र के साथ साथ मधुमेह राज्य रोपा (सामांय वजन घटाने के बिना एक मधुमेह जानवर में मनाया) । यह एक बड़ा omental वसा पैड, जो बाहर प्रत्यारोपण ले जाने के लिए आदर्श है में परिणाम कर सकते हैं ।
  2. इंसुलिन छर्रों का रोपण
    1. गैस संज्ञाहरण (3% आइसोफ्लूरेन में ५०० मिलीलीटर/मिनट ओ2) का उपयोग कर चूहा एनेस्थेटिज़ और प्रवण स्थिति में चूहे जगह ।
    2. पलटा (पंजा बन्द रखो) की अनुपस्थिति की जाँच करके संज्ञाहरण स्थिति की जाँच करें । पॉविटोन आयोडीन का उपयोग करके गर्दन को साफ करें, और एक रेज़िडोर ब्लेड का उपयोग करके क्षेत्र को दाढ़ी बढ़ाएं । पोविटोन आयोडीन को फिर से लागू करें और इसे 3 मिनट के लिए खड़े होने दें ।
    3. प्लेस १.५ इंसुलिन छर्रों (3 इकाइयों (यू)/200 ग्राम चूहा) एक 1:5 पतला पोविलोन आयोडीन समाधान में छर्रों जीवाणुरहित करने के लिए । एक 16 जी trocar का उपयोग गर्दन त्वचा पियर्स और सुसज्जित गाइड और stylet का उपयोग कर गोली डालें । गाइड और शूकिका निकालते हैं और एक भी बिंदु सिलाई । सिलाई को साफ करने के लिए पोविटोन आयोडीन का प्रयोग करें ।
      नोट: कोई शल्य चिकित्सा के बाद दर्द प्रबंधन आवश्यक था के रूप में हस्तक्षेप एक एकल चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) इंजेक्शन के लिए तुलनीय था ।
    4. चूहा संज्ञाहरण से उबरने और यह सुनिश्चित करें कि चूहों हाइपोग्लाइसीमिया से बचने के लिए भोजन के लिए उपयोग किया है ।
    5. प्रत्यारोपण के बाद ग्लाइकेमिया कमी को मापने के द्वारा गोली की दक्षता को मापने ।
    6. 1 महीने के लिए हर हफ्ते ग्लाइसीमिया स्तर की निगरानी करके गोली दक्षता की जांच करें ।
    7. सहगण में चूहों को शामिल करें जब पूंछ शिरा रक्त सी पेप्टाइड स्तर का एक उपाय के तहत बनाए रखा है २०० pM 1 महीने के बाद इंसुलिन गोली प्रत्यारोपण के बाद.
      नोट: सी-पेप्टाइड स्तर की जाँच करने के लिए प्रत्यारोपण से पहले आधारभूत पर जानवरों का मूल्यांकन करने के लिए और उनके मधुमेह राज्य की पुष्टि करने के लिए अनिवार्य है. कम सी पेप्टाइड पुनर्जनन हमेशा अनुवर्ती के दौरान होता है. सबसे कम सी-पेप्टिडेमिया सबसे कम उत्थान का संकेत है ।

2. होमिंग: इंट्रा-ओमेंटल मैट्रिक्स टाप फॉम

  1. टाप-मैट्रिक्स मिश्रण तैयारी ।
    1. एक स्तरीय प्रवाह हुड में चिपचिपा टाप वाहक तैयार करते हैं । १.५% की एकाग्रता पर बाँझ पीबीएस में alginate पाउडर भंग । एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से पारित होने से तैयारी जीवाणुरहित । प्रति प्राप्तकर्ता ४०० μl तैयार करें ।
      नोट: एक 21 ग्राम सुई के माध्यम से इंजेक्शन के लिए उपयुक्त चिपचिपापन के साथ हाइड्रोजेल के किसी भी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. स्वस्थ लुईस चूहों से अलग टाप (200-250 ग्राम) के रूप में पहले12वर्णित है ।
    3. गिनती टाप संख्या में टाप समकक्ष (ieq) (एक ieq १५० μm के व्यास के साथ एक अग्नाशय टाप के बराबर माना जाता है)13.
    4. एक स्तरीय प्रवाह हुड में, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ७६६०-टाप समकक्ष (ieq) के aliquots तैयार करते हैं ।
    5. धो islets ५०० μl cmrl के साथ (कनॉट मेडिकल रिसर्च प्रयोगशालाओं) भ्रूण गोजातीय सीरम से मुक्त मध्यम ।
    6. पेलेट का islets (५०० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट) अपकेंद्रीकरण द्वारा । सुपरनांट को त्याग दें ।
    7. islets पर alginate हाइड्रोजेल वाहक के १५० μl जोड़ें, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिश्रण और बर्फ पर मिश्रण जगह है ।
    8. सिरिंज में खाली alginate के १५० μl लोड करने के द्वारा एक atraumatic 21 जी सुई और मृत मात्रा के बिना एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें ।
    9. सिरिंज को आइलेट्स और एल्गिनेट (१५० μl, कुल मात्रा ३०० μl) के मिश्रण से भरें । सिरिंज को बर्फ पर रखें ।
  2. शल्य प्रक्रिया
    1. शीत नसबंदी (20 मिनट के लिए 2% steranios) का उपयोग कर शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित ।
    2. एनेस्थेटाइज़ करने से चूहे आइसोफ्लूराने संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं और प्रवण स्थिति में चूहे की जगह ।
    3. गर्दन एक रेज़ ब्लेड का उपयोग कर क्षेत्र दाढ़ी और पोविटोन आयोडीन के साथ क्षेत्र जीवाणुरहित । आयोडीन को 3 मिनट के लिए खड़े होने दें ।
    4. एक स्केलपेल का उपयोग कर एक चीरा बनाओ और १.५ इंसुलिन छर्रों का उपयोग करके निकालें । एक या दो एकल सिलाई अंक का उपयोग कर त्वचा को बंद करें । निश्चेतना से चूहे न निकालें ।
      नोट: 1 महीने के बाद, गोली चूर्णशील हो सकता है के रूप में कुछ फाइब्रोटिक ऊतक छर्रों के रूप में लपेट कर सकते हैं; कैंची का प्रयोग ठीक से इसे काटना ।
    5. चूहे को सुपिने की स्थिति में रखें । दाढ़ी और जीवाणुरहित (पोविड्रोन आयोडीन के साथ) पेरिटोनियल क्षेत्र । आयोडीन को 3 मिनट के लिए खड़े होने दें ।
    6. सिर्फ एक स्केलपेल का उपयोग कर उरोस्थि के तहत एक १.५ सेमी लेप्रोटॉमी बनाएँ । चीखकर क्षेत्र के चारों ओर गीला बाँझ धुंध रखें ।
    7. ओमेन्टम की पहचान करें जो पेट के बगल में स्थानीयकृत वसा पैड है । ध्यान से omentum पकड़ने के लिए, यह पेरिटोनियल गुहा से बाहर धीरे खींच, और धुंध पर फैल करने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
      नोट: omental ऊतक तिल्ली से ग्रहणी के लिए फैली हुई है और पेट के लिए अपने मध्य बिंदु पर देता है । इंसुलिन थेरेपी प्राप्त करने वाले मधुमेह चूहों का सामान्य ओमेंटम लगभग 2 सेमी ² होता है जब धुंध पर फैलता है ।
    8. omental ऊतक अच्छी तरह से हाइड्रेट पूर्व warmed के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर ३७ ° c बाँझ खारा । ऊतक में हेरफेर और omental परतों के बीच सुई के साथ omental बढ़त घुसना करने के लिए छोटे घुमावदार संदंश का प्रयोग करें । सुई पूरी तरह से डालें ।
    9. टाप की तैयारी का इंजेक्शन धीरे से शुरू करें और ध्यान से सुई को पीछे की ओर कई स्थानों (लाइनों के रूप में) में टाप सुई करने के लिए कदम. सुई को वापस लेने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल ने बिखरे हुए islets के नुकसान से बचने के लिए सुई से बाहर निकलना बंद कर दिया है ।
    10. इस हेरफेर दोहराएं के लिए विभिंन प्रवेश अंक का उपयोग कर सिरिंज की पूरी सामग्री सुई के लिए omental ऊतक भर में islets वितरित की जरूरत है ।
      नोट: चूहों में आम तौर पर चार से पांच इंजेक्शन की जरूरत होती है ।
    11. जांचें कि islets संकुल के अंत में सिरिंज में नहीं है इंजेक्शन ।
      नोट: यदि कुछ आइलेट्स अभी भी दिखाई दे रहे हैं, तो सिरिंज से सुई को वापस लेना संभव है, सिरिंज को खाली हाइड्रोजेल के १०० μl के साथ सीधे भरें, और सुई को फिर से कनेक्ट करें । इंजेक्शन का दूसरा दौर शेष islets बाहर निकलवाने के लिए किया जा सकता है ।
    12. omental ऊतक और laparotomy की दीवार हाइड्रेट करने के लिए फिर से बाँझ खारा का उपयोग करें. उदर गुहा में ओमेंटम को सावधानीपूर्वक प्रतिस्थापित करने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
    13. चूहे को पुन: हाइड्रेट करने के लिए उदर गुहा में पूर्व-गर्म बाँझ खारा के 2 मिलीलीटर सुई ।
    14. एक सतत धागा सीवन का उपयोग कर मांसपेशियों की दीवार को बंद करें । फिर एकल सिलाई बिंदु (बिंदु-दर-बिंदु) के साथ त्वचीय परत सिलाई ।
    15. एक दिन में एक बार 5 दिनों के लिए एक एनाल्जेसिक के रूप में meloxicam (१.५ मिलीग्राम/किलोग्राम) सुई लगाना ।
    16. निश्चेतना से वसूली जब तक एक हीटिंग पैड पर एक पिंजरे में चूहे प्लेस । सभी प्राप्तकर्ता चूहों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं ।
    17. प्रतिदिन रोपाई के बाद रक्त ग्लूकोज को मापें । यदि ग्लाइसीमिया > 2 जी/एल है, तो दिन में एक बार लंबे समय से अभिनय इंसुलिन के 6 यू इंसेक्ट करें ।
    18. 1 या 2 महीने से अधिक ग्लाइसीमिया और सी-पेप्टिडेमिया निगरानी द्वारा भ्रष्टाचार समारोह का आकलन करें ।
      नोट: सफल ट्रांसप्लांटेशन के मामलों में, ग्लाइसीमिया प्रत्यारोपण के बाद 2-5 दिनों के भीतर स्थिर होना चाहिए, और चूहों को इंसुलिन से लिया जा सकता है ।

3. omental भ्रष्टाचार explantation

नोट: इस प्रक्रिया के अच्छे भ्रष्टाचार समारोह की पुष्टि की अनुमति होगी । एक कार्यात्मक भ्रष्टाचार की बहाली के बाद, चूहों एक मधुमेह राज्य के लिए वापस जाना चाहिए । यह चरण 1 या 2 महीने के चयापचय अनुवर्ती के बाद किया जाता है ।

  1. गैस संज्ञाहरण के साथ चूहे को एनेस्थेटिज़ करें और इसे स्पिन की स्थिति में रखें ।
  2. पेरिटोनियल क्षेत्र दाढ़ी और यह 3 मिनट के लिए पोविड्रोन आयोडीन का उपयोग कर जीवाणुरहित ।
  3. सिर्फ एक स्केलपेल का उपयोग कर उरोस्थि के तहत १.५ सेमी लेप्रोटॉमी बनाएँ । चीखकर क्षेत्र के चारों ओर गीला बाँझ धुंध प्लेस.
  4. ओमेन्टम को पहचानें, जो पेट के बगल में है । सावधानी से इसे धुंध पर फैलाने के लिए उपयोग करें ।
  5. omentum excise करने के लिए कैंची का उपयोग करें । उस भाग से प्रारंभ करें जो अग्न्याशय की पूंछ पर (प्लीहा के बगल में) का पालन करता है । यदि रक्तस्राव होता है, तो इसे रोकने के लिए सूखी बाँझ धुंध का उपयोग करें ।
  6. पेट से जुड़े हिस्से के साथ छांटना जारी रखें और ओमेन्टम को पुनः प्राप्त करें ।
    नोट: इस स्थान पर, gastroepiploic धमनियों (चित्रा 1) अगर वे गलती से काट रहे हैं रक्तस्राव की एक बड़ी राशि का कारण बन सकता है । धमनी चीरों को भ्रष्टाचार को पुनः प्राप्त करने के लिए अपरिहार्य हैं, लेकिन रक्तस्राव को संदंश और धुंध का उपयोग करके प्रबंधित किया जा सकता है । यदि एक आकस्मिक कटौती होता है, सूखी धुंध के साथ दृढ़ता से सेक और कम से कम 1 मिनट के लिए संपीड़न बनाए रखें । रक्तस्राव बंद होना चाहिए । यदि नहीं, तो क्लिप्स का उपयोग करें या एक इलेक्ट्रिक bistoury का उपयोग करने के लिए जहाजों दाग़ना ।

Figure 1
चित्रा 1: omental धमनी वितरण । ओमेंटम भ्रष्टाचार की पड़ताल के लिए, gastroepiploic धमनियों से बना महत्वपूर्ण क्षेत्र नीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है । omental ऊतक के इस भाग की लकीर के दौरान, ध्यान सही gastroepiploic धमनी अनुभाग के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । संपीड़न, संयुक्ताक्षर, या दाग़ना रक्तस्राव को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

  1. किसी भी खून बह रहा है की जाँच करें. यदि नहीं, तो पूर्व-गर्म नमकीन के 2 मिलीलीटर सुई, चूहा बंद करें, और प्रक्रिया के रूप में पहले वर्णित है ।
     explanted पशु एक मधुमेह राज्य के लिए वापस । इंसुलिन इंजेक्शन (6 U/SC/दिन) तो पशुओं की अच्छी तरह से किया जा रहा आश्वस्त करने के लिए अनिवार्य है ।
  2. pentobarbital की अधिक मात्रा का उपयोग कर 10 से 12 दिनों के लिए चूहा euthanize (१८२.२ मिलीग्राम/

4. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण: हेमेटॉक्सिलिन और इओसिन धुंधला

  1. 4% paraformaldehyde (pfa) का उपयोग कर पुनर्प्राप्त omenta ठीक करें और पैराफिन में एंबेड ।
  2. कटौती वर्गों 4 μm मोटाई में और प्रत्यारोपण के रूपात्मक मूल्यांकन के लिए hematoxylin और eosin दाग लागू होते हैं ।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकी महत्व का निर्धारण सॉफ्टवेयर और दोहराया उपायों के विचरण का विश्लेषण (anova) एक पोस्ट हॉक परीक्षण के रूप में tukey ईमानदार महत्व अंतर परीक्षण के साथ. p मान के रूप में प्रतिनिधित्व करते हैं: *p < ०.०५; * * p < ०.०१; पी < ०.००१.

Representative Results

होमिंग विधि इंट्रावैस्कुलर प्रत्यारोपण के परिहार और एक अंग में islets के कारावास की अनुमति देता है । 8-10 मिनट का एक अधिकतम समय पूरे टाप प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, संज्ञाहरण सहित, जो एक समयरेखा शास्त्रीय जिगर प्रत्यारोपण के लिए तुलनीय.

का अध्ययन करने के लिए जिस तरह से आइलेट्स omental ऊतक के अंदर वितरित कर रहे हैं, डेक्सट्रान मोती homing विधि (चित्रा 2) का उपयोग कर प्रत्यारोपित किया गया । एक दिन प्रत्यारोपण के बाद, चूहों बलि दिया गया, और omental ऊतकों हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्राप्त किए गए. hematoxylin और eosin धुंधला ऊतक भर मोती का एक समान वितरण से पता चला (चित्रा 2, नीचे सही). अक्सर, मोती रक्त वाहिकाओं के करीब थे और वसा ऊतक में अच्छी तरह से प्रत्यारोपित किया गया । प्रत्यारोपण के तुरंत बाद, मोतियों के आसपास एक भड़काऊ प्रतिक्रिया होती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक पुनर्विन्यास में आइसोलेट को ऊतक में नेस्ट किया जाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: होमिंग तकनीक और मनका वितरण omental ऊतक के माध्यम से एक दिन प्रत्यारोपण के बाद का विवरण । () होमिंग तकनीक का चित्रण । अंग जोखिम के बाद (एक, बाएँ), टाप-hydrogel मिश्रण (बेहतर दृश्य के लिए नीले रंग का डेक्सट्रान मोती द्वारा यहाँ की जगह) ध्यान से एक atraumatic सुई का उपयोग कर ऊतक में इंजेक्शन था (एक, मध्य). ऊतक में प्रत्यारोपित मोती दिखाई दे रहे हैं (एक, सही). () बीड इंजेक्शन के बाद हेमेटोक्सिलिन और ओसिन का दाग 1 दिन तक । मोती एक समान वितरण के साथ ऊतक में पाए जाते हैं । स्केल बार = १०० मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस तकनीक को मान्य करने के लिए, हम लुईस चूहों का उपयोग कर समजीनी अध्ययन किया (n = 8). मधुमेह टाप प्रत्यारोपण प्राप्त चूहों (७६६० टाप समकक्ष, ieq) प्रति किलो चूहा शरीर के वजन homing का उपयोग कर दो महीने के लिए glycemia और सी पेप्टिडेमिया के लिए निगरानी की गई । Glycemia इंसुलिन गोली के प्रत्यारोपण द्वारा नियंत्रित किया गया था (के रूप में ग्लाइसीमिया में पहली बूंद के लिए attesting चित्रा 3aमें मनाया) । graft समारोह लगभग 2 g/L और C-पेप्टिडेमिया > 500 pM के glycemia द्वारा परिलक्षित किया गया था । प्रत्यारोपण से पहले, चूहों मधुमेह (glycaemia > 5 जी/एल और सी-पेप्टिडेमिया < 200 बजे) थे । प्रत्यारोपण और इंसुलिन गोली लाने के बाद, glycemia रखरखाव और सामान्यीकरण सिर्फ 3 दिनों के बाद homing प्रत्यारोपण मनाया गया था और जब तक भ्रष्टाचार पुनर्प्राप्ति (पी < ०.०५ पूर्व प्रत्यारोपण के स्तर की तुलना में) बनाए रखा गया था । omental पड़ताल के बाद, glycemia पूर्व प्रत्यारोपण स्तर पर फिर से गुलाब, islets की कार्यक्षमता के लिए attesting कि homing द्वारा प्रत्यारोपित किया गया (चित्रा 3a) । सी-पेप्टिडेमिया पैटर्न बिल्कुल विपरीत था, graft से पहले undetectable स्तरों के लिए कम के साथ, एक वृद्धि और रखरखाव के अध्ययन के पाठ्यक्रम में इस वृद्धि हुई स्तर पर पीछा किया (p < 0.05), और, omental अन्वेषण के बाद, एक पूर्व प्रत्यारोपण के स्तर को कम (चित्रा 3b) । हिस्टोलॉजी द्वारा लगाए गए ओमेन्टम के विश्लेषण से पता चला कि रक्त वाहिकाओं (चित्रा 3 सी) के लिए उनकी निकटता का परिणाम के रूप में सबसे अधिक संभावना है ।

Figure 3
चित्रा 3: दो महीने के चयापचय अनुवर्ती होमिंग और भ्रष्टाचार मूल्यांकन प्राप्त चूहों की । () ग्लाइसीमिया मापन और () सी-पेप्टाइड आकलन के बाद एक टाप वाहक के रूप में alginate का उपयोग कर homing (Tx: प्रत्यारोपण और इंसुलिन गोली है़; एक्सप्लेशन: ओमेन्टम का अन्वेषण). grafts कार्यात्मक हैं, के रूप में normoglycemia के रखरखाव के द्वारा दिखाया गया है इंसुलिन गोली है़ और सी-पेप्टिडेमिया में वृद्धि के बाद टाप प्रत्यारोपण. धूसर छाया क्षेत्र प्रत्येक समय बिंदु पर ंयूनतम और अधिकतम रिकॉर्ड किए गए मान दर्शाते हैं । () होमिंग विधि का उपयोग करते हुए टाप ट्रांसप्लांटेशन के बाद एक ओमेंटल सेक्शन का हेमाटॉक्सिलिन और ईओसिन दाग । islets ऊतक में अच्छी तरह से एकीकृत कर रहे है किसी भी आसपास के फाइब्रोटिक ऊतक के बिना प्रत्यारोपण के बाद दो महीने । जहाजों के आसपास और islets के अंदर हो गए हैं, के रूप में तीर द्वारा दिखाया गया है, और इस तरह पूरी तरह से टाप समारोह बहाल । islets के morphology भी अच्छी तरह से संरक्षित लगता है. स्केल पट्टियां = ५० μm. (n = 8) (*p < ०.०५; * * p < ०.०१; * * * p < ०.००१ के रूप में एक पोस्ट हॉक परीक्षण के रूप में tukey ईमानदार महत्व अंतर परीक्षण के साथ विचरण के दोहराया उपाय विश्लेषण (anova) का उपयोग कर निर्धारित) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों को हाइलाइट किया जा सकता है । सबसे पहले, सर्जरी और ऊतकों को हेर-फेर करने वाले व्यक्ति को वसा ऊतक के साथ नाजुक होना चाहिए, क्योंकि यह नाजुक है । ओमेन्टम को कुचलने या हानिकारक होने से बचा जाना चाहिए । ओमेन्टम, एक रक्षात्मक ऊतक के रूप में, मैक्रोफेज और अन्य ल्यूकोसाइट्स में समृद्ध है । इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं अत्यधिक हेरफेर द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और नकारात्मक भ्रष्टाचार को प्रभावित कर सकता है । दूसरे, भ्रष्टाचार (टाप-हाइड्रोगेल मिश्रण) लोडिंग भी महत्वपूर्ण है । प्रक्रिया प्रदर्शन व्यक्ति मृत मात्रा से बचना चाहिए और इंजेक्शन डिवाइस में hydrogel-टाप मिश्रण के सभी लोड करना होगा. इस कदम के तुरंत बाद, एक और महत्वपूर्ण बिंदु इंजेक्शन ही है । इंजेक्शन धीरे से किया जाना चाहिए, देखभाल के साथ, और नाजुक. सिरिंज खाली हाइड्रोजेल द्वारा किसी भी शेष islets पुनः प्राप्त करने के लिए शुरू में लोड निकाल दिया होना चाहिए । तीसरा, suturing ध्यान से और दो चरणों में किया जाना चाहिए । पेशी की योजना पहले सिलाई किया जाना चाहिए, देखभाल मांसपेशी के साथ ओमेंटूम सीवन नहीं करने के लिए, और त्वचा अलग से सिलाई किया जाना चाहिए । omental भ्रष्टाचार के लिए अन्वेषण प्रक्रिया के बारे में, विशेष ध्यान इस समय लिया जाना चाहिए जब धमनियों के बंद पेट (gastroepiploic धमनियों) चीरा कर रहे हैं । किसी भी रक्तस्राव के लिए ध्यान देना महत्वपूर्ण है जो जानवर को बंद करने से पहले उन्हें रोकता है, क्योंकि किसी भी लगातार रक्तस्राव से कई दिनों के भीतर पशु मौत हो जाती है ।

islets ले जाने के लिए माध्यम के बारे में समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है; हाइड्रोजेल का विकल्प प्रयोगकर्ता के पास है, जब तक हाइड्रोजेल का इंजेक्शन है । विभिंन सामग्रियों का उपयोग चर भ्रष्टाचार समारोह में परिणाम कर सकते है (के साथ या बिना पूरकता, उदाहरण के लिए) । विधि यहां वर्णित निष्क्रिय सह के लिए अपनी दक्षता साबित कर दिया है ७६६० ieq की एक टाप अनुपात के साथ सामग्री प्रत्यारोपण/

वर्तमान विधि omental आकार और हाइड्रोजेल गुण द्वारा सीमित किया जा सकता है । एक मधुमेह कृंतक मॉडल का उपयोग करने के लिए, इंसुलिन थेरेपी पहले टाप प्रत्यारोपण करने के लिए पर्याप्त ग्राफ्टिंग क्षेत्र प्रदान करने के लिए अनिवार्य है । मधुमेह कृंतकों stz प्रेरित मधुमेह के कारण वजन और वसा द्रव्यमान का एक बहुत कुछ खोना । इस अध्ययन में नामांकित पशुओं के छोटे वजन को ध्यान में रखते हुए, एक भी छोटे क्षेत्र में कलम लगाना संभव नहीं है ।

उचित glycemia प्रबंधन के संरक्षण (छर्रों का उपयोग कर प्रत्यारोपण और उसके बाद लंबे समय से अभिनय इंसुलिन का उपयोग करने से पहले) अनिवार्य है । यहां, हम कई कारणों के लिए प्रत्यारोपण के दिन तक इंसुलिन गोली संरक्षण के लिए चुना है । सबसे पहले, एक उचित ग्लाइसेमिक नियंत्रण के रखरखाव काफी ऑक्सीडेटिव प्राप्तकर्ता अंगों में मधुमेह द्वारा प्रेरित तनाव कम कर देता है, जो टाप भ्रष्टाचार11 के लिए हानिकारक हो सकता है और गहन इंसुलिन थेरेपी और प्राप्तकर्ता की निरंतरता की अनुमति देता है तैयारी क्लिनिक में मनाया12. दूसरा, हम चूहों के लिए संज्ञाहरण प्रक्रियाओं की अधिकतम संख्या को सीमित करना चाहता था. लंबे समय से अभिनय इंसुलिन का उपयोग करते हुए चयापचय अनुवर्ती के दौरान इंसुलिन थेरेपी के कार्यान्वयन के बारे में, इस योजना का इस्तेमाल ग्लूकोसिटी के कारण बड़े पैमाने पर जटिलताओं से बचा जाता है (जो grafts को नष्ट कर सकता है) और एक "वास्तविक" ग्लाइसीमिया मूल्य का संरक्षण करने के लिए ।

भ्रष्टाचार दक्षता की निगरानी करने के लिए, glycemia पहले कुछ दिनों में एक प्रासंगिक पैरामीटर नहीं है अगर चूहों इंसुलिन चिकित्सा छर्रों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. यही कारण है कि सी-पेप्टाइड स्तर की जाँच से पूर्व कई बार प्रत्यारोपण करना अनिवार्य है. इन बार अध्ययन की शुरुआत में शामिल हैं, stz इंजेक्शन के बाद पशुओं का चयन करने के लिए, और फिर सिर्फ प्रत्यारोपण पूर्ववर्ती, यह सुनिश्चित करने के लिए कि चूहों मधुमेह रहने और कि उत्थान कम है.

हाइड्रोगेल गुण भी महत्वपूर्ण हैं । तरल हाइड्रोजेल omental ऊतक के बाहर रिसाव होगा और उच्च चिपचिपा हाइड्रोजेल इंजेक्शन नहीं होगा । hydrogel चिपचिपापन और इंजेक्शन का उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जा करने के लिए है, लेकिन यह भी सीधे टाप या किसी अन्य कोशिकाओं विट्रो में अस्तित्व के मूल्यांकन द्वारा सामग्री का परीक्षण करने के लिए आवश्यक प्रतीत होता है. यहाँ, के रूप में islets हाइपोक्सिया के लिए बहुत संवेदनशील हैं और एक उच्च चिपचिपा वाहक का उपयोग ऑक्सीजन प्रसार को प्रभावित कर सकते हैं.

मौजूदा तरीकों के संबंध में यहाँ वर्णित विधि के महत्व के संदर्भ में, इस अंतर-ऊतक प्रत्यारोपण तकनीक पुनरुत्पादन की अवधि में लाभ है. यह ऊतक के लिए भी अप्रोच है और इसके अतिरिक्त संवहनी स्थान के कारण, रक्तस्राव और थ्रोम्बोसिस जोखिम से बचाता है । इसके अलावा, जब टाप ट्रांसप्लांटेशन पर विचार, तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया से बचा जाता है14. इसके अलावा, homing islets प्रत्यारोपण एक गैर महत्वपूर्ण अंग में, जिगर, जो यकृत समारोह के मामले में जोखिम बन जाता है में प्रत्यारोपण के विपरीत की अनुमति देता है15.

इष्टतम प्रदर्शन का उत्पादन करने के लिए, एक हाइड्रोजेल के लिए यह ले जाएगा कोशिकाओं को अनुकूलित किया जाना है । वृद्धि कारकों या विशिष्ट प्रोटीन का उपयोग प्रतिरोपित कोशिकाओं पर सकारात्मक प्रभाव हो सकता है16,17.

समाप्त करने के लिए, इस तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है vivo में एक हाइड्रोजेल के सत्यापन के विभिंन प्रकार के सेल, खासकर जब एक सक्रिय चयापचय वातावरण की जरूरत है, islets के लिए के रूप में । इसके अलावा, इस शल्य चिकित्सा तकनीक कई अनुप्रयोगों के लिए लागू है और हो सकता है, भविष्य में, तेजी से मनुष्यों के लिए अंतरणीय, के रूप में यह आसानी से लेप्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम région alsace द्वारा वित्त पोषित किया गया था, bioartmatrix-pôle alsace बायोवैली-cqdm; 53/14/C1. लेखक पीआर की टीम के लिए आभारी हैं । इस अभिनव तकनीक के विकास में मदद करने के लिए hôpitaux विश्सिटेयर्स डे स्ट्रासबर्ग से bruant-rodier ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginate (PRONOVA UP LMV) Novamatrix 4200206 Hydrogel carrier
Atraumatic needle (Blunt) B.Braun 9180109
CMRL without FBS Gibco 11500576
C-peptide ELISA kit Mercodia 10-1172-01
Eosin Leica Microsystems 3801592E
Ethilon 4/0 Ethicon F2414 Surgical suture
Hematoxylin Leica Microsystems 3801562E
Insulin pellets Linshin INS-B14
Isofluorane Centravet ISO007
Lantus (Insulin-Glargin) Sanofi Adventis Lantus SoloStar Long acting insulin
Metacam Boehringer Ingelheim MET019 Anti-inflammatory drug
NaCl (for saline 0.9%) Sigma 10112640
Needle 26 G TERUMO 050101B
Oxygen Linde 2010152 For isoflurane use
Sodium pentobarbital Vetoquinol Dolethal For euthanasia
Steranios 2% Anios 11764046
Streptozotocin Santa-Cruz SC-200719A
Syringe – Injekt-F B.Braun 9166017V
Trocar & stylet (linshin) Linshin G12-SS For pellet insertion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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