Author Produced

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הממצא הידוע P53 חלבון מוכר יכול לשמש כגורם שעתוק (TF) ב -S. cerevisiae ס שמרים הורשו לפיתוח בחני פונקציונלי שונים ללמוד את ההשפעות של 1) מחייב האתר [i.e., אלמנט התגובה (RE)] משתני רצף על P53 הפעלה ספציפיות או 2) TP53 מוטציות, שיתוף מבוטא קופטים, או מולקולות קטנות על פעילות הפעלה P53. יישומי מחקר בסיסיים וטרנסלבותית שונים פותחו. הגישות הללו מנצלות שני יתרונות עיקריים של מודל השמרים. מצד אחד, הקלות של עריכת הגנום מאפשרת בנייה מהירה של מערכות עיתונאי איכותיות או כמותיים על ידי ניצול זנים איזוגניים הנבדלים רק ברמה של P53 מסוימים-RE כדי לחקור את הרצף-ספציפיות של P53 תלוי הפעלה מעבר. מצד שני, הזמינות של מערכות מוסדרים עבור ביטוי חוץ רחמי P53 מאפשר הערכה של הפעלה במגוון רחב של ביטוי חלבון. סקר בדוח זה משמשים באופן נרחב מערכות המבוססות על גנים עיתונאי צבע, לluciferase, ואת הצמיחה של שמרים כדי להמחיש את הצעדים מתודולוגיים העיקריים שלהם כדי להעריך באופן אנוש את כוח החיזוי שלהם. יתר על כן, רב-תכליתיות קיצונית של גישות אלה ניתן לנצל בקלות כדי ללמוד TFs שונים כולל P63 ו P73, שהם חברים אחרים של TP53 משפחת גנים.

Introduction

תמלול הוא תהליך מורכב מאוד הכרוך בפעילות דינמית, מרחבית וטמפורלית של גורמי שעתוק (TFs) וקופנים לגיוס ואפנון של RNA פולימות על אזורי כרומטין בתגובה לגירויים ספציפיים1 . רוב TFs, כולל מדכא הגידול האנושי P53, לזהות רכיבים ספציפיים משחק ציס בצורה של רצפי DNA הנקרא רכיבי תגובה (REs), אשר מורכב של יחיד (או מספר) מוטיבים ייחודיים ~ 6-10 נוקלאוטידים ארוך. בתוך מוטיבים אלה, עמדות בודדות עשויות להראות דרגות שונות של השונות2, מסוכמים בדרך כלל על ידי מטריצות משקל מיקום (pwm) או לוגו3,4.

שמרים S. cerevisiae ס היא מערכת המודל המתאים ללמוד היבטים שונים של חלבונים אנושיים דרך compleמנטציה, ביטוי חוץ רחמי, ומוסר פונקציונלי, גם כאשר גן שמרים אורתוולוגי אינו נוכח5, מיכל בן 6 , 7. בשל השימור האבולוציוני של רכיבי בסיס של מערכת הטרנססקריפט8, מספר רב של מערכות האדם (כאשר הביעו הבעה בתאי שמרים) יכולים לווסת את הביטוי של גן עיתונאי על ידי משחק באמצעות יזמים שעברו הנדסה ל הכיל REs מתאים. מערכת מודל התמלול המוצגת כאן עבור P53 אנושי מתאפיינת בשלושה משתנים מרכזיים שהאפקטים יכולים להיות מאופנן: 1) מודאליות של הביטוי והסוג של P53, 2) רצף RE השליטה P53 תלויי שעתוק, ו 3) סוג של גן עיתונאי (איור 1A).

בנוגע למודאליות של הביטוי P53, ס' cerevisiae ס מאפשר בחירה של inducible, מחדש, או קונסטיטוטיביות9,10,11. בפרט, inducible GAL1 יזם מאפשר בסיס (באמצעות רפפינז כמקור פחמן) או משתנה (על ידי שינוי כמות של גלקטוז במדיה) ביטוי של TF ב שמרים. למעשה, הביטוי tunable דק מייצג פיתוח קריטי ללמידה לא רק P53 עצמה אלא גם P53 משפחה אחרים חלבונים12,13.

בנוגע לסוג ה-REs השולט בביטוי התלוי בP53, ס' cerevisiae ס מאפשר בנייה של זנים כתבת שונים בעל הבדלים ייחודיים ב RE של עניין ברקע איזוגניים אחרת. מטרה זו היא להגיע באמצעות הסתגלות של גישה מגוונת במיוחד הגנום לעריכה שפותחה ב -S. cerevisiae ס, הנקרא delitto perfetto12,14,15,16.

יתר על כן, גנים עיתונאי שונים (כלומר, URA3, HIS3, ו- ADE2) ניתן להשתמש באיכות הפעולה והערכה כמותית של הפעילות של tfs האדם ב -S. cerevisiae ס, כל אחד עם תכונות ספציפיות שיכול ל להתאים לצרכים הניסיוניים17,18,19,20,21. הביטוי של הגנים האלה העיתונאי מדבר על ה, היסטידין, ובהתאמה. הכתב הURA3 אינו מאפשר את צמיחת התאים בנוכחות של 5 וכדומה, ולכן ניתן לבחור בו בצורה נגדית. מערכת ADE2 עיתונאי יש את היתרון כי, מלבד הבחירה התזונתית, זה מאפשר זיהוי של תאים שמרים לבטא פראי סוג (כלומר, פונקציונלי על ADE2 ביטוי) או מוטציה (כלומר,לא פונקציונלי על ADE2 ) P53 מצבע המושבה.

לדוגמה, תאים שמרים המבטאים את הגן ADE2 ליצור בגודל בדרך כלל מושבות לבנות על הצלחות המכילות כמויות מגבילות של אדנין (2.5-5.0 mg/L), בעוד אלה כי לא מתאים או לא לתעתזה מופיע על צלחת זהה אדום קטן (או ורוד) מושבות. הדבר נובע מהצטברות של ביניים במסלול הביוסינתטי של אדנין (כלומר, P-ריבוסידלסטינו-סראזול, שנקרא בעבר באופן כולל ובאוויר), המומר ליצירת פיגמנט אדום. הצבע האיכותני המבוססת על ADE2 הוא גן הכתבים מאז הוחלף על ידי הגחלילית הכמותית (LUC1)12,22. לאחרונה, העיתונאי ADE2 כבר בשילוב עם העיתונאי lacz ב קל לציון, חצי כמותי, שיטת עיתונאי כפול כי ניתן לנצל לסווג משנה P53 מוטציות לפי רמת השיורית של פונקציונליות . עשריםואחד

כתבים פלורסנט כגון egfp (חלבון פלורסנט ירוק משופר) או dsred (Discosoma sp. אדום חלבון הניאון) יש גם שימש הערכה כמותית של פעילות ההפעלה הקשורים לכל מוטציות ההיגיון האפשרי ב TP53 ברצף24. לבסוף, הסיכוי של שילוב היזמים tunable עבור ביטוי P53 אלל עם זנים שמרים איזוגניים שונים עבור RE ו/או הגן עיתונאי הובילו לפיתוח של מטריצת נתונים היוצרת סיווג מעודן של סרטן הקשורים ו germline . מוטציה P53 אלטלס25,26,27

הגישות המתוארות לעיל משמשות למדידת הפעילות הטרנסקריפטוניים של החלבון הP53. עם זאת, הביטוי של פראי מסוג P53 ב שמרים S. cerevisiae ס28 ו שיזוסכמיומיב פומל29 יכול לגרום לפיגור הצמיחה, אשר נקשר עם מעצר מחזור התא28,30 או . מוות תאים31 בשני המקרים, עיכוב הצמיחה שמרים מופעלת על ידי ביטוי P53 גבוהה, כבר מתואם עם אפנון פוטנציאל ההמרה של גנים שמרים אנדוגניים מעורב צמיחת תאים. תמיכה השערה זו, אובדן הפונקציה מוטציה P53 R273H לא להפריע צמיחת תאים שמרים כאשר מתבטאת ברמות דומות כמו פראי P5332. לעומת זאת, הביטוי בשמרים של המוטציות הרעילים P53 V122A (הידוע בפעילות הטרנססקריפט גבוהה יותר לעומת פראי-סוג P53) גרם לאפקט מעכבות גדילה חזק יותר מאשר פראי סוג P5332.

בנוסף, זה הוכיח כי האדם MDM2 היה מסוגל לעכב את הפעילות האנושית P53 הטרנס בשמרים, קידום אוביקווינציה שלה והשפלה הבאים33. בהתאם, היכולת של MDM2 אנושי ו mdmx לעכב את P53 המושרה עיכוב הצמיחה שמרים הפגינו32,34. במחקר נוסף, מתאם בין פעילות P53 טרנססקריפט ורמות ביטוי אקטין הוקמה, עם זיהוי של P53 RE במעלה הזרם על הגן ACT1 ב שמרים32. בעקביות, ביטוי אקטין היה משופר על ידי פראי P53 ואפילו יותר כך על ידי P53 V122A, אבל לא על ידי מוטציה P53 R273H. לעומת זאת, ביטוי אקטין ידי P53 ירד בנוכחות שיתוף של P53 מעכבי MDM2, mdmx, או pifithrin-α (מדכא קטן מולקולה של הפעילות P53 הטראנס), עקבי עם התוצאות המבוססות על שמרים-גידול שמרי. חשוב מכך, תוצאות אלה הקימו מתאם בין P53 המושרה עיכוב הצמיחה ומידת הפעילות שלה שמרים, אשר נוצל גם כדי לזהות וללמוד מולקולות קטנות מודלדירוג P53 פונקציות28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה של ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים המכיל מחדש מסוים (YAFM-re או ylfm-re)

  1. פס yAFM icore או ylfm-icore להתאמץ12,14 (icore = אני, isce-i endonuclease תחת GAL1 יזם; CO = מונה לבחירה URA3; RE = כתבת KanMX4 הענקת התנגדות לקנאמיצין; שולחן 1) מ 15% מניות גליצרול שאוחסנו ב-80 ° c על צלחת בע (שולחן 2). תן לו לצמוח 2-3 ימים ב 30 ° c.
  2. קח מושבה אחת שמרים מן הלוח הטרי (לא יותר מ 3 שבועות בן) ומניחים אותו בבקבוקון קטן המכיל 5 מ ל YPDA (שולחן 2). דגירה ב 30 ° צ' לילה, רועד ב 150-200 סל ד.
  3. למחרת, כדי להסיר את כל העקבות של דקסטרוז, מצנלת את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את הסופרנטנט על ידי היפוך של הצינור.
    הערה: בצע את כל הcentrifugations בפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT).
  4. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 30-50 מ ל של טרום מחומם (מדיה מלאה) המכיל את גלקטוז (שולחן 2) ו הדגירה עבור 4 h ב 30 ° c, לרעוד ב 150-200 סל"ד (הכרחי עבור אינדוקציה של I-scei).
  5. צנטריפוגה את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את supernatant על ידי היפוך של הצינור.
  6. להשעות מחדש את הגלולה בתא ב 30-50 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.
  8. להשעות מחדש את הגלולה תא 5 מ ל של LiAcTE סטרילי (שולחן 3), פתרון יונית מעדיף ספיגת ה-DNA. חזור על שלב 1.5.
  9. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 250 μL של LiAcTE סטרילי ולהעביר את התאים לצינור 1.5 mL. חזור על שלב 1.5 והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב 300-500 μL של LiAcTE סטרילי.
  10. במהלך השטף, הטמפרטורה 10 מ"ג/mL של הספק ה-DNA של זרע של דג סלמון עבור 10 דקות ב 100 ° צ' ולהירגע מיד על הקרח כדי לשמור עליו כמו דנ א אחד נטוש.
  11. ב שפופרת נפרד 1.5 mL, להוסיף 500 picomoles הרצוי של מחלת השמש הרצויה (שולחן 3), 5 μl של ה-DNA של הנושאת זרע של סלמון מבושלים, 300 μl של השעיית liacte מבושל (שולחן 3), ו50 μl של הבולם התא של שמרים (משלב 1.9).
  12. מערבולת את הצינורות עבור 10 s כדי לערבב ו דגירה עבור 30 דקות ב 30 ° צ', רועד ב 150-200 סל ד. מניחים את צינורות 1.5 mL בצד לטובת לרעוד.
  13. החום הלם התאים שמרים עבור 15 דקות ב 42 ° c בבלוק חימום, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים עבור 20 s ב 10,000 x g. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1 מ ל של מים סטריליים.
  14. התפשטות 100 μL של השעיית התא על הצלחת באגר YPDA ומודטה (הפוך) ליום אחד ב 30 ° c. כדי להבטיח היטב הופרדו מושבות מתקבלים, גם להפיץ 100 μL של 1:10 דילול.
  15. למחרת, צלחת עותק משוכפל באמצעות לוטרינרים סטרילי על צלחת אגר ס מ המכיל דקסטרוז ו 5-זה (שולחן 2). לשקול צלחת העתק השני על צלחת חדשה אם הרבה תאים מועברים (כלומר, כמה הצמיחה של URA3 תאים).
  16. שלושה ימים לאחר מכן, לוחית העתק על שאינם סלקטיבית YPDA ו-YPDA המכיל G418 (אנטיביוטיקה הגליקסייד דומה לקאנאמיצין) אגר צלחות (שולחן 2), סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאים שלהם. מודאת הצלחות לילה. ב -30 מעלות צלזיוס
  17. למחרת, לזהות את זני העיתונאי המועמדים ממושבות כי הם G418 רגישים אבל לגדול על צלחות YPDA (למשל, yLFM-או yAFM-RE מושבות). פס המושבות מזוהה (3-6 מושבות) על צלחת YPDA חדש כדי לקבל מושבה אחת לבודד ולתת להם לגדול עבור יומיים ב 30 ° c.
  18. תיקון מושבות שמרים יחיד על צלחת YPDA כדי לבודד את המושבות עבור ניתוחים נוספים. לאחר 24 שעות ב 30 ° c, מבחן אותם על ידי ציפוי משוכפל על צלחת באגר YPGA (שולחן 2) למנוע את הצמיחה של מוטציות קטנות (כלומר, המוטנטים לקויה הנשימה). באותו זמן, לוחית העתק על צלחת חדשה של YPDA אגר.
  19. בדוק את התיקונים הנכונים (כלומר, צמיחה על YPDA ו-YPDA אגר צלחות; 1-3 מושבות) משלב 1.18 לנוכחות של התיקון הנכון של מחלת האוגיונואוןעל ידי המושבה PCR. להרכיב תערובת התגובה על ידי הוספת 5 μl של מאגר ה-PCR 10x (1.5 mM mgcl2), 2 μl של 10 picomoles/μl התחל (שולחן 3), 4 μl של 2.5 mM dntps, 0.25 μl של 5 U/μl מסוג, ומים לנפח הסופי של 50 μ הכפל את תערובת התגובה עבור מספר מושבות שמרים צריך להיות מוקרן ו סדרת מחלקים 50 μl לתוך כל צינור PCR. באמצעות פיפטה, להוסיף כמות קטנה מאוד של תאים שמרים מהצלחת הלוח YPDA לתוך ערבוב אחד התגובה PCR.
  20. בצע את תגובת ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 94 ° צ' למשך 8 דקות ואחריו 35 מחזורי הדנטורציה עבור 1 דקות ב-94 ° c, מעגלי התחל עבור 1 דקות בשעה 55 ° c וסיומת 2 דקות ב-72 ° c.
  21. לאחר השלמת התגובה, טען סדרת מחלקים של תגובת ה-PCR (כעשירית הנפח) על ג'ל agarose כדי לבדוק את הגודל הנכון (~ 500 bp).
  22. רצף את מוצר ה-PCR לאחר הטיהור עם ערכת מסחרית כדי לאשר את האינטגרציה של הרצף RE הרצוי באמצעות אותו התחל של שלב 1.19.
  23. לאחר האימות של הרצף הנכון, לעשות 15% גליצרול מלאי של תרבות yAFM-RE או yLFM-RE הזנים (ב YPDA) ולאחסן אותו ב--80 ° c.

2. הערכה של יכולת הפעלת חלבון P53 באמצעות האיכות האיכותית ADE2 שמרים המבוססת על צבע

  1. חזור על שלבים 1.1 ו-1.2 באמצעות המתח yAFM-RE (טבלה 1).
  2. יום לאחר מכן, לדלל את התרבות התא (1:10) ב 30-50 מ ל של טרום מחומם מראש ולהמשיך המאריטה ב 30 ° צ' על ידי טלטול עד OD600nm מגיע 0.8-1.0 (~ 2 h).
  3. חזור על שלבים 1.5-1.10.
  4. בצינור 1.5 mL נפרד, להוסיף 300-500 ng של שמרים P53 (או שליטה) הביטוי וקטור (שולחן 4), 5 μl של המוביל הזרע סלמון מבושלים ה-DNA, 300 μl של הבולם הסטרילי של LiAcTE, ו50 μl של השעיית תא שמרים.
  5. חזור על שלבים 1.12 ו 1.13 אבל להשעות מחדש את הגלולה התא ב 300 μL של מים סטריליים.
  6. התפשטות 100 μL של השעיית התא על סלקטיבי סינתטי (עבור P53 ביטוי או שליטה וקטור) לוחות המכילים דקסטרוז כמקור פחמן כמות גבוהה של אדנין (שולחן 2), ואז דגירה (הפוך) ב 30 ° c עבור 2-3 ימים.
  7. מושבות שמרים בעלי פס יחיד (2-6 פסים לצלחת) על צלחת סלקטיבית חדשה ולתת להם לצמוח לילה ב 30 ° c.
  8. ביום שלאחר מכן, באמצעות צלחת העתק סטרילי ולוטרינרים על לוחות סלקטיבי חדשים המאפשרים הערכה של הצבע פנוטיפ (כלומר, צלחות המכילות דקסטרוז as מקור פחמן, אך הגבלת כמות של אדנין; טבלה 2). הפוך את הצלחות ב 30 ° c עבור 3 ימים. באופן אופציונלי, כדי להעריך את רגישות הטמפרטורה של חלבון P53, דגירה בשלוש טמפרטורות שונות עבור 3 ימים: 24 ° צ', 30 ° c, ו 37 ° c.
    הערה: הרצף יכול להיות בציפוי משוכפל פעמים רבות.
  9. כדי להעריך את יכולת ההפעלה P53 חלבון, לבדוק את הצבע מבוסס הפנוטיפ של מושבות שמרים ולהשוות את P53 החלבון ביחס P53 wild-סוג וריקים פנוטיפים וקטוריים.

3. הערכה של היכולת להפעלת חלבון P53 באמצעות האור הכמותי מבוסס שיטת LUC1 שמרים

  1. שינוי צורה של תאים שמרים עם P53 (או בקרה) וקטורי ביטוי (טבלה 4) תוך שימוש בשיטה המבוססת על liac המתוארת בפרוטוקול 2. השתמש במתח של yLFM-RE (טבלה 1).
  2. תיקון transformants יחיד על צלחת סלקטיבית חדשה עם כמות גבוהה של אדנומין המכיל גלוקוז כמו מקור הפחמן ולתת להם לגדול ב 30 ° c לילה. עבור כל סוג שינוי, לעשות 5-7 טלאים שונים.
  3. לאחר הצמיחה לילה, להשעות כמות קטנה של תאים שמרים באמצעות קיסם סטרילי או פיילט עצה מן הצלחת ב בינונית סלקטיבית סינתטי המכיל דקסטרוז או רפפינז כמו מקור הפחמן (200 μL הסופי של שקוף 96 טוב צלחת, עם סיבוב או בתחתית שטוחה). אם הניסוי דורש inducible P53 ביטוי, להוסיף גלקטוז למדיום רפפינוז לווסת את רמת האינדוקציה (שולחן 2).
    הערה: השעיות התא הללו אמורות להיות בעלת OD600nm של כ-0.4 וללא יותר מ-1.
  4. מדוד את ספיגת כל טוב ב OD600nm לאחר inducible P53 ביטוי (4-8 h ב 30 ° צ' עם 150-200 rpm רועד) באמצעות קורא לוחית multilabel. ודא שהשעיות התאים הן הומוגניות על-ידי ערבוב כל היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  5. העבר 10-20 μL של השעיית התא מתוך שקוף 96 הצלחת הבאר לתוך 384 לבן (או 96) צלחת היטב לערבב עם נפח שווה (10-20 μL) של מאגר לפירוק. דגירה עבור 10-15 דקות ב RT על שייקר (150-200 rpm) כדי להשיג חדירות של התא למצע לוציפראז.
  6. הוסף 10-20 μL של גחלילית לוציפראז ולמדוד את יחידות האור (LU) על ידי קורא לוחית רב תוויות.
  7. כדי לקבוע את יכולת ההפעלה של חלבון P53, לנרמל את ה-LUs של כל הבאר ל-OD600nm (יחידת אור יחסית, rlu). חישוב ממוצע RLU וסטיית התקן מ-3-4 טלאים של מושבות שמרים.
  8. להשוות את נתוני הP53 החלבון ביחס P53 פראי סוג וקטור ריק, או על ידי חיסור הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק או על ידי חלוקה לפי הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק (כלומר, קיפול המחשוב של אינדוקציה).
    הערה: ניתן להעריך גם את פעילות P53 ההפעלה באמצעות הערכה ניסיונית זהה בנוכחות של חלבונים בעלי P53 אינטראקציה (כלומר, MDM2 ו-MDMX) ו/או כולל טיפול תרופתי.

4. הערכה של עיכוב הצמיחה של חלבון P53 באמצעות השמרים פנומיטילי

  1. שינוי צורה של תאים שמרים עם P53/MDM2/MDMX (או פקד) ביטוי וקטורים (טבלה 4) באמצעות השיטה המבוססת על liac המתוארת בסעיף 2. השתמש זן CG379 (טבלה 1) ולהפיץ transformants שמרים על לוחות סלקטיבי מינימלי (טבלה 2).
  2. לגדול תאים שהפכו בינוני סלקטיבי מינימלי (שולחן 2) כ 1 OD כ600nm.
  3. לדלל תאים שמרים כדי 0.05 OD600nm במדיום אינדוקציה סלקטיבית (שולחן 2), ובמידת הצורך, להוסיף מולקולה קטנה שנבחרה לריכוז המתאים (או ממס בלבד) כדי לבדוק את יעילותה בהפעלה מחדש של מוטציה P53 או מעכב MDM2- /MDMXT-P53 אינטראקציות.
  4. התאים מודדים ב 30 ° c תחת טלטול מסלולית רציפה (200 rpm) עבור כ 42 h (הזמן הנדרש על ידי שמרים בקרה שלילית להגיע באמצע יומן השלב, על 0.45 OD600nm).
  5. ספוט 100 μL של תרביות תאים שמרים על לוחות סלקטיביים מינימליים (שולחן 2).
  6. מודטה למשך יומיים ב -30 ° c.
  7. למדוד את הצמיחה שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהתקבלו 100 μL התרבות טיפות (המושבה ויוצרים יחידה, ספירת CFU). לדוגמה, לחשב את ההשפעה של מוטציה הפעלה מחדש של תרכובות בהתחשב הצמיחה של פראי-סוג P53 ביטוי שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית (להגדיר כדי 100%), בעוד הצמיחה של תאים המבטא מוטציה P53 (אבל חשוף לבקרת ממס) מייצג רמת אפס של ההפעלה מראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניית מ ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים

הגישה הטיפולית12,14,15,16 כבר הותאם כדי לאפשר את הבנייה של P53 העיתונאי זנים שמרים (איור 1b). השיטה מעסיקה לפחות 30 נוקלאוטידים הומולוגיים המכילים, בשני הצדדים, ובשתי הקצוות האלה, שלושים ושוב הומולואיזם לפני המיזוג הנבחר. באופן ספציפי, הומולוגיה מקבילה לרצפים המאגפים את אתר האינטגרציה של ICORE בקסטה כפולה, המכילה את KlURA3 ו kanMX4 (הגן העיתונאי מתן עמידות לגנטיסין, G418) הממוקם בעבר . אתר היעד המבוקש15,16 קלטת זו מכילה גם את רצף שמרים I-scei endonחכירה קידוד, תחת inducible GAL1 יזם ואתר היעד קנצוני שלה. לכן, בורר בגלקטוז המכיל בינונית לפני הטרנספורמציה של תאים שמרים עם תוצאות הרצף הרצוי ביטוי I-SceI ויצירת הסוגר של הפסקה כפולה אחת (DSB) באתר של אינטגרציה ICORE. הנוכחות של DSB מעוררת מאוד את תדירות המיקוד של אירועים, עם יותר מ-1,000 החלפות שהתקבלו עם שינוי יחיד.

בסופו של תהליך המיקוד והבחירה מבוסס על התנגדות נרכש 5-ורגישות G418, המועמדים שיבוטים מאושרות על ידי המושבה PCR הגברה של מקום שונה ורצף שלנגר כדי לאמת את השילוב הנכון של ה הרצוי P53 RE (איור 1C). בסוף פרוטוקול הבנייה זן, כי ניתן להשלים בעוד כשבוע, פאנל של זנים שמרים הכתב איזוגניים מתקבלים כי ניתן להשתמש כדי להעריך כיצד הבדלים ברצף של REs להשפיע על קיבולת ההפעלה של P53 חלבון.

מוטציה P53s הטרוגנית פונקציונלית

בגידולים אנושיים, הגן TP53 מושפע בעיקר על ידי מוטציות מוטעית אחת כי בדרך כלל לערב שישה נקודות המגע העיקריים (R175, G245, R248, R249, R273, ו R282) ממוקם בתחום ה-DNA המרכזי מחייב (dbd) של חלבון P53. עם זאת, יותר מ 2,000 יחיד P53 החלפות חומצות אמינו הוקלטו, כולל כמה כי הם נצפו לעתים רחוקות27. מוטציה P53s יכול להיות מסווג כאיש קשר DNA או מוטציות מבניות, בהתאם להשפעות של החלפת חומצה אמינית על מגע DNA-חלבון (למשל, R273H) או חלבון מבנה (g., R175H)36. יחיד TP53 missense מוטציות ההשפעה פונקציות P53, יצירת מגוון רחב של מגוון פונקציונלי, אשר יכול להשפיע על תכונות קליניות חשובות כגון תוקפנות הגידול, הכימותרפיה התנגדות, ו גרורתי פוטנציאל37, 38 , 39.

המושג מוטציות P53 הם הטרוגנית מבחינה פונקציונלית ברור התפתחה ב 15 השנים האחרונות באמצעות כמות גדולה של נתונים ניסיוניים זמין במסדי נתונים TP53 מוטציה (למשל, < P53. fr//>)27. שונות הפונקציונליות שונים מבוסס על שמרים ו/או מערכות העיתונאי היונקים פותחו, הדגשת תכונות שונות של מוטציות P53s (כלומר, הפעלה, רגישות לטמפרטורה, הפוטנציאל דומיננטי-שלילי, הפרעה עם חברי משפחת P53 ואינטראקציות עם tfs אחרים)13,24,40,41,42,43,44. המחקר הפונקציונלי המקיף ביותר בדק יותר מ 2,300 מוטציות בתוך שמרים מבוסס על ידי אפיון פעילות ההפעלה שלהם לקראת שמונה P53 REs24שונים.

הנתונים אישרו כי כמעט כל מוטציה P53s מעורבים שאריות נקודה חמה הם אובדן של פונקציה (כלומר, הם איבדו לחלוטין את פעילות ההפעלה). לעומת זאת, מוטציה P53s כי פגע במיקומים אחרים של חלבון P53 ונמצאים בדרך כלל בתדר מתון עד נמוך בסרטן45 הם פונקציה חלקית מוטציות, אשר לשמור על רמה מסוימת של פעילות ההפעלה על P53 REs13, 17. דוגמה לשימוש בADE2 , כדי ללמוד את החלבונים המתוארים P53 טרוגניות פונקציונליים מוצג באיור 2a. למעשה, בעוד R175H הוא אובדן פונקציה של מוטציה המייצרת מושבות אדומות בכל מצב נבדק, R282W הראה רגישות לטמפרטורה כי היה ברור יותר באמצעות גלקטוז תלוי P53 ביטוי (כלומר, המגזר האדום בשעה 37 ° c במתח P21-5 ' RE ב לוחית המכילה את הגלקטוז התחתון, ההופך לורוד בלוח הגלקטוז הגבוה יותר. איור 2B מציג סיכום של תוצאות עבור פאנל מורחב של P53 מוטציות וזנים עיתונאי.

קיומו של זה P53 פונקציונלי טרוגניות מתבקש לבדוק אם טרוגניות כגון וקרב טרוגניות נצפתה ברמה הקלינית בנושאים עם TP53 germline מוטציות. TP53 germline מוטציות בסיס הבסיס המולקולרי של קבוצה של הפרעות הסרטן נטייה, כולל לסלי-פרמני חמור יותר (lfs) ו-li-פרמני כמו (lfs) תסמונות, ואת הנטייה פחות חמורה לא הסינדרומית עם (fh) או ללא (ללא FH) היסטוריה משפחתית46.

הפרוטוקול גנוטיפ-פנוטיפ-הקשר על-ידי התאמת יכולות הפעלה מבוססות שמרים מבוססי ההפעלה של כל TP53 germline המוטציות עם נתונים קליניים המקביל ממסד הנתונים iarc < http://www-p53.iarc.fr/Germline.html >. אובדן של פונקציה P53 מוטציות נמצאו בסרטן חמורה יותר תסמונות ובדייקנות, בעוד פונקציה חלקית P53 מוטציות נמצאו במצב סרטן חמור פחות בתוך התנאים. זה מציין כי P53 שיורית יכולת הפעלה משפיע על השפעות קליניות בחולים אשר ירש TP53 מוטציות ופיתח סרטן25,26.

נוקלאוטיד וריאציות רצפים בתוך REs למשול P53 פוטנציאל להפעלה טרנסציאלית

P53 אנושי הוא tetrameric (דימר של דימרס) TF. כל P53 דיימר מזהה מחדש המורכב 10 נוקלאוטידים (rrrcwwgyyy, R = a או G; W = A או T; Y = C או T)47,48. שני אתרים כאלה יכולים להיות סמוכים או מרווחים בהפרש של עד 13-20 נוקלאוטידים, המהווים פונקציונלי P53 RE. עם זאת, P53 REs עם מרווח מאופיינים על ידי נמוכה P53 זיקה ו transactivation פעלה מאשר P53 REs ללא מרווח49,50, ב בחני פונקציונלי שונים ממערכות שונות.

זה הוכיח לאחרונה כי מחצית אתרים יכול לגייס P53 ארבמרס כי הם מאוגדים במיוחד51, יחד עם בחני פונקציונלי ומחקרים immunoprecipitation כרומטין, ממצאים אלה מצביעים על כך P53 יכול לפעול גם ב-REs לא קאנוני, הכולל מחצית מהאתרים ושלושה רבעים48,52. יתר על כן, העובדה כי הקונצנזוס המלא P53 RE מוטיב הוא מאוד מנוון (RRRCWWGYYY)2 לקדם את האפשרות כי REs בודדים יכול להיות שונה באופן משמעותי בנושא הזיקה והכריכה. בהתחשב בכך מאות גנים היעד P53 זוהו הגנום האנושי41,48, כמעט כל P53 REs הראה רצף לא זהה בין השני. יתר על כן, זה כבר שיערו כי REs עם האהדה ברורה האיגוד DNA נבחרו היזמים של גנים היעד P53 מעורב מעצר מחזור התא או אפופטוזיס53.

ניתוח שמרים של גרסאות רבות של P53 RE במיקום גנומית קבוע הקימה את ההשפעה של משתנים נוקלאוטיד, רווח וארגון של מחצית אתרים על קיבולת ההפעלה49. זה אפילו הוביל את הגילוי של פולימרים P53 REs עם שני אללים שונות במידה ניכרת בתגובה של היזם המשויך כדי P5314,54,55. לאחרונה, מידע הנובע תכונות רצף P53 RE ופוטנציאל ההפעלה שמרים מבוססי הפעלה מקודד ב P53 רטריבר, אלגוריתם חיפוש דפוס כי הוא מסוגל להתאים את הדירוג הן קאנוני ולא קנוני, על פי ה ניבא הפוטנציאלים הפעלה ברחבי הגנום האנושי כולו52.

כדוגמה לשימוש בשיטה לחקר פוטנציאל הP53 הספציפי לרצף, המוצג כאן הוא השוואה בין מסוג פראי אנושי P53 לבין החלבון P53 הרחוק האבולוציוני מהאלמרנים (איור 3). תוצאות אלה הן מעקב של מחקר שנערך לאחרונה שבו הסטייה ההתפתחותית של הפעלה ספציפיות בין P53 חלבונים נחקרו56. זני כתבת אילגניים-RE. פותחו כמתואר בפרוטוקול במיוחד, Cep-1 P53 RE נגזר ced13 gene57, וארבע משתנים (V1-V4) השוו (איור 3a). משתני RE נבנו כדי לבחון את ההשפעה של שונים את אורך המרחב המפריד בין שני מוטיבים decameric (אשר ב ced13, הוא 28 נוקלאוטידים) וכלה לבחון שינויים נוקלאוטידים החוצה את מוטיב הליבה CWWG (אשר ב ced13, הם/T עשיר; בעוד P53 REs האנושי הגבוה ביותר הקרבה, הם G/C עשיר)58. התוצאות מראות בבירור כיצד Cep1 והאדם P53 מתפצל במונחים של הפעלה מסוימים ספציפיות. למעשה, בעוד הP53 בתיווך האנושי מעכבות מאוד על ידי נוכחות של מרווח (איור 3B), cep-1 פעילות מעוכב על ידי הסרת מרווח (איור 3b). יתר על כן, Cep-1-הפעלה בתיווך בוטלה כאשר RE משתנה מ-A/T-לתוך עשיר G/C. לא P53 אנושי ולא Cep-1 יכול לבצע הפעלה מתוך decamer יחיד נגזר ced13 RE.

חיפוש אחר מולקולת מולקולה קטנה של אינטראקציות P53-MDM2/MDMX והפעלות מחדש של פעילות P53 מוטציה

הקורלציה הוקמה בין ההשפעה המעכבות הצמיחה של האדם P53 ומידת הפעילות שלה בשמרים הוביל שיטת סינון פשוטה המבוססת על מדידות של צמיחת תאים שמרים לנתח את ההשפעה של גורמים מפריעים על פעילות P53 (איור 4 ). את האפקטיביות של הכדאיות פנוסטי שמרים למסך עבור סוכנים פוטנציאליים נוגדי סרטן הפגינו במספר יצירות. שימוש בתאי שמרים ביטוי P53 ומעכבי שלה MDM2 ו/או MDMX, מוטציות חדשות של אינטראקציות אלה זוהו על ידי היכולת שלהם לעכב את ההשפעה השלילית של Mdmx ב-P53, ובכך מחדש הקמת פראי מסוג הצמיחה שמרים המושרה הגדילה ( איור 4A). בפרט, שיטת הפעולה הובילה לגילוי של 1) pyranoxanthone 1 כמו P53-MDM2 אינטראקציה הראשון עם מעכב קסאחד34 ו 2) oxאזובלוולואינוןאחד של P53 MDM2 אינטראקציה59. בנוסף, עם שיטת הפעולה הזאת, mangostin ו חומצה gambogic תוארו בפעם הראשונה כמעכבי פוטנציאליים של P53-MDM2 אינטראקציה30.

מאוחר יותר, אותה הכדאיות הוכיחה כי הפרלציה של כלקונוסים הגדילו את יכולתם לשבש את P53-MDM2 אינטראקציה60. מעניין, שיטת שמרים זו גם הובילה לגילוי של שני מעכבי של P53-MDM2/MDMX אינטראקציות: הטריפטוהנול-הנגזר oxazolopiperidone ופק לקטתם OXAZ-161 ו טריפטוהנול-הנגזרות oxazolopiperidone DIMP53-162.

ההשפעה מופחתת של אובדן הפונקציה מוטציה P53 על צמיחת תאים שמרים גם נחקרו על המסך עבור מוטציה P53-הפעלה מחדש של תרופות, המאופיינת על ידי היכולת לשחזר את הפעילות מעכבות הצמיחה פראי כמו מוטציה P53 (איור 4B). בעזרת שמרים זו, reactivator של מוטציה P53 R280K, האנאנטיפורה טריטופנול-הנגזרים מהאוזולוולואיזואינבינות1 SLMP5363, זוהה. איור 4C,D מציג את התוצאות הייצוגית שהתקבלו שמרים עם הביטוי של P53 או טיפולים עם המעכב של P53-MDM2 האינטראקציה משוגע-3a או עם reactivator של P53 מוטציה Y220C PhiKan083.

אימות של המנגנון המולקולרי של פעולה של תרכובות אלה כמו סוכני מפעיל P53, כמו גם פעילות אנטי סרטניים שלהם, הן בתאי הגידול האנושי תאים34,60,61,62,63 ודגמי בעלי חיים62,63, מעיד על הפוטנציאל הגדול של שיטת הפנוטימית המרים בגילוי הסמים.

Figure 1
איור 1 : תכונות של שמרים מבוסס P53 transactivation פעלה בחני וזרימת עבודה עבור הבנייה של P53 הכתב זנים שמרים. (A) את הקלות של מניפולציה הגנום מבוקרת ביטוי גן החוץ הרחמי מעבד שמרים הדומה "במבחנה vivo test", שבו משתנים מספר רלוונטי לבחון P53 פונקציות ההפעלה הם נחקרו בקפדנות. משתנים אלה כוללים את רמות הביטוי של חלבון מסוג פראי או של מוטציה P53, את הרצף של RE, ואת סוג של גן העיתונאי [איכותי/חצי כמותי (למשל, ADE2 ו lacz) או כמותי (למשל, LUC1)]. הרצף החדש של הקונצנזוס מאוד מנוון (מחדש = מסודר-n-RRRCGA); R = purine; W = A/T; Y = pyrimidine; CWWG = רצף ליבה, n = 0-13 bps. מספר ההתנגשויות ביחס לקונצנזוס, רצף הליבה ומספרם של מפרידי הזוגות הבסיסיים ישפיעו על פעילות ההפעלה הטרנסזוגית. פאנל זה שונה מהפרסום הקודם64. (ב) הערכה של הגישה מחדש perfetto כדי להחדיר הרצוי P53 RE במעלה הזרם של יזם מינימלי המניע את ADE2 או LUC1 הביטוי גן הכתב. הפרוטוקול הותאם מפרסומים קודמים12,15,16. (ג) דוגמה של התוצאות של מושבת שמרים PCR הגברה של האזור המקיף את אתר האינטגרציה OLIGO מחדש. הדימוי של האלקטרופורזה מציג את תוצאת ההגברה של שתי מושבות חיוביות (URA3 מינוס ו G418 רגישים) עם השליטה השלילית המקבילה של ה-PCR בסמוך לסולם ה-DNA 1 kb (Promega). הלהקה של ~ 500 nt הצפויה באמצעות התחל שתוארה בטבלה 3 יכולה להיות מדוייקת כדי לאשר את העריכה הנכונה של היזם, כפי שמוצג ב-electropherogram. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : חלבונים P53 מציגים פוטנציאל להפעלה מחדש ורגיש של טמפרטורה. פראי סוג P53 ו המצוין TP53 מוטציות מוטעית נבדקו באמצעות שיטת הכתב האיכותית המבוססת על צבע שמרים וניצול זנים עיתונאי כי הנמל P53 REs שונים שליטה ביטוי הגנים ADE2 . (א) דוגמה לצבע המושבה פנוטיפ לP53 פראי, R175H, וR282W עם הפומה (BBC3) ומגרש P21-5 ב -30 ° צ' ו-37 ° c מוצג. מתון (0.008% גלקטוז) וגבוה (0.12% גלקטוז) P53 ביטוי מושווה. (ב) תוצאות שהתקבלו עם קבוצה מורחבת של מוטציות P53 וזנים כתבת שמרים בדק את P53-תלויי המושבה צבע פנוטיפ בשלוש טמפרטורות (24 ° c, 30 ° צ', ו 37 ° c). התוצאות מדגימה טרוגניות תפקודית של אלולים P53 מוטנטים ומסוכמים בתבנית טבלה. לדוגמה, R175H היא מוטציה של אובדן פונקציה, בעוד G199H מהסוג הפראי P53 כמו. K139E ו R282W לשמור על פונקציה חלקית והתצוגה רגישות קר ורגישות חום, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : P53 אנושי ומוצג בצורה מאוד מתוחכמת (A) רצפים של: רצף הקונצנזוס P53 RE האנושית, cep-1 P53 re נגזר מהגן ced13 , וארבע משתנים (V1-V4) כי נבדקו assays פונקציונלי. (ב) הפעלת הפעלה נמדדה לאחר שP53 הביטוי האנושי במשך 8 שנים באמצעות שלושה מקורות פחמן שונים כדי להשיג נמוך, בינוני וגבוה ביטוי (0.008%, 0.032%, 0.12% גלקטוז הוסיפו למדיום סלקטיבי המכיל 2% רפפיז). התוצאות מתבטאות כיחידות אור יחסית ממוצעות (RLU) ושגיאה סטנדרטית של ארבעה משכפל. פעילות עיתונאי עבור תא ששונה עם וקטור ביטוי ריק הועצמה. (ג) הפעלת ספציפיות של Cep1 כפי שנמדד ב (ב). בשני החלבונים, רמות ההפעלה הטרנסטרליים היו יחסיות לכמות הגלקטוז. יחידות אור גבוה יותר נמדד כאשר האדם P53 מבוטא יכול להיות תלוי ברמות שונות של כמויות חלבונים המיוצרים, בשל ההבדל באורך החלבון ופוטנציאל גם השימוש קודון. שני החלבונים מאופיינים ספציפיות הפעלה שונות לקראת REs שונים נבדק מאפיין זה אינו מושפע הבדלים אפשריים בכמות החלבון היחסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מפעילי מולקולה קטנה של P53 מזוהה באמצעות שמרים פנוטידים השיטה. (א) שמרים תאים לבטא אדם פראי-סוג P53 ו MDM2 או MDMX שימשו כדי לחפש מעכבי של P53 MDM2 ו P53-mdmx אינטראקציות. במערכת זו, אינטראקציה מעכבי שחזור P53-המושרה עיכוב הצמיחה שמרים בתאי שמרים ביטוי P53 ו MDM2 או MDMX. גישה זו אפשרה זיהוי של מעכבי של P53-MDM2 אינטראקציה וזיהוי של מעכבי כפולה של P53 MDM2 ו P53-MDMX אינטראקציות. (ב) תאים שמרים המבטא האדם מוטציה P53 השתמשו כדי לחפש מוטציה P53 reהפעלות והוא מסוגל לשחזר את הגידול הפראי כמו P53 שמרים המושרה הצמיחה בתאי מוטציה P53 ביטוי שמרים. (ג) דמויות מייצגות של הצלחת המקום לוחית מראה את ההשפעה של פראי-סוג P53 או מוטציה Y220C על צמיחת המושבה שמרים לעומת וקטור ריק (ראה שלב 4.5). (ד) תוצאות כמותי של שיטת הצמיחה: 10 Μm פסיכי-3a משחזרת P53 המושרה שמרים הצמיחה עיכוב בתאים ביטוי MDM2; 50 μM PhiKan083 משחזרת את הצמיחה מסוג פראי כמו P53 שמרים המושרה עיכוב לP53 מוטציה Y220C. שני ההשפעות הן מותוות יחסית להשפעה המיעכבות צמיחה שמרים של פראי-סוג P53, אשר הוגדר כאחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם הזנים ו-גנוטיפ שימוש ספציפי מספר פרוטוקול
yAFM-ICORE: מאטה leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 הוא משמש לבניית YAFM RE זן (מאטה leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) כי הוא ניצל בתוך האיכות האיכותית, המבוססת על צבע ADE2. פרוטוקולים 1, 2
Ylfm-ICORE: מאטה leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 הוא משמש לבניית זן Ylfm-RE (מאטה leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) המנצלים את הLUC1 הכמותית המבוססת על ה. פרוטוקולים 1, 3
CG379: מאטה, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [קיל-הו] היא משמשת לצורך הגדילה הפנוטימית. פרוטוקול 4

טבלה 1: זנים שמרים.

שם מדיה ומתכון שימוש ספציפי מספר פרוטוקול
מיכל הפרדה (2% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז, 200 mg/L אדנין) + 2% אגר YPDA ללא אגר הוא מעוקר רצוי על ידי סינון. YPDA + אגר הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג; ניתן להשמיט את דקסטרוז מן המתכון ולהוסיף דקסטרוז מ 20% מסנן פתרון מעוקר במים לפני לשפוך את הצלחות. פרוטוקולים 1-4
CM [0.17% בסיס חנקן שמרים ללא AA ו אמוניום גופרתי, 0.5% אמוניום גופרתי, 5% (אמצעי אחסון/אמצעי אחסון, v/v) ללא חיוניות חומצה אמינית, 20 מ"ג/l histidine, 20 מ"ג/l טריפטופן, 20 מ"ג/l uracil, 30 מ"ג/l ליזין, 100 Mg/l leucine, 200 mg/l adenine] + 2% גלקטוז המדיה מחוטאת על-ידי סינון. פתרונות מניות סטרילי הבאים מוכנים במים (למעט uracil, כי הוא הומס 0.1 M NaOH) על ידי סינון: הפתרון הלא חיוני חומצות אמינו (0.04% arginine, 0.04% מתיונין, 0.06% isoleucine, 0.1% פנילאלנין, 0.2% גלוטמית חומצה, 0.2% אספרטית חומצה, 0.3% valine, 0.4% טראונין, 0.8% סרין, 1% histidine, 1% טריפטופן, 1% uracil, 1% ליזין, 1% לאוצין, 0.5% אדנין, 20% גלקטוז. אין לאחסן את פתרון המניה של אדנין במקרר בשל היווצרות הגבישים ומשקעי הקריסטלים. פתרון המניה של טריפטופן חייב להיות מאוחסן בחשכה. פרוטוקול 1
CM (ראה לעיל) + 2% דקסטרוז + 1g/L 5-עד 2% אגר התקשורת (מכיל בסיס חנקן שמרים ללא AA ו אמוניום סולפט, אמוניום סולפט ו-אגר) הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג. שאר הרכיבים נוספים לאחר שמירה על מרכיבי חום-לאבאיל; ניתן להוסיף את האבקה של 5-י ישירות באמצעי התקשורת לאחר שהיא מקורר ל-55 ° c. פרוטוקול 1
Ypda + 400 Μg/mL G418 + 2% אגר G418 יש להוסיף לאחר אוטוקלינג פעם מדיה התקרר על 55 ° c. אם החל אבקה, 50 mg/mL G418 מניות פתרון יכול להיות מוכן במים מעוקר על ידי סינון. פרוטוקול 1
איגה [2% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% גליצרול (v/v), 200 mg/L אדנין] + 2% אגר התקשורת מחוטאת על ידי אוטוקלינג. פרוטוקול 1
לוח סלקטיבי סינתטי: [0.17% שמרים חנקן בסיס ללא AA ו אמוניום סולפט, 0.5% אמוניום גופרתי, 5% (v/v) לא חיוניים חומצות אמינו פתרון (0.04% arginine, 0.04% מתיונין, 0.06% isoleucine, 0.1% פנילאלנין, 0.2% גלוטמית חומצה, 0.2% אספרטית חומצה, 0.3% valine, 0.4% מיכל שטרטין, 0.8% סרין), 20 מ"ג/L histidine, 20 מ"ג/L uracile, 20 מ"ג/L טריפטופן (בהתאם לסמן בחירת וקטור), 30 מ"ג/L ליזין, 100 mg/mL לאוצין (בהתאם לסמן בחירת וקטור), 5 מ"ג/L או 200 mg/L adenine] + 2% דקסטרוז התקשורת (מכיל בסיס חנקן שמרים ללא AA ו אמוניום סולפט, אמוניום סולפט ו-אגר) הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג. שאר הרכיבים נוספים לאחר שמירה על מרכיבי חום-לבנה. כאשר משתמשים ב-pLS-ו pLSG מבוססי וקטורים להכין צלחות ללא leucine. בעת שימוש בוקטורים מבוססי pTS ו-pTSG מכינים צלחות ללא טריפטופן. פרוטוקולים 2-3
מדיה סלקטיבית מלאכותית: [0.17% שמרים חנקן בסיס ללא AA ו אמוניום סולפט, 0.5% אמוניום גופרתי, 5% (v/v) לא חיוני חומצות אמינו פתרון (0.04% arginine, 0.04% מתיונין, 0.06% isoleucine, 0.1% פנילאלנין, 0.2% גלוטמית חומצה, 0.2% אספרטית חומצה, 0.3% valine, 0.4% מיכל שטרטין, 0.8% סרין), 20 מ"ג/L histidine 20 מ"ג/L uracile, 20 מ"ג/L טריפטופן (בהתאם לסמן בחירת וקטור), 30 מ"ג/L ליזין, 100 mg/mL לוצין (בהתאם לסמן בחירת וקטור), 200 mg/L adenine] + 2% דקסטרוז או הרפפיז + 0-2  התקשורת מחוטאת על-ידי סינון. בעת שימוש ב-pLS או בווקטורים מבוססי-pTS בטיפול תרופתי, הכינו מדיה ללא לוקמיה או טריפטופן, בהתאמה אך המכילה 2% דקסטרוז. בעת שימוש בוקטור plsg-או ptsg בביטוי inducible P53 עם או בלי טיפול בסמים להכין מדיה ללא לאוצין או טריפטופן, בהתאמה אך המכיל 2% רפפיז וכמות משתנה של גלקטוז כדי לווסת את הביטוי P53. היקף P53 אינדוקציה יכול גם להיות מאופנן על ידי שינוי זמן הדגירה. פרוטוקול 3
לוחיות סלקטיבי מינימליות: 2% גלוקוז, 0.7% בסיס חנקן שמרים (ללא חומצות אמינו ו אמוניום גופרתי), 50 mg/l adenine, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidine, 50 mg/l טריפטופן (בהתאם לסמן בחירת וקטור), 50 mg/l לאוצין (תלוי סמן בחירה וקטורית), 2% אגר המדיום הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג. כאשר משתמשים בווקטורים מבוססי pLS89 מכינים מדיום ללא טריפטופן. השתמש בווקטור pLS89-ריק (לא לבטא חלבון כלשהו) כפקד שלילי. בעת שימוש בוקטורים מבוססי pLS89 ו-pGADT7-MDM2 (ביטוי משותף של P53 ו-MDM2), הכינו בינוני ללא לוקיצין וטריפטופן. השתמש pLS89-ריק ו-pGADT7 (שניהם לא לבטא חלבון כלשהו) כפקדים שליליים. בעת שימוש בווקטורים מבוססי pLS76 להכין בינוני ללא leucine. השתמש בווקטור pRS315 (לא לבטא חלבון כלשהו) כפקד שלילי. פרוטוקול 4
בינונית סלקטיבית מינימלית: כמו צלחות סלקטיבית מינימלית אבל בלי אגר המדיום מעוקר באמצעות סינון. פרוטוקול 4
בינוני אינדוקציה סלקטיבי: כמדיום סלקטיבי מינימלי, אך המכיל 2% גלקטוז במקום גלוקוז. המדיום מעוקר באמצעות סינון. פרוטוקול 4

שולחן 2: מדיה שמרים.

שם הפתרון, שם המתכון או הרצף הפריימר תכונות ספציפיות ושימוש מספר פרוטוקול
Liac/TE: 10 mm טריס-HCl, pH 8.0, עם 1 מ"מ edta ו 0.1 ליתיום אצטט פתרונות מניות סטרילי הבאים במים מוכנים על ידי אוטוקלינג: 1M ליתיום אצטט pH 7.5, 1 M טריס-HCl/0.1 M EDTA pH 8.0 (TE מאגר 10X). פרוטוקולים 1-4
יתד/LiAc/TE: 40% פוליאתילן גליקול (יתד) בתוך 10 mM טריס-HCl, pH 8.0, עם 1 מ"מ edta ו 0.1 M ליתיום אצטט פתרונות מניות סטרילי הבאים במים מוכנים על ידי אוטוקלינג: 1 M ליתיום אצטט pH 7.5, 1 M טריס-HCl/0.1 M EDTA pH 8.0 (TE מאגר 10X), 50% פג (משקל מולקולרי ~ 3350). פרוטוקולים 1-4
זנבות הומולוגיה לגבי המיונואודים מחדש
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-מחדש-משוב-שלושה '
בתנאי הוא הרצף של זנבות הומולוגיה, המתאים רצפים כרומוזומחוצה את הקלטת icore משולב; RE = רצף חדש. פרוטוקול 1
צבעי יסוד: Ade2 Fw: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 קרוואן: 5 '-GGAGCCATGGTA-3 ';
Luc1-קרוואן: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
עבור yAFM-RE זן (PCR ו רצף) לשלב Ade2 Fw עם Ade2 Rv פריימר. עבור המתח yLFM-RE (PCR ו רצף) לשלב Ade2 Fw עם Luc1-Rv פריימר. פרוטוקול 1

שולחן 3: פתרונות ומחלת הנגד.

סוגי וקטורים פקדים חיוביים ושליליים מספר פרוטוקול
P53 (או פקד) וקטורים.
pLS-או מבוססי pLSG: P53 ביטוי חלבון תחת היזם ADH1 קונסטיטוטיבי או גלקטוז inducible מקדם GAL1, בהתאמה (LEU2 כסמן בחירה).
מבוסס pTS או pTSG: P53 ביטוי חלבון תחת מקדם קונסטיטוטיב ADH1 או גלקטוז inducible יזם GAL1, בהתאמה (TRP1 כסמן בחירה)
pLS-ו-pLSG מבוסס: להשתמש כמו שליטה חיובית pLS76 ו pLSG-P53 וקטורים (המבטא פראי סוג P53), בהתאמה; להשתמש בתור שליטה שלילית pRS315 וקטור (לא לבטא חלבון כלשהו).
מבוסס pTS ו-pTSG: השתמש כפקד חיובי pTS76 ו pTSG-P53 וקטורים (המבטא פראי סוג P53), בהתאמה; להשתמש בתור שליטה שלילית pRS314 וקטור (לא לבטא חלבון כלשהו).
פרוטוקול 2, 3
P53 ו-MDM2 (או שליטה) וקטורים.
pLS89: סוג פראי P53 ביטוי חלבון תחת גלקטוז inducible מקדם GAL1 יזם (TRP1 כסמן בחירה).
מבוסס pLS76: מוטציה P53 חלבון ביטוי תחת מיזם ADH1 קונסטיטוטיבי (LEU2 כסמן בחירה).
מבוסס pGADT7: MDM2 ביטוי חלבון תחת מקדם קונסטיטוטיב ADH1 (LEU2 כסמן בחירה)
pLS89 מבוסס: להשתמש כשליטה חיובית pLS89-P53 וקטור (הבעת סוג פראי P53); להשתמש כפקד שלילי pLS89-ריק (לא לבטא חלבון כלשהו).
מבוסס pLS76: השתמש כפקד חיובי pLS76-מוטציה P53 וקטור (הבעת מוטציה P53); להשתמש בתור שליטה שלילית pRS315 וקטור (לא לבטא חלבון כלשהו).
pGADT7 מבוסס: להשתמש כשליטה חיובית pGADT7-MDM2 וקטור (הבעת סוג פראי MDM2); להשתמש בתור שליטה שלילית pGADT7 וקטור (לא לבטא חלבון כלשהו).
פרוטוקול 4

שולחן 4: וקטורים של ביטוי שמרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שמרים מבוססי בחני הוכיחו שימושי כדי לחקור היבטים שונים של פונקציות חלבון P53. בחני אלה רגישים במיוחד להערכת פוטנציאל ההפעלה הפעלת כלפי משתנים של אתרי יעד RE, כולל הערכה של פולימריות פונקציונלי. השימוש כתבים צבע, כמו גם המזעור של התוצאה לוציפראז תוצאות בעלות חסכונית ומדרגי יחסית. כמו כן, מבחן עיכוב הצמיחה היא פוטנציאלית לשימוש בהקרנה הספרייה הכימית, אוטומציה של הכדאיות של שמרים תאים באמצעות מדידה של ספיגת. בעוד חדירות מוגבלות בשל קיר התא ופעולה של מובילי ABC נחשב מגבלה באמצעות שמרים להקרנה סמים, שינויים גנטיים כדי לשפר את ספיגת כבר פותחו בהצלחה22,65.

בהשוואה מבוססת תא מבוססי היונקים, הP53 המבוססת על שמרים עשוי לשפר את הזיהוי של להיטים ישירים, בהינתן כי P53 מבודדת מן המורכבות המדהימה של קופנים ו איתות מסלולים אשד לווסת את הפונקציות שלה eukaryotes גבוה יותר. שמרים מבוססי בחני פונקציונלי יש גם היה מוצלח חלקית בניטור האינטראקציה של P53 עם קופנים חלבון (כלומר MDM2 ו mdmx22,32,33,34) ואת ההשפעה של קטן מולקולות (כגון נאטלין-3a) באינטראקציות אלה. עם זאת, את הרגישות ואת הכוח החזוי של שמרים מבוססי בחני אומר לחקור את הוצלב בין P53 לבין חלבונים האינטראקציה עשויה להיות מוגבלת במקצת, בהתאם לאופן האינטראקציות האלה ב vivo תלוי בשינויים שלאחר ההעברה ו מפלי איתות ספציפיים למינים.

המערכות המתוארות כאן יכולות להתאים בקלות ל-TFs אחרים. אכן, בחני פונקציונלי שמרים פותחו עבור P63 וP73 חלבונים42,49 , כמו גם חברי משפחת NF κB66,67 [או אפילו עבור הומבוקס חלק בסיסי-לולאה סליל (bhlh) Tfs68,69]. קולטנים גרעיניים האדם גם ביטא שמרים והוכח לעבוד כמו ligand תלויי, רצף ספציפי TFs70. גורם מגביל אחד זוהה בקיבולת החלשה של מתחם הפעלה של כמה משתמשים (טד) כדי לקיים אינטראקציה עם מכונות תמלול שמרים בסיס8, קיצור שיכול להיות להתגבר על ידי שימוש בונה השאריק כולל פעיל הטרוולוגי במקצת68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgments

אנו מודים לאיחוד האירופי (כספי פדר poci/01/0145/פדר/007728 באמצעות מתכנתים המבצע מפעל להתחרות) וכספים לאומיים (fct/MEC, האופרה הלאומית של ciência e ומיניצ) באמצעות ה הסכם שותפות PT2020 UID/קי/50006/2019 והפרוייקטים (3599-PPCDT) לפטין/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-פדר-016581. מלגות FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. גומז). עבודה זו נתמכת על ידי Compagnia S. פאולו, טורינו, איטליה (פרויקט 2017.0526) ומשרד הבריאות, (פרויקט 5x1000, 2015 ו 2016; המחקר הנוכחי 2016). אנו מודים עמוקות ד ר תרזה לופס-אריות מונטנגרו (אוניברסיטת טרנטו, מעבדות לימוד של מדעים ניסיוניים) לסיוע בהקלטת וידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics