Author Produced

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Представлены здесь четыре протокола для создания и эксплуатации дрожжей Saccharomyces cerevisiae репортер штаммов для изучения человека P53 трансактивации потенциал, последствия его различных связанных с раком мутаций, совместно выраженных взаимодействующих белков, и эффекты конкретных малых молекул.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Вывод о том, что известный белок P53 млекопитающих может выступать в качестве транскрипции фактор (TF) в дрожжах S. cerevisiae позволило для разработки различных функциональных анализов для изучения воздействия 1) связывающий сайт (т.е., элемент ответа (RE) варианты последовательности на P53 трансактивации специфичности или 2) TP53 мутации, совместно выраженные кофакторы, или небольшие молекулы на P53 трансактивации деятельности. Разработаны различные базовые и трансляционные исследовательские приложения. Экспериментально эти подходы используют два основных преимущества модели дрожжей. С одной стороны, простота редактирования генома позволяет быстро строить качественные или количественные системы репортера, используя изогенные штаммы, которые отличаются только на уровне конкретного P53-RE для изучения последовательности-специфическости P53-зависимых трансактивации. С другой стороны, наличие регулируемых систем эктопического выражения P53 позволяет оценивать трансактивацию в широком диапазоне экспрессии белка. Рассмотрены в этом докладе широко используются системы, которые основаны на генах цвет репортера, люциферазе и росте дрожжей, чтобы проиллюстрировать их основные методологические шаги и критически оценить их прогностической силы. Кроме того, крайняя универсальность этих подходов может быть легко использована для изучения различных TFs, включая P63 и P73, которые являются другими членами семейства генов TP53.

Introduction

Транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим динамическую, пространственную и временную организацию транскрипционных факторов (ТФ) и кофакторов для набора и модуляции РНК-полимераз на хроматиновых регионах в ответ на специфические стимулы1 . Большинство TFs, в том числе человека P53 супрессор опухоли, признают конкретные цис-действующих элементов в виде последовательностей ДНК, называемых ответных элементов (REs), которые состоят из одного (или несколько) уникальных мотивов 6-10 нуклеотидов долго. В рамках этих мотивов, отдельные позиции могут показать различные степени изменчивости2, как правило, суммируется по позиции вес матрицы (PWM) или логотипы3,4.

Дрожжи S. cerevisiae является подходящей модельной системой для изучения различных аспектов человеческих белков через дополнения анализы, эктопические выражения, и функциональные анализы, даже если ортололожный дрожжевой ген не присутствует5, 6 , 7. Из-за эволюционного сохранения базальных компонентов транскрипционной системы8, многие человеческие TFs (когда эктопически выражается в дрожжевых клетках) может модулировать выражение гена репортера, действуя через промоутеров инженерии содержат соответствующие REs. Система транскрипционной модели, представленная здесь для человека P53, характеризуется тремя основными переменными, эффекты которых могут быть модулированы: 1) модальность выражения и тип P53, 2) re последовательность управления P53-зависимой транскрипции, и 3) тип ген репортера(рисунок 1A).

Что касается модальности выражения P53, S. cerevisiae позволяет выбирать индуцируемую, репрессивную или составную промоутеров9,10,11. В частности, индуцированный промоутер GAL1 позволяет базальный (используя раффиноз в качестве источника углерода) или переменной (путем изменения количества галактозы в средствах массовой информации) выражение TF в дрожжах. В самом деле, тонко настраиваемый выражение представляет собой критическое развитие для изучения не только P53 себя, но и другие белки семьи P5312,13.

Что касается типа REs, контролирующего P53-зависимое выражение, S. cerevisiae позволяет строить различные штаммы репортера, обладающие уникальными различиями в RE интереса в ином изогенном фоне. Эта цель достигается с помощью адаптации особенно универсальный подход к редактированию генома, разработанный в S. cerevisiae, называется delitto perfetto12,14,15,16.

Кроме того, различные гены репортеров (т.е. URA3, HIS3 и ADE2) могут быть использованы для качественной и количественной оценки транскрипционной деятельности человека TFs в S. cerevisiae, каждый с конкретными особенностями, которые могут быть адаптированы к экспериментальным потребностям17,18,19,20,21. Выражение этих генов репортера придает uracil, гистидин, и аденина прототрофии, соответственно. Репортер URA3 не позволяет рост клеток в присутствии 5-FOA, а также, и, таким образом, он может быть противопоставить. Система репортеров ADE2 имеет то преимущество, что, помимо выбора питательных веществ, она позволяет идентифицировать дрожжевые клетки, которые выражают дикий тип (т.е. функциональный на экспрессии ADE2) или мутант (т.е.не функциональный на ADE2 ) P53 из колонии цвета.

Например, дрожжевые клетки, выражающие ген ADE2, генерируют белые колонии нормального размера на пластинах, содержащих ограничивающие количества аденина (2,5-5,0 мг/л), в то время как те, которые плохо или не транскрибируют, появляются на той же пластине, что и меньший красный (или розовый) Колонии. Это связано с накоплением промежуточного в аденина биосинтетических пути (т.е. P-рибосиламино-имидазол, который ранее был назван амино-имидазол риботид или AIR), который преобразуется в форме красного пигмента. Качественный цвет на основе ADE2 репортер ген с тех пор был заменен на количественные Светлячок Photinus пиралис (LUC1)12,22. Совсем недавно репортер ADE2 был объединен с репортером лака в простой в оценке, полуколичественный, двойной репортер ассс, который может быть использован для подкласса класса P53 мутантов в соответствии с их остаточным уровнем функциональности 23.

Флуоресцентные репортеры, такие как EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) или DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), также использовались для количественной оценки трансактивационной активности, связанной со всеми возможными мутациями неправильности в TP53 последовательность кодирования24. Наконец, вероятность объединения настраиваемых промоутеров для экспрессии аллелей P53 с изогенными штаммами дрожжей, отличающимися для гена RE и/или репортера, привела к разработке матрицы данных, которая генерирует уточненную классификацию связанных с раком и зародышевых мутант P53 аллели25,26,27.

Описанные выше подходы используются для измерения транскрипционной активности белка P53. Тем не менее, выражение дикого типа P53 в дрожжах S. cerevisiae28 и Schizosaccharomyces pombe29 может вызвать замедление роста, которое было связано с арестом клеточного цикла28,30 или клеточная смерть31. В обоих случаях ингибирование роста дрожжей вызвано высоким выражением P53 и коррелирует с потенциальной транскрипционной модуляцией эндогенных дрожжевых генов, участвующих в росте клеток. Поддерживая эту гипотезу, потеря функции мутант P53 R273H не вмешиваться в рост дрожжевых клеток, когда выражается на аналогичных уровнях, как дикий тип P5332. И наоборот, выражение в дрожжах токсичного мутанта P53 V122A (известный более высокой транскрипционной активностью по сравнению с диким типом P53) вызвало более сильный тормозной эффект роста, чем дикий тип P5332.

Кроме того, было продемонстрировано, что человек MDM2 был в состоянии ингибировать человека P53 транскрипционной активности в дрожжах, способствуя его убиквиции и последующей деградации33. Соответственно, способность человека MDM2 и MDMX ингибировать P53-индуцированного ингибирования роста дрожжей было продемонстрировано32,34. В дополнительном исследовании, корреляция между P53 транскрипционной активности и уровней экспрессии актина была установлена, с определением предполагаемых P53 RE вверх по течению на гене ACT1 в дрожжах32. Последовательно, экспрессия актина была усилена диким типом P53 и тем более P53 V122A, но не мутантом P53 R273H. И наоборот, экспрессия действия P53 уменьшилась в со-присутствии ингибиторов P53 MDM2, MDMX, или пифитрин-З (маломолекулярный ингибитор транскрипционной активности P53), согласующиеся с результатами, основанными на оценке роста дрожжей. Важно отметить, что эти результаты установили корреляцию между P53-индуцированной ингибирования роста и степень его активности в дрожжах, который также был использован для выявления и изучения малых молекул, модулирующих Функции P5328,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов, содержащих конкретные RE (yAFM-RE или yLFM-RE)

  1. Полоса yAFM-ICORE или yLFM-ICORE штамм12,14 (ICORE I, ISce-I эндонуклеаз под GAL1 промоутер; CO - счетчик выбираемый URA3; RE - репортер KanMX4, дающий сопротивление канамицину; Таблица 1) из 15% глицерола, хранящегося при -80 градусах по Цельсию на агарной пластине YPDA(таблица 2). Дайте ему расти в течение 2-3 дней при 30 градусах Цельсия.
  2. Возьмите одну дрожжевую колонию из свежей тарелки (не более 3 недель) и поместите ее в небольшую колбу, содержащую 5 мл YPDA(Таблица 2). Инкубировать при 30 градусах Цельсия на ночь, встряхивая при 150-200 об/мин.
  3. На следующий день, чтобы удалить все следы декстроза, гранулы клетки в течение 2 мин на 3000 х г и отбросить супернатант путем инверсии трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все центрифугии в этом протоколе при комнатной температуре (RT).
  4. Приостановите действие клеточной гранулы в 30-50 мл предварительно разогретого СМ (полные носители), содержащего галактозу(таблица 2) и инкубировать 4 ч при 30 градусах Цельсия, встряхивая при 150-200 об/мин (необходимо для индукции I-SceI).
  5. Центрифуги клетки в течение 2 мин на 3000 х г и отбросить супернатант путем инверсии трубки.
  6. Приостановите действие клеточной гранулы в 30-50 мл стерильной воды. Повторите шаг 1.5.
  7. Отдохните ялку гранулы в 10 мл стерильной воды. Повторите шаг 1.5.
  8. Resuspend клеточной гранулы в 5 мл стерильных LiAcTE (Таблица 3), ионный раствор, который способствует поглощению ДНК. Повторите шаг 1.5.
  9. Приостановите действие клеточных гранул в 250 л стерильных LiAcTE и перенесите клетки в трубку 1,5 мл. Повторите шаг 1.5 и resuspend яблочная гранулы в 300-500 Л л стерильного LiAcTE.
  10. Во время стирает, денатурировать раствор 10 мг/мл лосося днк носителя спермы в течение 10 минут при 100 градусов по Цельсию и холод сразу на льду, чтобы сохранить его в качестве одноцепочечной ДНК.
  11. В отдельной трубке 1,5 мл добавьте 500 пикоолев желаемого олигонуклеотида(таблица 3), 5 л от вареного лосося, 300 л стерильной LiAcTE PEG (Таблица3), и 50 зл и суспензию дрожжевой клетки (от шага 1.9).
  12. Вихрь трубки для 10 с, чтобы смешать и инкубировать в течение 30 мин при 30 градусах Цельсия, встряхивая при 150-200 об/мин. Поместите 1,5 мл труб на стороне в пользу встряхивания.
  13. Тепло шокирует дрожжевые клетки в течение 15 мин при температуре 42 градусов по Цельсию в нагревательном блоке, затем центрифуги клетки на 20 с при 10000 х г. Удалите супернатант и resuspend клетки в 1 мл стерильной воды.
  14. Распространение 100 л клеточной подвески на агарной пластине YPDA и инкубировать (вверх ногами) в течение 1 дня при 30 градусах Цельсия. Для обеспечения хорошо разделенных колоний, а также распространение 100 зл 100 л 1:10 разбавления.
  15. На следующий день, реплики пластины с использованием стерильных бархатов на CM агар пластины, содержащие декстрозу и 5-FOA (Таблица 2). Рассмотрим вторую пластину реплики на новой пластине, если многие клетки передаются (т.е. некоторый рост URA3 клеток).
  16. Три дня спустя, реплики пластины на неселективных YPDA и YPDA, содержащий G418 (аминогликозид ный антибиотик похож на канамицин) агар пластины (Таблица 2), маркировка каждой пластины для облегчения их последующего сравнения. Инкубировать тарелки на ночь при 30 градусах Цельсия.
  17. На следующий день, определить кандидата репортер штаммов из колоний, которые G418 чувствительных, но растут на yPDA пластин (например, yLFM- или yAFM-RE колоний). Полоса выявленных колоний (3-6 колоний) на новой пластине YPDA, чтобы получить одну колонию изолятов и пусть они растут в течение 2 дней при 30 градусах Цельсия.
  18. Патч отдельных колоний дрожжей на пластине YPDA, чтобы изолировать колонии для дальнейшего анализа. После 24 ч при 30 градусах Цельсия, проверьте их, воспроизваясь на пластине агара YPGA(Таблица 2), которые предотвращают рост мелких мутантов (т.е. респираторно-дефицитных мутантов). В то же время, реплики пластины на новой пластине Агар YPDA.
  19. Проверьте правильные патчи (т.е. рост на агарных пластинах YPDA и YPGA; 1-3 колонии) со ступени 1.18 на наличие правильной интеграции олигонуклеотидов колонией ПЦР. Соберите реакционную смесь, добавив 5 qL 10x пЦР буфера (1,5 мМ MgCl2), 2 л из 10 пикомолей / Л праймеров (Таблица 3), 4 мЛ 2,5 мМ dNTPs, 0,25 л 5 U / L Taq полимеразы, и воды до окончательного объема 50 л. Умножьте реакционную смесь для количества дрожжевых колоний, которые должны быть проверены и aliquot 50 QL в каждой трубке ПЦР. Используя пипетку, добавьте очень небольшое количество дрожжевых клеток из агаровой пластины YPDA в единую реакционную смесь ПЦР.
  20. Выполните реакцию ПЦР со следующей программой: 94 кв. м в течение 8 мин, а затем 35 циклов денатурации в течение 1 мин при 94 градусах По Цельсию, грунтовки annealing в течение 1 мин при 55 градусах По Цельсию, и расширение в течение 2 мин при 72 градусах По Цельсию.
  21. После того, как реакция завершена, загрузите аликвот реакции ПЦР (около одной десятой объема) на гель агарозы, чтобы проверить правильный размер (500 bp) .
  22. Последовательность пЦР продукт после очистки с коммерческим комплектом, чтобы подтвердить интеграцию желаемой последовательности RE, используя те же грунтовки шаг 1.19.
  23. После проверки правильной последовательности, сделать 15% глицерол запас yAFM-RE или yLFM-RE деформации культуры (в YPDA) и хранить его при -80 градусов по Цельсию.

2. Оценка способности трансактивации белка P53 с использованием качественного анализа дрожжей ADE2 на основе цвета

  1. Повторите шаги 1.1 и 1.2 с помощью штамма yAFM-RE(таблица 1).
  2. На следующий день после, разбавить клеточной культуры (1:10) в 30-50 мл предварительно нагревается YPDA и продолжать инкубировать при 30 градусов по Цельсию, встряхивая до од600nm достигает 0,8-1,0 (2 ч).
  3. Повторите шаги 1.5-1.10.
  4. В отдельной трубке 1,5 мл добавьте 300-500 нг дрожжей P53 (или контроль) вектора экспрессии(Таблица 4), 5 л от вареного лосося, носителя ДНК спермы лосося, 300 л стерильной LiAcTE PEG, и 50 зл ел суспензии дрожжевых клеток.
  5. Повторите шаги 1.12 и 1.13, но resuspend клетки гранулы в 300 злител стерильной воды.
  6. Распространение 100 зл и суспензии клеток на синтетических селективных (для p53 выражения или контрольный вектор) пластин, содержащих декстрозу в качестве источника углерода и большое количество аденина(таблица 2), затем инкубировать (вверх ногами) при 30 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.
  7. Полоса одного дрожжей трансформаторов колоний (2-6 полос на тарелку) на новой селективной пластины и пусть они растут на ночь при 30 градусах Цельсия.
  8. На следующий день после, используя стерильные бархаты реплики пластины на новые селективные пластины, которые позволяют для оценки цвета фенотипа (т.е. пластины, содержащие декстрозу в качестве источника углерода, но ограничение количества аденина ; Таблица 2). Инкубировать тарелки вверх дном при 30 градусах по Цельсию в течение 3 дней. Дополнительно, чтобы оценить температурную чувствительность белка P53, инкубировать при трех различных температурах в течение 3 дней: 24 градуса по Цельсию, 30 градусов по Цельсию и 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна и та же полоса может быть реплики покрывало несколько раз.
  9. Чтобы оценить способность трансактивации белка P53, проверьте цветной фенотип дрожжевых колоний и сравните фенотип белка P53 по отношению к p53 дикого типа и пустых векторных фенотипов.

3. Оценка способности трансактивации белка P53 с использованием количественного люминесценции на основе LUC1 дрожжей анализ

  1. Преобразуйте дрожжевые клетки с помощью векторов экспрессии P53 (или управления)(Таблица4) с помощью метода, описанного в протоколе 2. Используйте штамм yLFM-RE(таблица 1).
  2. Патч одиночников трансформаторов на новой селективной пластины с большим количеством аденина, содержащего глюкозу в качестве источника углерода, и пусть они растут на 30 градусов по Цельсию в одночасье. Для каждого типа преобразования сделайте 5-7 различных патчей.
  3. После ночного роста, resuspend небольшое количество дрожжевых клеток, используя стерильные зубочистки или пипетки отзыв из пластины в синтетической селективной среде, содержащей декстрозу или раффинозу в качестве источника углерода (200 Л. окончательный объем в прозрачной пластине 96 хорошо, с круглым или плоское дно). Если эксперимент требует индуцируемого выражения P53, добавьте галактозу в раффинозу среды, чтобы модулировать уровень индукции(таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти суспензии клетки должны иметь OD600nm около 0.4 и не выше 1.
  4. Измерьте абсорбцию каждой скважины при ОД600нм после индуцируемого выражения P53 (4-8 ч при 30 градусах Цельсия при 150-200 об/мин) с помощью многофункционального считывателя пластин. Убедитесь, что клеточные суспензии однородны, смешивая каждый колодец с многоканальной пипеткой.
  5. Перенесите 10-20 злиц яточной суспензии из прозрачной пластины 96 скважин в белую 384 (или 96) скважину и смешайте с равным объемом (10-20 л) буфера из лиза. Инкубировать в течение 10-15 мин на RT на шейкере (150-200 об/мин) для достижения пермяки клетки в субстрат люциферазы.
  6. Добавьте 10-20 л субстрата Светлячок люциферазы и измерьте световые единицы (LU) спомощьим пластины с несколькими этикетками.
  7. Чтобы определить способность трансактивации белка P53, нормализуем ЛЮ каждого колодца до соответствующего OD600nm (относительная световая единица, RLU). Рассчитайте средний RLU и стандартное отклонение от 3-4 участков дрожжевых колоний трансформаторов.
  8. Сравните данные трансактивации белка P53 по отношению к дикому типу P53 и пустому вектору, либо путем вычитания значений, полученных с пустым вектором, либо путем деления на значения, полученные с пустым вектором (т.е. вычислительной складкой индукции).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансактивационная активность P53 может быть также оценена с помощью той же экспериментальной настройки в присутствии взаимодействующих С53 белков (т.е. MDM2 и MDMX) и/или включая медикаментозное лечение.

4. Оценка ингибирования роста белка P53 с использованием фенотипического анализа дрожжей

  1. Преобразуйте дрожжевые клетки с помощью векторов экспрессии P53/MDM2/MDMX (или управления)(таблица4) с помощью метода, описанного в разделе 2. Используйте штамм CG379 (Таблица 1) и распространение дрожжей трансформаторов на минимальных селективных пластин (Таблица2).
  2. Выращивайте преобразованные клетки в минимальной селективной среде(таблица 2) примерно до 1 OD600nm.
  3. Разбавлять дрожжевые клетки до 0,05 OD600nm в селективной индукционной среде(Таблица2), и дополнительно, добавить выбранную небольшую молекулу в соответствующую концентрацию (или только растворитель), чтобы проверить его эффективность в реактивации мутантА P53 или в ингибировании MDM2- /MDMX-P53 взаимодействий.
  4. Инкубировать клетки при 30 градусах Цельсия при непрерывной орбитальной встряхивания (200 об/мин) примерно 42 ч (время, требуемое отрицательными дрожжами управления, достигает средней фазы, около 0,45 OD600nm).
  5. Пятно 100 qL aliquots дрожжевых клеточных культур на минимальных селективных пластин(Таблица 2).
  6. Инкубировать в течение 2 дней при 30 градусах Цельсия.
  7. Измеряйте рост дрожжей, подсчитывая количество колоний, полученных в 100 сбросах культуры (подразделение по формированию колонии, cFU). Например, вычислить эффект реактивации мутантов соединений с учетом роста дикого типа P53, выражающих дрожжи как максимальновозможный эффект (установленный на 100%), в то время как рост клеток, выражающих мутант P53 (но подверженный контролю растворителя) представляет нулевой уровень реактивации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов

Delitto perfettoapproach12,14,15,16 был адаптирован для строительства P53 репортер штаммов дрожжей (рисунок1B). Метод использует одно- или двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие, на обоих концах, по крайней мере 30 нуклеотидов гомологичных к выбранному локусу интеграции. В частности, гомология соответствует последовательностям, обрамляющим место интеграции двойной маркерной кассеты ICORE, содержащей KlURA3 и kanMX4 (ген репортера, обеспечивающий устойчивость к генетике, G418), ранее позиционировалась на желаемый целевой участок15,16. Эта кассета также содержит дрожжи I-SceI эндонуклеазы кодирования последовательности, под индуцированным GAL1 промоутер и его cognate целевой сайт. Таким образом, переключатель в галактозы, содержащей среду прямо перед преобразованием дрожжевых клеток с желаемой последовательности приводит к i-SceI выражение и последующее поколение одного двухструйного перерыва (DSB) на месте интеграции ICORE. Наличие DSB сильно стимулирует частоту таргетинга событий, с более чем 1000 замен, полученных с одной трансформации.

В конце процесса таргетинга и отбора, основанного на приобретенном сопротивлении 5-FOA и чувствительности к G418, клоны-кандидаты подтверждаются усилением пЦР на основе доработанных локусов и секвенирования Сэнгера для проверки правильной интеграции желаемый P53 RE(Рисунок 1C). В конце протокола строительства штамма, который может быть завершен примерно через неделю, получается группа изогенных репортуционных штаммов дрожжей, которые могут быть использованы для оценки того, как различия в последовательности REs влияют на трансактивационную способность P53 Белка.

Функционально неоднородный мутант P53s

В человеческих опухолях ген TP53 в основном подвержен одноразовым мутациям, которые обычно связаны с шестью основными остатками горячих точек (R175, G245, R248, R249, R273 и R282), расположенными в центральном ДНК-связывающем домене (DBD) белка P53. Тем не менее, более 2000 одного P53 аминокислотные замены были зарегистрированы, в том числе некоторые, которые редко наблюдаются27. Мутант Ы53 можно классифицировать как контакт ДНК или структурные мутанты, в зависимости от влияния аминокислотной замены на контакт ДНК-белка (например, R273H) или белковую структуру (например, R175H)36. Одноместные мутации TP53 влияют на функции P53, создавая широкий спектр функционального разнообразия, которое может влиять на важные клинические особенности, такие как агрессивность опухоли, химио-резистентность и метастатический потенциал37, 38 , 39.

Концепция, что мутанты P53 являются функционально неоднородными четко возникла в последние 15 лет через большое количество экспериментальных данных, доступных в базах данных мутаций TP53 (например, lt;p53.free.fr//)gt;)27. Разработаны различные функциональные анализы, основанные на дрожжах и/или системах репортеров млекопитающих, подчеркивающие различные свойства мутантов P53s (т.е. трансактивация, чувствительность к температуре, доминирующий отрицательный потенциал, помеха с члены семьи P53 и взаимодействия с другими TFs)13,24,40,41,42,43,44. Наиболее полное функциональное исследование рассмотрели более 2300 мутантов в дрожжей на основе исследования, характеризуя их трансактивации деятельности по отношению к восьми различных P53 REs24.

Данные подтвердили, что почти все мутанты P53s, связанные с остатками горячих точек, являются убыточными (т.е. они полностью потеряли трансактивационную активность). И наоборот, мутант Ы53, которые поражают другие позиции белка P53 и, как правило, встречаются при умеренной-низкой частоте при раке45 являются частичной функцией мутантов, которые сохраняют определенный уровень трансактивации активности на P53 REs13, 17. Пример использования ADE2 анализ для изучения описанных белков P53 функциональной неоднородности представлен на рисунке 2A. В самом деле, в то время как R175H является потерей функции мутанта производства красных колоний в каждом условии испытания, R282W показал чувствительность температуры, которая была более очевидной с помощью галактоза-зависимых P53 выражение (т.е., красный сектор при 37 градусов по Цельсию в Штамм P21-5' RE в пластина, содержащая нижнюю галактоза, которая становится розовой в более высокой пластине галактоза). Рисунок 2B представляет собой сводку результатов для расширенной панели мутантов P53 и репортирующих штаммов.

Существование этой функциональной неоднородности P53 побудило исследование того, соответствует ли такая неоднородность неоднородности клинической жизни у субъектов с зародышевыми мутациями TP53. Мутации зародышевой линии TP53 лежат в основе молекулярной основы группы нарушений предрасположенности к раку, включая более тяжелые синдромы Ли-Фраумени (LFS) и Li-Fraumeni (LFL), а также менее тяжелые несиндромные предрасположенности с (FH) или без (нет FH) семейная история46.

Протокол подчеркнул генотип-фенотип корреляции путем сопоставления дрожжей анализ основе трансактивации способности всех TP53 зародышевых мутантов аллелей с соответствующими клиническими данными из базы данных IARC lt;http:///www-p53.iarc.fr/Germline.html; Потеря функции P53 мутантов были найдены в более тяжелых синдромов склонности рака, в то время как частичная функция P53 мутантов была обнаружена в менее тяжелых условиях склонности рака. Это указывает на то, что способность p53 остаточной трансактивации влияет на клинический фенотип у пациентов, унаследовавших мутации TP53 и развившегося рака25,26.

Нуклеотидные последовательности вариаций в REs регулируют P53 трансактивационный потенциал

Человек P53 является тетрамерией (димер димеров) TF. Каждый P53 dimer распознает RE, состоящий из 10 нуклеотидов (RRRCWWGYYY, R q a или G; W или T; Y q C или T)47,48. Два таких полуучастка могут быть либо примыкающими к ним, либо расположенными друг от друга до 13-20 нуклеотидов, что является функциональным P53 RE. Тем не менее, P53 REs с spacer характеризуются более низким p53 сродство и трансактивации, чем P53 REs без spacer49,50, в различных функциональных анализов из различных систем.

Недавно было продемонстрировано, что половина сайтов может набирать P53 тетрамеры, которые связаны hemispecifically51, наряду с функциональными анализы и хроматин иммунопрецистицитов исследований, эти выводы показывают, что P53 может также действовать на неканонических REs, состоит из полусайтов и трех четвертей сайтов48,52. Кроме того, тот факт, что полный консенсус P53 RE мотив очень вырожденный (RRRCWWGYYY)2 предвосхищает возможность того, что отдельные REs может существенно отличаться по последовательности и связывания сродства. Учитывая, что сотни генов-мишеней P53 были идентифицированы в геноме человека41,48, практически все P53 REs показали неидентичную последовательность между собой. Кроме того, было гипотеза, что REs с четкой сродства связывания ДНК выбраны в промоутеров P53 целевых генов, участвующих в остановке клеточного цикла или апоптоза53.

Анализ на дрожжах многих вариантов P53 RE в постоянном геномном месте установил влияние нуклеотидных вариантов, прокладки и организации полулокаций RE на трансактивационную мощность49. Это даже привело к открытию полиморфных P53 REs с двумя аллелями заметно отличается в отзывчивости связанного промоутера p5314,54,55. В последнее время информация, полученная из p53 RE функции последовательности и дрожжей на основе трансактивации потенциал был закодирован в p53 retriever, алгоритм поиска шаблонов, который способен локализовать и ранжировать как канонические и неканонические REs, в соответствии с их предсказал трансактивации потенциалов по всему геному человека52.

В качестве примера использования анализ для изучения последовательности конкретных P53 трансактивации потенциал, представленный здесь сравнение между человеком дикого типа P53 и эволюционным далеким протеином P53 от Caenorhabditis elegans (Рисунок 3). Эти результаты являются продолжением недавнего исследования, в котором эволюционное расхождение трансактивации специфичность среди белков P53 был изучен56. Изогенные штаммы репортеров yLFM-RE были разработаны, как описано в протоколе. В частности, Были сравнены Cep-1 P53 RE, полученные из гена ced13 57,и четыре варианта (V1-V4). Варианты RE были построены для изучения воздействия различной длины прокладки, которая отделяет два декамерикических мотивов (которые в ced13, имеет 28 нуклеотидов) и для изучения изменений в нуклеотидах, обрамляющих основной мотив CWWG (который в ced13, являются A/T богатыми; в то время как в самом высоком сродстве человека P53 REs, являются G / C богатых)58. Результаты ясно показывают, как Cep1 и человека P53 расходятся с точки зрения трансактивации специфики. В самом деле, в то время как человек P53-опосредованных трансактивации сильно тормозится наличием прокладки(Рисунок 3B), Cep-1 деятельность тормозится удалением прокладки (Рисунок3C). Кроме того, Cep-1-опосредованные трансактивации отменяется, когда RE модифицируется из A / T- в G / C-богатых. Ни человек P53, ни Cep-1 не могут трансактивироваться из одного декамира, полученного из ced13 RE.

Поиск малых молекулных разрушителей взаимодействий P53-MDM2/MDMX и реактиваторов активности мутантов P53

Установленная корреляция между ингибирующим эффектом роста человека P53 и степенью его активности в дрожжах привела к упрощенному скрининговому анализу на основе измерений роста дрожжевых клеток для анализа влияния факторов вмешательства на активность P53 (Рисунок 4 ). Эффективность дрожжевого фенотипического асссиса для проверки потенциальных противоопухолевых агентов была продемонстрирована в нескольких работах. Использование дрожжевых клеток совместного выражения P53 и его ингибиторы MDM2 и / или MDMX, новые разрушители этих взаимодействий были определены их способность подавлять негативное влияние MdMs на P53, тем самым восстанавливая дикий тип P53 индуцированных дрожжей ингибирование роста / Рисунок 4A). В частности, этот ассеа привел к открытию 1) пираноксантона 1 в качестве первого ингибитора взаимодействия P53-MDM2 с ксантиноновый эшафот34 и 2) ингибиторы oxazoloisoindolinone взаимодействия P53-MDM259. Кроме того, с этим анализом, мангостин и гамбогиновая кислота были впервые описаны в качестве потенциальных ингибиторов взаимодействия P53-MDM230.

Позже, тот же вывод продемонстрировал, что prenylation чалконей повысили их способность нарушать взаимодействие P53-MDM260. Интересно, что этот дрожжевой асса также привел к открытию двух ингибиторов взаимодействий P53-MDM2/MDMX: триптофанола, полученных оксазолопиридон лактамОК ОКСАЗ-161 и триптофанол производные оксазоолизоиндолин DIMP53-162.

Снижение воздействия потери функции мутанта P53 на рост дрожжевых клеток также были изучены для проверки мутантов P53-реактивирующих препаратов, характеризуется способностью восстановить дикий тип типа реакции роста ингибиторной активности мутант А53 (Рисунок 4B). С этим дрожжевой асссе, реактиватор мутанта P53 R280K, enantiopure триптофанол полученных оксазолосоинолинон SLMP53-163, был определен. Рисунок 4C,D показывает репрезентативные результаты, полученные в дрожжах с выражением P53 или лечения с ингибитором взаимодействия P53-MDM2 Nutlin-3a или с реактиватором P53 мутант Y220C PhiKan083.

Проверка молекулярного механизма действия этих соединений в виде P53-активирующие вещества, а также их противоопухолевой активности, как в линиях опухолевых клеток человека34,60,61,62,63 и животных моделей62,63, свидетельствует о большой потенциал дрожжей фенотипический анализ в открытии наркотиков.

Figure 1
Рисунок 1 : Особенности дрожжей на основе P53 трансактивации анализы и рабочий процесс для строительства P53 репортер дрожжей штаммов. (A) Легкость манипуляции генома и контролируемое экспрессия генов эктопического делает дрожжи сродни "in vivo пробирке", в которой тщательно изучены несколько переменных, имеющих отношение к изучению функций трансактивации P53. Эти переменные включают уровни экспрессии белка дикого типа или мутанта P53, последовательность RE и тип гена репортера «качественный/полуколичественный(например, ADE2 и LAC)или количественные (например, LUC1) Последовательность консенсуса RE сильно выродилась (RE - RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R и пурина; W и A/T; Y й пиримидин; CWWG - CORE последовательность, n - 0-13 б.п. Количество несоответствий по отношению к консенсусу, последовательности CORE и количеству прокладок базовых пар будет влиять на активность трансактивации. Эта панель была изменена из предыдущей публикации64. (B) Схема delitto perfetto подход ввести желаемый P53 RE вверх по течению от минимального промоутерв вождения ADE2 или LUC1 репортер аген выражения. Протокол был адаптирован из предыдущих публикаций12,15,16. (C) Пример результатов дрожжевой колонии ПЦР усиления региона, окружающего олиго RE интеграции сайта. Изображение электрофореза представляет собой результат усиления двух прогнозных положительных колоний (URA3 минус и G418 чувствительных) с соответствующим пЦР отрицательный контроль рядом с 1 кБ ДНК лестницы (Promega). Диапазон 500 nt, ожидаемый с помощью праймеров, описанных в таблице 3, может быть секвенирован для подтверждения правильного редактирования промоутера, как показано на электроферограмме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Белки P53 показывают потенциал трансактивации RE-специфического и чувствительного к температуре. Дикий тип P53 и указанные мутации TP53 были протестированы с помощью качественного цветового репортирующего анализа на дрожжах и эксплуатации штаммов репортеров, которые питают различные P53 REs, контролирующие экспрессию гена ADE2. (A) Пример фенотипа цвета колонии для P53 дикого типа, R175H и R282W с PUMA (BBC3) и P21-5' REs при 30 и 37 C показано. Сравнивается умеренное (0,008% галактоза) и высокое (0,12% галактоза) P53 выражение. (B) Результаты, полученные с расширенным набором P53 мутантов и дрожжевых штаммов репортер рассмотрены для P53-зависимых колонии цвет фенотипа при трех температурах (24 градуса по Цельсию, 30 градусов по Цельсию, и 37 градусов по Цельсию). Результаты иллюстрируют функциональную неоднородность аллелей мутантов P53 и обобщаются в формате таблицы. Например, R175H является нефункциональным мутантом, в то время как G199H является диким типом P53-как. K139E и R282W сохраняют частичную функцию и обладают холодной чувствительностью и теплочувствительностью, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Человек P53 и зачисленных ортодок Cep-1 экспонат весьма расходятся трансактивации специфики. (A) Последовательности: человек P53 RE консенсус последовательности, Cep-1 P53 RE, полученных от гена ced13, и четыре варианта (V1-V4), которые были протестированы в функциональных анализов. (B) Трансактивация была измерена после индуцирования человека P53 выражение для 8 ч с помощью трех различных источников углерода для достижения низкой, умеренной и высокой экспрессии (0,008%, 0,032%, 0,12% галактозы добавил к селективной среде, содержащей 2% рафинозы). Результаты выражаются как средние относительные единицы света (RLU) и стандартная ошибка четырех репликатов. Активность репортера для ячейки, преобразованной с пустым вектором выражения, была вычтена. (C) Трансактивация специфичность Cep1, как измеряется в (B). Для обоих белков уровни трансактивации были пропорциональны количеству галактоза. Более высокие единицы света, измеренные при выражении человека P53, могут зависеть от различных уровней производимых белков, из-за разницы в длине белка и, возможно, также в использовании кодона. Эти два белка характеризуются различной специфичностью трансактивации по отношению к различным испытаниям REs, и на это свойство не влияют возможные различия в относительном количестве белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Малые молекулы активаторы P53 определены с помощью дрожжевого фенотипического асссе. (A) Дрожжевые клетки, совместно выражающие человеческий дикий тип P53 и MDM2 или MDMX, были использованы для поиска ингибиторов взаимодействий P53-MDM2 и P53-MDMX. В этой системе ингибиторы взаимодействия восстанавливают ингибирование роста дрожжей, индуцированного P53, в дрожжевых клетках, совместно выражающих P53 и MDM2 или MDMX. Такой подход позволил выявить ингибиторы взаимодействия P53-MDM2 и определить двойные ингибиторы взаимодействий P53-MDM2 и P53-MDMX. (B) Дрожжевые клетки, выражающие человеческий мутант P53, были использованы для поиска мутантных реактиваторов P53 и способны восстановить ингибирование роста дрожжей, индуцированного с диким типом P53, в мутантных дрожжевых клетках. (C) Репрезентативные изображения анализ пятна пластины, показывающие влияние дикого типа P53 или мутанта Y220C на рост дрожжевой колонии по сравнению с пустым вектором (см. шаг 4.5). (D) Количественные результаты исследования роста: 10 мкм Nutlin-3a восстанавливает ингибирование роста дрожжей P53 в клетках, совместно выражающих МДМ2; 50 мкм PhiKan083 восстанавливает дикий тип типа P53 индуцированного ингибирования роста дрожжей мутант P53 Y220C. Оба эффекта построены относительно ингибирующего эффекта роста дрожжей дикого типа P53, который был установлен как один. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Название и генотип Конкретное использование Номер протокола
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 Используется для строительства штамма yAFM-RE (MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2), который используется в качественном, цветном анализе ADE2. Протоколы 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1:LUC1 Используется для строительства штамма yLFM-RE (MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1), который используется в количественном luminescence основе LUC1 асссе. Протоколы 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 «Кил-О» Он используется для фенотипического роста асссе. Протокол 4

Таблица 1: Дрожжи.

Название сми и рецепт Конкретное использование Номер протокола
YPDA (2% дрожжевого экстракта, 2% пептон, 2% декстроза, 200 мг/л аденина) 2% агара YPDA без агара стерилизовать предпочтительно путем фильтрации. YPDA - агар стерилизован путем автоклавирования; можно опустить деэкстрозу из рецепта и добавить декстрозу из 20% фильтра стерилизованного раствора в воде перед заливкой пластин. Протоколы 1-4
CM 0.17% Дрожжевой азотной базы без АА и сульфата аммония, 0,5% Сульфат аммония, 5% (объем/объем, v/v) несущественный аминокислотный раствор, 20 мг/л гистидин, 20 мг/л триптофан, 20 мг/л uracil, 30 мг/л лизина, 100 мг/л лейцин, 200 мг/л аденин 2% галактоза Средства массовой информации стерилизованы путем фильтрации. Следующие стерильные стоковые растворы готовятся в воде (за исключением урацила, который растворяется в 0,1 М/ НаУХ) путем фильтрации: несущественный аминокислотный раствор (0,04% аргинин, 0,04% метионина, 0,06% изолейцина, 0,1% фенилаланина, 0,2% клейамик кислота, 0,2% аспарговая кислота, 0,3% валиновая, 0,4% threonine, 0,8% серин, 1% гистидин, 1% триптофан, 1% uracil, 1% лизин, 1% лейцин, 0,5% аденина, 20% галактозы. Раствор аденина не должен храниться в холодильнике из-за образования и осадка кристаллов. Триптофан фондовый раствор должен храниться в темноте. Протокол 1
CM (см. выше) 2% Декстроза 1г/L 5-FOA 2% агар Средства массовой информации (содержащие дрожжевой азотной базы без АА и аммония сульфат, аммоний сульфат и агар) стерилизованы путем автоклавирования. Другие компоненты добавляются после автоклавирования для сохранения тепло-лабильных ингредиентов; 5-FOA порошок может быть добавлен непосредственно в средствах массовой информации, как только он остыл до около 55 градусов по Цельсию. Протокол 1
YPDA - 400 мкг/мл G418 и 2% агар G418 должны быть добавлены после автоклавирования, как только средства массовой информации остыли примерно до 55 градусов по Цельсию. Если начать с порошка, 50 мг/мл G418 бульонный раствор может быть подготовлен в воде и стерилизована фильтрацией. Протокол 1
YPGA 2% дрожжевого экстракта, 2% пептон, 2% глицерол (v/v), 200 мг/л аденина 2% агара Средства массовой информации стерилизованы путем автоклавирования. Протокол 1
Синтетическая селективная пластина: 0,17% Дрожжевой азотной базы без АА и сульфата аммония, 0,5% Сульфат аммония, 5% (v/v) несущественный аминокислотный раствор (0,04% аргинин, 0,04% метионин, 0,06% изолейцин, 0,1% фенилаланин, 0,2% глутамовая кислота, 0,2% аспарагиновая кислота threonine, 0,8% серина), 20 мг/л гистидина, 20 мг/л урацила, 20 мг/л триптофана (в зависимости от маркера выбора переносчика), 30 мг/л лизин, 100 мг/мл лейцин (в зависимости от маркера выбора переносчика), 5 мг/л или 200 мг/л. Средства массовой информации (содержащие дрожжевой азотной базы без АА и аммония сульфат, аммоний сульфат и агар) стерилизованы путем автоклавирования. Другие компоненты добавляются после автоклавирования для сохранения тепло-лабильных ингредиентов. При использовании векторов на основе pLS- и pLSG готовят пластины без лейцина. При использовании векторов на основе pTS- и pTSG готовят пластины без триптофана. Протоколы 2-3
Синтетические селективные носители: 0,17% Дрожжевой азотной базы без АА и сульфата аммония, 0,5% Сульфат аммония, 5% (v/v) несущественный аминокислотный раствор (0,04% аргинин, 0,04% метионин, 0,06% изолейцин, 0,1% фенилаланин, 0,2% глутамовая кислота, 0,2% аспагинная кислота молотина, 0,8% серина), 20 мг/л гистидина, 20 мг/л урацила, 20 мг/л триптофана (в зависимости от маркера выбора переносчика), 30 мг/л лизин, 100 мг/мл лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 200 мг/л аденина 2% декстетроза или рафиноса  Средства массовой информации стерилизованы с помощью фильтрации. При использовании pLS- или pTS основе векторов в лечении наркотиков подготовить средства массовой информации без лейцина или триптофан, соответственно, но содержащие 2% декстроза. При использовании pLSG- или pTSG основе вектора в индуцируемой p53 выражение с или без лечения наркотиками подготовить средства массовой информации без лейцина или триптофан, соответственно, но содержащие 2% рафиноза и переменное количество галактозы модулировать P53 выражение. Степень индукции P53 также может модулироваться путем изменения времени инкубации. Протокол 3
Минимальные селективные пластины: 2% глюкозы, 0,7% дрожжевой азотной базы (без аминокислот и сульфата аммония), 50 мг/л аденина, 50 мг/л хистидина, 50 мг/л триптофана (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переноса), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переноса), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина (в зависимости от маркера выбора переносчика), 50 мг/л лейцина ( маркер выбора переносчика), 2% агар Среда стерилизуется путем автоклавирования. При использовании pLS89 основе векторов подготовить среду без триптофан. Используйте pLS89-пустой вектор (не выражая никакого белка) в качестве отрицательного контроля. При использовании векторов pLS89 и pGADT7-MDM2 (совместное выражение P53 и MDM2) подготовьте среду без лейцина и триптофана. Используйте pLS89-пустой и pGADT7 (оба не выражая любого белка) в качестве отрицательного контроля. При использовании pLS76 на основе векторов подготовить среду без лейцина. Используйте вектор pRS315 (не выражая никакого белка) в качестве отрицательного контроля. Протокол 4
Минимальная селективная среда: как минимальные селективные пластины, но без агара Среда стерилизуется фильтрацией. Протокол 4
Селективная индукционная среда: как минимальная селективная среда, но содержащая 2% галактоза вместо глюкозы Среда стерилизуется фильтрацией. Протокол 4

Таблица 2:Дрожжи сми.

Имя решения и рецепт или имя и последовательность грунтовки Специфические особенности и использование Номер протокола
LiAc/TE: 10 мм Tris-HCl, pH 8.0, с 1 мМ EDTA и 0.1M литий-ацетат Следующие стерильные стоковые растворы в воде готовятся путем автоклавирования: 1M Lithium acetate pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE буфер 10X). Протоколы 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% Полиэтиленгликоль (PEG) в 10 мм Tris-HCl, pH 8.0, с 1 мМ EDTA и 0.1 M литий-ацетат Следующие стерильные стоковые растворы в воде готовятся путем автоклавирования: 1 M Lithium acetate pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE буфер 10X), 50% PEG (молекулярный вес 3350). Протоколы 1-4
Гомология хвосты для RE олигонуклеотидов:
5'-gcggaattgactttctttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggtgtatatatagcgtgg-3'
При условии, последовательность хвостов гомологии, соответствующие хромосомных последовательностей фланговых интегрированной кассеты ICORE; RE и RE последовательность. Протокол 1
Праймеры: Ade2 Fw: 5'-AAGTTTCCTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTCTGCCAACCGAA-3'
Для штамма yAFM-RE (PCR и sequencing) смешайте Ade2 Fw с Ade2 Rv primer. Для штамма yLFM-RE (PCR и sequencing) смешайте Ade2 Fw с Primer Luc1-Rv. Протокол 1

Таблица 3: Решения и олигонуклеотиды.

Типы векторов Положительный и отрицательный контроль Номер протокола
Векторы P53 (или управления).
pLS- или pLSG-на основе: P53 выражение белка под составным промоутером ADH1 или галактозы индуцируемого GAL1 промоутер, соответственно (LEU2 в качестве маркера выбора).
pTS- или pTSG-основано: Выражение протеина P53 под constitutive промоутерadh1 или промоутерgala galctose индуцируемое GAL1, соответственно (TRP1 как маркер выбора)
pLS- и pLSG на основе: использование в качестве положительного контроля pLS76 и векторов pLSG-P53 (выражение дикого типа P53), соответственно; использовать в качестве отрицательного контроля pRS315 вектор (не выражая любой белок).
pTS- и pTSG-based: использование в качестве положительного контроля векторах pTS76 и pTSG-P53 (выражение дикого типа P53), соответственно; использовать в качестве отрицательного контроля pRS314 вектор (не выражая любой белок).
Протокол 2,3
Векторы P53 и MDM2 (или управления).
pLS89 на основе: дикий тип P53 выражение белка под галактозой индуцируемого GAL1 промоутер (TRP1 в качестве маркера выбора).
pLS76 на основе: мутант P53 выражение белка под составным промоутером ADH1 (LEU2 в качестве маркера выбора).
pGADT7 на основе: ВЫРАЖЕНИЕ белка MDM2 под составным промоутером ADH1 (LEU2 в качестве маркера выбора)
pLS89 на основе: использование в качестве положительного контроля вектора pLS89-P53 (выражение дикого типа P53); использовать в качестве отрицательного контроля pLS89-пустой (не выражая любой белок).
pLS76 на основе: использование в качестве положительного контроля pLS76-мутант P53 вектор (выражение мутанта P53); использовать в качестве отрицательного контроля pRS315 вектор (не выражая любой белок).
pGADT7: использование в качестве положительного контроля вектора pGADT7-MDM2 (выражение дикого типа MDM2); использовать в качестве отрицательного контроля pGADT7 вектор (не выражая какой-либо белок).
Протокол 4

Таблица 4: Векторы экспрессии дрожжей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Дрожжи на основе анализов оказались полезными для изучения различных аспектов функций белка P53. Эти анализы особенно чувствительны для оценки потенциала трансактивации P53 по отношению к вариантам целевых объектов RE, включая оценку функциональных полиморфизмов. Использование цветных репортеров, а также миниатюризация анализов люциферазы приводят к экономически эффективным и относительно масштабируемым анализам. Кроме того, тест на ингибирование роста потенциально поддается использованию в химическом библиотечном скрининге, автоматизируя количественную оценку жизнеспособности дрожжевых клеток путем измерения абсорбции. В то время как ограниченная проницаемость из-за клеточной стенки и действия транспортеров ABC считается ограничением в использовании дрожжей для скрининга наркотиков, генетические модификации для улучшения поглощения были успешно разработаны22,65.

По сравнению с млекопитающими на основе клеток анализ, дрожжи на основе P53 анализ может улучшить идентификацию прямых хитов, учитывая, что P53 изолирован от удивительной сложности кофакторов и сигнализации каскадных путей, которые модулируют свои функции в высших эукариот. Дрожжи на основе функциональных анализов также были частично успешными в мониторинге взаимодействия P53 с белкакометами (а именно MDM2 и MDMX22,32,33,34) и воздействие малых молекул (таких как Nutlin-3a) на этих взаимодействиях. Тем не менее, чувствительность и прогностические силы анализов на основе дрожжей для исследования перекрестного разговора между P53 и взаимодействующих белков может быть несколько ограничен, в зависимости от того, как эти взаимодействия in vivo зависят от посттрансляционных модификаций и видового сигнального каскада.

Описанные здесь системы могут быть легко адаптированы к другим TFs. Действительно, дрожжи функциональные анализы были разработаны для P53 связанных P63 и P73 белков42,49, а также членов nF-ЗБ семьи66,67 (или даже для некоторых homeobox и основные суглики петли-сhelix (bHLH) TFs68,69. Человеческие ядерные рецепторы также были выражены в дрожжах и доказали свою работу в качестве лиганд-зависимых, последовательность конкретных TFs70. Один ограничивающий фактор был определен в слабой способности некоторых млекопитающих трансактивации домена (TAD) взаимодействовать с дрожжевой базальной транскрипции машины8, недостаток, который может быть преодолен с помощью химерных конструкций, включая активные гетерологический TAD68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Европейский союз (FedER средств POCI/01/0145/FEDER/007728 через Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) и национальные фонды (FCT/MEC, Funda'o пара Ci'ncia e Tecnologia и Министерио да Эдукао э Ciincia) в соответствии с Соглашение о партнерстве PT2020 UID/Куи/50006/2019 и проекты (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Стипендии ФСТ: SFRH/BD/96189/2013 (С. Гомес). Эта работа была поддержана Компанией С. Паоло, Турин, Италия (проект 2017.0526) и Министерством здравоохранения (Проект 5x1000, 2015 и 2016; текущие исследования 2016). Мы глубоко благодарим д-ра Терезу Лопес-Ариас Черногорию (Университет Тренто, учебные лаборатории экспериментальных наук) за помощь в видеозаписи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics