Author Produced

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De bevinding dat het bekende zoogdier P53 eiwit kan fungeren als een transcriptiefactor (TF) in de gist S. cerevisiae heeft toegestaan voor de ontwikkeling van verschillende functionele assays om de effecten van 1) bindingsplaats te bestuderen [d.w.z., Response element (re)] sequentie varianten op P53 transactiveringsspecificiteit of 2) TP53 mutaties, co-uitgedrukt cofactoren of kleine moleculen op P53 trans activatie activiteit. Er zijn verschillende basis-en translationele onderzoekstoepassingen ontwikkeld. Experimenteel, deze benaderingen benutten twee belangrijke voordelen van het gist model. Aan de ene kant maakt het gemak van genoom bewerking een snelle constructie van kwalitatieve of kwantitatieve verslaggever systemen mogelijk door het exploiteren van isogene stammen die alleen verschillen op het niveau van een specifieke P53-RE om sequentie-specificiteit van P53 afhankelijke trans. Aan de andere kant maakt de beschikbaarheid van gereguleerde systemen voor buitenbaarmoederlijke P53 expressie de evaluatie van trans activatie mogelijk in een breed scala aan eiwit expressie. Beoordeeld in dit rapport zijn uitgebreid gebruikte systemen die zijn gebaseerd op Color reporter genen, Luciferase, en de groei van gist ter illustratie van hun belangrijkste methodologische stappen en kritisch beoordelen hun voorspellende vermogen. Bovendien kan de extreme veelzijdigheid van deze benaderingen gemakkelijk worden benut om verschillende TFs te bestuderen, waaronder P63 rooms en P73, die andere leden zijn van TP53 genfamilie.

Introduction

Transcriptie is een uiterst complex proces waarbij dynamische, ruimtelijke en temporele organisatie van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren voor de werving en modulatie van RNA-polymerasen op chromatine-gebieden in reactie op specifieke stimuli1 . De meeste TFs, met inbegrip van de menselijke P53 tumor suppressor, herkennen van specifieke CIS-Acting elementen in de vorm van DNA-sequenties genaamd Response Elements (REs), die bestaan uit enkele (of meerdere) unieke motieven ~ 6-10 nucleotiden lang. Binnen deze motieven kunnen individuele posities verschillende graden variabiliteit2vertonen, meestal samengevat op positie gewicht matrices (PWM) of logo's3,4.

De gist S. cerevisiae is een geschikt modelsysteem voor het bestuderen van verschillende aspecten van menselijke eiwitten door middel van complementatie assays, ectopische expressie en functionele assays, zelfs wanneer een ortholoog gist gen niet aanwezig is5, 6 , 7. vanwege het evolutionaire behoud van basale componenten van het transcriptionele systeem8, kunnen veel menselijke TFs (wanneer ectopisch uitgedrukt in gistcellen) de uitdrukking van een reporter-gen moduleren door te handelen via organisatoren die zijn ontworpen om passende REs bevatten. De transcriptie modelsysteem gepresenteerd hier voor menselijke P53 wordt gekenmerkt door drie belangrijke variabelen waarvan de effecten kunnen worden gedifferentieerd: 1) de modaliteit van expressie en type van P53, 2) de RE sequentie die P53-afhankelijke transcriptie bestuurt, en 3) het type Reporter gen (Figuur 1a).

Met betrekking tot de modaliteit van P53 uitdrukking, stelt S. cerevisiae de keuze van de niet-behoudende, onderdeelbare of constitutieve promotoren9,10,11toe. In het bijzonder, de induceerbare cytochromen GAL1 promotor maakt basale (met behulp van raffinose als een koolstofbron) of variabele (door het veranderen van de hoeveelheid galactose in de media) uitdrukking van een tf in gist. In feite vertegenwoordigt de fijnafstemmingen een kritische ontwikkeling voor het bestuderen van niet alleen P53 zelf, maar ook andere P53 familie eiwitten12,13.

Met betrekking tot het type van REs het beheersen van de P53-afhankelijke expressie, S. cerevisiae laat de bouw van verschillende reporter stammen bezitten unieke verschillen in de re van belang in een anders isogene achtergrond. Dit doel wordt bereikt door een aanpassing van een bijzonder veelzijdige genoom Editing aanpak ontwikkeld in S. cerevisiae, genaamd delitto perfetto12,14,15,16.

Bovendien kunnen verschillende reporter genen (d.w.z. URA3, HIS3 en ADE2) worden gebruikt om de transcriptionele activiteiten van Human TFs in S. cerevisiaekwalitatief en kwantitatief te evalueren, elk met specifieke functies die kunnen worden afgestemd op experimentele behoeften17,18,19,20,21. De uitdrukking van deze reporter genen kent respectievelijk uracil, histidine en adenine prototrofie. De URA3 reporter staat niet toe dat de groei van cellen in de aanwezigheid van 5-FOA ook, en dus het kan worden tegengeselecteerd. Het ADE2 reporter systeem heeft als voordeel dat, naast nutritionele selectie, het de identificatie mogelijk maakt van gistcellen die wild type uitdrukken (d.w.z. functioneel op ADE2 expressie) of Mutant (D.W.Z.niet functioneel op ADE2 ) P53 uit de kolonie kleur.

Bijvoorbeeld, gistcellen die het gen ADE2 uitdrukken genereren normaliter witte kolonies op platen met beperkende hoeveelheden adenine (2,5-5,0 mg/L), terwijl die die slecht zijn of niet transcriberen, op dezelfde plaat verschijnen als kleiner rood (of roze) Kolonies. Dit is te wijten aan accumulatie van een intermediair in de adenine biosynthetische Pathway (d.w.z. P-ribosylamino-imidazol, die eerder amino-imidazol ribotide of lucht genoemd is), die wordt omgezet in een rood pigment. Het kwalitatieve ADE2 reporter gen is sindsdien vervangen door de kwantitatieve Firefly Photinus lichtmot (LUC1)12,22. Meer recentelijk is de ADE2 reporter gecombineerd met de lacz reporter in een eenvoudig te scoren, semi-kwantitatieve, dubbele reporter assay die kan worden benut om P53 mutanten te classificeren op basis van hun rest niveau van functionaliteit 23.

Fluorescerende verslaggevers zoals EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) of dsred (discosoma SP. rood fluorescerende proteïne) zijn ook gebruikt voor de kwantitatieve evaluatie van de transactiveringsactiviteit in verband met alle mogelijke missense-mutaties in de TP53 Codeer volgorde24. Tot slot heeft de kans om tunable promotors te combineren voor P53 allel expressie met isogene giststammen die verschillen voor het re en/of reporter gen geleid tot de ontwikkeling van een data matrix die een verfijnde classificatie genereert van kanker-geassocieerde en kiembaan Mutant P53 allelen25,26,27.

De hierboven beschreven benaderingen worden gebruikt om de transcriptionele activiteit van het P53-eiwit te meten. Echter, de uitdrukking van wild-type P53 in de gist S. cerevisiae28 en schizosaccharomyces pombe29 kan leiden tot groeiachterstand, die is geassocieerd met celcyclus arrestatie28,30 of celdood31. In beide gevallen wordt de remming van de gist groei veroorzaakt door een hoge P53 expressie en gecorreleerd met mogelijke transcriptionele modulatie van endogene gist genen die betrokken zijn bij celgroei. Ter ondersteuning van deze hypothese, de verlies-van-functie Mutant P53 R273H niet interfereren met gist celgroei wanneer uitgedrukt op vergelijkbare niveaus als wild-type P5332. Omgekeerd veroorzaakte de uitdrukking in gist van de giftige Mutant P53 V122A (bekend voor een hogere transcriptionele activiteit in vergelijking met wild-type P53) een sterkere groei remmende werking dan wild type P5332.

Bovendien werd aangetoond dat Human MDM2 in staat was om de menselijke P53 transcriptionele activiteit in gist te remmen, de ubiquitinatie en daaropvolgende afbraak33te bevorderen. Dienovereenkomstig werd het vermogen van Human MDM2 en mdmx voor de remming van P53-geïnduceerde gist groeiremming aangetoond32,34. In een aanvullend onderzoek werd een correlatie tussen P53 transcriptionele activiteit en actine uitdrukkings niveaus vastgesteld, met de identificatie van een vermoedelijke P53 re stroomopwaarts op het ACT1 gen in gist32. Consequent, actine expressie werd versterkt door wild-type P53 en nog meer door P53 V122A, maar niet door Mutant P53 R273H. Omgekeerd daalde de actine expressie door P53 in de co-aanwezigheid van P53 remmers MDM2, MDMX of pifithrin-α (een kleine molecuul remmer van P53 transcriptionele activiteit), in overeenstemming met de resultaten op basis van de gist groei test. Belangrijk, deze resultaten vastgesteld een correlatie tussen P53-geïnduceerde groeiremming en de mate van haar activiteit in gist, die ook is uitgebuit om te identificeren en bestuderen van kleine moleculen modulerende P53 functies28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bouw van ADE2 of LUC1 reporter giststammen met een specifieke re (yafm-re of ylfm-re)

  1. Streak een yafm-icore of ylfm-icore stam12,14 (icore = i, ISCE-I endonuclease onder GAL1 promotor; CO = teller selecteerbaar URA3; RE = reporter KanMX4 het verlenen van kanamycine resistentie; Tabel 1) van een 15% glycerol bestand opgeslagen bij-80 °C op een YPDA agar plaat (tabel 2). Laat het groeien voor 2-3 dagen bij 30 °C.
  2. Neem één gist kolonie van de verse plaat (niet meer dan 3 weken oud) en plaats deze in een kleine kolf met 5 mL YPDA (tabel 2). Inincuberen bij 30 °C 's nachts, schudden bij 150-200 rpm.
  3. De volgende dag, om alle sporen van dextrose te verwijderen, pellet de cellen voor 2 min bij 3.000 x g en gooi de supernatant door inversie van de buis.
    Opmerking: Voer bij kamertemperatuur (RT) alle centrifugaties in dit protocol uit.
  4. Respendeer de celpellet in 30-50 mL voorverwarmde CM (complete media) met galactose (tabel 2) en inbroed voor 4 uur bij 30 °c, schudden bij 150-200 rpm (noodzakelijk voor de inductie van I-SCEI).
  5. Centrifugeer de cellen 2 min bij 3.000 x g en gooi het supernatant door de inversie van de buis.
  6. Respendeer de celpellet in 30-50 mL steriel water. Herhaal stap 1,5.
  7. Respendeer de celpellet in 10 mL steriel water. Herhaal stap 1,5.
  8. Respendeer de celpellet in 5 mL steriele LiAcTE (tabel 3), een Ionische oplossing die de DNA-opname bevordert. Herhaal stap 1,5.
  9. Respendeer de celpellet in 250 μL steriele LiAcTE en breng de cellen over in een buis van 1,5 mL. Herhaal stap 1,5 en rebreng de celpellet in 300-500 μL steriele LiAcTE.
  10. Tijdens de Wassers, denatureren een 10 mg/mL oplossing van zalm sperma DNA drager voor 10 min bij 100 ° c en chill onmiddellijk op ijs om het te behouden als één-streng DNA.
  11. Voeg in een aparte tube van 1,5 mL 500 picomoles toe van het gewenste oligonucleotide (tabel 3), 5 μl van het DNA van de gekookte zalm sperma drager, 300 μL steriele LIACTE Peg (tabel 3) en 50 μL van de suspensie voor gistcellen (vanaf stap 1,9).
  12. Vortex de buizen voor 10 s te mengen en inbroed gedurende 30 min bij 30 ° c, schudden bij 150-200 rpm. Plaats de 1,5 mL buisjes aan de zijkant om de gunst te schudden.
  13. Hitteschok de gistcellen gedurende 15 minuten bij 42 °C in een verwarmingsblok en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende 20 sec. bij 10.000 x g. Verwijder de supernatant en rebreng de cellen in 1 mL steriel water.
  14. Verdeel 100 μL van de celsuspensie op de YPDA agar-plaat en incuberen (ondersteboven) gedurende 1 dag bij 30 °C. Om ervoor te zorgen dat goed gescheiden kolonies worden verkregen, spreidt u ook 100 μL van een 1:10 verdunning uit.
  15. De volgende dag, replica plaat met behulp van steriele velvets op CM agar plaat met dextrose en 5-FOA (tabel 2). Overweeg een tweede replica plaat op een nieuwe plaat als veel cellen worden overgebracht (dat wil zeggen, sommige groei van URA3 cellen).
  16. Drie dagen later, replica plaat op niet-selectieve YPDA en YPDA met G418 (een aminoglycoside antibioticum vergelijkbaar met kanamycine) agar platen (tabel 2), het markeren van elke plaat om hun latere vergelijking te vergemakkelijken. Incuberen de platen 's nachts op 30 °C.
  17. De volgende dag, Identificeer de kandidaat reporter stammen uit kolonies die G418-gevoelig maar groeien op YPDA platen (bijvoorbeeld yLFM-of yAFM-RE kolonies). Streep de geïdentificeerde kolonies (3-6 kolonies) op een nieuwe YPDA plaat om enkele kolonie isolaten te verkrijgen en laat ze groeien voor 2 dagen bij 30 °C.
  18. Patch enkele gist kolonies op een YPDA plaat om de kolonies te isoleren voor verdere analyses. Na 24 uur bij 30 °C, test ze door replica plating op een YPGA agar plaat (tabel 2) die de groei van Petite mutanten (d.w.z. respiratoire-deficiënte mutanten) voorkomen. Op hetzelfde moment, replica plaat op een nieuwe YPDA agar plaat.
  19. Test de juiste patches (d.w.z. groei op YPDA-en YPGA-agar-platen; 1-3 kolonies) uit stap 1,18 voor de aanwezigheid van een juiste oligonucleotide-integratie door kolonie PCR. Monteer een reactiemix door 5 μL van 10x PCR-buffer (1,5 mM MgCl2) toe te voegen, 2 μl van 10 picomoles/μL primers (tabel 3), 4 μl 2,5 mm dntps, 0,25 μL van 5 U/μL Taq polymerase en water tot een eindvolume van 50 μL. Vermenigvuldig de reactiemix voor het aantal gist kolonies dat moet worden gescreend en aliquot 50 μL in elke PCR-buis. Voeg met behulp van een pipet een zeer kleine hoeveelheid gistcellen van de YPDA agar-plaat toe aan een enkele PCR-reactiemix.
  20. Voer de PCR-reactie uit met het volgende programma: 94 °C gedurende 8 minuten, gevolgd door 35 cycli denaturatie gedurende 1 minuut bij 94 °C, primers gloeien gedurende 1 minuut bij 55 °C en verlenging voor 2 minuten bij 72 °C.
  21. Nadat de reactie is voltooid, laadt u een aliquot van de PCR-reactie (ongeveer een tiende van het volume) op een agarose-gel om de juiste maat te controleren (~ 500 BP).
  22. Volg het PCR-product na zuivering met een commerciële Kit om de integratie van de gewenste RE-sequentie te bevestigen met behulp van dezelfde primers van stap 1,19.
  23. Na de validatie van de juiste volgorde, maak een 15% glycerol voorraad yAFM-RE of yLFM-RE stam cultuur (in YPDA) en opslaan bij-80 °C.

2. evaluatie van P53 eiwit transactiveringsvermogen met behulp van de kwalitatieve ADE2 gist assay op basis van kleur

  1. Herhaal de stappen 1,1 en 1,2 met behulp van de yAFM-RE stam (tabel 1).
  2. De dag daarna verdunt u de celkweek (1:10) in 30-50 mL voorverwarmde YPDA en blijft u door schudden tot 30 °C inbrokkelen tot de OD600nm 0,8-1,0 (~ 2 uur) bereikt.
  3. Herhaal stap 1.5-1.10.
  4. Voeg in een aparte 1,5 mL-buis 300-500 ng gist P53 (of controle) expressie vector (tabel 4), 5 μl van de gekookte zalm sperma-DNA drager, 300 μL steriele LIACTE PEG en 50 μL gist celsuspensie toe.
  5. Herhaal de stappen 1,12 en 1,13 maar hervat de celpellet in 300 μL steriel water.
  6. Verdeel 100 μL van de celsuspensie op synthetische selectieve (voor P53 expressie-of besturings vector) platen die dextrose als koolstofbron bevatten en een grote hoeveelheid adenine (tabel 2), en incuberen (ondersteboven) bij 30 °c gedurende 2-3 dagen.
  7. Streak enkele gist transformant kolonies (2-6 strepen per plaat) op een nieuwe selectieve plaat en laat ze groeien 's nachts op 30 ° c.
  8. De dag na, met behulp van steriele velvets replica plaat op nieuwe selectieve platen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de kleur fenotype (dat wil zeggen, platen met dextrose als koolstofbron, maar het beperken van de hoeveelheid adenine; Tabel 2). Inincuberen de platen ondersteboven bij 30 °C gedurende 3 dagen. Als u de temperatuurgevoeligheid van P53 eiwit wilt evalueren, inbroed dan bij drie verschillende temperaturen gedurende 3 dagen: 24 °C, 30 °C en 37 °C.
    Notes: dezelfde streak kan meerdere malen in een replica worden geplateerd.
  9. Voor het evalueren van het P53 eiwit transactiveringsvermogen, Controleer het op kleur gebaseerde fenotype van gist kolonies en vergelijk het P53 eiwit fenotype met betrekking tot P53 wild-type en lege Vector fenotypes.

3. evaluatie van P53 eiwit transactiveringsvermogen met behulp van de kwantitatieve luminescentie LUC1 gist assay

  1. Transformeer gistcellen met P53 (of Control) expressie vectoren (tabel 4) met behulp van de op Liac gebaseerde methode zoals beschreven in Protocol 2. Gebruik yLFM-RE stam (tabel 1).
  2. Patch enkele transformanten op een nieuwe selectieve plaat met de hoge hoeveelheid adenine bevattende glucose als de koolstofbron en laat ze groeien bij 30 °C 's nachts. Maak 5-7 verschillende patches voor elk transformatietype.
  3. Na nachtelijke groei, regenereren een kleine hoeveelheid gistcellen met behulp van een steriele tandenstoker of pipetpunt van de plaat in synthetische selectieve medium met dextrose of raffinose als de koolstofbron (200 μL eindvolume in een transparante 96 goed plaat, met een ronde of vlakke bodem). Als het experiment induceerbare cytochromen P53 expressie vereist, voeg galactose toe aan het raffinose medium om het inductie niveau te moduleren (tabel 2).
    Opmerking: deze celsuspensies moeten een OD600nm hebben van ongeveer 0,4 en niet hoger dan 1.
  4. Meet de extinctie van elk goed bij OD600nm na een Induceerbaar P53 expressie (4-8 h bij 30 °c met 150-200 rpm schudden) met behulp van een multilabel plaat lezer. Zorg ervoor dat de celsuspensies homogeen zijn door elke put te mengen met een meerkanaalspipet.
  5. Breng 10-20 μL celsuspensie van de doorzichtige 96 goed plaat over in een witte 384 (of 96) goed plaat en meng met een gelijk volume (10-20 μL) lysisbuffer. Inincuberen voor 10-15 min bij RT op een shaker (150-200 rpm) om permeabilization van de cel naar de plaats substraat te bereiken.
  6. Voeg 10-20 μL Firefly plaats substraat toe en meet de licht eenheden (LU) door een multi-label plaat lezer.
  7. Om P53 eiwit transactiveringsvermogen te bepalen, Normaliseer de LUs van elke put naar de corresponderende OD600nm (relatieve licht eenheid, rlu). Bereken de gemiddelde RLU en standaarddeviatie van 3-4 patches van gist transformant kolonies.
  8. Vergelijk de P53-eiwit transactiveringsgegevens met betrekking tot P53 wild-type en lege Vector, hetzij door de waarden die zijn verkregen met de lege Vector af te trekken of door te delen door de waarden die zijn verkregen met de lege Vector (d.w.z. computer vouw van inductie).
    Opmerking: de P53 trans activatie-activiteit kan ook worden geëvalueerd met dezelfde experimentele opstelling in de aanwezigheid van P53-interactie eiwitten (d.w.z. MDM2 en MDMX) en/of met inbegrip van medicamenteuze behandeling.

4. evaluatie van P53 eiwit groeiremming met behulp van de gist fenotypic assay

  1. Transformeer gistcellen met P53/MDM2/MDMX (of Control) expressie vectoren (tabel 4) met behulp van de op Liac gebaseerde methode zoals beschreven in punt 2. Gebruik de CG379 stam (tabel 1) en spreid gist transformanten op minimale selectieve platen (tabel 2).
  2. Groei getransformeerde cellen in minimaal selectief medium (tabel 2) tot ongeveer 1 od600nm.
  3. Verdun gistcellen tot 0,05 OD600nm in het selectieve inductie medium (tabel 2) en voeg desgewenst een gekozen kleine molecule toe aan de juiste concentratie (of alleen oplosmiddel) om de werkzaamheid ervan te testen bij het reactiveren van mutant P53 of bij het remmen van MDM2- /MDMX-P53 interacties.
  4. Incuberen cellen bij 30 °C onder continu orbitaal schudden (200 rpm) gedurende ongeveer 42 uur (tijd vereist door negatieve controle gist om de mid-log-fase te bereiken, ongeveer 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 μL aliquots van gist celculturen op minimale selectieve platen (tabel 2).
  6. Incuberen gedurende 2 dagen bij 30 °C.
  7. Meet de gist groei door het aantal kolonies te tellen dat is verkregen in de 100 μL kweek druppels (kolonie vormende eenheid, CFU tellingen). Bereken bijvoorbeeld het Mutante reactiverende effect van verbindingen gezien de groei van wild-type P53 die gist uitdrukken als het maximaal mogelijke effect (ingesteld op 100%), terwijl de groei van cellen die Mutant P53 (maar blootgesteld aan oplosmiddel controle) representeert het nulniveau van reactivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aanleg van ADE2 of een LUC1 reporter giststammen

Dedelitto perfettoapproach12,14,15,16 is aangepast om de bouw van P53 reporter giststammen mogelijk te maken (Figuur 1b). De methode maakt gebruik van enkelvoudige of dubbel-gestrande oligonucleotiden die, aan beide uiteinden, ten minste 30 nucleotiden homologe aan de gekozen locus van integratie bevatten. Specifiek, de homologie komt overeen met sequenties flaneren de plaats van integratie van de dubbele marker cassette ICORE, met de KlURA3 en kanMX4 (reporter gene die resistentie tegen Geneticin, G418) eerder gepositioneerd op de gewenste doellocatie15,16. Deze cassette bevat ook de gist I-SCEI endonuclease Codeer volgorde, onder de induceerbare cytochromen GAL1 promoter en zijn verwant target site. Daarom, een schakelaar in galactose-bevattende medium vlak vóór de transformatie van gistcellen met de gewenste volgorde resulteert in I-SceI expressie en de daaruit voortvloeiende generatie van een enkele dubbele strand break (DSB) op de site van ICORE integratie. De aanwezigheid van een DSB stimuleert de frequentie van targetinggebeurtenissen sterk, met meer dan 1.000 vervangingen die met één transformatie zijn verkregen.

Aan het einde van het targeting-en selectieproces op basis van verworven resistentie tegen 5-FOA en gevoeligheid voor G418, worden kandidaat-klonen bevestigd door kolonie PCR-gebaseerde versterking van de gemodificeerde Locus en Sanger-sequencing om de juiste integratie van de gewenste P53 RE (afbeelding 1c). Aan het einde van de stam bouw protocol, dat kan worden voltooid in ongeveer een week, een panel van isogene reporter giststammen worden verkregen die kunnen worden gebruikt om te evalueren hoe verschillen in de volgorde van de REs invloed op de trans activatie capaciteit van de P53 Eiwit.

Functioneel heterogene Mutant P53s

In menselijke tumoren wordt het TP53 -gen hoofdzakelijk beïnvloed door enkelvoudige missense-mutaties die in het algemeen zes belangrijke hotspot residuen (R175, G245, R248, R249, R273 en R282) bevatten die zich in het centrale DNA-bindende domein (DBD) van het P53 eiwit bevinden. Echter, meer dan 2.000 single P53 aminozuursubstituties zijn geregistreerd, waaronder sommige die zelden worden waargenomen27. Mutant P53s kan worden geclassificeerd als DNA-contact of structurele mutanten, afhankelijk van de effecten van aminozuur substitutie op het DNA-eiwit contact (bijv. R273H) of eiwitstructuur (bijvoorbeeld R175H)36. Single TP53 missense mutaties impact P53 functies, het genereren van een breed scala van functionele diversiteit, die belangrijke klinische kenmerken zoals tumor agressiviteit kan beïnvloeden, chemo-resistentie, en metastatische potentiaal37, 38 , 39.

Het concept dat mutanten P53 functioneel heterogeen zijn, is de afgelopen 15 jaar duidelijk naar voren gekomen door middel van een grote hoeveelheid experimentele gegevens die beschikbaar zijn in TP53 mutatie databases (bijv. < P53. free. fr//>)27. Verschillende functionele assays op basis van gist en/of zoogdier reporter systemen zijn ontwikkeld, waarbij de verschillende eigenschappen van mutanten P53s (d.w.z. Trans activatie, temperatuurgevoeligheid, dominant-negatieve potentiaal, interferentie met de leden van de P53 familie en interacties met andere TFs)13,24,40,41,42,43,44. De meest uitgebreide functionele studie onderzocht meer dan 2.300 mutanten in een gist-gebaseerde assay door hun transactiveringsactiviteit te karakteriseren naar acht verschillende P53 REs24.

De gegevens bevestigden dat bijna alle Mutante P53s met betrekking tot hotspot residuen verlies-of-functie zijn (d.w.z. dat ze de trans activatie activiteit volledig verloren hebben). Omgekeerd zijn Mutant P53s die andere posities van het P53 eiwit troffen en die over het algemeen bij een matige tot lage frequentie in kanker45 worden aangetroffen, gedeeltelijke functie mutanten, die een zekere mate van transactiveringsactiviteit op P53 REs13behouden, 17. een voorbeeld van het gebruik van de ADE2 assay om de beschreven P53 eiwitten functionele heterogeniteit te bestuderen, wordt weergegeven in Figuur 2a. Terwijl R175H een verlies-van-functie mutant is die rode kolonies produceert in elke geteste toestand, vertoonde R282W temperatuurgevoeligheid die duidelijker was met behulp van galactose-afhankelijke P53 expressie (d.w.z. de rode sector bij 37 °C in de P21-5 ' RE-stam in de plaat met een lagere galactose, die roze wordt in de hogere galactose plaat). Figuur 2b presenteert een samenvatting van de resultaten voor een uitgebreid panel van P53 mutanten en reporter stammen.

Het bestaan van deze P53 functionele heterogeniteit leidde tot verkenning van de vraag of een dergelijke heterogeniteit de heterogeniteit die op het klinische niveau bij proefpersonen met TP53 kiembaan mutaties werd waargenomen, parallel zou brengen. TP53 kiembaan mutaties ten grondslag liggen aan de moleculaire basis van een groep van kanker predispositie stoornissen, met inbegrip van de meer ernstige Li-fraumeni (LFS) en Li-fraumeni-achtige (LFL) syndromen, en de minder ernstige niet-syndromic predisposities met (FH) of zonder (geen FH) familiegeschiedenis46.

Het protocol benadrukte genotype-fenotype correlaties door de op gist assay gebaseerde transactiveringscapaciteiten van alle TP53 kiembaan Mutant allelen met bijbehorende klinische gegevens uit de IARC database te matchen < http://www-p53.IARC.fr/germline.html >. Verlies van functie P53 mutanten zijn gevonden in meer ernstige kanker aanleg syndromen, terwijl gedeeltelijke functie P53 mutanten is gevonden in minder ernstige kanker aanleg voorwaarden. Dit geeft aan dat P53 residuele trans activatie vermogen van invloed is op klinisch fenotype bij patiënten die TP53 mutaties hebben geërfd en kanker hebben ontwikkeld25,26.

Nucleotide sequenties variaties binnen REs beheersen P53 potentieel voor trans activatie

Human P53 is een tetramere (dimer van dimers) tf. Elke P53 dimeer herkent een RE bestaande uit 10 nucleotiden (RRRCWWGYYY, R = A of G; W = A of T; Y = C of T)47,48. Twee van dergelijke halve locaties kunnen ofwel aangrenzend of verdeeld worden door maximaal 13-20 nucleotiden, die een functioneel P53 RE vormen. Niettemin, P53 res met een spacer worden gekenmerkt door een lagere P53 affiniteit en trans activatie dan P53 REs zonder een spacer49,50, in verschillende functionele assays uit verschillende systemen.

Het werd onlangs aangetoond dat halve sites P53 tetramers die gebonden zijn hemispecifiek51, samen met functionele testen en Chromatine immunoprecipitatie studies kunnen rekruteren, deze bevindingen geven aan dat P53 ook op niet-canonieke REs kan handelen, bestaande uit halve locaties en driekwart sites48,52. Bovendien is het feit dat het volledige consensus P53 RE-motief zeer ontaarden is (RRRCWWGYYY)2 voor de mogelijkheid dat individuele REs aanzienlijk kunnen verschillen in volgorde en bindende affiniteit. Gezien het feit dat honderden P53 doel genen zijn geïdentificeerd in het menselijk genoom41,48, vertoonde vrijwel alle P53 REs een niet-identieke sequentie tussen elkaar. Bovendien is het veronderstelde dat REs met een uitgesproken DNA-binding affiniteit zijn geselecteerd in de promotors van P53 doel genen die betrokken zijn bij arrestatie van de celcyclus of apoptosis53.

De analyse in gist van vele varianten van de P53 RE op een constante genomische locatie vestigde de impact van nucleotide varianten, spacer en organisatie van RE half-sites op trans activatie capaciteit49. Het leidde zelfs tot de ontdekking van polymorfe P53 REs met de twee allelen duidelijk verschillend in de responsiviteit van een geassocieerde promotor aan P5314,54,55. Onlangs is informatie die voortvloeit uit P53 RE sequence-functies en op gist gebaseerd transactiveringspotentieel gecodeerd in P53 Retriever, een patroon zoekalgoritme dat in staat is om zowel canonieke als niet-canonieke REs te lokaliseren en te rangschikken, volgens hun voorspelde trans activatie mogelijkheden in het hele menselijk genoom52.

Als voorbeeld van het gebruik van de assay voor het bestuderen van sequentie-specifieke P53 transactiveringspotentieel, hier gepresenteerd is een vergelijking tussen menselijk wild-type P53 en de evolutionaire verre P53 eiwit van Caenorhabditis elegans (Figuur 3). Deze resultaten zijn een follow-up van een recente studie waarin de evolutionaire divergentie van transactiveringsspecificiteit onder P53 eiwitten werd verkend56. Isogene yLFM-RE reporter stammen werden ontwikkeld zoals beschreven in het protocol. Specifiek, de CEP-1 P53 RE afgeleid van de ced13 gen57, en vier varianten (v1-v4) werden vergeleken (Figuur 3a). De RE-varianten werden geconstrueerd om de impact te onderzoeken van het variëren van de lengte van de afstandhouder die de twee decamerische motieven scheidt (die in ced13 van 28 nucleotiden zijn) en om veranderingen in de nucleotiden te onderzoeken die het CWWG-kern motief (dat in ced13, zijn A/T rijk; terwijl in de hoogste affiniteit Human P53 REs, zijn G/C Rich)58. De resultaten laten duidelijk zien hoe Cep1 en Human P53 uiteenvallen in termen van transactiveringsspecificiteit. Terwijl de door de mens P53 gemedieerde trans activatie sterk wordt geremd door de aanwezigheid van een afstandhouder (Figuur 3b), wordt de activiteit van CEP-1 geremd door het verwijderen van de afstandhouder (figuur 3c). Bovendien wordt CEP-1-gemedieerde trans activatie afgeschaft wanneer de RE wordt gewijzigd van A/T-in G/C-rijk. Noch Human P53 noch CEP-1 kunnen transactiveren van een enkele decamer afgeleid van de ced13 RE.

Zoeken naar kleine molecule hormoonontregelaars van P53-MDM2/mdmx interacties en reactivators van mutant P53 activiteit

De vastgestelde correlatie tussen het groei remmende effect van menselijke P53 en de mate van haar activiteit in gist leidde tot een vereenvoudigde screeningtest op basis van metingen van gist celgroei om de impact van storende factoren op P53 activiteit te analyseren (Figuur 4 ). De effectiviteit van de gist fenotypische assay op het scherm voor potentiële middelen tegen kanker is aangetoond in verschillende werken. Met behulp van gistcellen die samen P53 en de remmers MDM2 en/of MDMX uitdrukken, werden nieuwe verstoorders van deze interacties geïdentificeerd door hun vermogen om het negatieve effect van Mdm's op P53 te remmen, waardoor wild-type P53-geïnduceerde gist groeiremming ( Fig. 4a). In het bijzonder leidde deze test tot de ontdekking van 1) pyranoxanthon 1 als de eerste P53-MDM2 interactie remmer met een xanthone steiger34 en 2) oxazoloisoindolinone remmers van de P53-MDM2 interactie59. Bovendien werden, met deze test, α-mangostin en gambogic acid voor het eerst beschreven als potentiële remmers van de P53-MDM2 interactie30.

Later, dezelfde assay toonde aan dat prenylatie van chalconen versterkt hun vermogen om te verstoren de P53-MDM2 interactie60. Interessant is dat deze gist test ook leidde tot de ontdekking van twee remmers van de P53-MDM2/MDMX interacties: de tryptophanol-afgeleide oxazolopiperidone lactam OXAZ-161 en tryptophanol-afgeleide oxazoloisoindolinone DIMP53-162.

De verminderde impact van verlies-van-functie Mutant P53 op gist celgroei is ook onderzocht om te schermen voor Mutant P53-reactiverende geneesmiddelen, gekenmerkt door het vermogen om wild-achtige groei remmende activiteit te herstellen naar Mutant P53 (figuur 4b). Met deze gist Assay, een Reactivator van mutant P53 R280K, werd de enantiomeer tryptophanol-afgeleide oxazoloisoindolinone SLMP53-163, geïdentificeerd. Figuur 4c,D toont representatieve resultaten verkregen in gist met de uitdrukking van P53 of behandelingen met de remmer van de P53-MDM2 interactie nutlin-3a of met de Reactivator van P53 Mutant Y220C PhiKan083.

Validatie van het moleculaire werkingsmechanisme van deze verbindingen als P53-activerende agenten, alsmede hun antitumorale activiteit, zowel in menselijke tumor cellijnen34,60,61,62,63 en diermodellen62,63, getuigt van het grote potentieel van de gist fenotypische assay in de opsporing van geneesmiddelen.

Figure 1
Figuur 1 : Kenmerken van gist gebaseerde P53 trans activatie testen en workflow voor de bouw van P53 reporter giststammen. A) het gemak van genoom manipulatie en gecontroleerde ectopische genexpressie maakt gist verwant aan een "in vivo reageerbuis", waarbij verschillende variabelen die relevant zijn voor het onderzoeken van P53 transactiveringsfuncties grondig worden onderzocht. Deze variabelen omvatten de uitdrukkings niveaus van een wild-of Mutant P53 eiwit, de sequentie van de RE en het type reporter gen [kwalitatief/semi-kwantitatief (bv. ADE2 en lacz) of kwantitatief (bijv. LUC1)]. De consensus RE-sequentie is sterk gedegenereerd (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purine; W = A/T; Y = pyrimidine; CWWG = kern sequentie, n = 0-13 bps-afstandhouder). De aantallen mismatches met betrekking tot de consensus, de kern volgorde en het aantal Base pair spacers zullen de trans activatie activiteit beïnvloeden. Dit deelvenster is gewijzigd van een vorige publicatie64. (B) schema van de delitto perfetto benadering om een gewenste P53 te introduceren van de minimale promotor die de ADE2 of LUC1 reporter genexpressie besturen. Het protocol is aangepast uit eerdere publicaties12,15,16. (C) voorbeeld van de resultaten van gist kolonie PCR-versterking van de regio rond de site van OLIGO Re integration. Het beeld van elektroforese presenteert het versterkings resultaat van twee puttieve positieve kolonies (URA3 minus en G418 gevoelig) met de corresponderende PCR negatieve controle naast de 1 KB DNA ladder (Promega). De band ~ 500 NT verwacht met behulp van primers zoals beschreven in tabel 3 kunnen worden geordend om de juiste promotor bewerking te bevestigen, zoals weergegeven in het electropherogram. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : P53 eiwitten tonen herspecifieke en temperatuurgevoelige trans activatie mogelijkheden. Wild-type P53 en de aangegeven TP53 missense mutaties werden getest met behulp van de kwalitatieve op kleur gebaseerde reporter assay in gist en het exploiteren van Reporter stammen die verschillende P53 REs beheren die de ADE2 genexpressie beheersen. A) een voorbeeld van de kolonie kleur fenotype voor P53 wild-type, R175H en R282W met de Puma (BBC3) en de P21-5 ' REs bij 30 °c en 37 °c wordt getoond. Matige (0,008% galactose) en hoge (0,12% galactose) P53 expressie wordt vergeleken. B) resultaten verkregen met een uitgebreide reeks P53 mutanten en gist reporter stammen onderzocht voor het P53-afhankelijke kolonie kleur fenotype bij drie temperaturen (24 °c, 30 °c en 37 °c). De resultaten illustreren de functionele heterogeniteit van de Mutante P53 allelen en worden samengevat in een tabelformaat. Bijvoorbeeld, R175H is een verlies van functie Mutant, terwijl G199H is wild-type P53-achtige. K139E en R282W behouden een gedeeltelijke functie en vertonen respectievelijk koude gevoeligheid en hitte gevoeligheid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Human P53 en gecrediteerde ortholog CEP-1 vertonen een sterk afgeweken transactiveringsspecificiteit. A) sequenties van de: Human P53 re consensussequentie, CEP-1 P53 re afgeleid van het ced13 gen, en vier varianten (v1-v4) die werden getest in de functionele assays. B) de trans activatie werd gemeten na inducerende humane P53 expressie voor 8 uur met behulp van drie verschillende koolstofbronnen om een lage, matige en hoge expressie te bereiken (0,008%, 0,032%, 0,12% galactose toegevoegd aan selectief medium dat 2% raffinose bevat). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde relatieve licht eenheden (RLU) en standaardfout van vier replicaten. Reporter activiteit voor cel getransformeerd met lege expressie vector werd afgetrokken. C) specificiteit van de trans activatie van Cep1 zoals gemeten onder B). Voor beide eiwitten waren de transactiveringsniveaus evenredig met de hoeveelheid galactose. De hogere licht eenheden gemeten wanneer menselijke P53 wordt uitgedrukt kunnen afhankelijk zijn van verschillende niveaus van eiwit hoeveelheden geproduceerd, als gevolg van het verschil in eiwit lengte en mogelijk ook in codon gebruik. De twee eiwitten worden gekenmerkt door verschillende transactiveringsspecificiteit naar de verschillende geteste REs en deze eigenschap wordt niet beïnvloed door mogelijke verschillen in relatieve eiwit hoeveelheid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Kleine molecule Activators van P53 geïdentificeerd met behulp van de gist fenotypische assay. A) gistcellen die het menselijk wild type P53 en MDM2 of mdmx uitdrukken, zijn gebruikt om te zoeken naar remmers van de interacties P53-MDM2 en P53-mdmx. In dit systeem, interactie remmers herstellen P53-geïnduceerde gist groeiremming in gistcellen co-uitdrukken P53 en MDM2 of MDMX. Deze aanpak heeft de identificatie van remmers van de P53-MDM2 interactie en de identificatie van dubbele remmers van P53-MDM2 en P53-MDMX interacties toegestaan. B) gistcellen die de menselijke Mutant P53 uitdrukken, zijn gebruikt om te zoeken naar Mutant P53 reactivators en kunnen de door het wild soort-achtige P53-geïnduceerde gist groeiremming in Mutante P53-uitdrukken van gistcellen herstellen. C) representatieve afbeeldingen van de plaatspot test met de impact van wild type P53 of Mutant Y220C op de groei van de gist kolonie in vergelijking met de lege Vector (zie stap 4,5). D) kwantitatieve resultaten van de groei test: 10 ΜM nutlin-3a herstelt P53-geïnduceerde gist groeiremming in cellen die MDM2 uitdrukken; 50 μM PhiKan083 herstelt wild-type-achtige P53-geïnduceerde gist groeiremming naar Mutant P53 Y220C. Beide effecten zijn uitgezet ten opzichte van de gist groei remmende effect van wild-type P53, die werd ingesteld als één. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Stamnaam en genotype Specifiek gebruik Protocol nummer
Yafm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 Het wordt gebruikt voor de bouw van de Yafm-re stam (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) dat wordt uitgebuit in de kwalitatieve, op kleur gebaseerde ADE2 test. Protocollen 1, 2
Ylfm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 Het wordt gebruikt voor de bouw van de Ylfm-re stam (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) die wordt geëxploiteerd in de kwantitatieve luminescentie-gebaseerde LUC1 assay. Protocollen 1, 3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [kil-O] Het wordt gebruikt voor de fenotypische groei test. Protocol 4

Tabel 1: Giststammen.

Naam en recept voor media Specifiek gebruik Protocol nummer
Ypda (2% gistextract, 2% peptone, 2% dextrose, 200 mg/L adenine) + 2% agar YPDA zonder agar wordt gesteriliseerd bij voorkeur door filtratie. YPDA + agar wordt gesteriliseerd door Autoclaveren; het is mogelijk om dextrose uit het recept te weglaten en dextrose toe te voegen van een 20% gesteriliseerde oplossing in water voordat de platen worden gestort. Protocollen 1-4
Cm [0,17% gist stikstof basis zonder AA en ammonium sulfaat, 0,5% ammonium sulfaat, 5% (volume/volume, v/v) niet-essentiële aminozuur oplossing, 20 mg/l histidine, 20 mg/l tryptofaan, 20 mg/l uracil, 30 mg/l lysine, 100 mg/l leucine, 200 mg/l adenine] + 2% galactose De media worden gesteriliseerd door filtering. De volgende steriele stamoplossingen worden bereid in water (met uitzondering van uracil, dat wordt opgelost in 0.1 m NaOH) door filtering: niet-essentiële aminozuur oplossing (0,04% arginine, 0,04% methionine, 0,06% isoleucine, 0,1% fenylalanine, 0,2% glutamine zuur, 0,2% Aspartic acid acid, 0,3% valine, 0,4% Threonine, 0,8% serine), 1% histidine, 1% tryptofaan, 1% uracil, 1% lysine, 1% Leucine, 0,5% adenine, 20% galactose. Adenine stockoplossing mag niet worden bewaard in de koelkast vanwege de vorming en de sedimentatie van kristallen. Tryptofaan stamoplossing moet worden opgeslagen in het donker. Protocol 1
Cm (zie boven) + 2% dextrose + 1g/L 5-FOA + 2% agar De media (met gist stikstof basis zonder AA en ammoniumsulfaat, ammoniumsulfaat en agar) worden gesteriliseerd door autoclaven. De andere componenten worden toegevoegd na Autoclaveren om warmte-labiele ingrediënten te behouden; het 5-FOA poeder kan direct in de media worden toegevoegd zodra het tot ongeveer 55 °C is afgekoeld. Protocol 1
Ypda + 400 μg/ml G418 + 2% agar G418 moet worden toegevoegd na Autoclaveren zodra de media is afgekoeld tot ongeveer 55 °C. Als u begint met poeder, kan een 50 mg/mL G418 stockoplossing worden bereid in water en gesteriliseerd door filtratie. Protocol 1
YPGA [2% gistextract, 2% peptone, 2% glycerol (v/v), 200 mg/L adenine] + 2% agar De media worden gesteriliseerd door autoclaven. Protocol 1
Synthetische selectieve plaat: [0,17% gist stikstof basis zonder AA en ammoniumsulfaat, 0,5% ammoniumsulfaat, 5% (v/v) niet-essentiële aminozuur oplossing (0,04% arginine, 0,04% methionine, 0,06% isoleucine, 0,1% fenylalanine, 0,2% glutaminezuur, 0,2% Aspartic acid acid, 0,3% valine, 0,4% Threonine, 0,8% serine), 20 mg/L histidine, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptofaan (afhankelijk van de vector selectie marker), 30 mg/L lysine, 100 mg/mL Leucine (afhankelijk van vector selectie marker), 5 mg/L of 200 mg/L adenine] + 2% dextrose + 2% agar De media (met gist stikstof basis zonder AA en ammoniumsulfaat, ammoniumsulfaat en agar) worden gesteriliseerd door autoclaven. De andere componenten worden toegevoegd na Autoclaveren om warmte-labiele ingrediënten te behouden. Bij het gebruik van pLS-en pLSG gebaseerde vectoren voor te bereiden platen zonder leucine. Bij het gebruik van pTS-en pTSG-gebaseerde vectoren bereiden platen zonder tryptofaan. Protocollen 2-3
Synthetische selectieve media: [0,17% gist stikstof basis zonder AA en ammoniumsulfaat, 0,5% ammoniumsulfaat, 5% (v/v) niet-essentiële aminozuur oplossing (0,04% arginine, 0,04% methionine, 0,06% isoleucine, 0,1% fenylalanine, 0,2% glutaminezuur, 0,2% Aspartic acid acid, 0,3% valine, 0,4% Threonine, 0,8% serine), 20 mg/L histidine, 20 mg/l uracile, 20 mg/L tryptofaan (afhankelijk van de vector selectie marker), 30 mg/L lysine, 100 mg/mL Leucine (afhankelijk van de vector selectie marker), 200 mg/L adenine] + 2% dextrose of raffinose + 0-2% galactose  De media worden gesteriliseerd door filtratie. Bij het gebruik van pLS-of pTS-gebaseerde vectoren in medicamenteuze behandeling voor te bereiden media zonder Leucine of tryptofaan, respectievelijk maar met 2% dextrose. Bij gebruik van plsg-of ptsg-gebaseerde vector in induceerbare cytochromen P53 expressie met of zonder medicamenteuze behandeling voor te bereiden media zonder Leucine of tryptofaan, respectievelijk met 2% raffinose en variabele hoeveelheid galactose om P53 uitdrukking te moduleren. De omvang van P53 inductie kan ook worden gemoduleerd door de tijd van incubatie te variëren. Protocol 3
Minimale selectieve platen: 2% glucose, 0,7% gist stikstof base (zonder aminozuren en ammoniumsulfaat), 50 mg/l adenine, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidine, 50 mg/l tryptofaan (afhankelijk van de vector selectie marker), 50 mg/l Leucine (afhankelijk van vector selectie marker), 2% agar Het medium wordt gesteriliseerd door Autoclaveren. Bij het gebruik van pLS89 gebaseerde vectoren bereiden medium zonder tryptofaan. Gebruik pLS89-lege Vector (geen eiwit uitdrukken) als negatieve controle. Bij het gebruik van pLS89-gebaseerde en pGADT7-MDM2 vectoren (co-expressie van P53 en MDM2), bereid medium zonder Leucine en tryptofaan. Gebruik pLS89-Empty en pGADT7 (beide geen eiwitten uitdrukken) als negatieve controles. Bij het gebruik van pLS76-gebaseerde vectoren bereiden medium zonder leucine. Gebruik pRS315 vector (geen eiwit uitdrukken) als negatieve controle. Protocol 4
Minimaal selectief medium: als minimale selectieve platen maar zonder agar Het medium wordt door filtratie gesteriliseerd. Protocol 4
Selectief inductie medium: als minimaal selectief medium, maar met 2% galactose in plaats van glucose Het medium wordt door filtratie gesteriliseerd. Protocol 4

Tabel 2: gist media.

Naam van de oplossing en recept of primer naam en volgorde Specifieke functies en gebruik Protocol nummer
Liac/te: 10 mm tris-HCl, pH 8,0, met 1 mm EDTA en 0,1 m Lithium acetaat De volgende steriele stamoplossingen in water worden bereid door Autoclaveren: 1M Lithium acetaat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X). Protocollen 1-4
Peg/LiAc/te: 40% polyethyleenglycol (PEG) in 10 mm tris-HCl, pH 8,0, met 1 mm EDTA en 0,1 M Lithium acetaat De volgende steriele stamoplossingen in water worden bereid door Autoclaveren: 1 M Lithium acetaat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X), 50% PEG (molecuulgewicht ~ 3350). Protocollen 1-4
Homologie staarten voor de RE oligonucleotiden:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
De volgorde van de staarten van homologie, overeenkomend met de chromosomale sequenties die de geïntegreerde ICORE-cassette flaneren; RE = RE sequentie. Protocol 1
Primers: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
Voor yAFM-RE strain (PCR en sequencing) combineren Ade2 FW met Ade2 RV primer. Voor yLFM-RE stam (PCR en sequencing) combineren Ade2 FW met Luc1-RV primer. Protocol 1

Tabel 3: oplossingen en oligonucleotiden.

Soorten vectoren Positieve en negatieve controles Protocol nummer
P53 (of Control) vectoren.
pLS-of plsg-based: P53 eiwit expressie onder constitutieve ADH1 promotor of galactose induceerbare cytochromen GAL1 promotor, respectievelijk (LEU2 als selectie marker).
pTS-of ptsg-based: P53 eiwit expressie onder constitutieve ADH1 promotor of galactose-induceerbare cytochromen GAL1 Promoter, respectievelijk (TRP1 als selectie marker)
pLS-en pLSG-based: gebruik als positieve controle de pLS76 en de pLSG-P53 vectoren (het uitdrukken van wild type P53), respectievelijk; gebruik als negatieve controle pRS315 vector (geen eiwit uitdrukken).
pTS-en pTSG-based: gebruik als positieve controle de pTS76 en de pTSG-P53 vectoren (het uitdrukken van wild type P53), respectievelijk; gebruik als negatieve controle pRS314 vector (geen eiwit uitdrukken).
Protocol 2, 3
P53 en MDM2 (of Control) vectoren.
pLS89-based: wild type P53 eiwit expressie onder galactose-induceerbare cytochromen GAL1 Promoter (TRP1 als selectie marker).
pLS76-based: Mutant P53 eiwit expressie onder constitutieve ADH1 promotor (LEU2 als selectie marker).
pGADT7-based: MDM2 eiwit expressie onder constitutieve ADH1 promotor (LEU2 als selectie marker)
pLS89-based: gebruik als positieve controle de pLS89-P53 vector (het uitdrukken van wild type P53); gebruik als negatieve controle pLS89-leeg (geen eiwit uitdrukken).
pLS76-based: gebruik als positieve controle de pLS76-Mutant P53 vector (uitdrukken Mutant P53); gebruik als negatieve controle pRS315 vector (geen eiwit uitdrukken).
pGADT7-based: gebruik als positieve controle de pGADT7-MDM2 vector (het uitdrukken van wild type MDM2); gebruik als negatieve controle pGADT7 vector (geen eiwit uitdrukken).
Protocol 4

Tabel 4: vectoren van gist uitdrukkingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Op gist gebaseerde assays zijn nuttig gebleken om verschillende aspecten van P53 eiwit functies te onderzoeken. Deze assays zijn bijzonder gevoelig voor het evalueren van P53 transactiveringspotentieel naar varianten van RE target sites, met inbegrip van de evaluatie van functionele polymorfismen. Het gebruik van kleuren verslaggevers en miniaturisatie van de plaats-assay resulteren in kosteneffectieve en relatief schaalbare assays. Ook is de groeiremmende test mogelijk vatbaar voor gebruik in de chemische bibliotheek screening, waarbij de kwantificering van de levensvatbaarheid van de gistcellen wordt automatiseert door meting van de extinctie. Terwijl beperkte permeabiliteit als gevolg van de celwand en de werking van ABC vervoerders is beschouwd als een beperking in het gebruik van gist voor drug screening, genetische modificaties om de opname te verbeteren zijn met succes ontwikkeld22,65.

Vergeleken met de zoogdiercellen op basis van zoogdieren kan de gist gebaseerde P53 assay de identificatie van directe hits verbeteren, gezien het feit dat P53 geïsoleerd is van de verbazingwekkende complexiteit van cofactoren en het signalering van Cascade trajecten die zijn functies in hogere eukaryoten moduleren. Functionele assays op basis van gist zijn ook gedeeltelijk succesvol geweest bij het monitoren van de interactie van P53 met eiwit cofactoren (namelijk MDM2 en mdmx22,32,33,34) en de impact van kleine moleculen (zoals Nutlin-3a) op deze interacties. De gevoeligheid en voorspellende kracht van op gist gebaseerde assays voor het onderzoeken van Overspraak tussen P53 en de interactie van eiwitten kunnen echter enigszins beperkt zijn, afhankelijk van hoe deze interacties in vivo afhangen van post-translationele modificaties en soorten-specifieke signalering Cascades.

De hier beschreven systemen kunnen eenvoudig worden aangepast aan andere TFs. Inderdaad, gist Functionele assays zijn ontwikkeld voor P53-gerelateerde p63 rooms en P73 eiwitten42,49 evenals leden van de NF-κb familie66,67 [of zelfs voor sommige Homeobox en Basic Helix-lus-Helix (bhlh) TFs68,69]. Menselijke nucleaire receptoren zijn ook uitgedrukt in gist en bewezen te werken als ligand-afhankelijke, sequentie-specifieke TFs70. Een beperkende factor is vastgesteld in de zwakke capaciteit van sommige zoogdier transactiveringdomein (TAD) om te communiceren met de gist basal transcriptie machine8, een tekortkoming die kan worden overwonnen door gebruik te maken van chimerische constructies, waaronder een actieve heterologe tad68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Wij danken de Europese Unie (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 via programa Operacional Factores de Competitividade-concurreren) en nationale fondsen (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia en Ministério da Educação e Ciência) onder de Partnerschapsovereenkomst PT2020 UID/QUI/50006/2019 en de projecten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT Fellowships: SFRH/BD/96189/2013 (v. Gomes). Dit werk werd gesteund door de Compagnia S. Paolo, Turijn, Italië (project 2017,0526) en Ministerie van volksgezondheid (project 5x1000, 2015 en 2016; huidig onderzoek 2016). We danken Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universiteit van Trento, experimentele wetenschappen onderwijs laboratoria) ten zeerste voor hulp bij video-opnames.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics