Author Produced

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bilinen memeli p53 proteinin, Maya S. cerevisiae 'de bir transkripsiyon faktörü (TF) olarak hareket edebilir bulgu, 1 ' in etkilerini incelemek için farklı fonksiyonel bulguların gelişmesine izin verdi) bağlayıcı site [Yani, yanıt elemanı (Re)] p53 transaktivasyonu özgüllüğü veya 2) TP53 mutasyonlar, ortak ifade edilen Cofactors veya p53 Transaktivasyon aktivitesinde küçük moleküller üzerinde sıra türevleri. Farklı temel ve translasyonel araştırma uygulamaları geliştirilmiştir. Deneysel olarak, bu yaklaşımlar Maya modelinin iki büyük avantajları sömürüyor. Bir yandan, genom düzenleme kolaylığı, yalnızca belirli bir p53-RE seviyesinde farklı olan izojenik suşları sömürüyor ve p53 bağımlına göre sıralı-özgüllüğü araştırmak için nitel veya kantitatif muhabir sistemlerinin hızlı inşası sağlar transaktivasyonu. Öte yandan, ektopik p53 ifadesi için düzenlenmiş sistemlerin kullanılabilirliği, çok çeşitli protein ifadesinde Transaktivasyon değerlendirilmesi sağlar. Bu raporda yaygın olarak renk muhabiri genler, luciferase ve Maya büyümesi temel metodolojik adımları göstermek ve eleştirel onların öngörü gücünü değerlendirmek için dayalı sistemler kullanılır. Dahası, bu yaklaşımların aşırı çok yönlülüğü, TP53 gen ailesinin diğer üyeleri olan P63 ve P73 dahil olmak üzere farklı TFs çalışmaları için kolayca yararlanılabilir.

Introduction

Transkripsiyon, belirli uyaranlara yanıt olarak kromatin bölgelerinde RNA polimerinlerinin işe alma ve modülasyonu için dinamik, uzamsal ve temporal transkripsiyon faktörleri (TFs) ve Kofaktörler organizasyonu içeren son derece karmaşık bir süreçtir1 . Çoğu TFs, insan p53 tümör bastırıcı dahil, DNA dizileri şeklinde belirli cis-etkili unsurları tanımak yanıt elemanları denilen (REs), tek (veya birden fazla) benzersiz motifleri oluşur ~ 6-10 nükleotid uzun. Bu motifler içinde, bireysel pozisyonlar varyasyon2, genellikle pozisyon ağırlık matrisleri (PWM) veya logolar3,4tarafından özetlenen çeşitli dereceleri gösterebilir.

Maya S. cerevisiae , bir ortolog Maya geni mevcut olmadığında bile, tamamlayıcı bulgular, ektopik ifade ve fonksiyonel bulgular yoluyla insan proteinlerinin farklı yönlerini incelemek için uygun bir model sistemidir. 6 , 7. transkripsiyon sisteminin bazal bileşenlerinin evrimsel koruma nedeniyle8, birçok insan TFs (ektopik Maya hücrelerinde ifade edildiğinde) için tasarlanan organizatörler aracılığıyla hareket ederek bir muhabir geni ifadesi modüle olabilir uygun REs içerir. Burada insan p53 için sunulan transkripsiyon modeli sistemi, etkileri modüle edilebilir üç büyük değişken ile karakterize edilir: 1) ifade ve p53 türünün modalitesi, 2) RE dizisi p53 bağımlı transkripsiyon kontrol, ve 3) türü (Şekil 1a).

P53 ifadesinin modalitesi ile ilgili olarak, S. cerevisiae , indüklenebilir, bastırılabilir veya kurucu organizatörler9,10,11' in seçimini sağlar. Özellikle, indüklenebilir GAL1 Organizatör bazal sağlar (bir karbon kaynağı olarak bulunan Rafinoz kullanarak) veya değişken (medyada galaktoz miktarını değiştirerek) Maya bir TF ifadesi. Aslında, ince ayarlanabilir ifade sadece p53 kendisi değil, aynı zamanda diğer p53 aile proteinlerini incelemek için kritik bir gelişimi temsil eder12,13.

P53-bağımlı ifade kontrol res türü ile ilgili olarak, S. cerevisiae başka bir izojenik arka plan ilgi Re benzersiz farklılıklar sahip farklı gazeteci suşları inşası sağlar. Bu amaç, S. cerevisiae'de geliştirilen ve delitto Perfetto12,14,15,16adlı özellikle çok yönlü genom düzenleme yaklaşımının adaptasyonu kullanılarak ulaşılır.

Ayrıca, farklı muhabir genler (i.e., URA3, HIS3, ve ADE2) niteliksel ve niceliksel S. cerevisiaeiçinde insan TFs transkripsiyonel faaliyetleri değerlendirmek için kullanılabilir, belirli özellikleri ile her Deneysel ihtiyaçlar için uyarlanmış17, 18,19,20,21. Bu muhabirin genlerinin ifadesi, sırasıyla urasil, histidin ve adenin protorofinin ifadesidir. URA3 Reporter 5-FOA varlığında hücrelerin büyümesini de izin vermez ve böylece counterselected olabilir. ADE2 Reporter sistem avantajı vardır, beslenme seçimi yanı sıra, bu vahşi tipi (i.e., ADE2 ifade işlevsel) veya Mutant (i.e.,fonksiyonel değil ifade Maya hücrelerinin tanımlanması sağlar ADE2 ) Koloni renkten p53.

Örneğin, ADE2 geni ifade Maya hücreleri normal boyutta beyaz koloniler (2.5-5.0 mg/L) adenin miktarları sınırlayıcı içeren plakaları oluşturmak, bu kötü ya da daha küçük kırmızı (veya pembe) aynı plaka üzerinde görünür transkripleme değil iken Koloni. Bu, bir orta adenin biyosentetik yol birikimi nedeniyle (yani, P-ribosylamino-imidazol, daha önce amino-imidazol ribotide veya hava denir), kırmızı bir pigment oluşturmak için dönüştürülür. Nicel Firefly photinus pyralis (LUC1)12,22ile değiştirildi bu yana nitel renk tabanlı ADE2 Reporter gen vardır. Daha yakın zamanda, ADE2 Reporter lacz Reporter ile kombine edilmiştir kolay-to-Score, yarı-niceliksel, Çift muhabiri assay bu alt sınıflandırmak için yararlanılabilir p53 mutantlar işlevselliği onların kalıntı düzeyine göre 23 yaşında.

EGFP (Gelişmiş yeşil floresan proteini) veya DsRed (Discosoma Sp. kırmızı floresan proteini) gibi floresan muhabirleri, tüm olası yanlış mutasyonlar ile ilişkili Transaktivasyon aktivitesinin nicel değerlendirilmesi için de kullanılmıştır. TP53 kodlama sırası24. Son olarak, Re ve/veya muhabir geni için farklı izojenik maya suşları ile p53 allel ifade için ayarlanabilir Rehberleri birleştirerek şans kanser ilişkili ve germline rafine sınıflandırma üreten bir veri matrisinin gelişmesine yol açmıştır mutant p53 alelleri25,26,27.

Yukarıda açıklanan yaklaşımlar p53 proteinin transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kullanılır. Ancak, MA S. cerevisiae28 ve şizofrenozaccharomyces pombe29 ' da Wild-Type p53 ifadesi, hücre döngüsü tutuklaması ile ilişkili olan büyüme gerilmesine neden olabilir28,30 veya hücre ölümü31. Her iki durumda da, Maya büyüme inhibisyonu yüksek p53 ifadesi ile tetiklenir ve hücre büyümesi dahil endojen Maya genlerinin potansiyel transkripsiyonel modülasyonu ile korelasyon olmuştur. Bu hipotezi destekleyen, kayıp-of-fonksiyon mutant p53 R273H mantar hücre büyüme vahşi tipi olarak benzer düzeylerde ifade edildiğinde müdahale etmedi p5332. Tersine, toksik mutant p53 V122A Maya ifadesinde (vahşi tip p53 ile karşılaştırıldığında daha yüksek transkripsiyonel aktivite için bilinen) vahşi tip p5332daha güçlü bir büyüme inhibitör etkisi neden oldu.

Ayrıca, insan MDM2 Maya, onun mayası ve sonraki bozulma33teşvik insan p53 transkripsiyonel aktivite inhibe başardı gösterildi. Buna göre, human MDM2 ve mdmx p53 indüklenen Maya büyüme inhibisyonu inhibe yeteneği gösterildi32,34. Ek bir çalışmada, p53 transkripsiyonel aktivite ve aktin ifade seviyeleri arasında bir korelasyon, Maya32 ACT1 geni üzerinde bir Putatif p53 Re upstream belirlenmesi ile kuruldu. Sürekli olarak, aktin ifadesi Wild-Type p53 ve daha çok p53 V122A tarafından, ancak mutant p53 R273H tarafından geliştirilmiştir. Tersine, p53 tarafından aktin ifadesi p53 inhibitörleri MDM2, mdmx veya pifithrin-α (p53 transkripsiyon aktivitesinin küçük bir molekül inhibitörü), Maya-büyüme tahlil dayalı sonuçlar ile tutarlı bir ortak varlığı azaldı. Daha da önemlisi, bu sonuçlar p53-indüklenen büyüme inhibisyonu ve Maya aktivitesinin derecesi arasında bir korelasyon kuruldu, hangi da tanımlamak ve küçük moleküller modüle p53 fonksiyonları çalışma sömürüldü28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. özel bir RE (yAFM-RE veya yLFM-RE) içeren ADE2 veya LUC1 muhabiri maya suşları inşaatı

  1. Yafm-ıcore veya ylfm-ıcore strain,12,14 (ıcore = ı, ISCe-ı endonükleaz GAL1 Promoter altında) Streak; CO = sayaç seçilebilir URA3; RE = muhabir KanMX4 kanamyisin direnci conferring; Tablo 1) bir YPDA agar plakasında-80 °C ' de saklanan% 15 gliserol stokta (Tablo 2). 2-3 gün boyunca 30 °C ' de büyümesine izin verin.
  2. Taze plaka bir Maya kolonisi alın (fazla 3 hafta eski) ve YPDA (Tablo 2) 5 ml içeren küçük bir Flask yerleştirin. 30 °C ' de geceleyin, 150-200 rpm 'de sallayarak.
  3. Ertesi gün, dekstroz tüm izlerini kaldırmak için, 3.000 x g de 2 dakika için hücreleri Pelet ve tüp inversiyon tarafından süpernatant atmak.
    Not: bu protokoldeki tüm santrifüjleri oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirin.
  4. 30-50 mL 'Lik ön ısıtılmış CM 'lik (tam medya), galaktoz (Tablo 2) içeren hücre pelsini ve 30 °c ' de 4 h için inküreme, 150-200 rpm 'de sallayarak (ı-scei indüksiyonu için gerekli).
  5. 3.000 x g 'de 2 dakika boyunca hücreleri santrifüjle çıkarın ve tüpün inversiyonu ile süpernatant 'i atın.
  6. 30-50 ml steril su içinde hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  7. 10 ml steril suda hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  8. 5 ml steril liacte (Tablo 3), DNA alımı iyilik bir iyonik çözüm hücre Pelet resuspend. 1,5 adımı yineleyin.
  9. 250 μL steril liacte hücre Pelet resuspend ve bir 1,5 ml tüp hücreleri aktarmak. Tekrar adım 1,5 ve yeniden pelletini 300-500 μL steril liacte içinde hücre Pelet.
  10. Yıkanmalar sırasında, 100 °C ' de 10 dakika boyunca somon sperm DNA taşıyıcısının 10 mg/mL çözeltisini denmesi ve tek telli DNA olarak korumak için buzda hemen Chill.
  11. Ayrı bir 1,5 mL Tüp, istenilen oligonükleotid 500 picomoles ekleyin (Tablo 3), 5 μL haşlanmış somon sperm taşıyıcı DNA, 300 μL steril LiAcTE Peg (Tablo 3), ve 50 μL Maya hücre süspansiyonu (adım 1,9).
  12. 150-200 rpm 'de sallayarak, 30 °C ' de 30 dakika boyunca karıştırın ve inküye 10 s için tüpler Vortex. Sıkışmak lehine yan 1,5 mL tüpler yerleştirin.
  13. Isı şok Maya hücreleri 15 dakika 42 °C ' de bir ısıtma bloğu içinde, daha sonra 20 s için hücreleri santrifüjler 10.000 x g. Süpernatant çıkarın ve 1 ml steril su hücreleri pelletini.
  14. YPDA agar plakasında hücre süspansiyonunun 100 μL 'i yaymak ve 30 °C ' de 1 gün boyunca inküsyon (ters). İyi ayrılmış kolonilerin elde edildiğinden emin olmak için 1:10 seyreltme 100 μL de yayılır.
  15. Ertesi gün, dekstroz ve 5-FOA içeren cm agar plaka üzerine steril kadifeler kullanarak yineleme plakası (Tablo 2). (Yani, URA3 hücrelerin bazı büyüme) birçok hücre transfer ise yeni bir plaka üzerinde ikinci bir kopya plaka düşünün.
  16. Üç gün sonra, olmayan seçici ypda ve ypda üzerinde yineleme plakası G418 (bir aminoglikozid antibiyotik kanamycin benzer) agar plakaları (Tablo 2), onların sonraki karşılaştırma kolaylaştırmak için her plaka işaretleme. Levhaları bir gecede 30 °C ' de kulküat.
  17. Ertesi gün, G418-Sensitive ama YPDA plakaları (örneğin, yLFM veya yAFM-RE kolonileri) büyümeye koloniler aday muhabiri suşları tanımlayın. Tek kolonli izolatlar elde etmek ve 30 °C ' de 2 gün boyunca büyümelerine izin vermek için yeni bir YPDA plakasında tanımlanan kolonileri (3-6 koloni) çizin.
  18. Daha fazla analiz için kolonileri izole etmek için bir YPDA plakasında tek Maya kolonisi yama. 30 °C ' de 24 saat sonra, minyon mutantların büyümesini (yani solunum eksikliği mutantları) engelleyen bir YPGA agar plakasında (Tablo 2) yineleme kaplama ile test edin. Aynı zamanda, yeni bir YPDA agar plaka üzerinde yineleme plakası.
  19. Doğru yamaları test (yani, YPDA ve YPGA agar plakaları üzerinde büyüme; 1-3 koloniler) koloni PCR tarafından doğru oligonükleotit entegrasyonu varlığı için adım 1,18. 5 μL 10X PCR tampon (1,5 mM MgCl2), 2 μL 10 picomoles/μL astar (Tablo 3), 4 μL 2,5 mm dntps, 0,25 μL 5 U/μL Taq polimeraz ve son hacmine kadar su (50 μL) ekleyerek bir reaksiyon karışımını birleştirin. Her bir PCR tüpüne x 50 μL olarak taranması gereken Maya kolonilerinin sayısı için reaksiyon karışımını çarpın. Bir pipet kullanarak, tek bir PCR reaksiyon karışımı içine YPDA agar plaka Maya hücreleri çok az miktarda ekleyin.
  20. Aşağıdaki program ile PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 94 °C ' de 8 dakika için 35 denatürasyon döngüsü, 94 °C ' de 1 dk, 55 °C ' de 1 dakika tavlama ve 72 °C ' de 2 dakika uzatma.
  21. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, doğru boyutu (~ 500 BP) kontrol etmek için bir agaroz jel üzerinde PCR reaksiyonu (yaklaşık onuncu hacmi) bir kısım yükleyin.
  22. Adım 1,19 aynı astar kullanarak istenilen RE dizisinin entegrasyonunu onaylamak için ticari bir kit ile arıtma sonra PCR ürün sırası.
  23. Doğru sıra doğrulandıktan sonra, yAFM-RE veya yLFM-RE gerinim kültürü (YPDA)% 15 gliserol stok yapmak ve at-80 °C saklayın.

2. p53 protein Transaktivasyon yeteneği nitel renk tabanlı ADE2 Maya tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. 1,1 ve 1,2 yAFM-RE gerilimi (Tablo 1) kullanarak adımları yineleyin.
  2. Sonraki gün, 30-50 mL 'Lik ön ısıtılmış YPDA hücre kültürünü (1:10) seyreltir ve OD600nm 0.8-1.0 (~ 2 h) ' ye ulaşıncaya kadar 30 °c ' de sallama devam eder.
  3. 1,5-1.10 arasındaki adımları yineleyin.
  4. Ayrı bir 1,5 mL Tüp, Ekle 300-500 ng Maya p53 (veya kontrol) ifade vektörü (Tablo 4), 5 μL haşlanmış somon sperm DNA taşıyıcı, 300 μL steril LiAcTE Peg, ve 50 μL Maya hücre süspansiyonu.
  5. 1,12 ve 1,13 adımları yineleyin ama hücre Pelet, 300 μL steril su yeniden pelletini.
  6. Karbon kaynağı olarak dekstroz ve yüksek miktarda adenin (Tablo 2) içeren sentetik seçici (p53 ifade veya kontrol vektörü için) hücre süspansiyonunun μl 100 Spread 'i, sonra 2-3 gün boyunca 30 °c ' de (baş aşağı) inküsyon yapın.
  7. Yeni seçici plakaya tek Maya transformant kolonileri (plaka başına 2-6 çizgiler) serin ve 30 °C ' de bir gecede büyümelerine izin verin.
  8. Gün sonra, renk fenotipinin değerlendirilmesi için izin yeni seçici plakalar üzerine steril kadifeler çoğaltma plakası kullanarak (yani, karbon kaynağı olarak dekstroz içeren plakaları ama adenin miktarını sınırlamak; Tablo 2). Plakaları 3 gün boyunca 30 °C ' de baş aşağı inkoyun. İsteğe bağlı olarak, p53 proteinin sıcaklık hassasiyetini değerlendirmek için 3 gün boyunca üç farklı sıcaklıkta inküye: 24 °C, 30 °C ve 37 °C.
    Not: aynı çizgi birden çok kez çoğaltma kaplama olabilir.
  9. P53 protein transaktivasyonu yeteneğini değerlendirmek için, Maya kolonilerinin renk tabanlı fenotipi kontrol ve p53 Wild-tipi ve boş vektör fenotipleri ile ilgili p53 protein fenotipi karşılaştırın.

3. p53 protein Transaktivasyon yeteneğinin niceliksel lüminesans tabanlı LUC1 Maya tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. P53 (veya kontrol) ifade vektörler (Tablo 4) ile Maya hücrelerini Transform protokol 2 ' de açıklanan Liac tabanlı yöntemi kullanarak. YLFM-RE gerinim (Tablo 1) kullanın.
  2. Karbon kaynağı olarak glikoz içeren yüksek miktarda adenin ile yeni bir seçici plaka üzerinde yama tek transformanlar ve onları 30 °C gecede büyümeye izin. Her dönüşüm türü için 5-7 farklı yamalar yapın.
  3. Gece büyüme sonra, karbon kaynağı olarak dekstroz veya bulunan Rafinoz içeren sentetik seçici orta plakadan steril bir küral veya pipet ucu kullanarak Maya hücrelerinin küçük bir miktar pelletini (200 bir yuvarlak ile şeffaf 96 iyi plaka, μL son hacim veya düz alt). Deney indüklenebilir p53 ifadesi gerektiriyorsa, indüksiyon seviyesini modüle etmek için bulunan Rafinoz ortamına galaktoz ekleyin (Tablo 2).
    Not: Bu hücre süspansiyonları yaklaşık 0,4 ve 1 ' den daha yüksek bir OD600nm olmalıdır.
  4. Ölçmek bir MultiLabel plaka okuyucu kullanarak indüklenebilir p53 ifade (4-8 h 30 °C ' de 150-200 RPM ile) sonra OD600nm her iyi emici. Hücre süspansiyonların her iyi çok kanallı pipet ile karıştırılarak homojen olduğundan emin olun.
  5. Transfer 10-20 μl hücre süspansiyon şeffaf 96 iyi plaka beyaz bir 384 (veya 96) iyi plaka ve eşit hacim (10-20 μl) lizis tampon ile karıştırın. , Lusiferaz substrat hücre geçirgen elde etmek için bir shaker (150-200 rpm) RT 10-15 dk için inkübe.
  6. 10-20, Firefly Lusiferaz substrat μL ekleyin ve ışık birimlerini (Lu) çok etiketli bir plaka okuyucusu ile ölçün.
  7. P53 protein transaktivasyonu yeteneğini belirlemek için, her iyi ilgili OD600nm (bağıl ışık ünitesi, RLU) Için lu 'lar normalleştirmek. Maya transformant kolonilerin 3-4 yamaları ortalama RLU ve standart sapma hesaplayın.
  8. P53 protein Transaktivasyon verilerini p53 vahşi tip ve boş vektörüne göre karşılaştırın, ya boş vektörden elde edilen değerleri çıkararak ya da boş vektörden elde edilen değerlere bölerek (yani indüksiyon kat hesaplama).
    Not: p53 Transaktivasyon aktivitesi de p53 etkileşen proteinler (örn. MDM2 ve MDMX) ve/veya ilaç tedavisi dahil olmak üzere aynı deneysel ayarlama kullanılarak değerlendirilebilir.

4. p53 protein büyüme inhibisyonu Maya fenotipi tahlil kullanarak değerlendirilmesi

  1. P53/MDM2/MDMX (veya kontrol) ifade vektörler (Tablo 4) ile Maya hücrelerini Transform Bölüm 2 ' de açıklanan Liac tabanlı yöntemi kullanarak. CG379 gerinim (Tablo 1) kullanın ve en az seçici plakalar (Tablo 2) Maya transformants yayılır.
  2. En az seçici ortamda (Tablo 2) dönüştürülmüş hücreleri YAKLAŞıK 1 od600nm'ye büyütün.
  3. Seçici indüksiyon ortamında 0,05 OD600nm için seyreltilebilir Maya hücreleri (Tablo 2) ve isteğe bağlı olarak, seçilen küçük bir molekül uygun konsantrasyon (veya sadece solvent) mutant p53 veya inhibe MDM2-içinde etkinliğini test etmek için eklemek- /MDMX-P53 etkileşimleri.
  4. Hücreleri 30 °C ' de sürekli orbital sallama (200 rpm) altında yaklaşık 42 h (negatif kontrol mayasının orta günlük faz ulaşmak için gerekli zaman, yaklaşık 0,45 OD600nm) altında kuluçka.
  5. Spot 100 en az seçici plakalar üzerinde Maya hücre kültürlerinin μL plakaya (Tablo 2).
  6. 30 °C ' de 2 gün boyunca inküye yapın.
  7. 100 μL kültür damlaları (koloni şekillendirme ünitesi, CFU sayar) elde edilen kolonilerin sayısını sayarak Maya büyümesini ölçmek. Örneğin, (100), mutant p53 ifade hücrelerin büyümesi (ancak solvent kontrolüne maruz) temsil ederken en fazla olası etkisi (p53% olarak ayarlanmış), vahşi tipi büyüme dikkate bileşiklerin mutant yeniden aktive etkisini hesaplamak yeniden etkinleştirme sıfır düzeyi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnşaatı ADE2 veya LUC1 muhabir maya suşları

Delitto perfettoyaklaşım12,14,15,16 p53 Reporter maya suşları (Şekil 1B) inşası sağlamak için adapte edilmiştir. Yöntem, her iki ucunda, en az 30 nükleotidler entegre seçilen Locus homolog içeren tek veya çift telli oligonükler kullanır. Özellikle, Homoloji, KlURA3 ve kanMX4 IÇEREN ÇIFT Marker kaset ıcore entegrasyonu site Flanşlı dizileri karşılık (Reporter gen genetik, G418 direnç sağlayan) daha önce konumlandırılmış istenen hedef site15,16. Bu kaset Ayrıca Maya ı-scei endonükleaz kodlama dizisi içerir, indüklenebilir GAL1 organizatör ve onun bilat hedef site altında. Bu nedenle, galaktozdaki bir anahtar, Maya hücrelerinin dönüştürme işleminden hemen önce içeren orta sağ ı-SceI ifadesinde ve ıCORE entegrasyonunun yapıldığı yerde tek bir çift iplikli Break (DSB) oluşumu sonucu elde edilir. Bir DSB varlığı, tek bir dönüşümle elde edilen 1.000 ' den fazla değiştirme ile olayları hedefleme sıklığını son derece uyarır.

Hedefleme ve seçim sürecinin sonunda, 5-FOA ' a elde edilen direncin ve G418 'e olan hassasiyete dayalı olarak, aday klonlar, değiştirilmiş Locus ve Sanger sıralamanın koloni PCR bazlı amplifikasyonuyla istenilen p53 RE (Şekil 1C). Gerinim inşaat protokolünün sonunda, bu yaklaşık bir hafta içinde tamamlanabilir, bir panel izojenik muhabir maya suşları elde edilir nasıl res dizisi farklılıkları p53 transaktivasyonu kapasitesini etkileyen değerlendirmek için kullanılabilir Protein.

Fonksiyonel heterojen mutant P53s

İnsan tümörlerinde, TP53 geni genellikle 6 büyük Hotspot kalıntıları (R175, G245, R248, R249, R273 ve R282) p53 PROTEIN merkezi DNA-bağlayıcı alan (DBD) bulunan içeren tek yanlış mutasyonlar etkilenir. Ancak, 2.000 ' den fazla tek p53 amino asit değişimler kaydedildi, bazıları da dahil olmak üzere nadiren gözlenen27. Mutant P53s DNA-protein teması (örn., R273H) veya protein yapısı (örn., R175H)36amino-asit ikame etkilerini bağlı olarak, DNA teması veya yapısal mutantlar olarak sınıflandırılabilir. Tek TP53 missense mutasyonları p53 fonksiyonlarını etkiler, böylece tümör saldırganlık, kemoterapi-direnç ve metastatik potansiyel37 gibi önemli klinik özellikleri etkileyebilir fonksiyonel çeşitlilik, geniş bir yelpazede üreten, 38 , 39.

Mutantların p53 işlevsel heterojen olduğu kavramı, son 15 yılda TP53 mutasyon veritabanlarında (örn. < p53. Free. fr//>)27' de bulunan büyük miktarda deneysel veri aracılığıyla ortaya çıkmıştır. Maya ve/veya memelinin muhabiri sistemlerine dayanan farklı fonksiyonel özellikler, mutantların farklı özelliklerini vurgulayan P53s (yani Transaktivasyon, sıcaklık hassasiyeti, baskın-negatif potansiyel, parazit p53 ailesinin üyeleri ve diğer TFs ile etkileşimler)13,24,40,41,42,43,44. En kapsamlı fonksiyonel çalışma, sekiz farklı p53 REs24' ye doğru Transaktivasyon aktivitesini karakterize ederek Maya tabanlı bir tahlil sırasında 2.300 ' den fazla mutantları inceledi.

Veri, neredeyse tüm mutant P53s Hotspot kalıntılarının içeren-fonksiyon kaybı olduğunu doğruladı (yani, onlar tamamen Transaktivasyon etkinliğini kaybetti). Tersine, p53 protein diğer pozisyonları vurdu ve genellikle kanser45 orta-düşük frekans bulunan mutant P53s kısmi fonksiyon mutantlar vardır, hangi p53 res13üzerinde Transaktivasyon aktivitesinin bazı düzeyde korumak, 17. ADE2 assay kullanılarak tanımlanan p53 proteinlerin çalışması için bir örnek fonksiyonel heterojenlik Şekil 2asunulmaktadır. Aslında, R175H, test edilen her koşulda kırmızı koloniler üreten bir fonksiyon kaybı olduğunda, R282W, galaktoz bağımlı p53 ifadesi kullanılarak daha belirgin olan sıcaklık duyarlılığı göstermiştir (yani, 37 ° c 'de kırmızı sektör, P21-5 ' te) yüksek galaktoz plaka pembe olur alt galaktoz, içeren plaka). Şekil 2B p53 mutantlar ve muhabir suşları genişletilmiş bir panel için sonuçların bir özetini sunar.

Bu p53 fonksiyonel heterojenliğin varlığı, TP53 germline mutasyonları olan konulardaki klinik düzeyde gözlenen heterojenlik gibi heterojenliğin paralelliği olup olmadığına dair bir keşif istenir. TP53 germline mutasyonları, daha şiddetli Li-Fraumeni (LFS) ve Li-Fraumeni benzeri (LFL) sendromları ve (FH) ile daha az şiddetli sendromsuz eğilimlerin dahil olmak üzere bir grup kanser yatkınlık bozukluklarının moleküler temelini oluşturmaktadır veya olmadan (FH) aile geçmişi46.

Protokol, tüm TP53 germline mutant alelleri 'in Maya tahlil tabanlı Transaktivasyon yeteneklerini IARC veritabanından karşılık gelen klinik verilerle eşleştirerek genotip-fenotip korelasyonlarını vurgulayarak < http://www-p53.iarc.fr/germline.html >. Fonksiyon kaybı p53 mutantlar daha şiddetli kanser meyil sendromlarında bulunmuştur, kısmi fonksiyon p53 mutantlar daha az şiddetli kanser meyil koşullarında bulunurken. Bu p53 kalan transaktivasyonu yeteneği TP53 mutasyonlar kalıtsal hastalarda klinik fenotip etkiler ve kanser geliştirilen gösterir25,26.

Res Içinde nükreotid dizileri varyasyonları p53 yönetir Transaktivasyon potansiyeli

Human p53 bir elasmobranchs (dimers dimer) TF olduğunu. Her p53 dimer bir RE 10 nükleotid (RRRCWWGYYY, R = A veya G oluşan tanır; W = A veya T; Y = C veya T)47,48. İki böyle yarı siteler ya bitişik veya dışında 13-20 nükleotidler tarafından aralıklı olabilir, işlevsel bir p53 Re oluşturmaktadır. Yine de, bir spacer ile p53 res p53 res daha düşük p53 benzeşimi ve Transaktivasyon ile karakterizedir bir spacer49,50, çeşitli sistemlerde farklı işlevsel deneyleri.

Bu son zamanlarda yarı siteleri p53 hemispecif51 ically bağlı olan tetramers işe olabilir göstermiştir, fonksiyoneldeneyleri ve kromatin immünoprecipitation çalışmaları ile birlikte, bu bulgular p53 aynı zamanda non-kanonik res hareket edebilir gösterir, yarı siteler ve üç çeyrek siteleri48,52. Ayrıca, tam uzlaşma p53 RE motif çok dejenere olduğu gerçeğini (RRRCWWGYYY)2 bireysel res önemli ölçüde sıra ve bağlayıcı benzeşimi farklı olabilir olasılığı prerakamlar. P53 hedef genlerinin yüzlerce insan genomu41,48, neredeyse tüm p53 res tespit edilmiştir göz önünde bulundurulduğunda birbirleri arasında özdeş olmayan sıra gösterdi. Ayrıca, farklı bir DNA bağlayıcı benzeşimi ile res hücre döngüsü tutuklama veya apoptoz53dahil p53 hedef genlerin Organizatör seçilir hipotez olmuştur.

Sabit bir genomik konumda p53 RE birçok varyantlarının Maya Analizi nükleotid türevleri etkisi kuruldu, spacer ve RE yarım siteler organizasyon Transaktivasyon kapasitesi49. Hatta, iki alelleri ile ilgili bir organizatör p5314,54,55için yanıt olarak farklı olan polimorfik p53 res keşfi yol açtı. Son zamanlarda, bilgi p53 Re sırası özellikleri ve Maya tabanlı transaktivasyonu potansiyeli p53 Retriever, yerelleştirmek ve kurallı ve standart dışı res hem Rank edebiliyoruz bir desen arama algoritması kodlu olmuştur türeyen, göre kendi Bütün insan genomu52boyunca tahmin Transaktivasyon potansiyelleri.

Serisine özgü p53 Transaktivasyon potansiyelini incelemek için tahlil kullanmanın bir örneği olarak, burada sunulan insan vahşi tip p53 ve Caenorhabditis elegans gelen evrimsel uzak p53 protein arasında bir karşılaştırma (Şekil 3). Bu sonuçlar p53 proteinleri arasında Transaktivasyon özgüllüğü evrimsel sapma56keşfedildi hangi bir son çalışmada bir takip vardır. İsogenic yLFM-RE muhabiri suşları protokolde açıklandığı gibi geliştirilmiştir. Özellikle, cep-1 p53 RE ced13 gen57türetilmiştir ve dört varyantları (v1-v4) karşılaştırıldı (Şekil 3A). Re türevleri iki decameric motifleri ayıran spacer uzunluğunu değişen etkisini incelemek için inşa edildi (hangi ced13 yılında, 28 nükleotis) ve cwwg çekirdek motif yan nükleotidler değişiklikleri incelemek için (hangi ced13, A/T zengin; en yüksek yakınlık insan p53 REs iken, G/C zengin)58. Sonuçlar açıkça nasıl Cep1 ve insan p53 Transaktivasyon özgüllüğü açısından sapmak gösterir. Aslında, insan p53-aracılı Transaktivasyon güçlü bir spacer varlığı tarafından engellenmiş iken (Şekil 3B), cep-1 aktivite spacer kaldırılması ile engellenir (Şekil 3c). Ayrıca, YENIDEN A/T-G/C-zenginden değiştirildiğinde cep-1-aracılı Transaktivasyon kaldırılmıştır. Ne insan p53 ne de cep-1 ced13 RE türetilen tek bir debekten transactivate olabilir.

P53-MDM2/MDMX etkileşimlerini ve mutant p53 aktivitesinin reaktitrörlerinin küçük molekül bozucular aranıyor

İnsan p53 büyüme inhibitör etkisi ve Maya aktivitesinin derecesi arasındaki kurulan korelasyon p53 aktivite üzerinde müdahale faktörlerin etkisini analiz etmek için Maya hücre büyümesi ölçümlerine dayalı basitleştirilmiş bir tarama tahlil yol açtı (Şekil 4 ). Potansiyel antikanser ajanları için ekrana Maya fenotipi tahlil etkinliğini çeşitli eserler gösterildi. P53 ve onun inhibitörleri MDM2 ve/veya MDMX, bu etkileşimlerin yeni kesiciler Maya hücreleri Co-ifade kullanarak p53 üzerinde MDMs olumsuz etkisini inhibe yeteneği tarafından tespit edildi, böylece yeniden oluşturma Wild-Type p53 kaynaklı Maya büyüme inhibisyonu ( Şekil 4A). Özellikle, bu tahlil Discovery yol açtı 1) pyranoxanthone 1 ilk p53-MDM2 etkileşim inhibitörü olarak bir xanthone iskele34 ve 2) oxazoloisoindolinone inhibitörleri p53-MDM2 etkileşim59. Ayrıca, bu tahlil ile, α-mangostin ve gambogik asit p53-MDM2 etkileşimi30potansiyel inhibitörleri olarak ilk kez tanımlanmıştır.

Daha sonra, aynı tahlil p53-MDM2 etkileşim60bozmak için becerilerin güçlendirilme konküller prenylation göstermiştir. İlginçtir, bu Maya tahlil de p53-MDM2/mdmx etkileşimleri iki inhibitörleri keşfi yol açtı: triptophanol-türevi oxazolopiperidone laktam oxaz-161 ve triptohanol-türeyen oxazoloisoindolinone DIMP53-162.

Maya hücre büyümesi üzerinde fonksiyon kaybı mutant p53 azaltılmış etkisi de mutant p53 için ekrana incelenmiştir-reaktivasyonu ilaçlar, mutant p53 (Şekil 4b) vahşi tip benzeri büyüme inhibitör aktivite geri yeteneği ile karakterize. Bu Maya tahlil ile, mutant p53 R280K bir reactivator, enantiomer triptophanol-türeyen oxazoloisoindolinone SLMP53-163, tespit edildi. Şekil 4c,D p53 ya da p53-MDM2 etkileşimi nutlin-3A Inhibitörü Ile veya p53 mutant Y220C PhiKan083 reactivator ile tedavi ile Maya elde edilen temsili sonuçları gösterir.

P53-aktive ajanlar yanı sıra onların antitümör aktivite olarak bu bileşiklerin eylem moleküler mekanizması doğrulama, insan tümörü hücre hatları hem de34,60,61,62,63 ve hayvan modelleri62,63, ilaç keşfi Maya fenotipi tahlil büyük potansiyele kanıtlıyor.

Figure 1
Şekil 1 : P53 muhabiri Maya suşlarının inşaatı için Maya bazlı p53 transaktivasyonu ve iş akışı özellikleri. (A) genom manipülasyon ve kontrollü ektopik Gen ifadesinin kolaylığı, p53 Transaktivasyon fonksiyonlarını incelemek için ilgili çeşitli değişkenlerin titizlikle keşfedildiği "in vivo test tüpüne" benzeyen bir Maya oluşturur. Bu değişkenler, vahşi tip veya Mutant p53 protein, RE dizisi ve muhabir geni türü [nitel/yarı nicel (örn., ADE2 ve lacz) veya nicel (örn., LUC1)] ifade düzeylerini içerir. Uzlaşma YENIDEN sırası son derece dejenere olduğunu (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purine; W = A/T; Y = pyrimidine; CWWG = çekırdek sırası, n = 0-13 bps spacer). Uzlaşma, çekirdek sırası ve temel çifti mesafe tutucular sayısı ile ilgili uyuşmazların sayıları Transaktivasyon etkinliğini etkileyecektir. Bu panel bir önceki yayın64güncellenmiştir. (B) ADE2 veya LUC1 muhabir gen ifadesi sürüş minimal Organizatör istenen p53 Re upstream tanıtmak delitto Perfetto yaklaşımı şeması. Protokol önceki yayınlardan12,15,16' ya uyarlanmıştır. (C) OLIGO Re entegrasyon bölgesini çevreleyen bölgenin Maya KOLONISI PCR Amplifikasyonunun sonuçlarının örneği. Elektroforez görüntü iki Putatif pozitif kolonilerin amplifikasyon sonucu sunar (URA3 eksi ve G418 duyarlı) ile ilgili PCR negatif kontrol 1 KB DNA merdiven (Promega) yanında. Tablo 3 ' te açıklanan astar kullanılarak beklenen ~ 500 NT Band, Electropherogram 'da gösterildiği gibi doğru promotör düzenlemeyi onaylamak için sıralanabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : P53 proteinleri yeniden spesifik ve sıcaklığa duyarlı Transaktivasyon potansiyelini gösterir. Wild-Type p53 ve belirtilen TP53 missense mutasyonlar Maya ve farklı p53 res ADE2 gen ifade kontrol liman muhabiri suşları sömürüyor nitel renk tabanlı muhabir tahlil kullanılarak test edildi. (A) Puma (BBC3) ile p53 Wild-Type, R175H ve R282W için koloni renk fenotipinin bir örneği ve 30 °c ' de P21-5 ' REs ve 37 °c ' de gösterilir. Orta (0,008% galaktoz) ve yüksek (0,12% galaktoz) p53 ifade karşılaştırılır. (B) üç sıcaklıklarda (24 °c, 30 °c ve 37 °C) p53 bağımlı koloni renk fenotipi için Incelenmiştir p53 mutantlar ve Maya muhabiri suşları genişletilmiş bir dizi ile elde edilen sonuçlar. Sonuçlar mutant p53 allelinin fonksiyonel heterojenliğini örneklenmiş ve bir tablo formatında özetlenmiştir. Örneğin, R175H bir işlev kaybı mutant, G199H ise Wild-Type p53 gibi. K139E ve R282W kısmi fonksiyonu korumak ve soğuk duyarlılık ve ısı hassasiyeti, sırasıyla sergiler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Human p53 ve yatırılmış ortoloğundan cep-1 sergi yüksek Transaktivasyon özgüllüğü ayrılmaktadır. (A) dizileri: Human p53 Re görüş sırası, cep-1 p53 Re ced13 geni türetilmiştir, ve dört varyantları (v1-v4) fonksiyonel testlerinde test edildi. (B) Transaktivasyon, düşük, orta ve yüksek ifade (% 0,008,% 0,032,% 0,12 galaktoz% 2 raffinose içeren seçici orta eklendi) elde etmek için üç farklı karbon kaynakları kullanarak 8 h Için insan p53 ifade inducing sonra ölçülmüştür. Sonuçlar ortalama bağıl ışık birimleri (RLU) ve dört çoğaltır standart hata olarak ifade edilir. Boş ifade vektörü ile dönüştürülmüş hücre için Reporter etkinliği dışarı çıkarılır. (C) Cep1 (B) cinsinden ölçülen transaktivasyonu özgüllüğü. Hem proteinler için, Transaktivasyon seviyeleri galaktoz miktarına orantılı oldu. İnsan p53 ifade edildiğinde ölçülen yüksek ışık üniteleri, protein uzunluğundaki fark ve potansiyel olarak da kodon kullanımı nedeniyle üretilen protein miktarlarının farklı seviyelere bağlı olabilir. İki protein farklı REs test karşı farklı Transaktivasyon özgüllüğü ile karakterize ve bu özellik göreli protein miktarı olası farklılıkları etkilenmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : P53 küçük molekül aktirekleri Maya fenotipik assay kullanılarak tespit edilmiştir. (A) p53-MDM2 ve p53-mdmx etkileşimlerinin inhibitörleri için arama yapmak üzere insan vahşi tipi p53 ve MDM2 veya MDMX 'i ortak ifade eden Maya hücreleri kullanılmıştır. Bu sistemde, etkileşim inhibitörleri Maya hücrelerinde p53 ve MDM2 veya MDMX Co-ifade p53 kaynaklı Maya büyüme inhibisyonu geri. Bu yaklaşım, p53-MDM2 etkileşiminin inhibitörlerinin tanımlanması ve p53-MDM2 ve p53-MDMX etkileşimlerinin çift inhibitörlerinin tanımlanması için izin verdi. (B) ınsan mutant p53 ifade Maya hücreleri mutant p53 reaktipilatörleri aramak için kullanılan ve mutant p53-ifade Maya hücrelerinde vahşi tip gibi p53 kaynaklı Maya büyüme inhibisyonu geri edebiliyoruz. (C) boş vektör (bkz. Adım 4,5) göre Maya kolonisi büyüme vahşi tip p53 veya Mutant Y220C etkisini gösteren plaka spot tahlil temsili görüntüler. (D) büyüme tahlil nicel sonuçlar: 10 ΜM nutlin-3A p53-indüklenen Maya büyüme inhibisyonu hücreler Co-ifade MDM2; 50 μM PhiKan083, mutant p53 Y220C için yaban tipi benzeri p53 kaynaklı Maya büyüme inhibisyonu geri yükler. Her iki efekt, yaban tipi p53, bir olarak ayarlanmış olan Maya büyüme inhibitör etkisi göreli olarak çizilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Strain adı ve genotip Spesifik kullanım Protokol numarası
Yafm-ıCORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 Yafm-Re gerginliği (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) bu qualitative, renk tabanlı ADE2 tahlil sömürücü. Protokol 1, 2
Ylfm-ıCORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 Bu Ilfm-Re gerinim inşaatı için kullanılır (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) bu nicel Luminescence tabanlı LUC1 tahlil sömürülüyor. Protokoller 1, 3
CG379: MATa, ADE5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [kil-O] Fenotipik büyüme tahlil için kullanılır. Protokol 4

Tablo 1: Maya suşları.

Medya adı ve tarifi Spesifik kullanım Protokol numarası
Ypda (2% maya özü,% 2 peptone,% 2 dekstroz, 200 mg/L adenin) + 2% agar Agar olmadan YPDA tercihen filtrasyon tarafından sterilize edilir. YPDA + agar otoklavlama ile sterilize edilir; tariften dekstroz atlamak ve plaka dökme önce su içinde% 20 filtre sterilize solüsyon dekstroz eklemek mümkündür. Protokoller 1-4
Cm [0,17% aa ve amonyum sülfat olmadan Maya azot tabanı, 0,5% amonyum sülfat,% 5 (hacim/hacim, v/v) esansiyel olmayan amino asit çözeltisi, 20 mg/l histidin, 20 mg/l triptofan, 20 mg/l urasil, 30 mg/l lizin, 100 mg/l lösin, 200 mg/l adenin] + % 2 galaktoz Medya filtreleme ile sterilize edilir. Aşağıdaki steril stok çözümleri su içinde hazırlanır (urasil hariç, bu 0.1 M NaOH içinde çözünür) filtreleme ile: esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (0,04% arginin, 0,04% metionin, 0,06% ısoleucine, 0,1% phenylalanine, 0,2% glutamik asit, 0,2% aspartik asit, 0,3% valine, 0,4% threonine, 0,8% serine), 1% histidin, 1% triptofan, 1% urasil, 1% lizin,% 1 lösin,% 0,5 adenin,% 20 galaktoz. Adenin stok çözeltisi, kristallerin oluşumu ve sedimantasyonu nedeniyle buzdolabında saklanmalıdır. Triptofan stok çözümü karanlıkta depolanmalıdır. Protokol 1
Cm (üstte görmek) + 2% Dextrose + 1G/L 5-FOA + 2% agar Medya (AA ve amonyum sülfat, amonyum sülfat ve agar olmadan Maya azot tabanı içeren) otoklavlama ile sterilize edilir. Diğer bileşenler ısı-Labile malzemeyi korumak için otoklavlama sonra eklenir; 5-FOA tozu yaklaşık 55 °C soğutulmuş bir kez doğrudan medyada eklenebilir. Protokol 1
Ypda + 400 μg/ml G418 + % 2 agar G418, medya yaklaşık 55 °c ' ye kadar soğutulduktan sonra otoklavlama sonrası eklenmesi gerekir. Tozdan başlayarak, bir 50 mg/mL G418 stok çözeltisi su içinde hazırlanabilir ve filtrasyon ile sterilize edilebilir. Protokol 1
Ypga [2% maya özü,% 2 peptone, 2% gliserol (v/v), 200 mg/L adenin] + 2% agar Medya otoklavlama ile sterilize edilir. Protokol 1
Sentetik seçici plaka: [0,17% AA ve amonyum sülfat olmadan Maya azot tabanı, 0,5% amonyum sülfat, 5% (v/v) esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (0,04% arginin, 0,04% metiyonin, 0,06% ısoleucine, 0,1% Fenilalanin, 0,2% glutamik asit, 0,2% aspartik asit, 0,3% valine, 0,4% threonine, 0,8% serine), 20 mg/l histidin, 20 mg/l uracile, 20 mg/l triptofan (vektör seçim İşaretleyiciye bağlı olarak), 30 mg/l lizin, 100 mg/ml lösin (vektör seçim İşaretleyiciye bağlı olarak), 5 mg/l veya 200 mg/l adenin] + 2% dekstroz + 2% agar Medya (AA ve amonyum sülfat, amonyum sülfat ve agar olmadan Maya azot tabanı içeren) otoklavlama ile sterilize edilir. Diğer bileşenler ısı-Labile malzemeyi korumak için otoklavlama sonra eklenir. PLS kullanırken-ve pLSG tabanlı vektörler leucine olmadan plakaları hazırlamak. PTS-ve pTSG tabanlı vektörler kullanırken triptofan olmadan plakalar hazırlamak. Protokoller 2-3
Sentetik seçici medya: [0,17% AA ve amonyum sülfat olmadan Maya azot tabanı, 0,5% amonyum sülfat,% 5 (v/v) esansiyel olmayan amino asit solüsyonu (0,04% arginin, 0,04% metiyonin,% 0,06 Isoleucin, 0,1% Fenilalanin,% 0,2 glutamik asit,% 0,2 aspartik asit, 0,3% valine,% 0,4 threonine, 0,8% serine), 20 mg/L histidin, 20 mg/l uracile, 20 mg/l triptofan (vektör seçim İşaretleyiciye bağlı olarak), 30 mg/l lizin, 100 mg/ml lösin (vektör seçim İşaretleyiciye bağlı olarak), 200 mg/l adenin] + 2% dekstroz veya bulunan Rafinoz + 0-2% galaktoz  Medya filtrasyon ile sterilize edilir. Kullanarak pLS-veya pTS-tabanlı vektörler ilaç tedavisinde löine veya triptofan olmadan medya hazırlamak, sırasıyla ama içeren 2% dekstroz. Plsg-veya ptsg tabanlı vektörünün indüklenebilir p53 ifadesinde veya ilaç tedavisi olmadan kullanıldığında, sırasıyla lösin veya triptofan olmadan medya hazırlayın, ancak p53 ifadesini modüle etmek için% 2 bulunan Rafinoz ve değişken miktarda galaktoz içerir. P53 indüksiyon kapsamı da inkübasyon süresini değiştirerek modülasyonlu olabilir. Protokol 3
Minimal seçici plakalar: % 2 glikoz, 0,7% Maya nitrojen tabanı (amino asitler ve amonyum sülfat olmadan), 50 mg/l adenin, 50 mg/l urasil, 50 mg/l histidin, 50 mg/l triptofan (vektör seçim işaretleyicisine bağlı olarak), 50 mg/l lösin (bağlı olarak vektör seçim işaretçisi),% 2 agar Orta otoklavlama ile sterilize edilir. PLS89 tabanlı vektörler kullanırken triptofan olmadan orta hazırlayın. PLS89-Empty vektörü (herhangi bir proteini ifade etmiyor) negatif kontrol olarak kullanın. PLS89 tabanlı ve pGADT7-MDM2 vektörler (p53 ve MDM2 Co-ifade) kullanırken, lösin ve triptofan olmadan orta hazırlayın. PLS89-Empty ve pGADT7 (her ikisi de herhangi bir protein ifade değil) negatif kontroller kullanın. PLS76 tabanlı vektörler kullanırken orta leucine olmadan hazırlayın. PRS315 vektörü (herhangi bir proteini ifade etmiyor) negatif kontrol olarak kullanın. Protokol 4
Minimal seçici Orta: minimal seçici plakalar olarak ama agar olmadan Orta filtrasyon ile sterilize edilir. Protokol 4
Seçici indüksiyon Orta: minimal seçici orta ama glikoz yerine% 2 galaktoz içeren Orta filtrasyon ile sterilize edilir. Protokol 4

Tablo 2: Maya medya.

Çözüm adı ve tarifi veya astar adı ve sırası Belirli özellikler ve kullanım Protokol numarası
Liac/te: 10 mm Tris-HCL, pH 8,0, 1 mm EDTA ve 0.1 m Lityum asetat ile Su içinde aşağıdaki steril stok çözümleri autoclaving ile hazırlanır: 1M Lityum asetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE tampon 10X). Protokoller 1-4
Peg/LiAc/te: 40% Polietilen glikol (PEG) 10 mm Tris-HCL, pH 8,0, 1 mm EDTA ve 0,1 M Lityum asetat Suda aşağıdaki steril stok çözümleri otoklavlama ile hazırlanır: 1 M Lityum asetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE tampon 10X),% 50 PEG (moleküler ağırlık ~ 3350). Protokoller 1-4
RE oligonucleotides için Homoloji kuyrukları:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
Sağlanan Homoloji kuyrukları dizisidir, entegre ıCORE kaseti karşı kromozomal dizileri karşılık gelen; RE = RE sırası. Protokol 1
Primers: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
YAFM-RE gerilme (PCR ve sıralı) için Ade2 RV astar ile Ade2 FW birleştirin. İçin yLFM-RE strain (PCR ve sıralı) birleştirmek Ade2 fw ile Luc1-RV astar. Protokol 1

Tablo 3: çözümler ve oligonükleotidler.

Vektörler türleri Pozitif ve negatif kontroller Protokol numarası
P53 (veya kontrol) vektörler.
pLS-veya plsg tabanlı: p53 protein ifadesi altında kurucu ADH1 Organizatör veya galaktoz indüklenebilir GAL1 Organizatör, sırasıyla (LEU2 seçim işaretçisi).
pTS veya ptsg tabanlı: p53 protein ifadesi, sırasıyla (TRP1 seçim işaretçisi olarak) kurucu ADH1 Organizatör veya galaktoz indüklenebilir GAL1 Organizatör altında
pLS-ve pLSG tabanlı: pLS76 ve pLSG-p53 vektörler (Wild Type p53 ifade), sırasıyla pozitif kontrol olarak kullanın; negatif kontrol pRS315 vector (herhangi bir protein ifade değil) olarak kullanın.
pTS ve pTSG tabanlı: pTS76 ve pTSG-p53 vektörler (Wild Type p53 ifade), sırasıyla pozitif kontrol olarak kullanın; negatif kontrol pRS314 vector (herhangi bir protein ifade değil) olarak kullanın.
Protokol 2, 3
P53 ve MDM2 (veya kontrol) vektörler.
pLS89 tabanlı: galaktoz indüklenebilir GAL1 Organizatör altında vahşi tip p53 protein ifadesi (TRP1 seçim işaretçisi olarak).
pLS76 tabanlı: kurucu ADH1 organizatör (LEU2 seçim işaretçisi) altında mutant p53 protein ifadesi.
pGADT7 tabanlı: MDM2 protein ifadesi altında kurucu ADH1 organizatör (LEU2 seçim işaretçisi olarak)
pLS89 tabanlı: pLS89-p53 vektörü (Wild Type p53 ifade eden) pozitif kontrol olarak kullanın; negatif kontrol pLS89-Empty (herhangi bir protein ifade değil) olarak kullanın.
pLS76 tabanlı: pLS76-mutant p53 vektörü (mutant p53 ifade) pozitif kontrol olarak kullanın; negatif kontrol pRS315 vector (herhangi bir protein ifade değil) olarak kullanın.
pGADT7 tabanlı: pGADT7-MDM2 vektörü (Wild Type MDM2 ifade eden) pozitif kontrol olarak kullanın; negatif kontrol pGADT7 vector (herhangi bir protein ifade değil) olarak kullanın.
Protokol 4

Tablo 4: Maya ifade vektörler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Maya tabanlı konular p53 protein fonksiyonlarının çeşitli yönlerini araştırmak için yararlı olduğunu kanıtladı. Bu değerlendirme, fonksiyonel polimorfizmlerinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere RE hedef sitelerin türevleri doğrultusunda p53 Transaktivasyon potansiyelini değerlendirmek için özellikle duyarlıdır. Renkli gazetecilerin kullanımı yanı sıra Lusiferaz tahlil sonucu minyatürleşme maliyet-etkili ve nispeten ölçeklenebilir gösteriyor. Ayrıca, büyüme inhibisyonu testi potansiyel kimyasal Kütüphane taramasında kullanılmak üzere, emme ölçümü ile Maya hücre canlılığı kantifikasyon otomatikleştirme için imkan sağlar. Hücre duvarı ve ABC taşıyıcıları eylem nedeniyle sınırlı geçirgenlik ilaç taraması için Maya kullanarak bir sınırlama olarak kabul edilirken, alma geliştirmek için genetik değişiklikler başarıyla geliştirilen22,65.

Memeli hücre tabanlı testlerle karşılaştırıldığında, Maya tabanlı p53 tahlil doğrudan isabet tanımlaması artırabilir, verilen p53 Kofaktörler inanılmaz karmaşıklığı izole ve yüksek Ökaryotlar fonksiyonları modüle Cascade yolların sinyalizasyon. Maya tabanlı fonksiyonel bilgiler de kısmen p53 protein Kofaktörler (yani MDM2 ve mdmx22,32,33,34) ve etkisi ile etkileşimi izleme başarılı olmuştur küçük molekülleri (Nutlin-3A gibi) bu etkileşimler üzerinde. Ancak, p53 ve etkileşen proteinler arasındaki çarpıtmayı araştırmak için Maya tabanlı incelemelerle ilgili duyarlılık ve öngörü gücü, bu etkileşimlerin Post-translasyonel değişikliklere nasıl bağlı olduğuna bağlı olarak biraz sınırlı olabilir. türe özgü sinyalizasyon Cascades.

Burada açıklanan sistemler, diğer TFs 'ye kolayca adapte edilebilir. Nitekim, Maya fonksiyonel asder p53 ilgili P63 ve P73 proteinleri42,49 yanı sıra NF-κB aile66,67 [ya da bazı Homeobox ve temel Helix-döngü-Helix (bhlh) üyeleri için geliştirilmiştir TFs68,69]. İnsan nükleer reseptörleri de Maya ifade edilmiştir ve ligand bağımlı olarak çalışmak üzere kanıtlanmış, serisine özgü TFs70. Bir sınırlama faktörü bazı memeliyle Transaktivasyon alanı (tad) zayıf kapasitesinde Maya bazal transkripsiyon makine8, aktif bir dahil olmak üzere kimerik yapıları kullanarak üstesinden gelebilir bir eksiklik ile etkileşim belirlendi heterolog tad68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Acknowledgments

Biz Avrupa Birliği (FEDER fonları POCI/01/0145/FEDER/007728 programa Operacional factores de rekabet Vidade YARıŞıN) ve ulusal fonlar (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia ve Ministério da Educação e Ciência) altında teşekkür Ortaklık Anlaşması PT2020 UID/QUI/50006/2019 ve projeler (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT burs: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Bu çalışma Compagnia S. Paolo, Torino, Italya (Project 2017,0526) ve Sağlık Bakanlığı, (proje 5x1000, 2015 ve 2016; güncel araştırma 2016) tarafından destekleniyordu. Video kaydı ile ilgili yardım almak için Dr. Teresa López-Arias Montenegro 'ya (Trento Üniversitesi, Deneysel Bilimler Öğretim laboratuvarları) derinden teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics