Усвоение новых липидов покрытием наночастиц, содержащих Falcarindiol, мезенхимальных стволовых клеток человека

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Эта статья описывает инкапсуляции falcarindiol в липидной оболочкой 74 Нм наночастиц. Клеточного поглощения наночастиц, стволовых клеток человека в липидного капель контролируется флуоресцентные и конфокальная томография. Наночастицы изготавливаются методом быстрой инъекции растворителя ветра, и их размер измеряется с методом динамического рассеяния света.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Наночастицы находятся в центре внимания повышенный интерес в системах доставки препарата для лечения рака. Липидов покрытием наночастиц вдохновлены в структуре и размер липопротеидов низкой плотности (LDL) потому, что раковые клетки имеют повышенная потребность холестерина размножаться, и это была использована как механизм для доставки противораковые препараты рака клетки. Кроме того в зависимости от наркотиков, химия инкапсуляции препарат может быть выгодным, чтобы избежать деградации препарата во время циркуляции в естественных условиях. Таким образом, в этом исследовании, эта конструкция используется для изготовления липидов покрытием наночастиц противораковый препарат falcarindiol, обеспечивая потенциал новой системы доставки falcarindiol для того чтобы стабилизировать его химическое строение против деградации и улучшить его поглощение опухоли. Falcarindiol наночастиц, с фосфолипидов и холестерина монослоя, инкапсулирующий ядро очищенного препарата частицы, были разработаны. Однослойные покрытия липидов состоит из 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), холестерин (Чхоль) и 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) наряду с люминесцентные Метка DiI (молярное соотношение 43:50:5:2). Наночастицы изготовлены с использованием метода быстрой инъекции, который является быстрый и простой способ осадок наночастиц, хорошо растворитель для обмена анти растворителя. Он состоит из быстрого введения этанола раствор, содержащий компоненты наночастиц в водной фазе. Размер наночастиц флуоресцентные измеряется с помощью динамического рассеяния света (DLS) на 74,1 Нм ± 6,7. Поглощение наночастиц испытывается в мезенхимальных стволовых клеток человека (использования) и образы, используя флуоресценции и confocal микроскопии. Поглощение наночастиц наблюдаются в использования, предлагая возможности для такой системы доставки стабильного наркотиков для falcarindiol.

Introduction

Липидов покрытием наночастиц наблюдаем повышенный интерес относительно их функция как систем доставки препарата для терапии рака1. Опухоли имеют изменения метаболизма липидов перепрограммирования2 и повышенная потребность в холестерин размножаться3. Они overexpress LDL1 и в более LDL, чем нормальные клетки, в той степени, в какой больной раком ЛПНП игр может даже пойти вниз4. ЛПНП поглощение способствует агрессивная фенотипов5 приводит к распространению и вторжения в груди Рак6. Обилие рецепторов ЛПНП (LDLRs) является индикатором прогностические метастатического потенциала7. Вдохновленный ЛПНП и его поглощение раковых клеток, Новая стратегия называется: сделать выглядеть как пища рака наркотиков8. Таким образом эти новые наночастиц наркотиков доставки образцов8,9,10 были вдохновлены стабилизировать ядро и липидов дизайн природных LDL11 как механизм для доставки противораковые препараты для раковых клеток. Этот пассивный ориентации системы доставки поддерживает инкапсуляцию, особенно, гидрофобные наркотиков, которые обычно даются в форме устной дозировке, но обеспечивают лишь небольшое количество наркотиков в кровь, так что ограничение их ожидаемой эффективности12. Как с стелс липосомы13, полиэтиленгликоль (PEG) покрытие помогает уменьшить иммунологического ответа и расширяет циркуляции в крови для оптимального опухоли поглощения, якобы более проникновение и эффект удержания (EPR) 14 , 15. Однако, в дополнение к, в некоторых случаях, нестабильность в циркуляции и нежелательных распределения в системе16, некоторые препятствия остаются нерешенными, например, каким образом и в какой степени такие наночастицы принимаются клетки и что такое их внутриклеточного судьба. Именно здесь, что этот документ рассматривается наночастиц поглощение гидрофобные противораковый препарат falcarindiol, с помощью конфокальной и эпифлуоресцентного методы визуализации.

Цель исследования – для изготовления липидов покрытием наночастиц falcarindiol и изучить их внутриклеточного поглощения в использования. Таким образом, потенциально стабилизации своей администрации, преодоление проблем, связанных с доставкой и повышение биодоступности. Таким образом, оценка новой системы доставки для этого противораковый препарат. Ранее falcarindiol были администрируемых устно через falcarindiol высокой концентрации очищенный как дополнение питания17. Однако существует необходимость более структурированный подход к доставить этот перспективный препарат. Таким образом falcarindiol наночастиц, фосфолипидов и холестерина, инкапсулируя монослой с очищенного препарата, составляющие ядро частицы, были разработаны. Метод быстрого введения растворителя ветра, как недавно разработанный Needham et al. в этом исследовании используется 8, для инкапсуляции полиацетилена falcarindiol.

Этот метод ранее использовался для изготовления липидов наночастиц для инкапсуляции диагностических изображений агентов18,19, а так же проверить молекул (линоленовой)27 и наркотиков (орлистат, niclosamide стеарат)8 ,27,28. Это относительно простой метод, когда осуществляется с правом молекул. Он образует наноразмерных частиц, на пределе их критического нуклеации (диаметр ~ 20 Нм), высоко нерастворимых гидрофобные растворенных веществ, растворенных в Полярный растворитель. Растворителя обмен осуществляется путем быстрого инъекции раствора органического в избытке antisolvent (обычно, водной фазе в органических 1:9: соотношение Водный объем)20,21.

Композиционный дизайн наночастиц порождают множественные преимущества. DSPC:Chol компоненты обеспечивают очень плотный, почти непроницаемой, биосовместимых и биологически монослоя. КОЛЫШЕК обеспечивает труднодоступных стабилизирующим интерфейс, который действует как щит от опсонизацию, иммунной системы, замедление любой поглощение ретикулоэндотелиальной системы (печень и селезенка) и защита от одноядерных фагоцитарной системы, предотвращая их удержание и деградации иммунной системой и следовательно, увеличивая их циркуляции тайм в крови22. Это позволяет частицам распространить до тех пор, пока они extravasate на больные места, таких как опухоли, где протекающая сердечно-сосудистой системы, позволяя ЭПР эффект привести к пассивной накопления частиц. Кроме того слой липидов позволяет иметь лучший контроль над наночастиц размер кинетически треппинг ядро его измерения критических ядро27,28. Липиды побудить различные свойства поверхности (включая ориентации, пептид, который еще не был доступен для этого проекта), чистый препарат ядра и низкой полиизопрена22,27,28. Метод, используемый для анализа частиц размером является DLS, техника, которая позволяет исследователям для измерения размера большого числа частиц в то же время. Однако этот метод может смещения измерения до больших размеров, если наночастиц не монодисперсными23. Этот вопрос оценивается с липидный слой также. Более подробную информацию об этих основных конструкций и количественная оценка всех характеристик приведены в других публикаций27,28.

Препарат, инкапсулированные в наночастиц является falcarindiol, пищевые полиацетилена, найдено в растения из семейства зонтичные. Это вторичные метаболиты из алифатических C17полиацетилен типа, который был найден для отображения здоровь повышая влияния, включая противовоспалительной активностью, антибактериальный эффект и цитотоксичность против широкого спектра линий клеток рака. Его высокая реакционная способность связана с его способностью взаимодействовать с различными биомолекул, действуя как очень реактивной алкилирующий агент против меркапто и амино группы24. Falcarindiol ранее было показано, уменьшить количество опухолевых поражений в Колон-17,25, хотя биологические механизмы до сих пор неизвестны. Однако это мысль, что он взаимодействует с биомолекулами например NF-κB, COX1, так, COX-2, и подчеркнуть, цитокины, подавляя их опухоли прогрессии и клеток распространения процессов, привело к аресту клеточного цикла, эндоплазматический ретикулум (ER) и апоптоза 17,26 в раковых клетках. Falcarindiol используется в данном исследовании, как пример противораковые наркотиков благодаря противоопухолевой потенциал и механизм в настоящее время изучаются, и потому что он показывает многообещающие противораковые эффекты. Клеточного поглощения наночастиц испытывается в использования и образы с помощью эпифлуоресцентного и confocal микроскопии. Этот тип ячейки был выбран из-за ее большого размера, что делает их идеальными для микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. наночастицы синтез быстрого растворителя ветра техника

  1. Настройка следующих наночастиц подготовки: блок отопителя/образец концентратор, сушильный шкаф, цифровой дозатор с 1 мл шприц стекла, стекло 12 мл во флаконе, Магнитная мешалка, магнитные блоху (15 x 4.5 мм, в цилиндрическую форму с покрытие из политетрафторэтилена [PTFE]) внутри стеклянный флакон и вращательное испарителя.
  2. Отказаться от 2,4 мл акций 250 мкм falcarindiol растворяют в 70% EtOH смесь воды в пузырек сцинтилляционные.
  3. Испарения жидкой фракции, используя концентратор образца для приблизительно 4 ч, чтобы получить сухой falcarindiol.
    1. Вставить сцинтилляционные флакона в блок отопителя; Образец концентратор поставляет газ над образца с помощью иглы из нержавеющей стали, концентрации образца. Испарения при комнатной температуре; не используйте тепло.
  4. После того, как сушеные, добавьте следующие компоненты липидного покрытия в пробирку вышеупомянутых сцинтилляционные: 16.3 мкл 31.64 мм DSPC хлороформ Стоковый раствор, 3.4 мкл 17,82 мм DSPE PEG 2000 хлороформ Стоковый раствор, 24 мкл акций холестерина хлороформа 25 мм решение и 6 мкл 4 мм DiI хлороформ Стоковый раствор. После добавления каждого компонента, чтобы избежать перекрестного загрязнения очистите шприц с хлороформом.
    Предупреждение: Немедленно закройте флаконах, содержащих липидов, так что растворитель не испаряться и, таким образом, изменения концентрации. Работа в зонта.
    Примечание: Концентрации метилхлороформа фондовых решений может варьироваться, в зависимости от химической поставщика или разведения в лаборатории.
  5. Оберните ампулу с алюминиевой фольгой, чтобы защитить DiI от света. Оставьте на ночь образца в эксикатор для испарения хлороформ.
  6. Растворите сморщившимися образца в абсолютного этанола в окончательный объем 1,2 мл, которая дает окончательное концентрации DSPC, DSPE ПЭГ-2000, холестерин и DiI 0,43 мм, 0,05 мм, 0,5 мм и 0,02 мм, соответственно. Это решение представляет собой органические фазы.
  7. Взять стакан 12 мл во флаконе, заполнить его с 9 мл очищенной воды и, добавьте магнитные блох в пробирку, содержащую 9 мл воды. Держите флакон на магнитной мешалкой, помешивая на 500 об/мин (рис. 1).
  8. Прикрепите шприц 1 мл стекла к системе дозирования и очистить его с хлороформом, чтобы избежать любого загрязнения. Это медленно потянув хлороформ в стеклянный шприц и дозирования вручную в Тимс сборщика отходов по крайней мере 10.
    Предупреждение: Это должно быть сделано под вытяжного шкафа.
  9. Премьер шприц с этанолом. Грунтование заменяет старый растворителя, а также удаляет любые воздушные пузыри.
    Предупреждение: Это должно быть сделано под вытяжного шкафа.
  10. С помощью шприца, аспирационная 1 мл органические фазы.
  11. Вставьте шприц в стеклянный флакон, вплоть до середины 9 мл водяной знак и поддерживать устойчивый в середине флакона (как показано на рис. 1).
  12. Внедрять решение на выбранной скорости впрыска (833 мкл/s), нажав кнопку дозировки на дозатор (рис. 2). Это создает 10 мл 50 мкм липидов покрытием наночастиц falcarindiol в 10% этанола содержащих воду.
    Примечание: Эта скорость инъекции было установлено для достижения мельчайшие частицы, получение узкий гранулометрический состав. Важно, чтобы убедиться, что шприц находится в центре, устойчивый и прямо при решении.
  13. Сразу же после инъекции удалить флакон с мешалкой и передать образец раунд нижней колбе 50 мл (РБФ).
  14. Прикрепите РБФ роторный испаритель и испарится 1 мл органического растворителя, используя роторный испаритель при комнатной температуре. Избегайте образования избыточного пузырь.
    Примечание: Этот шаг займет ~ 5 мин.
  15. Передать наночастиц подвеска от РБФ еще 12 мл флаконе стекла. Убедитесь, что объём 9 мл. Разделение образца в два 12 мл стеклянных флаконах (поставить 4,5 мл в каждом).
  16. Добавьте 0,5 мл ультрачистая вода один из флаконов и 10 x фосфат амортизированное saline (PBS) для других флакон 0,5 мл. Взять 1 мл каждого образца для измерения размера частиц.

2. частица размер анализ с помощью метода DLS

Примечание: Размер измерения проводились с помощью анализатора DLS, который определяет распределением размера частиц. Он оснащен 100 МВт лазер, который работает на длине волны 662.2 Нм и с лавинный фотодиод детектор под углом 90° на инцидент угол. Луч разбросаны наночастицами и обнаружен фотоприемника.

  1. Включите инструмент DLS и установите желаемую температуру при 20 ° C, до тех пор, пока она стабилизируется.
  2. Установите параметры инструмента следующим образом: время приобретение данных = 4 s, количество приобретений = 30, функция auto затухания = On и auto затухание сроки = 0.
  3. Заполнить пластиковый кювета с 1 мл суспензии наночастиц и начать измерение.
  4. Доклад полученный размер в зависимости от использованного растворителя (вода или PBS).
    Примечание: Чтобы иметь приблизительное представление о размера ячеек в среде при лечении клетки производится измерение в PBS. Клеток лечение будет осуществляться с наночастицами, растворенных в воде.
  5. Повторите измерения 24 ч после синтеза, чтобы проверить для агрегации частиц.

3. клеток лечение

  1. Увеличение использования минимальных основных средних (MEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина, в камере гумифицированный при 37° C с 5% CO2.
    Предупреждение: Работа в стерильных Ламинарный шкаф для шагов, 3.1, 3.2 и 3.3.
  2. Семя примерно 50 000 клеток для получения плотность ячеек примерно 30% на ранее абсолютная EtOH стерилизовать coverslips #1.5 помещены в 6-ну пластины. Чтобы иметь окончательный объем 3 мл в каждую лунку добавьте MEM. Инкубируйте 24 h на тех же условиях, как и шаг 3.1. Семя клетки 24 ч до начала лечения.
    Примечание: Очень важно, что клетки являются семенами по крайней мере 24 часа перед началом лечения наночастиц, чтобы убедиться, что клетки находятся в адекватных слияния.
  3. Без удаления средство, добавить 3 мкл раствора наночастиц, для окончательного falcarindiol концентрации 5 мкм. инкубировать за 24 ч в тех же условиях, как и шаг 3.1.
    Примечание: Наночастиц подготовка была проведена в день лечения, чтобы избежать агрегации частиц.
  4. Впоследствии, после 24 ч лечения, вымыть клетки 2 x с PBS, исправить их в 4% формальдегида 10 мин при комнатной температуре и хранить их в PBS на 4° C до несколько месяцев до записи образа.
    Предупреждение: Это должно быть сделано под вытяжного шкафа.
    1. Кроме того после фиксации, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядерных окрашивания могут быть выполнены. Для этого, после фиксации клетки, разрушения их с 0.1% тритон X-100 на 30 мин, мыть их 2 x с PBS и выведение их с 250 мкл 300 Нм DAPI за 5 минут, защищенном от света.

4. микроскопия

  1. Микроскопии флуоресцирования
    1. Используйте widefield флуоресценции микроскоп оснащен электронно умножить CCD камера для получения изображений. Используйте 150 x 1,45 NA нефти цели и канал GFP LP.
  2. Конфокальная микроскопия
    1. Приобрести confocal микроскопии изображений, используя 63 x NA 1.4 нефти цель, Аргонового лазера (514 Нм) для ДИИ и двух Фотон лазер (780 нм) для DAPI, чтобы проверить усвоение наночастиц в клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Два различных видов наночастиц были сфабрикованы, а именно: чистый falcarindiol наночастиц и липидов покрытием falcarindiol наночастиц. Были протестированы различные концентрации холестерина и липидов. Как показано в таблице 1, немелованной наночастиц в воде и измеряется в PBS имели диаметр 71 Нм ± 20,3 с индексом полиизопрена (PDI) 0.571. Эти параметры были измерены на DLS анализатора. Липидов покрытием наночастиц falcarindiol, используемых в экспериментах и поэтому включая Люминесцентную краску, дии, были аналогичного размера, а именно 74,1 Нм ± 6,7; Однако они были найдены, чтобы быть относительно монодисперсными и Нижняя PDI 0.182, который указывает меньше распределение размеров частиц, так как PDI описывает размер распределение населения наночастиц. Как правило PDI ниже 0,3 желательно при изготовлении наночастиц для фармацевтических целей.

После изготовления размер частиц была измерена после 3 h и 24 h, раз на основании задержки, необходимой для добавления наночастиц в культуре клеток. Агрегирование не выполняется наблюдалось после 24 ч, однако данные не отображается в этой рукописи, как сообщалось в другом исследовании, и рекомендуется для проверки стабильности частиц после 24 ч. После подтверждения стабильности размер наночастиц липидов покрытием, помечены дии, липидов покрытием наночастиц были сфабрикованы, следуя протоколу и, в конечном счете, использоваться для изучения поглощения. Для каждого исследования был подготовлен образец свежие наночастиц. Схематическое изображение структуры окончательного falcarindiol наночастиц показан на рисунке 3и частицы размер данных после того, как изготовление показано в таблице 1, а также измерение 3 ч после изготовления.

Как первое наблюдение наночастиц внутри клетки эпифлуоресцентного микроскопии изображений были приобретены после 24 часов лечения. Наночастицы были визуализируется как белые яркие точки, и можно предположить, что наночастицы были расположены внутри клеток, окружающих ядро (рис. 4A).

Чтобы убедиться, что наночастицы falcarindiol вступил клетки, конфокальная микроскопия была выполнена на лечение за 24 ч. Confocal использования изображений подтвердил, что наночастицы вступил клетки, и большое количество наночастиц были разбросаны в цитоплазме в Каждая клетка (Рисунок 4B-D). Эти результаты показывают, что наночастицы выступать в качестве системы доставки стабильного наркотиков для falcarindiol.

Figure 1
Рисунок 1 : Установки подготовки наночастиц, показаны Ассамблеи для инъекций при помешивании27. Установка состоит из autopipette с 1 мл шприц стекла, заполнены с 1 мл спиртового раствора, содержащего наночастицы компонентов. Стеклянный флакон содержит 9 мл воды и магнитные блошиный помещается на магнитной мешалкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Схема смешивания растворителей в метод быстрого введения растворителя ветра:27. Панели показывают инъекции 1 мл спиртового фазы, содержащих наночастицы компонентов со скоростью 833 мкл/s 9 мл воды помешивая на 500 об/мин. Быстрое инъекции с хаотичной смешивания спиртового раствора, содержащего наночастицы компоненты (falcarindiol, DSPC, холестерин, DSPE PEG 2000, дии) в antisolvent (вода), leadd на формирование наночастиц. Цвет задаётся DiI. Можно наблюдать, как смешанные спиртового раствора, быстро увеличивая его концентрацию и наночастиц образуются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Схема структуры окончательного falcarindiol наночастиц. Структура наночастиц, включая DSPC, DSPE ПЭГ-2000, холестерина, DiI и falcarindiol. Различные компоненты, масштабируются в соответствии их концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Изображения наночастиц липидов покрытием falcarindiol в мезенхимальных стволовых клеток человека. (A) эпифлуоресцентного микроскопия image использования относились с наночастицами falcarindiol за 24 часа. Следующие панели показывают confocal микроскопии изображений использования, относились с falcarindiol наночастицы для 24 пятно DAPI h: (B) ядер, наночастицы и (D) наложение оба изображения, ядер DiI (C) показаны синим цветом и наночастицы в красный цвет. Масштаб гистограммы являются 10 мкм. наночастицы визуализируются как белые яркие точки в цитоплазме клетки. Изображения показывают, что большое количество наночастиц ввели клетки после 24 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Тип наночастиц Растворитель Размер наночастиц (Нм) Polydisperisty (Нм) Полиизопрена индекс (PDI)
Без покрытия Falcarindiol Воды 83.9 ± 23,9 0.571
PBS 71 ± 20,3 0.571
Липидов с покрытием Falcarindiol PBS 91,6 ± 6,4 0.141
PBS после 3h 93.5 ± 5,7 0.122
Липидов с покрытием Falcarindiol + дии PBS 74.1 ± 6,7 0.182

Таблица 1: различные конструкции изготовлены наночастиц. Размер и полиизопрена индекс наночастиц синтезированных falcarindiol, в зависимости от типа растворителя и наночастиц. Falcarindiol наночастиц с и без слой липидов были сфабрикованы. Были протестированы различные концентрации компонентов пальто. Агрегирование частиц был испытан через 3 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подробный протокол для изготовления липидов покрытием наночастицы для доставки лекарств с простой, быстрый, воспроизводимые и масштабируемых быстрого инъекционный метод жидкостной перехода был затем27,28 и представлен в этом документе, как применяется для falcarindiol. Управляя скорость инъекции органические фазы в водной фазе и, используя покрытие липидов в соответствующих концентрациях для пальто falcarindiol ядра элементарных частиц в диапазоне суб-100 Нм может быть получен успешно. Возможность индуцированных полиизопрена вследствие участия турбулентного смешения для falcarindiol осадков только контролировался присутствие покрытие липидов. Структура этих липидов покрытием наночастиц напоминала липопротеидов низкой плотности с исключением исключения родной 500000 кДа ApoB100 и дополнительного присутствия PEG-липиды для их пространственной стабильности). Эта система доставки пассивно целевых наркотиков позволяет инкапсуляции широкий спектр особенно гидрофобные лекарств и диагностических материалов18,19снижение иммунологической реакции и увеличивая накопление в Раковые ткани16,18. Кроме того в зависимости от деградации наркотиков реакций (например, гидролиз, enzymolysis), система доставки наркотиков защищает препарат от деградации во время своего обращения в естественных условиях.

Таким образом falcarindiol наночастиц, с липидов инкапсуляции монослоя, содержащие ядро чисто очищенного препарата, были разработаны и изготовлены. Однослойные покрытия липидов состоял из DSPC, холестерин и DSPE-ПЭГ-2000, с флуоресцентные метки DiI. Изготовление частиц было проведено с помощью метода быстрой инъекции растворителей ветра, который состоит из быстрого введения спиртового раствора, содержащего наночастицы компонентов в избыток водной фазы (1:9). Размер наночастиц была измерена с помощью DLS, и поглощение наночастиц рассматривался в использования и образы, используя флуоресценции и confocal микроскопии.

Можно также получить немелованной наночастиц, с размерами 71 Нм ± 20,3. Однако после выполнения протокола, описанных выше, наночастицы 74,1 Нм ± 6,7 Нм, с ценностями полиизопрена 0.182, были сфабрикованы. Таким образом, после изменения наночастиц, добавив слой липидов, размер и ДПИ наночастиц было сокращение, делая их более подходящими для наркотиков доставки.

Важно быть хорошо известно о критических шагов в протоколе, как важность позиции шприц при внутривенном введении органические фазы, подготовка наночастиц в тот же день лечения во избежание агрегации и заполнения ячеек за день до для обеспечения адекватного слияния уровня. В самом деле все шаги в первой части протокола может считаться критической, как они либо влиять на размер наночастиц или конечная концентрация активного соединения и покрытие липидов. Считая важным параметром «концентрации», шаги, 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 и 1.16 являются критическими. Учитывая «наночастиц размер» как важный параметр шаги 1.7, 1.11 и 1.12 имеют решающее значение.

Флуоресценции и конфокальная микроскопия показала, что наночастицы вступил клетки, и большое количество наночастиц были разбросаны в цитоплазме каждой ячейки. Эти результаты показывают, что наночастицы, разработанный в этом исследовании может функционировать как система доставки новой и стабильной наркотиков для falcarindiol.

Этот метод обеспечивает простой, быстрый и воспроизводимый подход для инкапсуляции различных рака наркотиков, и ограничения метода оцениваются с пальто липидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят за мезенхимальных стволовых клеток человека д-р Мустафа Кассем (Больница университета Оденсе, Дания). Авторы благодарят датский медицинский центр Bioimaging для доступа к их микроскопы. Авторы благодарят Carlsberg и Виллум основы для финансовой поддержки (для E.A.C.). Авторы признают финансовую поддержку, оказываемую премии профессора Нильса Бора от датского национального фонда научных исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
  2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
  3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
  4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
  5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
  6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
  7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
  8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
  9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
  10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
  11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
  12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
  13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
  14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
  15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
  16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
  17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
  18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
  19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
  20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
  21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
  22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
  23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
  24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
  25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
  26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
  27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
  28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics