人骨髓间充质干细胞吸收含有法卡林多醇的新型脂质包覆纳米颗粒

Bioengineering

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Summary

本文介绍了在脂肪包覆74纳米纳米粒子中的黄他醇的封装。通过荧光和共聚焦成像技术监测人干细胞对纳米颗粒的吸收。采用溶剂移位快速注射法制备纳米粒子, 并采用动态光散射技术对其尺寸进行了测量。

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Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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Abstract

纳米粒子是人们对癌症治疗药物输送系统越来越感兴趣的焦点。低密度脂蛋白 (ldl) 在结构和大小上都能激发脂肪包膜纳米颗粒, 因为癌细胞对胆固醇增殖的需求增加, 而这已被用作向癌症提供抗癌药物的一种机制细胞。此外, 根据药物化学的不同, 包封药物有利于避免药物在体内循环过程中的降解。因此, 在本研究中, 本设计用于制备抗癌药物 falcarindiol 的脂质涂层纳米颗粒, 为稳定其化学结构防止降解提供了一种新的输送系统。肿瘤的吸收。设计了用磷脂和胆固醇单层包覆纯化后的颗粒核心的法氏丁醇纳米颗粒。脂质单层涂层由1、1、2-依-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------标签 dii (摩尔比为 43:50:5:2)。采用快速注射法制备了纳米粒子, 该方法是一种快速简便的用好溶剂沉淀纳米颗粒进行抗溶剂交换的技术。它包括将含有纳米粒子成分的乙醇溶液快速注入水相。在 741-±6.7 nm 处使用动态光散射 (dls) 测量荧光纳米粒子的尺寸。在人骨髓间充质干细胞 (hmscs) 中测试纳米颗粒的吸收, 并使用荧光和共聚焦显微镜进行成像。在 hmscs 中观察到纳米颗粒的吸收, 这表明这种稳定的假溴化物药物输送系统的潜力。

Introduction

脂质涂层纳米颗粒对其作为癌症治疗药物输送系统的功能越来越感兴趣.癌症有一个改变的脂质代谢重新编程2和胆固醇扩散的需求增加3。它们超快 ldl1 , 吸收的 ldl 比正常细胞多, 以至于癌症患者的低密度脂蛋白计数甚至可以下降4。低密度脂蛋白的吸收促进攻击性表型 5导致乳腺癌的增殖和侵袭6。丰富的低密度脂蛋白受体 (ldlr) 是转移电位7的预后指标。受低密度脂蛋白及其癌细胞吸收的启发, 一项新的策略被称为: 让这种药物看起来像癌症的食物.因此, 这些新的纳米颗粒药物输送设计8,9,10的灵感来自于天然 ldl11的核心和脂稳定设计, 作为提供抗癌药物的一种机制到癌细胞。这种被动靶向给药系统支持包封, 特别是疏水药物, 这些药物通常以口服剂型给予, 但只为血液提供少量药物, 因此限制了其预期疗效12。与隐形脂质体13一样, 聚乙二醇 (peg) 涂层有助于减少任何免疫反应, 并通过所谓的增强渗透和保留 (epr) 效应延长血液中的循环, 以获得最佳的肿瘤吸收14,15. 然而, 除了在某些情况下系统16中的循环不稳定和不受欢迎的分布外, 一些障碍仍未解决, 例如细胞如何以及在多大程度上吸收了这种纳米粒子, 以及是什么他们的细胞内命运本文利用共聚焦和荧光成像技术, 探讨了一种特殊的疏水抗癌药物 falcarindiol 的纳米颗粒吸收问题。

本研究的目的是制备假体内二醇的脂包膜纳米颗粒, 并研究其在骨髓间充质干细胞中的细胞内吸收。因此, 有可能稳定其行政管理, 克服与交付有关的挑战, 并提高生物利用度。因此评估这种抗癌药物的新输送系统。此前, 法尔卡丁醇已口服通过高浓度纯化的法尔卡丁醇作为食品补充17。然而, 有必要采取更有组织的办法来提供这种有希望的药物。因此, 设计了以磷脂和胆固醇封装单层的法氏醇纳米颗粒, 并将纯化后的药物作为粒子的核心。李约瑟等人最近提出的溶剂转移快速注射方法.8、本研究用于封装聚乙炔法卡林多醇。

该方法以前曾被用于制备脂质纳米颗粒, 以封装诊断成像剂18,19, 以及测试分子 (三烯烃) 27 和药物 (奥利司他, 肌脂酸二酯)8 ,27,28。当使用正确的分子进行时, 这是一个相对简单的技术。它在临界成核 (~ 20 nm 直径) 的限制下, 形成纳米颗粒, 高不溶性疏水溶质溶解在极性溶剂中。溶剂交换是由有机溶液的迅速注射完成入反溶剂的过剩 (通常, 水相在1:9 有机: 水体积比)20,21

纳米粒子的组合设计产生了多重优势。dspc: chol 组件提供了一个非常紧密, 几乎不透水, 生物相容性和生物降解单层。peg 提供了一个严格稳定的界面, 作为免疫系统的光圣化的挡箭牌, 减缓网状内皮系统 (肝脏和脾脏) 的任何吸收, 并防止单核吞噬细胞系统, 防止其免疫系统的保留和退化, 从而增加他们在血液中的血液循环职。这使得这些粒子能够循环到它们在肿瘤等病变部位渗出, 血管系统漏水, 从而使 epr 效应产生粒子的被动积累。此外, 脂质涂层允许一个人更好地控制纳米粒子的大小, 通过动力学地捕获核心在其关键核尺寸27,28。脂类诱导各种表面特性 (包括该项目尚不具备的肽靶向)、纯药物核心和低多度22、2728.用于粒径分析的方法是 dls, 这是一种允许研究人员同时测量大量颗粒大小的技术。然而, 如果纳米粒子不是单分散的 23, 这种方法可能会将测量值偏置到更大的尺寸。这个问题也是用血脂来评估的。其他出版物2728提供了这些基本设计的更多细节和所有特征的量化。

包封在纳米颗粒中的药物是 falcarindiol, 这是一种饮食中的聚乙炔, 存在于阿皮亚科科植物中。它是脂肪性 c17 聚乙酰酸类型的次生代谢物, 已被发现显示出促进健康的效果, 包括抗炎活性、抗菌作用和对广泛的癌细胞系的细胞毒性。它的高反应性与它与不同生物分子相互作用的能力有关, 是对抗硫醇和氨基24的非常反应性的烷基化剂.此前已证明, 法尔卡丁醇可以减少结肠中的肿瘤病变数量 172 5, 尽管其生物学机制尚不清楚。然而, 人们认为它与 nf-b、cox1、cox-2 和细胞因子等生物分子相互作用, 抑制它们的肿瘤进展和细胞增殖过程, 从而抑制细胞周期、内质网 (er) 应力和凋亡。17,26在癌细胞中。本研究以法尔二醇为例, 研究了其抗癌潜力和机制, 并对其具有良好的抗癌作用。在 hmscs 中测试纳米粒子的细胞吸收, 并使用荧光和共聚焦显微镜进行成像。这种细胞类型的选择是由于其较大的尺寸, 使其成为理想的显微镜。

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Protocol

1. 快速溶剂转移技术合成纳米粒子

  1. 为纳米粒子的制备设置以下: 块加热器/样品集中器、干燥机、带有1毫升玻璃注射器的数字点胶系统、12毫升玻璃小瓶、磁力搅拌器、磁蚤 (15 毫米 x 4.5 mm), 呈圆柱形, 具有圆柱形。玻璃小瓶和旋转蒸发器内的聚四氟乙烯 [ptfe] 涂层。
  2. 在闪烁小瓶中分发溶解在 70% etoh 水混合物中的 250μm falcarindiol 原料2.4 毫升。
  3. 蒸发液体组分, 用样品集中器约 4小时, 得到干的法尔卡丁醇。
    1. 将闪烁插入块加热器;样品集中器使用不锈钢针头在样品上输送气体, 使样品浓缩。室温蒸发;不要使用热量。
  4. 一旦干燥, 在上述闪烁小瓶中加入脂质涂层的以下成分: 16.3μl 的 31.64 mm dspc 氯仿库存溶液, 3.4 微米 ldspe peg 2000 氯仿库存溶液, 24 微米 25 mm 胆固醇氯仿库存溶液, 和6μl 的 4 mm 二氧化二氯单油库存溶液。加入每个成分后, 用氯仿清洗注射器, 以避免交叉污染。
    注意: 立即关闭含有脂类的小瓶, 使溶剂不会蒸发, 从而改变浓度。在通风柜里工作。
    注: 氯仿库存溶液的浓度可能会有所不同, 具体取决于化学品供应商或实验室生产的稀释剂。
  5. 用铝箔包裹小瓶, 以保护 dii 免受光线的影响。将样品在干燥器中过夜, 使氯仿蒸发。
  6. 将绝对乙醇中的干燥样品溶解到 1.2 ml 的最终体积, 最终浓度分别为 0.43 mm、0.05 mm、0.5 mm 和 0.43 mm。此解决方案代表有机阶段。
  7. 取12毫升玻璃小瓶, 在里面装满9毫升的纯净水, 然后将磁性跳蚤加入含有9毫升水的小瓶中。将小瓶放在磁力搅拌器上, 以500转/分的速度搅拌 (图 1)。
  8. 将1毫升玻璃注射器连接到点胶系统, 并用氯仿清洁, 以避免任何污染。这通过, 慢慢地将氯仿拉入玻璃注射器, 并手动点胶到废物收集器中, 至少10头。
    注意: 这必须在通风罩下完成。
  9. 用乙醇为注射器提供优质。底漆取代旧溶剂, 并去除任何气泡。
    注意: 这必须在通风罩下完成。
  10. 使用注射器, 吸气1毫升的有机相。
  11. 将注射器插入玻璃小瓶, 直至9毫升水印的中间, 并在小瓶中间保持其稳定 (如图 1所示)。
  12. 按点胶系统上的点胶按钮, 按选定的注射速度 (833μl) 注入溶液 (图 2)。这在含有10% 乙醇的水中产生10毫升50μm 脂肪包覆的假他因醇纳米颗粒。
    注: 这种注射速度已被发现达到最好的粒子, 获得一个狭窄的粒径分布。在分配溶液时, 确保注射器处于中心位置、稳定和直接是至关重要的。
  13. 注射后, 立即从搅拌器中取出小瓶, 并将样品转移到50毫升的圆底烧瓶 (rbf)。
  14. 将 rbf 连接到旋转蒸发器上, 并在室温下使用旋转蒸发器将有机溶剂的1毫升蒸发。避免气泡形成过多。
    注: 此步骤将花费 ~ 5分钟。
  15. 将纳米颗粒悬浮液从 rbf 转移到另一个12毫升玻璃小瓶中。确保卷为9毫升。将样品分成两个12毫升玻璃瓶 (每个小瓶中放置4.5 毫升)。
  16. 在其中一个小瓶中加入0.5 毫升的超纯水, 在另一个小瓶中加入0.5 毫升的10倍磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。取出每个样品的1毫升进行粒度测量。

2. 使用 dls 技术进行粒径分析

注: 尺寸测量是使用确定粒度分布的 dls 分析仪进行的。它配备了一个 100 mw 的激光, 工作的波长为612.2 纳米, 并与入射角的90°角放置雪崩光电二极管探测器。光束被纳米粒子散射, 并由光电探测器检测。

  1. 打开 dls 仪器, 将所需温度设置为 20°c, 直到其稳定。
  2. 设置仪器参数如下: 数据采集时间 = 4秒, 采集次数 = 30, 自动衰减功能 = 开, 自动衰减时间限制 = 0。
  3. 用1毫升的纳米颗粒悬浮液填充塑料材料, 开始测量。
  4. 根据所使用的溶剂 (水或 pbs) 报告测量的尺寸。
    注: pbs 中的测量是为了在处理细胞时对培养基中细胞的大小有一个大致的了解。细胞处理将与溶解在水中的纳米颗粒一起进行。
  5. 合成后24小时重复测量, 以检查颗粒聚集。

3. 细胞治疗

  1. 在37°C 的腐殖质室中, 以10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素/链霉素为补充, 在的腐殖质室中生长 hmscs.
    注意: 在无菌层流罩中工作, 步骤3.1、3.2 和3.3。
  2. 种子大约 50, 000个细胞获得大约30% 的细胞密度在早先绝对 etoh 消毒 #1 5 盖板放置在6孔板材。添加 mL, 以便在每口井中的最终体积为3毫升。在与步骤3.1 相同的条件下孵化24小时。在治疗前24小时给细胞播种。
    注: 重要的是, 细胞在纳米颗粒治疗前至少24小时播种, 以确保细胞处于适当的融合状态。
  3. 在不去除介质的情况下, 加入3μl 的纳米颗粒溶液, 以便在与步骤3.1 相同的条件下, 最终的法尔丁多浓度为 5μm. 培养24小时。
    注: 纳米颗粒的制备是在细胞处理当天进行的, 以避免颗粒聚集。
  4. 随后, 经过24小时的处理后, 用 pbs 清洗细胞 2倍, 在室温下将其固定在4% 的甲醛中 10分钟, 并在4°C 将其存放在 pbs 中长达几个月, 直到成像。
    注意: 这必须在通风罩下完成。
    1. 或者, 固定后, 可以进行 4 ', 6-二胺-2-苯并丁醇 (dapi) 核染色。为此, 在固定细胞后, 用 0.1% triton x-100 对其进行渗透 30分钟, 用 pbs 清洗 2x, 并用250μl 的 300 nm dapi 染色 5分钟, 免受光线影响。

4. 显微镜检查

  1. 荧光显微镜
    1. 使用配备电子乘法 ccd 摄像机的宽场荧光显微镜来获取图像。使用 150x na 1.45 油目标和 gfp lp 通道。
  2. 共聚焦显微镜
    1. 利用 63x na 1.4 油目标、dii 的氩激光器 (514 nm) 和 dapi 的双光子激光 (780 nm) 获取共聚焦显微镜图像, 以验证纳米粒子在细胞中的吸收情况。

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Representative Results

制备了两种不同类型的纳米粒子, 即纯黄他汀类纳米粒子和脂质涂层的假溴酸二醇纳米颗粒。对不同浓度的脂质和胆固醇进行了测试。如表 1所示, 在水中形成并在 pbs 中测量的未涂层纳米粒子的直径为71±20.3 纳米, 多分度指数 (pdi) 为0.571。这些参数是在 dls 分析仪上测量的。实验中使用的假体内酯脂包纳米颗粒, 包括荧光染料 dii, 其尺寸相似, 即74.1 ±6.7 纳米;然而, 他们被发现是相对单分散和有较低的 pdi 0.182, 这表明较小的分布的颗粒大小, 因为 pdi 描述了纳米颗粒种群的大小分布。通常, 在为制药目的制造纳米粒子时, 需要低于0.3 的 pdi。

在制备后, 根据在细胞培养中添加纳米颗粒所需的延迟, 测量了3小时和24小时后的粒径。在24小时后没有观察到聚合, 但数据没有显示在本手稿中, 因为它将在另一项研究中报告, 建议在24小时后测试粒子稳定性。在确认了脂质涂层纳米粒子的尺寸稳定性后, 按照该协议制备了 dii 标记、脂质涂层纳米颗粒, 并最终用于吸收研究。每项研究都制备了新鲜的纳米颗粒样品。图 3显示了最终的 falcarindiol 纳米粒子结构示意图, 表1显示了制备后的颗粒大小数据, 以及制作后3小时的测量结果。

作为对细胞内纳米粒子的首次观察, 经过24小时的治疗, 获得了细胞内的荧光显微镜图像。纳米粒子被可视化为白色的明亮点, 可以假设纳米粒子位于细胞内, 围绕细胞核 (图 4a)。

为了验证假体二醇纳米颗粒是否进入细胞, 在经过24小时处理的 hmscs 上进行了共聚焦显微镜检查, 共聚焦图像证实纳米颗粒进入了细胞, 大量纳米颗粒分散在细胞中。每个单元 (图 4b-d)。这些结果表明, 纳米颗粒是一种稳定的假溴化药物输送系统。

Figure 1
图 1: 纳米粒子制备装置, 显示搅拌27下注塑的组装.该装置由带有1毫升玻璃注射器的自动驾驶仪组成, 该注射器中充满了含有纳米粒子成分的乙醇溶液的1毫升。玻璃小瓶含有9毫升的水, 磁性跳蚤被放置在磁力搅拌器上。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 溶剂混合原理图在溶剂移位27的快速注射方法中.面板显示, 在500次转速下搅拌时, 以833μl 的速度将含有纳米粒子成分的乙醇相注入9毫升的水中。快速注射与混合的乙醇溶液含有纳米粒子的组成部分 (falcarindiol, dspc, 胆固醇, dspe peg 2000, dii) 到抗溶剂 (水), 导致纳米颗粒的形成。颜色是由 dii 给出的。可以观察到乙醇溶液是如何混合的, 迅速增加其浓度, 形成纳米颗粒。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 最终的假溴二醇纳米粒子结构示意图.纳米粒子结构, 包括 dspc、dspe peg 2000、胆固醇、dii 和 falcarindiol。不同的成分根据其浓度进行缩放。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 人骨髓间充质干细胞中脂肪包覆的法丁醇纳米颗粒的图像.(a) 用法尔卡丁醇纳米颗粒处理的 hmscs 的荧光显微镜图像 24 h。以下面板显示了用法尔卡丁纳米颗粒处理的 hmscs 的共聚焦显微镜图像, 时间为 24小时: (b) 细胞核的 dapi 染色, (c) dii 纳米颗粒, 以及 (d) 这两个图像的叠加, 原子核以蓝色显示,红色的纳米粒子。刻度条为 10μm, 纳米粒子在细胞细胞质中被可视化为白色的光斑。图像显示, 大量纳米粒子在孵育 2 4小时后进入细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

纳米粒子的种类 溶剂 纳米粒子尺寸 (nm) 多分散体 (nm) 分散指数 (pdi)
未涂布的法尔卡丁醇 83。9 ±23, 9 0.571
Pbs 71 ±20, 3 0.571
脂质涂层法卡林多 Pbs 91。6 ±6, 4 0.141
3h 后的 pbs 93。5 ±5, 7 0.122
脂质涂层法卡林多 + dii Pbs 74。1 ±6, 7 0.182

表 1: 制备纳米粒子的不同设计.合成的黄他二醇纳米颗粒的大小和多分散性指数, 取决于溶剂和纳米颗粒的类型。制备了有和没有脂质涂层的法卡林多醇纳米颗粒。对涂层成分的各种浓度进行了测试。在3小时后对颗粒聚集进行了测试。

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Discussion

本文采用简单、快速、重复、可扩展的溶剂转移快速注射方法, 详细介绍了用于药物输送的脂包纳米颗粒的制备方案, 并提出了一种详细的方案。适用于法尔卡丁醇。通过控制有机相注入水相的速度, 并利用适当浓度的脂质涂层覆盖法尔卡丁醇岩心, 可以成功地获得低于100纳米范围内的颗粒。仅由于脂质的存在, 就控制了由于湍流混合而产生的多分散的可能性。这些涂有脂质的纳米粒子的结构类似于低密度脂蛋白, 但除了本地 50万 kda apob100 和额外存在的 peg 脂类的胸骨稳定性)。这种被动靶向给药系统允许封装广泛的特别疏水药物和诊断材料18, 19,减少免疫反应和增加积累癌细胞组织 16,18。此外, 根据药物降解反应 (如水解、酶解), 药物输送系统可保护药物在体内循环过程中不降解。

因此, 设计并制备了含有纯纯化药物的纯核心的脂质包单层法。脂质单层涂层由 dspc、胆固醇和 dspe-peg 2000 组成, 带有荧光标签 dii。这些颗粒的制备是使用溶剂转移的快速注射方法进行的, 该方法包括将含有纳米粒子成分的乙醇溶液快速注入过量的水相 (1:9)。用 dls 测量了纳米粒子的大小, 并在 hmscs 中检测了纳米粒子的吸收情况, 并用荧光和共聚焦显微镜对纳米粒子的吸收进行了成像。

此外, 还可以获得尺寸为71±20.3 纳米的未涂布纳米粒子。然而, 在遵循上述协议后, 制备了74.1 纳米±6.7 nm 纳米纳米纳米粒子, 其多分散值为0.182。因此, 在加入脂质涂层对纳米颗粒进行改性后, 减少了纳米颗粒的大小和 pdi, 使其更适合给药。

重要的是要高度意识到协议中的关键步骤, 比如注射有机相时针管位置的重要性, 治疗当天制备纳米颗粒以避免聚集, 以及细胞的播种前一天, 以确保适当的融合水平。事实上, 协议第一部分中的所有步骤都可以被认为是关键的, 因为它们要么影响纳米粒子的大小, 要么影响活性化合物和涂层脂质的最终浓度。将 "浓度" 视为一个重要参数, 步骤1.2、1.4、1.6、1.16 和1.16 至关重要。考虑到 "纳米颗粒尺寸" 是一个重要参数, 步骤1.7、1.11 和1.11 至关重要。

荧光和共聚焦显微镜显示, 纳米粒子进入细胞, 大量纳米颗粒分散在每个细胞的细胞质中。这些结果表明, 本研究中设计的纳米颗粒可以作为一种新的、稳定的假体二醇药物输送系统发挥作用。

该技术提供了一种简单、快速和可重复的方法来封装不同的癌症药物, 并评估该方法的局限性与脂质涂层。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢穆斯塔法·卡西姆医生 (丹麦欧登塞大学医院) 提供的人间充质干细胞。作者感谢丹麦医学生物成像中心获得了他们的显微镜。作者感谢嘉士伯和维勒姆基金会的财政支持 (向 e. a. c.)。提交人承认丹麦国家研究基金会的 niels bohr 教授奖提供的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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