Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu makalede falcarindiol lipid kaplı 74 nm nano tanecikleri encapsulation. Nano tanecikleri lipid damlacıkları içine insan kök hücreleri tarafından hücresel alımını floresan ve confocal görüntüleme tarafından izlenir. Nano tanecikleri değişen solvent hızlı enjeksiyon yöntemiyle cihazlarında ve büyüklükleri dinamik ışık saçılma tekniği ile ölçülür.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nano tanecikleri uyuşturucu dağıtım sistemlerinin kanser tedavisi için artan bir ilgi odağı vardır. Lipid kaplı nano tanecikleri yapısı ve boyut olarak düşük yoğunluklu lipoproteinler (kolesterolü) tarafından kanser hücrelerin prolifere kolesterol için artan bir ihtiyaç, ve bu antikanser ilaçlar kanser için teslim yöntemi olarak istismar çünkü ilham vardır hücreleri. Ayrıca, bağlı olarak ilaç kimya, ilaç Kapsüllenen dolaşım içinde vivo sırasında ilacın yıkımı önlemek için avantajlı olabilir. Bu nedenle, bu çalışmada, lipid kaplı nano tanecikleri falcarindiol düşmesine karşı kimyasal yapısını stabilize etmek ve geliştirmek için potansiyel yeni teslimat sistemi sağlayan antikanser ilaç falcarindiol, imal etmek bu tasarım kullanılır, tümör tarafından alımı. Falcarindiol nano tanecikleri, kolesterol ve fosfolipid monolayer parçacık arıtılmış uyuşturucu özünü Kapsüllenen bir dizayn edilmiştir. Lipid monolayer kaplama 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), kolesterol (CHOI) ve 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 oluşur] (DSPE PEG 2000) ile birlikte floresan etiket dıı (43:50:5:2 molar oranları). Nano tanecikleri tarafından iyi-solvent Anti-solvent değişimi için nano tanecikleri çökelti bir hızlı ve basit bir tekniktir hızlı enjeksiyon yöntemi kullanılarak imal edilmiştir. Sulu bir aşamaya nanopartikül bileşenleri içeren bir etanol çözüm hızlı bir enjeksiyon oluşur. Floresan nano tanecikleri boyutunu 74.1 ± 6,7 nm'de dinamik ışık saçılma (DL) ölçülür. Nano tanecikleri alımını insan mezenkimal kök hücre (hMSCs) test ve floresan ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma. Nano tanecikleri alımını hMSCs, böyle bir istikrarlı uyuşturucu dağıtım sistemi falcarindiol için potansiyeli düşündüren görülmektedir.

Introduction

Lipid kaplı nano tanecikleri artan bir ilgi ile ilgili işlevlerine uyuşturucu dağıtım sistemleri için kanser tedavisi1olarak görüyoruz. Kanser bir değişmiş lipid metabolizma programlama2 ve3çoğalırlar kolesterol için artan bir ihtiyaç var. Onlar kolesterolü1 overexpress ve daha fazla kolesterolü normal hücreleri, daha bir kanser hastanın LDL sayısı-ebilmek düz gitmek aşağı4ölçüde bu almak. LDL alımını yayılması ve meme kanseri6' ı işgal sonuçlanan agresif fenotipleri5 teşvik etmektedir. LDL reseptörleri (LDLRs) bir bolluk metastatik potansiyel7prognostik göstergedir. LDL ve onun alımını kanser hücreleri tarafından esinlenerek, yeni bir strateji adı olmuştur: kanserin gıda gibi bak uyuşturucu8. 8,9,10 ilham doğal kolesterolü11 çekirdek ve lipid stabilize tasarım tarafından antikanser ilaçlar teslim yöntemi olarak böylece, bu yeni nanopartikül ilaç teslim tasarımları kanser hücrelerinin. Bu pasif dağıtım sistemi hedefleme, özellikle Kapsüllenen, genellikle oral doz formunda verilen ama az miktarda kan dolaşımına kadar onların beklenen etkinliği12sınırlama, ilaçlara sağlamak hidrofobik ilaçlar destekler. Gelişmiş stealth lipozomlar13, Polietilen glikol (PEG) kaplama immünolojik yanıt azaltmaya yardımcı olur ve optimum tümör alımı için kan dolaşımını sözde tarafından uzanır gibi nüfuz ve saklama (EPR) etkisi 14 , 15. ancak, ek olarak, bazı örnekler, dolaşımda istikrarsızlık ve istenmeyen dağıtım sistemi16, bazı engeller, ne kadar ve ne ölçüde böyle nano tanecikleri hücreleri tarafından alınır ve ne gibi çözülmemiş kalır hücre içi kaderlerini. Burada bu kağıt bir özel hidrofobik antikanser ilaç falcarindiol, confocal ve kullanma teknikleri Imaging epifluorescence nanopartikül alımını giderir.

Çalışmanın amacı lipid kaplı nano tanecikleri falcarindiol, imal etmek ve hMSCs onların hücre içi Anlamazdın çalışmaya var. Böylece, potansiyel olarak, yönetim istikrarı, teslimatla ilişkili zorlukların üstesinden ve bioavailability geliştirmek. Böylece bu antikanser ilaç için yeni bir teslimat sistemi değerlendirilmesi. Daha önce falcarindiol sözlü olarak yüksek konsantrasyonlu saf falcarindiol bir gıda takviyesi17olarak idare. Ancak, bu umut verici ilaç teslim etmek daha yapılandırılmış bir yaklaşım vardır. Bu nedenle, falcarindiol nano tanecikleri, fosfolipid ve monolayer parçacık özünü oluşturan saf uyuşturucu ile Kapsüllenen kolesterol ile dizayn edilmiştir. Değişen, solvent hızlı enjeksiyon yöntemi olarak son zamanlarda geliştirilen tarafından Needham vd. 8, polyacetylene falcarindiol kapsüllemek için bu çalışmada kullanılır.

Yöntemi daha önce lipid nano tanecikleri imalatı için tanı görüntüleme ajanlar18,19saklanması gibi moleküller (triolein)27 ve ilaçlar (orlistat, niclosamide stearat) test için kullanılmıştır8 ,27,28. Doğru molekülleri ile yürütülen nispeten basit bir tekniktir. Polar bir çözücü içinde çözünmüş son derece çözünmez hidrofobik solutes, mikro parçacıklar, onların kritik çekirdekleşme (~ 20 nm çapında), sınırı oluşturur. Solvent Satım antisolvent aşırı içine organik çözüm hızlı bir enjeksiyonla gerçekleştirilir (1:9 organik genellikle, sulu bir aşamasında: sulu hacim oranı)20,21.

Nano tanecikleri kompozisyon tasarımını yükselişi için birden fazla avantajı ver. DSPC:Chol bileşenler çok sıkı, neredeyse geçirimsiz, biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen monolayer sağlar. PEG retiküloendotelyal sistem (karaciğer ve dalak) ve mononükleer Fagosit sistemi karşı koruyarak, önleme tarafından herhangi bir alım yavaşlama bağışıklık sistemi tarafından opsonizasyonla bir kalkan olarak davranan bir sterically teskin arabirimi sağlar onların saklama ve bağışıklık sistemi tarafından bozulması ve bu nedenle, onların dolaşım yarı-kan22yılında artan. Bu hastalıklı siteler, extravasate kadar dolaşmaya parçacıklar sağlar damar sistemi nerede sızan, tümör gibi izin vererek parçacıkları pasif birikimi çıkmasına EPR-etkisi. Ayrıca, lipid kat bir kinetically onun kritik çekirdeği boyut27,28özünde yakalama tarafından nano tanecikleri boyutu üzerinde daha iyi kontrol izin verir. Lipidler (henüz bu proje için mevcut değildi hedefleme, peptid dahil) çeşitli yüzey özellikleri, bir saf uyuşturucu çekirdek ve düşük polydispersity22,27,28neden. Partikül boyut analiz için kullanılmış DLS, araştırmacılar aynı anda çok sayıda parçacıkların boyutunu ölçmek için sağlar bir teknik yöntemidir. Ancak, bu Yöntem nano tanecikleri monodispersed23değilseniz ölçümleri için daha büyük boyutlarda, önyargı. Bu sorun lipid ceket ile de değerlendirilmektedir. Daha fazla bu temel tasarım detaylarını ve tüm özellikleri miktar diğer yayınlar27,28yılında verilmiştir.

Nano tanecikleri kapsüllü falcarindiol, Maydanozgiller aileden bitkilerde bulunan bir diyet polyacetylene ilaçtır. Bu ikincil bir metaboliti antienflamatuar aktivitesi, antibakteriyel etkileri ve sitotoksisite kanser hücre hatları geniş bir karşı da dahil olmak üzere, sağlık teşvik efektleri görüntülemek için bulundu alifatik C17polyacetylenes türü var. Onun yüksek reaktivite farklı biomolecules, mercapto ve amino grupları24karşı çok reaktif bir bölücü olarak hareket ile etkileşim yeteneği ile ilgilidir. Biyolojik mekanizmaları hala bilinmeyen olmakla birlikte Falcarindiol daha önce iki nokta üst üste17,25, neoplastik lezyonlar sayısını azaltmak için gösterilmiştir. NF-κB, COX1, COX-2 gibi biomolecules ile etkileşim kurar ve sitokinler, hücre döngüsü, endoplazmik retikulum (ER) tutuklamak için önde gelen tümör ilerleme ve hücre proliferasyonu süreçlerinin, inhibe stres düşünce ve apoptosis be 17,26 kanser hücrelerinin içinde. Falcarindiol Bu çalışmada kullanılan bir örnek antikanser ilaç antikanser potansiyeli ve mekanizması nedeniyle okudu gibi şu anda ve umut verici Antikanser etkisi gösterir çünkü. Nano tanecikleri hücresel alımını hMSCs içinde test edilmiş ve epifluorescence ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma. Bu hücre tipi büyük onun büyüklüğü nedeniyle, onları Mikroskopi için ideal hale seçildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. nanoparçacık sentezi hızlı çözücü teknik değişen tarafından

    2. partikül boyut analiz DLS tekniği kullanarak

    Not: Boyut ölçüleri parçacık boyutu dağıtımları belirleyen bir DLS Çözümleyicisi kullanılarak yapılmıştır. Bu dalga boyu 662.2 çalışır bir 100 mW lazer ile donatılmıştır nm ve olay açı 90 ° açıyla yerleştirilmiş bir çığ fotodiyot detektörlü. Işın nano tanecikleri tarafından dağınık ve photodetector tarafından algılandı.

    1. DLS araç üzerinde açın ve bu stabilize kadar istenilen sıcaklığı 20 ° C'de ayarlayın.
    2. Aracı parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: veri alma süresi = 4 s, satın almalar sayısı = 30, otomatik-zayıflama işlevi = On ve auto-zayıflama süre sınırları = 0.
    3. Nanopartikül süspansiyon ile 1 mL plastik küvet doldurmak ve ölçüm başlar.
    4. Ölçülen boyutuna bağlı olarak kullanılan çözücü (su veya PBS) rapor.
      Not: Orta hücrelerin boyutunu yaklaşık bir fikir ne zaman hücreleri tedavi için PBS ölçümü yapılır. Hücre tedavisi suda nano tanecikleri ile yapılacaktır.
    5. Ölçümler 24 h için parçacık toplama kontrol için sentez sonra tekrar edin.

    3. hücre tedavisi

    1. HMSCs % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin, % 5 CO237 ° C'de humified odasında ile takıma en az gerekli Orta (MEM) büyümek.
      Dikkat: steril Laminar akış mahalle 3.1, 3.2 ve 3.3 adımları için çalışır.
    2. Tohum yaklaşık 50.000 hücreleri daha önce mutlak-alkol-steril #1.5 coverslips yaklaşık % 30 hücre yoğunluğu elde etmek için 6-şey levha yerleştirilir. MEM her kuyuda son hacmi 3 mL için ekleyin. Adım 3.1 olduğu gibi aynı koşullar altında 24 h için kuluçkaya. Tohum hücreleri tedavi öncesi 24 saat.
      Not: Bu hücreler hücreleri yeterli bir izdiham içinde olduğundan emin olmak için nanopartikül tedavi öncesi en az 24 saat seribaşı önemlidir.
    3. Orta kaldırmadan, 3 µL nanopartikül çözümün bir son falcarindiol konsantrasyonu 5 µM. için eklemek için adım 3.1 olduğu gibi aynı koşullarda 24 saat Incubate.
      Not: Nano tanecikleri hazırlık Parçacık toplama önlemek için hücre tedavisi, günü gerçekleştirilmiştir.
    4. Daha sonra tedavinin 24 saat sonra hücreleri 2 yıkama x PBS ile % 4 formaldehit oda sıcaklığında 10 dakika içinde tamir ve stok onları içinde PBS 4 ° C'de için görüntüsü kadar birkaç ay kadar.
      Dikkat: Bu bir duman başlık altında yapılmalıdır.
      1. Alternatif olarak, fiksasyon, 4 ', sonra 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleer boyama gerçekleştirilebilir. Bunun için hücreleri, sabitleme sonra onları %0,1 ile permeabilize Triton X-100 30 dk, onları yıkamak 2 x ile PBS ve onları 300 250 µL ile leke ışıktan korunan nM DAPI 5 dakika.

    4. mikroskobu

    1. Floresans mikroskobu
      1. Bir elektron çarpılır CCD kamera ile donatılmış widefield floresan mikroskop görüntüleri elde etmek için kullanmak. 150 x NA 1,45 petrol amaç ve GFP LP kanal kullanın.
    2. Confocal mikroskobu
      1. Confocal mikroskobu görüntüleri, 63 x NA 1.4 petrol amaç, bir Argon lazer kullanarak (514 nm) dıı ve iki fotonlu lazer (780 nm) DAPI nano tanecikleri alımını hücrelere doğrulamak için için.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Nano tanecikleri iki farklı türde fabrikasyon, Yani saf falcarindiol nano tanecikleri ve lipid kaplı falcarindiol nano tanecikleri vardı. Yağlar ve kolesterol çeşitli konsantrasyonları test edildi. Tablo 1' de gösterildiği gibi suda oluşan ve PBS içinde ölçülen kaplamasız nano tanecikleri 0.571 bir polydispersity dizin (PDI) ile 71 ± 20,3 nm çapında vardı. Bu parametreler bir DLS Çözümleyicisi üzerinde ölçüldü. Deneylerde kullanılan ve çok floresan boyalar, dıı, dahil olmak üzere falcarindiol, lipid kaplı nano tanecikleri benzer bir boyutu, yani 74.1 ± 6,7 nm vardı; Ancak, onlar nispeten monodispersed bulundu ve PDI nanopartikül popülasyon boyutu dağılımı açıklar bu yana partikül boyutları, daha küçük bir dağılım gösteren 0.182, daha düşük bir PDI vardı. Genel olarak, PDI 0,3 aşağıda ne zaman ilaç amaçlar için nano tanecikleri imalatı isteniyorsa.

    Üretim partikül büyüklüğü 3 h ve 24 h, hücre kültürü için nano tanecikleri eklenmesi için gerekli gecikme dayalı kere sonra ölçülmüştür. Veri bu el yazması olarak başka bir çalışmada bildirilir ve bu parçacık istikrar için 24 saat sonra test etmek için tavsiye edilir gösterilmez ancak hiçbir toplama 24 saat sonra gözlendi. Lipid kaplı nano tanecikleri boyutu kararlılığını onayladıktan sonra dıı etiketli, lipid kaplı nano tanecikleri iletişim kuralı takip ederek fabrikasyon ve, sonunda, alımını çalışma için kullanılan. Her çalışma için taze nanopartikül örnek hazırlanmıştır. İmalat Tablo 1yanı sıra 3 h imalat sonra alınan ölçüm gösterilir sonra son falcarindiol nano tanecikleri yapısının şematik resim 3ve parçacığın boyutu veri gösterilir.

    Nano tanecikleri hücrelere ilk gözlem tedavi 24 saat sonra epifluorescence mikroskobu görüntüleri elde. Nano tanecikleri beyaz parlak noktalar görüntülenir ve nano tanecikleri (Şekil 4A) çekirdeği çevreleyen hücrelerin içinde bulunan olan.

    Falcarindiol nano tanecikleri hücreleri girmişti, confocal mikroskobu 24 h Confocal tedavi hMSCs üzerinde gerçekleştirilen doğrulamak için görüntüleri nano tanecikleri hücreleri girmişti ve çok sayıda nano tanecikleri içinde sitoplazmada dağınık doğruladı her hücre (Şekil 4B-D). Bu sonuçlar nano tanecikleri istikrarlı uyuşturucu iletim sistemi için falcarindiol olarak hareket göster.

    Figure 1
    Resim 1 : Nano tanecikleri hazırlık kurulum montaj27karıştırma altında enjeksiyon için gösterilen. Autopipette 1 mL nano tanecikleri bileşenleri içeren ethanolic çözeltisi ile dolu bir 1 mL Cam şırınga ile oluşur. 9 mL su cam şişe içerir ve manyetik pire manyetik karıştırıcı yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Resim 2 :27vites solvent hızlı enjeksiyon yöntemi çözücüler karıştırma şematik. Panelleri içine 9 mL su karıştırma 500 rpm'de ise 833 µL/s hızında nano tanecikleri bileşenleri içeren ethanolic faz 1 ml enjeksiyon göster. Antisolvent (su), nano tanecikleri oluşumu için leadd içine nano tanecikleri bileşenleri (falcarindiol, DSPC, kolesterol, DSPE PEG 2000, dıı) içeren ethanolic çözüm kaotik karıştırılması ile hızlı enjeksiyon. Renk dıı tarafından verilir. Ethanolic çözüm nasıl karışık görülebilir, hızla artan onun konsantrasyon ve nano tanecikleri oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Şekil 3 : Son falcarindiol nano tanecikleri yapısının şematik. Nanopartikül yapısı, DSPC, DSPE PEG 2000, kolesterol, dıı ve falcarindiol gibi. Farklı bileşenleri onların konsantrasyonları göre ölçeklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Şekil 4 : İnsan mezenkimal kök hücrelerinde lipid kaplı falcarindiol nano tanecikleri görüntülerini. (A)24 h için falcarindiol nano tanecikleri ile tedavi Epifluorescence mikroskobu görüntüsü hMSCs. Aşağıdaki panelleri çekirdeği 24 h (B) DAPI leke için falcarindiol nano tanecikleri ile tedavi hMSCs confocal mikroskobu görüntülerini göster, (C) dıı nano tanecikleri ve (D) her ikisi de bir bindirme görüntüleri, çekirdek mavi renkle gösterilir ve Kırmızı nano tanecikleri. Ölçek Bar 10 µm. edilir nano tanecikleri hücre sitoplazma içinde beyaz parlak noktalar olarak görüntülenir. Çok sayıda nano tanecikleri kuluçka 24 h sonra hücreleri girdiniz görüntüleri göstermek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Nano tanecikleri türü Solvent Nanopartikül boyutu (nm) Polydisperisty (nm) Polydispersity dizin (PDI)
    Kaplamasız Falcarindiol Su 83.9 ± 23,9 0.571
    PBS 71 ± 20,3 0.571
    Lipid Falcarindiol kaplı PBS 91.6 ± 6,4 0.141
    PBS 3h sonra 93.5 ± 5,7 0.122
    Lipid kaplı Falcarindiol + dıı PBS 74.1 ± 6,7 0.182

    Tablo 1: farklı tasarımlar fabrikasyon nano tanecikleri. Solvent ve nanoparçacık türüne bağlı olarak sentezlenmiş falcarindiol nano tanecikleri boyutu ve polydispersity dizin. Falcarindiol nano tanecikleri ile ve lipid kat olmadan fabrikasyon. Kat bileşenleri çeşitli konsantrasyonları test edildi. Parçacık toplama sonra 3 h test edildi.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Basit ilaç dağıtım için nano tanecikleri lipid kaplı imalatı için detaylı bir iletişim kuralı, solvent değişen hızlı, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir hızlı enjeksiyon yöntemi takip27,28 yapıldı ve bu yazıda, olarak gösterilmesini sağlar falcarindiol için uygulanan. Sulu faz içine organik faz enjeksiyon hızını kontrol ve kaplama lipidler uygun konsantrasyonlarda falcarindiol çekirdek kat için kullanarak, alt-100 nm aralığında parçacık başarıyla elde. Çalkantılı yalnız falcarindiol yağış için karıştırma tutulumu nedeniyle indüklenen polydispersity olasılığı kaplama lipidler varlığı tarafından kontrol ediliyordu. Bu lipid kaplı nano tanecikleri yapısını andıran düşük yoğunluklu lipoproteinler yerli 500.000 kDa ApoB100 dışlanması ve PEG-lipitler ek varlığı steric istikrar için istisna ile). Bu pasif hedeflenen uyuşturucu dağıtım sistemi özellikle hidrofobik ilaçların ve immünolojik yanıt azaltılması ve birikimi artırmak tanılama malzemeleri18,19, geniş bir kapsülleme sağlar kanserli dokuların16,18. Ayrıca, uyuşturucu bozulması reaksiyonlar bağlı olarak (örneğin, hidroliz, enzymolysis), uyuşturucu dağıtım sistemi ilaç yıkımı sırasında içinde vivo, dolaşımını korur.

    Bu nedenle, arıtılmış uyuşturucu, saf bir çekirdek içeren lipid Kapsüllenen monolayer ile falcarindiol nano tanecikleri tasarlanmış ve imal edilmiştir. Lipid monolayer kaplama DSPC, kolesterol ve DSPE-PEG 2000, floresan etiketle dıı oluşuyordu. Fabrikasyon parçacıkların nano tanecikleri bileşenleri içeren sulu faz (1:9) aşırı ethanolic bir çözüm hızlı bir enjeksiyon oluşan çözelti değişen, Hızlı enjeksiyon yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Nano tanecikleri boyutunu DLS kullanılarak ölçüldü ve nano tanecikleri alımını hMSCs içinde incelenmiş ve floresan ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma.

    Kaplamasız nano tanecikleri Ayrıca, 71 ± 20,3 nm boyutları ile elde edilebilir. Ancak, yukarıda açıklanan protokol sonrası sonra 74.1 nm ± 6,7 nm, nano 0.182, polydispersity değerleri ile tanecikleri fabrikasyon. Böylece, lipid kat ekleyerek nano tanecikleri değiştirdikten sonra boyutu ve nano tanecikleri PDI oldu azaltılmış, yapım onları daha uygun ilaç teslim.

    Organik faz, toplama önlemek için hazırlanması nano tanecikleri aynı gün tedavi ve tohum hücrelerini enjekte zaman son derece şırınga pozisyon önemi gibi protokol kritik adımlarda dikkat önemlidir önceki gün yeterli izdiham düzeyi sağlamak için. Aslında, tüm belgili tanımlık merdiven Protokolü'nün ilk bölümünde bunlar da nano tanecikleri boyutunu veya etkin bileşik ve kaplama lipidler son konsantrasyon etkileyecektir kritik kabul edilebilir. 'Konsantrasyon' önemli bir parametresi olarak göz önüne alındığında, 1.2, 1.4, 1.6, 1,15 ve 1,16 önemli adımlardır. 'Nanopartikül boyutu göz önüne alındığında' önemli bir parametre olarak, 1,7, 1.11 ve 1.12 önemli adımlardır.

    Floresan ve confocal mikroskobu nano tanecikleri hücreleri girmişti ve çok sayıda nano tanecikleri her hücre sitoplazma içinde dağınık gösterdi. Bu sonuçlar bu çalışmada tasarlanmış nano tanecikleri falcarindiol için yeni ve istikrarlı ilaç teslim sistemi olarak işlev görebilir öneririz.

    Bu tekniğin farklı kanser ilaçlar kapsüllemek için basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar ve yönteminin sınırlamalarını lipid kat ile değerlendirilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Yazarlar Dr Moustapha Kassem (Odense Üniversite Hastanesi, Danimarka) insan mezenkimal kök hücre için teşekkür ederiz. Yazarlar Danca tıp Bioimaging merkezi erişim onların mikroskoplar için teşekkür ederiz. Yazarlar Carlsberg ve Villum temelleri (E.A.C. için) finansal destek için teşekkür ederiz. Yazarlar tarafından Niels Bohr profesörlük Ödülü Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı sağlanan mali destek kabul etmiş oluyorsunuz.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
    6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
    Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
    Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
    Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
    Confocal Microscope Zeiss LSM510
    Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
    Desiccator Self-build
    DiI Invitrogen D282
    DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
    DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
    DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
    eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
    Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
    Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
    Incubator Panasonic  MCO-18AC
    Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
    Magnetic stirrer IKA RT-10
    Minimum Essential Media Gibco 32561-029
    PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
    Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
    Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
    Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
    Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
    2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
    3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
    4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
    5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
    6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
    7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
    8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
    9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
    10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
    11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
    12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
    13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
    14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
    15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
    16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
    17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
    18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
    19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
    20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
    21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
    22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
    23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
    24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
    25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
    26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
    27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
    28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics