Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nanodeeltjes zijn de focus van een toegenomen belangstelling voor drug delivery systemen voor kankertherapie. Lipide-gecoate nanodeeltjes zijn geïnspireerd van grootte en structuur van low-density lipoproteins (LDLs) omdat kankercellen een verhoogde behoefte aan cholesterol hebben te verspreiden, en dit heeft benut als een mechanisme voor het leveren van geneesmiddelen aan kanker cellen. Bovendien, afhankelijk van de drug chemie, inkapselen van de drug kan nuttig zijn om te voorkomen dat de afbraak van de drug tijdens het verkeer in vivo. Daarom in dit onderzoek dit ontwerp wordt gebruikt om fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes van de antikanker drug falcarindiol, biedt een potentiële nieuwe levering systeem van falcarindiol om te stabiliseren van de chemische structuur tegen afbraak en verbeteren de opname door tumoren. Falcarindiol nanodeeltjes, werden met een fosfolipide en cholesterol enkelgelaagde encapsulating het gezuiverde drug-kern van het deeltje, ontworpen. Het lipide enkelgelaagde kleefmiddel bestaat uit 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) samen met de TL Label DiI (molaire ratio's van 43:50:5:2). De nanodeeltjes worden vervaardigd gebruikend de snelle injectie-methode, die een snelle en eenvoudige techniek is te precipiteren nanodeeltjes door goed-solvent voor anti-oplosmiddel uitwisseling. Het bestaat uit een snelle injectie van een ethanol-oplossing met de nanoparticle-onderdelen in een waterige fase. De grootte van de fluorescerende nanodeeltjes is gemeten met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS) op 74.1 ± 6.7 nm. De verbreiding van de nanodeeltjes is getest in menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) en beeld met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. De opname van de nanodeeltjes wordt waargenomen in hMSCs, suggereert het potentieel voor een dergelijk stabiel drug delivery systeem voor falcarindiol.

Introduction

Lipide-gecoate nanodeeltjes zien een verhoogde belangstelling voor met betrekking tot hun functie als medicijn afgiftesystemen voor kanker therapie1. Kankers hebben een gewijzigde lipide-metabole herprogrammering2 en een toegenomen behoefte aan cholesterol3vermenigvuldigen. Ze overexpress LDLs1 en neem in meer LDLs dan normale cellen, in de mate dat een kankerpatiënt LDL graaf zelfs4 dalen kan. LDL opname bevordert agressief fenotypen5 resulterend in proliferatie en invasie in borst kanker6. Een overvloed aan LDL-receptoren (LDLRs) is een voorspellende indicator voor gemetastaseerde potentieel7. Geïnspireerd door de LDL en haar ICT door kankercellen, een nieuwe strategie heeft geroepen: maken van de drug van de kanker voedsel eruit8. Dus, deze nieuwe nanoparticle drug levering ontwerpen als een mechanisme voor het leveren van geneesmiddelen zijn geïnspireerd door het kern - en lipide-gestabiliseerde ontwerp van de natuurlijke LDLs11 8,9,10 tot kankercellen. Deze passieve targeting levering systeem ondersteunt het inkapselen van, met name, de hydrofobe drugs, die worden meestal gegeven in mondelinge doseringsvorm maar bieden slechts een kleine hoeveelheid van de drugs naar de bloedbaan, dus het beperken van hun verwachte werkzaamheid12. Zoals met de stealth liposomen13, een coating van polyethyleenglycol (PEG) draagt bij aan vermindering van een immunologische reactie en het verkeer in de bloedbaan voor optimale tumor opname door de vermeende breidt versterkte permeatie en retentie (EPR) effect 14 , 15. in aanvulling op, in sommige gevallen, de instabiliteit in de omloop en ongewenste distributie in het systeem16, sommige obstakels blijven echter onopgelost, zoals hoe en in welke mate dergelijke nanodeeltjes worden genomen in door cellen en wat is hun intracellulaire lot. Het is hier dat dit document de opname van de nanoparticle van een bepaald hydrofobe anticancer geneesmiddel falcarindiol behandelt, met behulp van de confocal en epifluorescence beeldvormende technieken.

Het doel van de studie is te fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes van falcarindiol en te bestuderen van hun intracellulaire penetratie in hMSCs. Aldus, potentieel te stabiliseren zijn administratie, het overwinnen van de uitdagingen in verband met de levering, en verbetering van de biologische beschikbaarheid. Dus de beoordeling van een nieuw systeem van de levering voor deze antikanker drug. Eerder, falcarindiol heeft al bestuurd mondeling via een hoge concentratie gezuiverd falcarindiol als een food supplement17. Er is echter behoefte aan een meer gestructureerde benadering leveren deze veelbelovende drug. Daarom, falcarindiol nanodeeltjes, met een fosfolipide en cholesterol encapsulating enkelgelaagde met de gezuiverde drug vormen de kern van het deeltje, werden ontworpen. De methode van de snelle injectie van oplosmiddel verschuiven, zoals onlangs ontwikkeld door Needham et al. 8, wordt in deze studie gebruikt om in te kapselen de polyacetyleen falcarindiol.

De methode is eerder gebruikt voor de fabrikatie van lipide nanodeeltjes kapselen diagnostische beeldvorming agenten18,19, evenals het testen van moleculen (triolein)27 en drugs (orlistat, niclosamide stearate)8 2827, ,. Het is een relatief eenvoudige techniek wanneer uitgevoerd met de juiste moleculen. Nanosized deeltjes, op de grens van hun kritische nucleatie (~ 20 nm diameter), vormt van zeer slecht oplosbaar hydrofobe opgeloste stoffen opgelost in een polair oplosmiddel. De oplosmiddelen uitwisseling wordt bereikt door een snelle injectie van de organische oplossing in een overmaat aan antisolvent (meestal een waterige fase in een 1:9-organische: waterige volumeverhouding)20,21.

De compositorische ontwerp van de nanodeeltjes meerdere voordelen meebrengen. De DSPC:Chol componenten bieden een zeer strakke, bijna ondoordringbare, biocompatibel en biologisch afbreekbaar enkelgelaagde. De PEG biedt een sterically stabiliserende interface die fungeert als een schild van opsonization door het immuunsysteem, vertragen van elke opname door de reticuloendotheliaal systeem (lever en milt) en bescherming tegen de mononucleaire fagocytensysteem systeem, voorkomen van hun retentie en aantasting van het immuunsysteem, en vandaar, het verhogen van hun verkeer halftijds in bloed22. Hierdoor kunnen de deeltjes te laten circuleren totdat ze op zieke sites extravasate, zoals tumoren, waar het vaatstelsel lekkende is, waardoor EPR-effect aanleiding geeft tot passieve accumulatie van de deeltjes. Bovendien, de lipide vacht maakt het mogelijk een betere controle hebben over de nanodeeltjes grootte door kinetisch overvulling de kern op haar kritieke nucleus dimensie27,28. Lipiden veroorzaken verschillende oppervlakte-eigenschappen (met inbegrip van peptide richt, die nog niet beschikbaar voor dit project was) een zuivere drug kern en een lage polydispersiteit22,27,28. De methode die wordt gebruikt voor de korrelgrootte is DLS, een techniek waarmee onderzoekers voor het meten van de grootte van een groot aantal deeltjes op hetzelfde moment. Deze methode kan echter de metingen aan grotere maten, bias, als de nanodeeltjes niet monodispersed23. Dit probleem wordt beoordeeld met het lipide vacht zo goed. Meer details van deze fundamentele ontwerpen en de kwantificering van alle kenmerken die worden gegeven in andere publicaties27,28.

De drug ingekapseld in de nanodeeltjes is falcarindiol, een dieet polyacetyleen gevonden in planten uit de familie van de Apiaceae. Het is een secundaire metaboliet van de alifatische C17polyacetylenen type dat is gevonden om de gezondheidsbevorderende effecten, met inbegrip van cytotoxiciteit tegen een breed scala van kanker cellijnen, anti-inflammatoire activiteit en antibacteriële effecten weer te geven. De hoge reactiviteit is gerelateerd aan haar vermogen om te communiceren met verschillende biomoleculen, als een zeer reactieve alkylerend gemachtigde tegen mercapto en amino groepen24. Falcarindiol heeft eerder is aangetoond dat het verminderen van het aantal neoplastische laesies in de dikke darm17,25, hoewel de biologische mechanismen nog onbekend zijn. Het is echter de gedachte dat het samenwerkt met biomoleculen zoals NF-recombination, COX1, COX-2 en cytokines, remming van hun tumor progressie en cel proliferatie processen, leidt tot de arrestatie van de celcyclus, endoplasmatisch reticulum (ER) benadrukken, en apoptose 17,,26 in kankercellen. Falcarindiol wordt gebruikt in deze studie een voorbeeld anticancer geneesmiddel vanwege de antikanker potentieel en het mechanisme worden momenteel bestudeerd, en omdat blijkt veelbelovend antikanker effecten. De mobiele opname van de nanodeeltjes is getest in hMSCs en beeld met behulp van epifluorescence en confocale microscopie. Dit celtype werd gekozen vanwege zijn grote omvang, waardoor ze ideaal zijn voor microscopie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nanoparticle synthese door snelle oplosmiddel verschuiving van techniek

  1. De volgende nanoparticles voorbereiding instellen: een blok kachel/monster concentrator, een exsiccator, een digitale doseersysteem met een spuit van 1 mL glas, een 12 mL glazen ampul, een magnetische roerder, een magnetische vlo (15 mm x 4,5 mm, in een cilindrische vorm met polytetrafluorethyleen [PTFE] coating) binnen de glazen ampul en een hiervoor verdamper.
  2. Afzien van 2,4 mL 250 µM falcarindiol voorraad opgelost in 70% EtOH water mengsel in een flesje van scintillatie.
  3. Het verdampen van de vloeibare fractie, met behulp van de concentrator monster gedurende ongeveer 4 uur, droge falcarindiol verkrijgen.
    1. De flacon Scintillatie invoegen in het blok verwarmingssysteem; de monster-concentrator levert gas over het gebruik van roestvast stalen naalden, monster concentreren van het monster. Verdampen bij kamertemperatuur; Gebruik geen warmte.
  4. Eenmaal gedroogd, voeg de volgende onderdelen van de lipide-coating in de bovengenoemde Scintillatie flacon: 16.3 µL van 31.64 mM DSPC chloroform stockoplossing, 3.4 µL van 17.82 mM DSPE PEG 2000 chloroform stockoplossing, 24 µL van 25 mM cholesterol chloroform voorraad oplossing en 6 µL van 4 mM DiI chloroform stamoplossing. Reinig de spuit met chloroform na het toevoegen van elke component Voorkom kruisbesmetting.
    Let op: Sluit onmiddellijk de flesjes waarin de lipiden, zodat het oplosmiddel niet verdampen en, daardoor, het wijzigen van de concentratie. Werken in een zuurkast.
    Opmerking: De concentraties van chloroform stamoplossingen kunnen variëren, afhankelijk van de chemische leverancier of verdunningen gemaakt in het lab.
  5. Wikkel de flacon met aluminiumfolie om DiI beschermen tegen licht. Laat het monster 's nachts in de exsiccator tot verdampen van de chloroform.
  6. Los van het gedroogde monster in absolute ethanol tot een eindvolume van 1,2 mL, waardoor de eindconcentraties van DSPC, DSPE PEG 2000, cholesterol en DiI van 0,43 mM, 0.05 mM en 0,5 mM 0,02 mM, respectievelijk. Deze oplossing vertegenwoordigt de organische fase.
  7. Nemen van de 12 mL glazen ampul, vullen met 9 mL van gezuiverd water en voeg de magnetische vlo in de flacon met 9 mL water. Houd de ampul op de magneetroerder, roeren bij 500 omwentelingen per minuut (Figuur 1).
  8. De spuit van 1 mL glas hechten aan de doseersysteem en schoon met chloroform om elke besmetting te voorkomen. Dit door langzaam trekken de chloroform in de glas-spuit en verstrekking handmatig in een ophaler minstens 10 tiems.
    Let op: Dit moet gebeuren onder een zuurkast.
  9. Prime de spuit met ethanol. Priming vervangt het oude oplosmiddel, evenals verwijdert alle luchtbellen.
    Let op: Dit moet gebeuren onder een zuurkast.
  10. 1 mL van de organische fase met behulp van de spuit, gecombineerd.
  11. De spuit in de glazen ampul, tot het midden van de 9 mL watermerk, invoegen en onderhouden gestage in het midden van de flacon (zoals weergegeven in Figuur 1).
  12. Injecteer de oplossing op de geselecteerde snelheid van injectie (833 µL/s) door het indrukken van de doseer-knop op de doseersysteem (Figuur 2). Dit genereert 10 mL 50 µM lipide-gecoate nanodeeltjes van falcarindiol in 10% ethanol bevattende water.
    Opmerking: Deze injectie snelheid is gebleken om de fijnste deeltjes, het verkrijgen van een smalle korrelgrootteverdeling. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de spuit in het center, stabiele en rechte is wanneer verstrekking van de oplossing.
  13. Onmiddellijk na de injectie, verwijderen de flacon van de roerder en het monster overbrengen in een 50 mL Rondbodemkolf (RBF).
  14. De RBF hechten aan de rotatievacuümverdamper en damp 1 mL van de organische oplosmiddelen, met behulp van de rotatievacuümverdamper bij kamertemperatuur. Vermijd overmatige luchtbel vorming.
    Opmerking: Deze stap duurt ~ 5 min.
  15. Breng de nanoparticle van de RBF een andere 12 mL glazen ampul. Zorg ervoor dat het volume 9 mL. Het splitsen van het monster in twee 12 mL glazen flesjes (put 4.5 mL in elk).
  16. Voeg 0,5 mL ultrazuiver water aan één van de flesjes en 0,5 mL 10 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar de andere flacon. Neem 1 mL van elk monster voor het deeltje grootte meten.

2. korrelgrootte met de DLS-techniek

Opmerking: Grootte metingen werden uitgevoerd met behulp van een DLS-analyzer die deeltje grootte distributies bepaalt. Het is uitgerust met een 100 mW laser die werkt bij een golflengte van 662.2 nm en met een lawine fotodiode detector geplaatst in een hoek van 90° tot de hoek van het incident. De bundel is verspreid door de nanodeeltjes en gedetecteerd door de foto-elektrische cel.

  1. Zet het instrument DLS en selecteer de gewenste temperatuur bij 20 ° C, totdat het stabiliseert.
  2. De instrument-parameters als volgt instellen: gegevens Acquisitietijd = 4 s, aantal overnames = 30, auto-demping functie = aan, en de termijnen van de auto-demping = 0.
  3. Vul de plastic Cuvet met 1 mL nanoparticle schorsing en start de meting.
  4. Verslag van de gemeten grootte afhankelijk van het oplosmiddel gebruikt (water of PBS).
    Opmerking: De meting in PBS is gemaakt om een benaderende idee van de grootte van de cellen in het medium bij de behandeling van de cellen. De behandeling van de cel zal gebeuren met de nanodeeltjes opgelost in water.
  5. Herhaal de metingen 24u na de synthese, om te controleren voor het samenvoegen van de particle.

3. cel behandeling

  1. HMSCs groeien in minimale essentiële medium (MEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine, in een humified kamer bij 37° C met 5% CO2.
    Let op: Werken in de steriele laminaire Flow Hood voor stap 3.1, 3.2 en 3.3.
  2. Zaad ongeveer 50.000 cellen te verkrijgen van een celdichtheid van ongeveer 30% op eerder absolute-EtOH-gesteriliseerd #1.5 coverslips geplaatst in 6-Wells-platen. MEM toevoegen om een eindvolume van 3 mL in elk putje. Incubeer gedurende 24 uur onder dezelfde voorwaarden zoals in stap 3.1. Zaad de cellen 24 h vóór de kuur.
    Opmerking: Het is essentieel dat de cellen worden overgeënt ten minste 24 uur vóór de behandeling van de nanoparticle, om ervoor te zorgen dat de cellen in een passende samenvloeiing worden.
  3. Zonder het verwijderen van het medium, voeg 3 µL van de nanoparticle oplossing, voor een definitieve falcarindiol concentratie van 5 µM. Incubate gedurende 24 uur onder dezelfde omstandigheden als in stap 3.1.
    Opmerking: De nanodeeltjes voorbereiding werd uitgevoerd op de dag van de behandeling van de cel, om te voorkomen dat deeltjes aggregatie.
  4. Vervolgens na 24 h behandeling, wassen de cellen 2 x met PBS, corrigeren in 4% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en ze opslaan in PBS bij 4° C voor tot enkele maanden totdat beeld.
    Let op: Dit moet gebeuren onder een zuurkast.
    1. Als alternatief, na fixatie, een 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nucleaire kleuring kan worden uitgevoerd. Voor dit, na de vaststelling van de cellen, permeabilize hen met 0,1% Triton X-100 voor 30 min, wassen ze 2 x met PBS, en vlekken hen met 250 µL van 300 nM DAPI voor 5 minuten, dat is beschermd tegen licht.

4. microscopie

  1. Fluorescentie microscopie
    1. Gebruik een widefield fluorescentie Microscoop uitgerust met een CCD-camera met elektron-vermenigvuldigd te verwerven van de beelden. Gebruik de 150 x nb 1.45 olie doelstelling en het GFP LP-kanaal.
  2. Confocale microscopie
    1. Verwerven van beelden in confocale microscopie, met behulp van de 63 x nb 1.4 olie doelstelling, een laser Argon (514 nm) voor DiI, en een twee-foton laser (780 nm) voor DAPI, om te controleren of de opname van de nanodeeltjes in de cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Twee verschillende types van nanodeeltjes waren vervaardigd, namelijk puur falcarindiol nanodeeltjes en falcarindiol lipide-gecoate nanodeeltjes. Verschillende concentraties van lipiden en cholesterol werden getest. Zoals blijkt uit tabel 1, had ongecoat nanodeeltjes gevormd in water en gemeten in PBS een diameter van 71 ± 20,3 nm met een polydispersiteit index (PDI) van 0.571. Deze parameters zijn gemeten over een DLS-analyzer. Het lipide-gecoate nanodeeltjes van falcarindiol die in de experimenten worden gebruikt, en dus met inbegrip van de fluorescente kleurstof, DiI, waren van een gelijkaardige grootte, namelijk 74.1 ± 6.7 nm; echter, ze bleken te zijn relatief monodispersed en had een lagere PDI van 0.182, die wijst op een kleinere verdeling van de deeltjesgrootte, aangezien PDI de grootteverdeling van de nanoparticle bevolking beschrijft. In het algemeen een PDI hieronder 0.3 gewenst is bij het fabriceren van nanodeeltjes voor farmaceutische doeleinden.

Na de fabricage, de grootte van de deeltjes werd gemeten na 3 h en 24u, keer op basis van de vertraging die nodig zijn voor de toevoeging van nanodeeltjes op de cultuur van de cel. Geen samenvoeging werd waargenomen na 24 h, maar de gegevens wordt niet weergegeven in dit manuscript als het zal worden gerapporteerd in een andere studie, en het is aangeraden om te testen voor de stabiliteit van het deeltje na 24 h. Na het bevestigen van de stabiliteit van de grootte van het lipide-gecoate nanodeeltjes, werden DiI-label, lipide-gecoate nanodeeltjes vervaardigd door het volgen van het protocol en, uiteindelijk, gebruikt voor de studie van de opname. Voor elke studie, werd een verse nanoparticle monster voorbereid. Een schematische voorstelling van de structuur van de definitieve falcarindiol nanoparticles wordt weergegeven in Figuur 3, en van het deeltje groottegegevens na fabricage wordt weergegeven in tabel 1, evenals de meting genomen 3 h na fabricage.

Als een eerste waarneming van de nanodeeltjes in de cellen, werden epifluorescence microscopie beelden verkregen na 24 h behandeling. Nanoparticles waren gevisualiseerd als witte bright dots genoemd, en het kon worden veronderstelde dat nanodeeltjes in de cellen, bevonden zich rond de kern (Figuur 4A).

Verifieer dat falcarindiol nanodeeltjes had ingevoerd de cellen, confocal microscopie werd uitgevoerd op hMSCs behandeld voor 24 h. Confocal bevestigd afbeeldingen dat nanodeeltjes in de cellen was gekomen, en een groot aantal nanodeeltjes uitgestrooid in het cytoplasma in elke cel (Figuur 4B-D). Deze resultaten tonen aan dat nanodeeltjes als een stabiele drug delivery systeem voor falcarindiol fungeren.

Figure 1
Figuur 1 : Nanodeeltjes voorbereiding setup weergegeven: vergadering voor injectie onder roeren27. De installatie bestaat uit de autopipette met een spuit van 1 mL glas gevuld met 1 mL van de oplossing oplossing nanoparticles componenten bevat. De glazen ampul bevat 9 mL water en de magnetische vlo wordt geplaatst op de magneetroerder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Schematische van het mengen van oplosmiddelen in de methode van de snelle injectie van oplosmiddel verschuiven27. Panelen tonen de injectie van 1 mL ethanolbevattend fase met nanodeeltjes onderdelen met een snelheid van 833 µL/s in 9 mL water al roerend bij 500 omwentelingen per minuut. De snelle injectie met het mengen van de chaotische het ethanolbevattend oplossing met nanoparticles onderdelen (falcarindiol, DSPC, cholesterol, DSPE PEG 2000, DiI) in de antisolvent (water), leadd tot de vorming van de nanodeeltjes. De kleur wordt gegeven door DiI. Het kan worden waargenomen hoe het ethanolbevattend oplossing is gemengd, pijlsnel de concentratie en de nanodeeltjes worden gevormd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Schematische van definitieve falcarindiol nanoparticles structuur. Nanoparticle structuur, met inbegrip van DSPC, DSPE PEG 2000, cholesterol, DiI en falcarindiol. De afmetingen van de verschillende onderdelen worden volgens hun concentraties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Beelden van falcarindiol lipide-gecoate nanodeeltjes in menselijke mesenchymale stamcellen. (A) Epifluorescence microscopie beeld van hMSCs behandeld met falcarindiol nanodeeltjes gedurende 24 uur. De volgende panelen Toon confocale microscopie beelden van de hMSCs behandeld met falcarindiol nanodeeltjes voor 24 h: (B) DAPI vlek van kernen, (C) DiI nanodeeltjes, en (D) een overlay van beide beelden, kernen worden in blauw weergegeven en de nanodeeltjes in het rood. De schaal bars zijn 10 µm. nanodeeltjes worden gevisualiseerd als witte heldere stippen in het cytoplasma van de cel. De beelden laten zien dat een groot aantal nanodeeltjes de cellen hebt ingevoerd na 24 uur incubatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Soort nanodeeltjes Oplosmiddel Nanoparticle grootte (nm) Polydisperisty (nm) Polydispersiteit Index (PDI)
Ongecoate Falcarindiol Water 83,9 ± 23,9 0.571
PBS 71 ± 20,3 0.571
Lipide gecoat Falcarindiol PBS 91,6 ± 6,4 0.141
PBS na 3h 93,5 ± 5,7 0.122
Lipide bedekt Falcarindiol + DiI PBS 74,1 ± 6,7 0.182

Tabel 1: verschillende ontwerpen van verzonnen nanoparticles. Grootte en polydispersiteit index van de gesynthetiseerde falcarindiol nanodeeltjes, afhankelijk van het type oplosmiddel- en nanoparticle. Falcarindiol nanodeeltjes met en zonder een lipide vacht werden vervaardigd. Verschillende concentraties van de vacht componenten werden getest. De aggregatie van de deeltjes werd getest na 3u.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een gedetailleerd protocol voor het fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes voor drug delivery met de eenvoudige, snelle, reproduceerbare en schaalbare snelle injectie methode van het oplosmiddel verschuiven was gevolgd27,28 en wordt gepresenteerd in dit document, als toegepast op falcarindiol. Door het beheersen van de snelheid van de injectie van de organische fase in de waterfase en met behulp van coating lipiden bij adequate concentraties jas de falcarindiol kern, kon deeltje in het sub-100 nm-bereik met succes worden verkregen. De mogelijkheid van geïnduceerde polydispersiteit als gevolg van de betrokkenheid van de turbulente mengen bij de falcarindiol precipitatie alleen werd gecontroleerd door de aanwezigheid van coating lipiden. De structuur van deze lipide-gecoate nanodeeltjes leek op de low-density lipoproteins met uitzondering van de uitsluiting van de inheemse 500.000 kDa ApoB100 en de extra aanwezigheid van PEG-lipiden voor sterische stabiliteit). Deze passief gerichte drug delivery systeem maakt het mogelijk de inkapseling van een brede waaier van vooral hydrofobe drugs en diagnostisch materiaal18,19, vermindering van de immunologische reactie en het vergroten van de accumulatie in kanker weefsels16,18. Bovendien, afhankelijk van de drug afbraak Reacties (bijv. hydrolyse, enzymolysis), de drug delivery systeem beschermt de drug tegen afbraak tijdens haar omloop in vivo.

Daarom werden de falcarindiol nanodeeltjes, met een lipide-encapsulating enkelgelaagde met een zuivere kern van de gezuiverde drug, ontworpen en gefabriceerd. De lipide enkelgelaagde coating bestond uit DSPC, cholesterol en DSPE-PEG 2000, met de fluorescerende label DiI. De fabricage van de deeltjes werd uitgevoerd met behulp van de methode van de snelle injectie van het verschuiven van de oplosmiddelen, die bestaat uit een snelle injectie van een ethanolische oplossing met de componenten van nanodeeltjes in een overmaat van waterige fase (1:9). De grootte van de nanodeeltjes werd gemeten met behulp van Distributielijsten, en de verbreiding van de nanodeeltjes werd onderzocht in hMSCs en beeld met behulp van fluorescentie en confocale microscopie.

Ongecoate nanodeeltjes kan ook verkregen worden, met de grootte van 71 ± 20,3 nm. Echter na het volgen van het protocol zoals hierboven beschreven, werden nanodeeltjes 74.1 nm ± 6.7 nm, met polydispersiteit waarden van 0.182, vervaardigd. Dus, na het wijzigen van de nanodeeltjes door toevoeging van de lipide vacht, de grootte en de PDI van de nanodeeltjes werd verlaagd, waardoor ze geschikter voor levering drug.

Het is belangrijk zich zeer bewust zijn van de kritische stappen in het protocol, zoals het belang van de positie van de spuit bij het injecteren van de organische fase, de voorbereiding van de nanodeeltjes op dezelfde dag van de behandeling te vermijden aggregatie, en het zaaien van de cellen eergisteren voldoende samenvloeiing niveau te waarborgen. In feite alle stappen in het eerste deel van het protocol kunnen worden als kritiek beschouwd als zij van invloed zijn op de grootte van de nanodeeltjes of de uiteindelijke concentratie van de werkzame stof en de coating lipiden. 'Concentratie' gezien als een belangrijke parameter, staan stap 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 en 1.16 kritisch tegenover. Rekening houdend met 'nanoparticle grootte' als een belangrijke parameter staan stappen 1.7 en 1.11, 1.12 kritisch tegenover.

Fluorescentie en confocale microscopie toonde dat nanodeeltjes in de cellen was gekomen, en een groot aantal nanodeeltjes uitgestrooid in het cytoplasma van elke cel. Deze resultaten suggereren dat nanodeeltjes ontworpen in deze studie als een nieuwe en stabiele drug delivery systeem voor falcarindiol functioneren kan.

Deze techniek biedt een eenvoudige, snelle en reproduceerbare benadering kapselen verschillende kanker medicijnen, en de beperkingen van de methode worden beoordeeld met de lipide vacht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Denemarken) voor de menselijke mesenchymale stamcellen. De auteurs bedanken de Deense medisch Bioimaging centrum voor toegang tot hun microscopen. De auteurs bedanken de Carlsberg en Villum grondslagen voor financiële steun (E.A.C.). De auteurs erkennen de financiële steun van de Niels Bohr hoogleraarschap award van de Deense nationale Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
  2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
  3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
  4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
  5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
  6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
  7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
  8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
  9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
  10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
  11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
  12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
  13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
  14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
  15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
  16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
  17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
  18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
  19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
  20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
  21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
  22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
  23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
  24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
  25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
  26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
  27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
  28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics