नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ के एक उपंयास मानव उपकला एंड्रोइड मॉडल

Immunology and Infection

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Summary

एंट्रल मानव रोग के अध्ययन में एक उपंयास मॉडल के रूप में उभर रहे हैं । प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि नवजात ऊतक से उत्पन्न आंत्रशोथ के लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के उपचार का उपयोग कर मानव नेक्रोटाइज़िंग एन्टीरोकोलाइटिस के एक एंटिरॉइड मॉडल का अनुकरण कैसे करें । एकत्र आंत्रशोथ मानव परिगलन enterocolitis में देखा उन के सदृश भड़काऊ परिवर्तन का प्रदर्शन ।

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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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Abstract

नेक्रोटाइज़िंग एंटोरोकोलाइटिस (NEC) नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी बीमारी है । यह मानव आंत्र उपकला में कई pathophysiologic परिवर्तन की विशेषता है, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता के लिए अग्रणी, बिगड़ा पुनर्शोधन, और वृद्धि की कोशिका मौत. हालांकि एनईसी के कई पशु मॉडल हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इसके अलावा, यह नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों, विशेष रूप से बच्चों में रोग पैथोफाइशियोलॉजी या उपंयास चिकित्सकीय एजेंटों का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, यह उच्च एनईसी के एक उपंयास मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर विकसित वांछनीय है । आंत्र उपकला कोशिकाओं से व्युत्पन्न 3-आयामी ऑर्गेनाइड्स हैं । वे जटिल शारीरिक बातचीत, सेल सिग्नलिंग, और मेजबान रोगज़नक़ रक्षा के अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं । इस पांडुलिपि में हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि संस्कृतियों आंत्र लकीर के दौर से गुजर रोगियों से आंत्र स्टेम सेल अलग करने के बाद मानव enteroids । तहखाना कोशिकाओं के विकास कारकों है कि मानव आंत्र उपकला के विभिन्न प्रकार के कोशिका के मूल निवासी में भेदभाव को प्रोत्साहित युक्त मीडिया में सभ्य हैं । इन कोशिकाओं को एक कृत्रिम, प्रोटीन है कि एक पाड़ के रूप में सेवा, अतिरिक्त सेलुलर तहखाने झिल्ली नकल उतारना में बड़े हो रहे हैं । एक परिणाम के रूप में, एंटेरोइड का विकास-basolateral ध्रुवता । मीडिया में लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के सह प्रशासन enteroids में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनता है, histologic, आनुवंशिक करने के लिए अग्रणी, और प्रोटीन अभिव्यक्ति मानव परिषद में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह परिवर्तन । एनईसी के एक प्रायोगिक मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर दवा और उपचार मानव परीक्षण से पहले परीक्षण के लिए एक अधिक सटीक मंच प्रदान कर सकते हैं, के रूप में हम इस बीमारी के लिए एक इलाज की पहचान करने का प्रयास करते हैं ।

Introduction

मानव enteroids एक पूर्व vivo 3 आयामी संस्कृति मानव आंत्र ऊतक के नमूनों के आंत्र तहखाने से अलग स्टेम कोशिकाओं से उत्पंन प्रणाली हैं । इस जमीन को तोड़ने मॉडल हंस Clevers द्वारा बीड़ा उठाया था एट अल २००७ में Lgr5 की खोज के बाद +1चूहों में छोटी आंत के तहखाने में स्टेम सेल । उनके काम एक पूर्व vivo कई सेल प्रकार है कि महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged हो सकता है की आंतों उपकला संस्कृति की स्थापना के लिए नींव रखी । इस खोज के बाद से, enteroids सामान्य पाचन शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और पुनर्योजी दवा के रूप में आंत्र रोगों के pathophysiology2.

आंत्र पैथोफाइसियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में एंटरॉइड का उपयोग वैकल्पिक तकनीकों पर कई फायदे हैं । पिछले कई दशकों के लिए, पशु मॉडल और अमर आंतों के कैंसर-व्युत्पन्न कोशिका लाइनों आंत्र शरीर विज्ञान3,4,5का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कोशिका संस्कृतियों सामांय आंत्र उपकला में मौजूद कोशिका प्रकार की विविधता का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, जिससे सेल के पार करने के लिए सेल की कमी-टॉक और सेगमेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति में विशिष्टता, संकेतन, और रोगज़नक़ रोग प्रेरित6। आंत्रशोथ में स्टेम सेल एंटेरोसाइट्स, पैनेथ कोशिकाओं, गोबलेट कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं और अधिक3के रूप में प्रमुख उपकला कोशिका प्रकार में अंतर । वे ध्रुवता प्रदर्शन, उपकला परिवहन कार्य बाहर ले, और आंतों खंड विशिष्टता6के लिए अनुमति देते हैं । के बाद से enteroids मानव आंत्र उपकला के कई कोशिका प्रकार दोहराऊंगा कर सकते हैं, वे कैंसर सेल आधारित प्रणाली की इस मांयता प्राप्त सीमा पर काबू पाने में सक्षम हैं । समय के साथ, सेल लाइनों के डेरिवेटिव subcloned है और प्रोटीन अभिव्यक्ति और3स्थानीयकरण में अधिक से अधिक विविधता को प्रदर्शित करने के लिए विकसित । इसके विपरीत, enteroids महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged किया जा सकता है । हालांकि एनईसी के लिए कई पशु मॉडल मौजूद हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इन सीमाओं का एक परिणाम के रूप में, पशु मॉडल से व्युत्पन्न चिकित्सा विज्ञान समय की ९०% असफल जब विषाक्तता या प्रभावकारिता में अंतर के कारण मानव परीक्षण में परीक्षण3. Enteroids पूर्व नैदानिक मॉडल है कि इन कमियों को दूर कर सकते है के रूप में सेवा, जटिल आंत्र pathophysiology की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी है और इसलिए, और अधिक सफल और लागत प्रभावी चिकित्सकीय नवाचारों । वहां भी हाल ही में सबूत है कि ऊतक की उंर है कि एक एंटिरॉइड से उत्पंन होता है biologically महत्वपूर्ण7। यह हमारे मॉडल के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विस्तार है क्योंकि enteroids नवजात ऊतक से उत्पन्न कर रहे हैं, जिससे NEC के साथ रोगियों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बनाए रखने.

मानव बीमारियों के मॉडल के रूप में enteroids की उपयोगिता के लिए गंभीर और व्यापक परिस्थितियों के इलाज खोजने की उंमीद में, विस्तार जारी है । परिगलन आंत्रशोथ (एनईसी) आंत्र परिगलन द्वारा विशेषता नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी आंत्र रोग है और अक्सर आंत्र दीवार, गलाघोंटू के वेध की ओर जाता है, और8मौत । एनईसी के जटिल और मल्टीफैक्टोरियल पैथोफाइशियोलॉजी के कारण, रोग की सही व्यवस्था को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है; हालांकि, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता स्पष्ट रूप से रोग प्रक्रिया में फंसाया गया है8. यह देखते हुए कि एनईसी और संभावित चिकित्सीय एजेंटों के अध्ययन नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों में चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से बच्चों, यह उच्च एनईसी के एक जैविक रूप से प्रासंगिक एंटिरॉइड मॉडल का उपयोग मानव नवजात ऊतक का प्रयोग वांछनीय है । इस प्रकार अब तक, एनईसी के अध्ययन में एंटेरोइड की एक सीमित भूमिका है । यह प्रोटोकॉल एक उपंयास पूर्व vivo मॉडल के रूप में मानव आंत्र ऊतक के नमूनों से प्राप्त enteroids के उपयोग के लिए परिगलन enterocolitis के अध्ययन के लिए वर्णन करता है ।

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Protocol

संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी एन और शिकागो, शिकागो, आईएल के रॉबर्ट एच Lurie बच्चों के अस्पताल में आंत्र लकीर के दौर से गुजर रोगियों से ऊतक के नमूने के संग्रह के लिए (IRB #2013-१५१५२) प्राप्त किया गया था । सभी प्रोटोकॉल मानव कल्याण के लिए संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुपालन में निष्पादित किए गए थे । लिखित सूचित माता पिता की सहमति की आवश्यकता थी और सभी मामलों में नमूना संग्रह से पहले प्राप्त की ।

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. पूरे ऊतक संग्रह के लिए संस्कृति मीडिया स्टॉक समाधान तैयार: Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 1 एल, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के ११० मिलीलीटर, Penicillin के 11 मिलीलीटर-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1%) और फिल्टर निष्फल इंसुलिन की १.१ मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता ०.१%.) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
  2. तैयार Chelating बफर #1: संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर (१.१ में वर्णित के रूप में), ०.५ मीटर Ethylenediaminetetraacetic एसिड की ६०० μL (EDTA) (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी), ३०० μL के Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%) और एमफोटेरीसिन बी के ६० μL (अंतिम एकाग्रता ०.२%) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
  3. तैयार Chelating बफर #2: संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर (१.१ में वर्णित के रूप में), ०.५ एम EDTA के ३०० μL (अंतिम एकाग्रता 5mM), Gentamicin के ३०० μL (अंतिम एकाग्रता 1%) और एमफोटेरीसिन बी के ६० μL (अंतिम एकाग्रता ०.२%) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
  4. मानव Minigut मीडिया तैयार: DMEM के ४१.४ मिलीलीटर/एफ-12, FBS के 5 मिलीलीटर (अंतिम 10%), पेनिसिलिन के ५०० μL-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1%), ५०० μL of L-ग्लूटामाइन (अंतिम एकाग्रता 1%), ५०० μL के Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%), १०० μL of एंफोट्रिसिन बी (अंतिम सांद्रता ०.२%), 1 एम एन-2 के ५०० μL-हाइड्रोक्शयथाइलपिपेरजेईन-एन-2-एथेन सल्फोनिक अम्ल (हेप्स) (अंतिम सांद्रता 10 मिमी), 100x N-2 सप्लीमेंट का ५०० μL, और 50x बी-27 के 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा ५० मिलीलीटर के लिए माइनस विटामिन ए । स्टोर स्टॉक समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर ।
  5. मानव Minigut मीडिया को पूरा तैयार: 10 मिलीलीटर मानव मिनीगट मीडिया (१.४ में तैयार), 10 μL १०० μg/mL Wnt3a (अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/एमएल), 10 μL of १०० μg/mL Noggin (अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/एमएल), 10 μL की 1 मिलीग्राम/एमएल आर-स्पॉंडिन (अंतिम एकाग्रता 1 μg/एमएल) , 10 μL ५०० μg/मिलीलीटर एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF) (अंतिम एकाग्रता ५० एनजी/एमएल), 10 μL of 1 एम एन-Acetylcysteine (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी), 10 μL की 10 मिमी Y-२७६३२ (अंतिम एकाग्रता 10 μM), 10 μL की ५०० μM A-८३ (अंतिम एकाग्रता ५०० एनएम), 10 μL की 10 मिमी SB202190 (अंतिम एकाग्रता 10 μM), १०० μL 1 M निकोटिनामाइड (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी) और 1 μL की १०० μM [leu] 15-गैसइन 1 (अंतिम एकाग्रता 10 एनएम). कुल मात्रा 10 मिलीलीटर । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
    नोट: समाधान ४८ h के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए ।

2. तहखाना अलगाव और पूरे ऊतक से चढ़ाना

  1. ऑपरेटिव सुइट में संग्रह के समय, ठंडे Dulbecco के फॉस्फेट Buffered खारा (DPBS) में मानव छोटे आंतों ऊतक नमूना जगह है । ठंडे DPBS में नमूना धोने जब तक मल और रक्त की स्पष्ट । RPMI १६४० मध्यम में 4 ° c पर नमूना स्टोर जब तक तहखाना अलगाव के लिए तैयार ।
    नोट: ऊतक 24 ज से अधिक संग्रहित नहीं किया जा सकता है ।
    1. सुनिश्चित करें कि नमूना मल और रक्त का स्पष्ट है । नाजुक विदारक कैंची का प्रयोग, किसी भी अतिरिक्त वसा या शल्य क्लिप/ नमूना तौलना ।
      नोट: एक टुकड़ा लगभग 0.75-2.5 g के लिए निशाना लगाओ ।
  2. ०.५ सेमी टुकड़े और Chelating बफर #1 के 30 मिलीलीटर में जगह में नमूना कट (के रूप में १.२ कदम में तैयार) ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कम गति से हिला ।
    2. १०० μm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर ऊतक और के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
  3. 30 मिलीलीटर के Chelating बफर #2 के लिए ऊतक जोड़ें (के रूप में १.३ कदम में तैयार) ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कम गति से हिला ।
    2. एक १०० μm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर ऊतक और के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
  4. चरण २.८ में उपयोग के लिए बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के गल ५०० मिलीलीटर ।
  5. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ठंडा DMEM के 10 मिलीलीटर के लिए ऊतक जोड़ें और 10 एस के लिए हाथ से जोरदार हिला ।
    1. एक १०० μm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर और (लेबल #1) के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा । ट्यूब #1 बर्फ पर रखें ।
    2. एक अलग ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ठंडे DMEM के एक और 10 मिलीलीटर के लिए ऊतक जोड़ें और 10 एस के लिए हाथ से जोरदार हिला ।
    3. एक १०० μm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर और (लेबल #2) के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा ।
    4. दोहराएं दो अतिरिक्त बार जब तक वहां के माध्यम से प्रवाह के साथ चार शंक्वाकार ट्यूबों है (लेबल ट्यूबों #1-4) ।
  6. फिल्टर ट्यूब #1 समाधान के माध्यम से एक १०० μm सेल छलनी और स्थानांतरण प्रवाह के माध्यम से में 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब (लेबल #1) । #2-4 के लिए दोहराएं ।
    1. सेंट्रीफ्यूज 15 एमएल ट्यूबों #1-4 पर २०० x जी 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  7. लैबिनार फ्लो हुड में, supernatant ट्यूबों #1-4 से हटा दें और छोड़ें । गोली के तुरंत ऊपर ऊतक के बादल बाधित करने से बचें, भले ही कि पीछे कुछ supernatant छोड़ने का मतलब है ।
    1. धीरे से पिख्ता करके, एक साथ गोली ट्यूबों #1-4 में बचे supernatant के साथ मिश्रण ।
    2. एक ही 2 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ट्यूबों #1-4 से मिश्रण हस्तांतरण ।
    3. सेंट्रीफ्यूज 4 ° c पर 20 मिनट के लिए २०० x g पर शंक्वाकार ट्यूब ।
  8. Supernatant निकालें और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के ५०० μL में गोली फिर से निलंबित कर दें ।
    नोट:
    सभी समय पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बर्फ पर रखने के लिए और अगले चरणों के लिए जल्दी से काम करते हैं । इस उत्पाद को बहुत जल्दी कमरे के तापमान पर polymerizes ।
    1. नमूना/तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन के ५० μL एक अच्छी तरह से एक 24-कुआं थाली में केंद्र के लिए लागू होते हैं । यह गुंबद के आकार का दिखाई देना चाहिए ।
      नोट: निलंबन के चिकनी हस्तांतरण में ठंडा पिपेट युक्तियां एड्स का उपयोग करें, polymerization को ंयूनतम ।
    2. 10 कुल कुओं को भरने के लिए 9 बार दोहराएं ।
  9. ३७ ° c में 24-well थाली प्लेस, 5% 30 मिनट के लिए सह2 इनयूबेटर polymerization अनुमति देने के लिए ।
  10. मानव Minigut मीडिया पूरा के ५०० μL जोड़ें (के रूप में १.५ कदम में तैयार) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए । हर 2 दिन बदलें ।
  11. 5-10 दिन, जब नवोदित visualized है के बाद enteroids लीजिए । संग्रह निर्देशों के लिए चरण 4 और 5 देखें ।

3. प्रायोगिक परिषद के प्रेरण

  1. 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की 10 μL जोड़ें (के रूप में १.५ चरण में तैयार) 1 दिन पर अच्छी तरह से मानव Minigut मीडिया के ५०० μL को पूरा (के रूप में) । संग्रह करने तक हर 2 दिन बदलें ।

4. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए तैयारी

  1. धीरे से मीडिया निकालें ।
    1. Pbs के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट देखभाल के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को भंग करने के लिए नहीं लाइसे enteroids ।
    2. सेंट्रीफ्यूज PBS/एंटेरॉयड मिश्रण < 300 x g पर 5 मिनट के लिए गोली और pbs को हटा दें ।
  2. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें ।
  3. पैलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए < 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और फिर pbs निकालें ।
    1. PBS के 1 मिलीलीटर के साथ धीरे से धोएं और < 300 x g को 5 मिनट के लिए पैलेट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर pbs को निकालें ।
    2. चरण 4.3.1 दोहराएं ।
  4. एक शंकु ट्यूब में वांछित राशि रखकर ऊतक प्रसंस्करण जेल (लगभग ३०० μL) की एक पर्याप्त मात्रा पिघल और यह एक सूखी स्नान इनयूबेटर में वार्मिंग 3-10 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर तरल तक ।
    1. गोली के लिए ऊतक प्रसंस्करण जेल जोड़ें और धीरे मिश्रण ।
    2. एक coverslip पर, एक छोटी सी क्लोनिंग अंगूठी प्लेस ।
    3. एक क्लोनिंग अंगूठी में ऊतक प्रसंस्करण जेल और एंटिरॉइड मिश्रण पिपेट एक coverslip पर चढ़कर ।
  5. ऊतक प्रसंस्करण जेल और एंटिरॉइड मिश्रण को 1 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने दें ।
    1. पैराफिन embedding के लिए तैयारी में ७०% इथेनॉल में जम मिश्रण के साथ क्लोनिंग अंगूठी जलमग्न ।

5. आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एंटरॉइड कलेक्शन

  1. धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा मानव Minigut मीडिया को हटा दें ।
  2. 1 मिलीलीटर PBS जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट झिल्ली मैट्रिक्स को भंग करने के लिए । आंत्रशोथ को असंबद्ध करने के लिए सावधान रहें ।
    1. PBS/एंटरॉइड मिश्रण को 2 मिलि शंकु नली में रखें ।
    2. < पर सेंट्रीफ्यूज 300 गोली के लिए 5 मिनट के लिए एक्स जी
    3. धीरे PBS निकालें, ध्यान लेने के लिए नहीं enteroids हटा दें ।
  3. दोहराएं चरण श्रृंखला ५.२ दो बार और ।
  4. में फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस तक प्रोटीन और/या आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयार है ।
  5. अच्छी तरह से स्थापित qRT-पीसीआर और पश्चिमी Blotting तकनीकों का उपयोग कर एन्टीलॉइड के जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन अलगाव प्रदर्शन करते हैं ।

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Representative Results

तुरंत चढ़ाना के बाद, ताजा अलग आंत्र तहखाने लम्बी छड़ के रूप में दिखाई देते हैं । घंटे के भीतर, एंड्रोइड एक गोल दिखावट पर ले जाएगा (चित्रा 1) । अगले कई दिनों में, एंटार्ड्स के रूप में चित्र 1में देखा क्षेत्रों के गठन शुरू कर देंगे । नवोदित 5-10 दिनों के बीच हो जाना चाहिए (चित्रा 1सी) और एंड्रोइड संग्रह उस समय होना चाहिए ।

बढ़ रही enteroids भी ध्रुवता का प्रदर्शन होगा, एक केंद्रीकृत लुमेन, एक शीर्ष सीमा और एक basolateral डोमेन (चित्रा 2) युक्त. Enteroids भी संरचनात्मक अखंडता दिखाने के लिए, एक मजबूत ऐक्टिन cytoskeleton द्वारा प्रतिनिधित्व (चित्रा 3). संस्कृति में कई दिनों के बाद, LPS enteroids अनुभव अधिक apoptosis का इलाज किया और नियंत्रण समूह से एक कम उपज होगा (चित्रा 4). के रूप में मानव परिषद में देखा और NEC9के murine मॉडल, टोल की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति रिसेप्टर 4 की तरह (TLR4) lps में पाया गया था नियंत्रण की तुलना में enteroids इलाज (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्रा 1: तहखाना संस्कृति और पूरे ऊतक से मानव एंटिरॉइड गठन । () दिन 0, दौर, फ्लैट उपस्थिति के साथ तहखाना संस्कृति । () मोची गठन के साथ दिन 4 एंटरलॉइड । () नवोदित (काले तीर) के साथ दिन में 7 enteroids । स्केल पट्टियां = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2 : एक एंटॉरॉइड की ऊतकीय उपस्थिति । Haemotoxylin और ईओसिन धुंधला । एंटेरॉइड एक केंद्रीकृत लुमेन प्रदर्शित करता है और ध्रुवता को दर्शाती है, दोनों एक और एक basolateral डोमेन के साथ । हेमोटॉक्सिलिन (बैंगनी) नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि eosin (गुलाबी) cytosolic घटकों का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3 : एंटिरॉयड ऐक्टिन साइटोकंकाल । एक आंत्रयोजी का इमयूनोफ्लोजेसेंस माइक्रोग्राफ. एंटिरॉइड संरचनात्मक अखंडता को प्रदर्शित करता है जैसा कि प्रमुख ऐक्टिन सिस्टोस्क्लीटॉन (magenta) द्वारा दर्शाया गया है । नाभिक के साथ दाग DAPI (नीला), स्केल बार = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4: एलपीएस उपचार के साथ मानव एंड्रोइड कल्चर यील्ड में कमी आई है । दिन 5 संस्कृति में एंटिलॉइड, एक ही पूरे ऊतक नमूना से उगाया । () नियंत्रण संस्कृति मीडिया के साथ व्यवहार किया । मजबूत विकास प्रदर्शित करें । () संस्कृति मीडिया में एलपीएस के साथ व्यवहार किया जाता है । केवल कुछ जीवित enteroids । स्केल बार = २०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 5
चित्रा 5: प्रयोगात्मक पूर्वोत्तर परिषद enteroids में TLR4 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई । () क्यूआरटी-पीसीआर ने एलपीएस (पी = ०.०३) के संपर्क में आने वाले एंटलड में एमआरएनए अभिव्यक्ति TLR4 वृद्धि दर्शाई । () वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण प्रायोगिक मानव एंटॉरॉइड एनईसी (पी = ०.०२) में वृद्धि TLR4 अभिव्यक्ति दिखा रहा है । प्रतिनिधि वेस्टर्न ब्लाटर चित्रित । मान का अर्थ है ± SEM प्रति समूह 3 नमूने । * छात्र के टी टेस्ट से पी < ०.०५ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस उपंयास पूर्व vivo मानव आंत्र एंड्रॉइड मॉडल परिगलन आंत्रशोथ (NEC) में आंत्र बाधा रोग के अध्ययन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है । यहां प्रस्तुत एंटरॉइड प्रोसेसिंग मेथड्स डीआरएस के पिछले काम से अनुकूलित किए गए थे । मिस्टी गुड, माइकल हेलमॅथ और जेसन Wertheim10,11,12

पूरे ऊतक संग्रह और तहखाना अलगाव के समय आसपास के विवरण इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं । ऊतक तुरंत ऑपरेटिव लकीर के समय एकत्र किया जाना चाहिए और ऊतक प्रयोगशाला में आने के रूप में जल्द ही तहखाना अलगाव के लिए संसाधित । हम रोगियों से कम 3 महीने पुराने इस मॉडल के लिए ऊतक का चयन किया । यदि आवश्यक हो तो पूरे ऊतक संग्रह के बाद 24 h के भीतर विलंबित प्रक्रिया हो सकती है । इसके अतिरिक्त, मानव ऊतक नमूना की गुणवत्ता बहुत तहखाना अलगाव की उपज को प्रभावित करता है । अंतर्निहित विकृति के बिना स्वस्थ छोटी आंत और युवा रोगियों से (< उंर के 2 महीने) के लिए सबसे अच्छा परिणाम उपज पाया गया है । इसके अतिरिक्त, एकत्र ऊतक स्वास्थ्यप्रद क्षेत्र से चुना जाना चाहिए, आम तौर पर उच्छेदन नमूना के बाहर समाप्त होता है । आंत का एक बड़ा टुकड़ा का उपयोग कर ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित समाधान संस्करणों के साथ तहखाना अलगाव में सुधार नहीं करता है । आंत्र खंड लंबाई में लगभग 1-2 सेमी, वजन 0.75-2.5 ग्राम इष्टतम हैं । Lps जोखिम के माध्यम से प्रयोगात्मक NEC के प्रेरण अच्छी तरह से स्थापित सेल संस्कृति और पशु मॉडल से मॉडलिंग था । Hackam एट अल के स्थापित काम एनईसी विकास9,13,14,15में TLR4 (lps रिसेप्टर) की महत्वपूर्ण भूमिका दिखाई । TLR4 के lps सक्रियकरण proinflammatory cytokines, बाधा अखंडता में कमी, और उपपिथीलेयल ल्यूकोसाइट्स कि संकेतन मानव परिषद में शामिल घटनाओं की विशेषता के सक्रियण उत्तेजित करता है । TLR4 सूजन को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण अणु के रूप में फंसाया गया है7 और पशुओं है कि कार्यात्मक TLR4 की कमी परिषद15के विकास से सुरक्षा का प्रदर्शन किया है । एलपीएस के परिसंचारी स्तरों एनईसी के साथ रोगियों में ऊंचा कर रहे है और मल और एनईसी के पशु मॉडल के प्लाज्मा में ऊंचा । LPS पशुओं में आंत्र सूजन लाती है कि मानव परिषद, जो इस मार्ग में सूजन के महत्व पर प्रकाश डाला गया जैसा दिखता है । की स्थापना की कोशिका संस्कृति और एनईसी के पशु मॉडल Mirroring, हमें विश्वास है कि प्रयोगात्मक परिषद के एंटलरॉइड संस्कृति में LPS प्रशासन के द्वारा प्रेरण एक उपयोगी पूर्व वीवो एनईसी के अध्ययन के लिए मानव नवजात मॉडल है । अन्य स्थापित मॉडलों में पिछले रिपोर्ट के साथ लाइन में, हमारे प्रयोगात्मक NEC एंटेरिड्स नियंत्रण की तुलना में TLR4 की अभिव्यक्ति में वृद्धि का प्रदर्शन किया.

LPS जोखिम के माध्यम से प्रयोगात्मक NEC के प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण संशोधनों और सुधार आया है । शुरू में, enteroids 5 दिनों के लिए बड़े हो गए थे, तो 24 घंटे के लिए LPS के साथ inoculated और बाद में एकत्र । प्रोटोकॉल अब हर संस्कृति मीडिया में जारी जोखिम के साथ 0 दिवस पर lps टीका की सिफारिश संग्रह जब तक बदल जाते हैं । साथ ही, LPS की खुराक ऑप्टिमाइज़ किया गया था । एक खुराक वक्र प्रदर्शन और कई अलग LPS सांद्रता trialing के बाद, 5 मिलीग्राम/एमएल चुना गया था । Lps टीका के साथ प्रयोग सीधे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में/चढ़ाना के समय में एंटरॉइड मिश्रण भी trialed था; हालांकि, यह बोझिल था और परिणाम में सुधार नहीं हुआ ।

वहां सीमाएं है कि मानव एंड्रॉइड मॉडल के उपयोग के रूप में संबोधित किया जाना चाहिए रहे है विकसित । २००७ में खोज के बाद से, कई अलग प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए और संस्कृति enteroids इस्तेमाल किया गया है. कई विकास एंटिरॉइड रखरखाव और भेदभाव कमी मानकीकरण के लिए आवश्यक कारकों, जो reproducibility को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, enteroid संस्कृति यांत्रिक बलों है कि शारीरिक परिस्थितियों में मानव आंत्र उपकला को प्रभावित का अभाव है । ल्यूमिनल फ्लो और क्रमाकुंचन से दबाव जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति है, जो इस मॉडल में के लिए जिंमेदार नहीं है प्रभावित कर सकते हैं । यह मॉडल भी नसों, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एक माइक्रोबायोम, vasculature और मध्योतक कि मानव आंत्र उपकला में मौजूद है का अभाव है ।

इस मानव आंत्र एंटरॉइड मॉडल में LPS के संपर्क में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण होता है, जो कि मानव परिषद में पाए जाने वाले हिलॉजिक, आनुवंशिक और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के समान है । हालांकि एनईसी के कई वर्तमान पशु मॉडल हैं, आंतों की चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप की प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच व्यापक रूप से बदलता है । चूंकि यह नैतिकता की दृष्टि से रोग पैथोफाइशियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए या सीधे मनुष्यों में उपन्यास चिकित्सकीय एजेंटों का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से शिशुओं, यह बेहद महत्वपूर्ण है कि इस उपंयास पूर्व vivo मॉडल की खेती के लिए जारी रखने के लिए एनईसी मानव ऊतक का उपयोग कर । मानव enteroids आनुवंशिक संशोधन के लिए उत्तरदाई है और कई मानव आंतों रोगों के लिए चिकित्सा के विकास में मौलिक हो सकता है16। भविष्य के निर्देश संस्कृति के लिए एक पारगम्य पाड़ पर मानव एंटेरोइड का लक्ष्य होना चाहिए शीर्ष और basolateral प्रवाह के साथ एक छिड़काव कक्ष में आदेश vivo crypt में पुन: पेश करने के लिए-विलस वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्रमाकुंचन और luminal प्रवाह के रूप में शारीरिक बलों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान संस्थान द्वारा मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारी अनुदान (K08DK106450) और जे Grosfeld पुरस्कार अमेरिकी बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन से C.J.H. करने के लिए समर्थन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

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References

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