להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יחידת נוירו-וסקולריים (NVU) מורכב microvascular תאי אנדותל ויוצרים את מחסום הדם - מוח (BBB), קרום המרתף אנדותל עם pericytes מוטבע, והלחין limitans עכשיו, דונלד על ידי קרום המרתף parenchymal, astrocytic סיום-feed חובק את ההיבט abluminal של מערכת העצבים המרכזית (CNS) microvessels. בנוסף לשמירה על מערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס NVU שולטת תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים. במהלך immunosurveillance של מערכת העצבים המספרים הנמוכים של לימפוציטים מופעל תוכלו לחצות את המכשול אנדותל מבלי לגרום BBB בתפקוד או מחלה קלינית. לעומת זאת, במהלך neuroinflammation כגון טרשת נפוצה או במודל חיה שלה ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) מספר גדול של תאים חיסוניים יכולים לחצות BBB ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד בסופו של דבר להגיע CNS parenchyma מובילים למחלות קליניות. נדידת תאים חיסוניים אל CNS parenchyma ולכן הוא תהליך בן שני שלבים זה כרוך העברה רציפה לאורך המכשול אנדותל, גליה של NVU העסקת ברורים המנגנונים המולקולריים. אם בעקבות מעבר שלהם על פני המכשול אנדותל, תאי T פוגשים אנטיגן cognate שלהם על תאים אנטיגן perivascular שלהם הפעלה מחדש המקומי תיזום מנגנונים הבאים מובילים לקראת הפעלת מוקד של gelatinases, אשר יאפשר תאי T לחצות את מחסום גליה ולהזין CNS parenchyma. לפיכך, הערכת, BBB חדירות והן פעילות MMP קורלציה מרחבית על הצטברות תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים במהלך EAE מאפשרת לציין אובדן שלמות של חסמי אנדותל, גליה NVU. אנו כאן מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל וכיצד לנתח לאחר מכן BBB חדירות ויוו באמצעות שילוב של המשדרים פלורסנט אקסוגני. עוד נראה, כיצד להמחיש, בתרגום gelatinase הפעילות במוח EAE מאת באתרו zymogaphy מצמידים stainings immunofluorescent של BBB המרתף ממברנות ו CD45 + תאי מערכת החיסון הפולשים.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) קואורדינטות הגוף וכל התפקודים המנטליים גולגולת, הומאוסטזיס CNS חיוני עבור תקשורת נאותה של נוירונים. CNS הומאוסטזיס היא מוצדקת על ידי היחידה נוירו-וסקולריים (NVU), אשר מגן על מערכת העצבים סביבה המשתנים של זרם הדם. NVU מורכב CNS microvascular אנדותל תאים, אשר מבחינה ביוכימית ייחודיים ולהקים את מחסום הדם - מוח (BBB) ב crosstalk רציפה עם pericytes, האסטרוציטים, נוירונים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), הקמת שני ממברנות המרתף ברורים1. קרום המרתף אנדותל ensheathes את ההיבט abluminal של תאי אנדותל BBB בנמלים מספר גבוה של pericytes והוא מורכב laminin α4 וα5 laminin, בנוסף חלבונים אחרים ECM2. לעומת זאת, קרום המרתף parenchymal מורכב laminin α1 ו laminin α2 ואת מוזמנת על ידי סיום astrocytic-מטר. קרום המרתף parenchymal יחד עם אסטרוציט הסוף-רגל מלחינה את limitans עכשיו, דונלד שמבודד הרשת העצבית CNS השדרתי מלא perivascular או חללים תת-עכבישי3. בשל הארכיטקטורה הייחודית של NVU, תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים היא נבדלת כי לתוך רקמות היקפיים כפי שהוא דורש תהליך בן שני שלבים עם תאים חיסוניים, קודם פורצים BBB אנדותל ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד על מנת להגיע אל CNS parenchyma.

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה נפוצה neuroinflammatory של מערכת העצבים, שבו מספר רב של מחזורי תאים חיסוניים להזין את מערכת העצבים ולגרום neuroinflammation, demyelination, ואובדן מוקד של BBB שלמות4. ההפסד של BBB שלמות הוא סימן ההיכר המוקדמים של MS, כפי שצוין על ידי הנוכחות של ניגוד גדוליניום שיפור נגעים ב מערכת העצבים כמו על ידי תהודה מגנטית (MRI)5. ליקוציט extravasation לתוך מערכת העצבים מתרחשת ברמה של postcapillary venules; עם זאת, המנגנון המדויק מעורב diapedesis תא החיסון על-פני קרום המרתף BBB ובעקבות כך למכשול גליה נשארים כדי להבטיח את הזמנתכם. ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) משמש במודל חיה עבור MS, והוא תרם באופן משמעותי את הידע הנוכחי שלנו על פתוגנזה MS. למשל, באמצעות מודל EAE זה כבר גילו כי ליקוציט extravasation מתרחשת בתהליך רב שלבי, כולל של הלכידה הראשונית, מתגלגל שלב מתווכת על-ידי selectins ומולקולות mucin דמוי כגון בחירת שמלות P ליגנד גליקופרוטאין (PSGL)-1, שהופעלו על ידי מעצר המשרד תלויי-אינטגרין סריקה של תאי T על תאי אנדותל BBB הצדדים מתירניות עבור diapedesis6.

ברגע T תאים חצו BBB אנדותל, קרום המרתף אנדותל, הם צריכים להיתקל שלהם אנטיגן cognate מקרופאגים או תאים דנדריטים לשפות אחרות באופן אסטרטגי את החללים leptomeningeal או perivascular. אינטראקציה זו גורם הייצור מוקד של מתווכים פרו-דלקתיים על ההדק המנגנונים הבאים הנדרשים לפלישה CNS רקמה של תאים חיסוניים באמצעות8,97,limitans עכשיו, דונלד. הפעלת מוקד של מטריקס-metalloproteinases (MMP)-2 ו- MMP-9 הפיצולים כימוקין הפעלה ומשרה השפלה של מטריצה חוץ-תאית רצפטורים על אסטרוציט סוף-כפות רגליים, המהווה תנאי הכרחי לקבלת החיסון תא העברה על-פני limitans עכשיו, דונלד לתוך CNS parenchyma, כדי לעודד הופעת התסמינים הקליניים של EAE10,11.

שילוב של זיהוי של CNS שחדר תא החיסון עם BBB זליגת ופעילות gelatinase בסעיפים רקמות CNS מספק מידע חשוב אודות שלמות פונקציונלית של המכשול אנדותל, גליה בהקשר של neuroinflammation. למשל, לאחרונה חקרנו. אובדן המכונן של המולקולה אדהזיה מהחיבור מולקולה צומת חזק אנדותל (ריבה)-B תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים בהקשר של EAE. לעומת עכברים C57BL/6 פראי-סוג בריא, בריא הארנבונים מאותה חשוכת-B-ריבה הראה אין ליקוי של BBB שלמות כפי שמוצג על ידי הערכת חדירות ויוו באמצעות המשדרים אנדוגני, כמו גם אקסוגני12. בהקשר של EAE, ריבה חשוכת-B C57BL/6 עכברים הראה תסמיני המחלה יושבחו, אשר היה קשור עם תאים דלקתיים השמנה leptomeningeal ו- perivascular רווחים12. לחקור תופעה זו והגשנו בקשה בחיי עיר zymography, המאפשר זיהוי של פעילות gelatinase כדי לבחון אם חוסר פעילות gelatinase בעכברים חשוכת-ריבה-B עשוי להיות אחראי על המספרים מופחתת של תאים חיסוניים מסוגל לפרוץ עכשיו, דונלד limitans12.

נתון הזמינות של שונות מהונדסים גנטית עכבר מודלים חסר, למשל, מולקולות צמוד לצומת BBB שונות העלולות לגרום שינויים בתפקוד BBB, מתודולוגיות על חקירת BBB שלמות חשובים. בנוסף, פיתח תרופות יכול להשפיע על NVU מחסומים. הנה אנחנו מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)-פפטיד aa35-55 adjuvants של שלמה פרוינד. אז נסביר איך למקם תא החיסון חדירה מעבר חסמי אנדותל, גליה NVU וכיצד לומדים המכשול אנדותל, גליה ויוו שלמות על ידי זיהוי באתרו של המשדרים אקסוגני ופעילות gelatinase, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים נערכו תחת המנחים לפי החקיקה שוויצרי בנושא ההגנה על בעלי חיים ואושרו על-ידי המשרד הווטרינרי של קנטון ברן, שווייץ (הרשאה מספרים: להיות 31/17, להיות 77/18).

1. דיור של עכברים C57BL/6 פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם

  1. מחזור בית עכברים בכלובים מאוורר בודד עם ה 12/12 בהירה-כהה. לספק מזון ומים libidum לספירה. כדי לפקח על איכות מיקרוביולוגית של העכברים, עברה קבוצה ניסיונית חודשיות בריאות פיקוח על-ידי זקיפים מצעים מלוכלך בעקבות המלצות FELASA13.
  2. שימוש אגרופים אוזן בנפרד לסמן עכברים C57BL/6 נקבה שבוע 8-12.

2. חיסון של עכברים C57BL/6

  1. אופן ההכנה של פתרונות14:
    1. עבור שלמה פרוינד אדג'וונט (CFA), לערבב 30 מ של אדג'וונט של פרוינד שלם עם 120 מ ג של חום טרי pestled להשבית שחפת Mycobacterium (H37RA) תחת ברדס fume. פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
    2. עבור הפתרון מניות MOGaa35-55-פפטיד, להמיס MOGaa35-55-פפטיד ב- PBS סטרילי (4 מ"ג/מ"ל) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. הכן ש א-האמולסיה:
      1. לדלל פרנק 1:2 עם פתרון מניות ש א-פפטיד microtube מ ל 2.
      2. חותם את microtube עם איטום הסרט ולתקן על מערבל מערבולת על ידי מכסה לחלוטין את הצינור עם דבק. מערבולת אמולסיה במשך 4 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    4. הכנת מזרקים עם אמולסיה יציבה:
      1. קח את microtube, במהירות ספין למטה האמולסיה באמצעות צנטריפוגה שולחן קטן. לאסוף אמולסיה לתוך מזרק באמצעות הזרקה במזרק 18G x 1½'' (1.2 מ"מ x 40 מ"מ).
      2. על פי מספר עכברים לכוונן את עוצמת הקול אמולסיה במזרק (µL 100/עכבר) והחלף את המחט 18 גרם הזרקה במזרק 27G x ¾'' (0.4 מ"מ x 19 מ"מ). חותם את המחט הזרקת המצורפת את המזרק עם איטום הסרט.
    5. עבור הפתרון רעלן (PTx) שעלת מניות, להמיס 50 µg של PTx lyophilized ב µL 500 ל- PBS סטרילי (100 ng/µL). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
    6. עבור הפתרון עובד PTx, מערבבים µL 97 ל- PBS סטרילי עם 3 µL של PTx מניות פתרון (300 ng/100 µL) לכל העכבר (לשימוש הזרקת בקרום הבטן מחט 30G x ½'' (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)).
  2. אינדוקציה EAE
    1. עזים ומתנגד עכברים C57BL/6 עם isofluorane באמצעות מערכת מכשיר אידוי. כדי לגרום הרדמה בעכברים, לחשוף את העכבר כדי isofluorane 4.5% חמצן בתוך תא קטן הדגירה לפני העברת העכבר facemask עם 2.1% isofluorane. השתמש יחידת הרדמה מצויד עם חימום כרית כדי למנוע היפותרמיה של העכבר.
    2. לתקן את העכבר anesthetized ביד אחת, קודם להזריק 30 µL של MOG35-55/פרנק-אמולסיה subcutaneously לתוך רגלו האחורית האגפים (איור 1:1 + 2; ב סה כ 60 µL; לאגף שמאל µL, האגף הימני 30 µL 30) קרוב אל בלוטות הלימפה במפשעה.
    3. הנח את העכבר על הבטן שלו ולהזריק 20 µL של MOGaa35-55/פרנק-אמולסיה לתוך רקמת שומן הרכות ימין ועל שמאל בבסיס הזנב (איור 1:3 + 4; ב סה כ 40 µL; µL שורש 20 הזנב בצד שמאל ואת צד ימין זנב µL שורש 20) ו- droplet קטנה משביל ישראל MOGaa35-55/פרנק-אמולסיה o הצוואר של העכבר (איור 1: 5).
    4. להזריק 100 µL של פתרון PTx intraperitoneally לתוך העכבר. . תחזיק את הראש של העכבר מתחת מרכז הגוף הימנעות הזרקה אל המעי
    5. להחליף דיאטה תחזוקה (חומרים מזינים הגדולות extrudate: הפרוטאין הגולמי 18.5% שומן גולמי 4.5% סיבים גסים 4.5%; אפר גולמי 6.5%; עמילן 35%; אנרגיה מטבולית: 13.1 MJ/kg) רבייה דיאטה (חומרים מזינים הגדולות extrudate: חלבון גולמי 23.5%; גולמי שומן 5.5% סיבים גסים 3%; אפר גולמי 5.7%; עמילן 36%; אנרגיה מטבולית: 14.3 MJ/kg) על מנת לספק לעכברים עם האוכל של תוכן אנרגיה גבוהה יותר לפני ובמהלך המחלה הקלינית הצפויה.
    6. להסיר את מסיכת הפנים ולהעביר את העכבר בכלוב הביתה עם כרית חימום. ודא שהעכבר הוא ער לחלוטין, תאי לאחר 10 דקות.
    7. חזור על PTx הזריקה (2.2.4) 48 שעות לאחר הטיפול הראשון.

3. מניה של EAE עכברים

  1. לבדוק את מצב הבריאות של EAE עכברים כל בוקר על ידי לקיחת מבט בתוך הכלובים.
  2. ציון EAE עכברים בכל יום אחר הצהריים.
  3. לקחת כל העכבר בודדים הכלולים הניסוי EAE הכלוב ואת הסימון אם הזנב יש טונוס על-ידי הזזתה כלפי מעלה עם האצבע. עכבר בריא, אמשיך זנבו (הזנב יש טונוס של). אם EAE קליניים החלה, טונוס הזנב יהיה התחתון, גלוי על ידי הירידה ההדרגתית של הזנב. בסופו של דבר העכבר לא יוכלו להרים את זנבו בכלל.
  4. למקם כל עכבר בודדות הכלולים הניסוי EAE על הספסל נקי ולא לצפות ולתעד את התנהגות הליכה. ראה טבלה 115 עבור ניקוד קריטריונים להערכה של חומרת המחלה (התוצאה EAE).
  5. להעריך ולתעד את המשקל של כל עכבר כלול את הניסוי.
  6. כדי להבטיח ספיגת מים ואוכל נאותה על ידי עכברים הצגה של EAE קליניים הציון 1 לספק מזון בטעימת בצלחת פלסטיק בתחתית הכלוב ולרענן מדי יום.

4. אין ויוו חדירות assay

  1. ההכנות של פתרונות:
    1. פתרונות מניות לתוספי, להמיס 10 מ ג של 10 kDa לתוספי אלקסה עבור חיל הים 488, כמו גם 3 kDa לתוספי טקסס אדום ב- 500 µL של 0.9% נתרן כלורי פתרון (20 מ"ג/מ"ל).
    2. עבור הפתרון עובד לתוספי, רק לפני הזרקת µL pipet 55 של 10 kDa לתוספי אלקסה עבור חיל הים 488 במניה פתרון (20 מ"ג/מ"ל) על חתיכת איטום הסרט ולהוסיף µL 55 של kDa 3 לתוספי פתרון מניות טקסס אדום (20 מ"ג/מ"ל). לערבב, לאסוף 100 µL לתוך מזרק חד פעמיות בסדר (ריכוז סופי 2 מ"ג/100 µL).
    3. הפתרון פורמלדהיד (PFA) 10% מניות, לשלב 10 גרם של תוספת טהור אבקת מחברים, 100 מ של PBS ו 200 µL של NaOH 1N ב כוס זכוכית נקי ומחממים עד בדיוק 56 ° C תחת זע באמצעות של פגים; לשמור ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד התפרקה לחלוטין כדורגלן; להתקרר לטמפרטורת החדר; להתאים את ה-pH ל 7.4; לסנן דרך מסנן נייר. החנות ב- 20 º C. יכול להיות מדולל הפתרון מניות נוספות באמצעות PBS.
  2. זמן קצר עזים ומתנגד בריא עכברים C57BL/6 או C57BL/6 עכברים הסובלים EAE עם איזופלוריין (העכבר יותר עבור 1 דקות). השתמש במערכת אוטומטית כמו שלב 2.2.1 (עכברים להיות חשופים לאיזופלוריין 4.5% חמצן ב חדר אינדוקציה, הועבר לאחר מכן facemask עם 2.1% איזופלוריין).
  3. למקם את העכבר anesthetized במיקום לרוחב על השולחן, אז דרך הווריד (למשל רטרו-orbitally) להזריק 100 µL של המשדרים פלורסנט לתוך העכבר לפני העכבר מתעוררת.
  4. מיד להסיר את facemask וודא שהעכבר הוא ער לחלוטין, תאי לאחר ההרדמה קצרה. תן את רכיב המעקב לזרום למשך 15 דקות.
  5. להמשיך עם שלב 5.1.

5. זלוף של עכברים

  1. להערכת חדירות ויוו:
    1. להתחיל את ההליך 15 דקות לאחר ההזרקה פלורסנט מעקב על ידי גרימת הרדמה עמוקה איזופלוריין. כדי לגרום הרדמה עמוקה בעכברים להשתמש 2.3% של איזופלוריין חמצן. להשתמש את רפלקס הנסיגה כפת לשפוט את עומק ההרדמה (צובטים את העור בין האצבעות; חוסר כיפוף מציין עומק מספיק), ולאחר בדיקה של הרפלקסים של גם את forelimb וגם את hindlimb בעכברים נתון EAE.
    2. לתקן את העכבר על גבו, לרסס את הבטן עם אתנול. פתיחת בית החזה בעזרת מספריים ולהסיר את הסרעפת. פתח את העלייה הימנית של הלב הפועם באמצעות מספריים, perfuse את העכבר דרך החדר השמאלי של הלב עם 10 מ"ל של PBS ואחריו 10 מ"ל של 4% מחברים ב- PBS.
      התראה: כדי למנוע שאיפת מחברים, perfuse את העכבר בשכונה fume.
    3. המשך סעיף 6.
  2. עבור בחיי עיר zymography:
    1. לגרום הרדמה עמוקה איזופלוריין באמצעות איזופלוריין 2.3% חמצן ב עכבר הסובלים EAE ובדוק את עומק ההרדמה כמו שלב 5.1.1.
    2. בשלב הבא, לתקן את העכבר על גבו, לרסס את הבטן עם אתנול. פתיחת בית החזה בעזרת מספריים ולהסיר את הסרעפת. פתח את העלייה הימנית של הלב הפועם באמצעות מספריים, perfuse את העכבר דרך החדר השמאלי של הלב עם 20 מ של PBS.
    3. המשך סעיף 6.

6. ניתוח וקופא של המוח

  1. הכנת אמבט קירור:
    1. מילוי מיכל דיואר שטוח עם קרח יבש כתוש ולהוסיף 2-methylbutane (איזופנטאן) עד שהנוזל מגיע בערך 1 ס מ מעל חבילת קרח יבש. חיפוי עם מכסה רופף – למשל דלי קרח.
  2. קליפ ראש של העכבר perfused עם מספריים חדות ולהסיר את העור ואת האוזניים באמצעות קבוצה קטנה יותר של מספריים.
  3. בזהירות לנתח הכיפה על ידי גזירה מן מאגנום נקב לחזית-השמאל וצד ימין המאפשר upfold הכיפה מעל המוח. . אז, בזהירות להרים המוח ללא פגע בבסיס הגולגולת תוך ניתוק העצבים אופטי באמצעות מרית מתכת שטוחים.
  4. במקום מוח על רדיד אלומיניום וחותכים את המוח לשלושה חלקים (פרונטלית המוח, המוח האמצעי, ואת המוח הקטן + גזע המוח) על ידי הצבת שני חתכים הילתית.
  5. למלא cryomold (25 מ מ x 20 מ מ x 5 מ מ) את הרבעון הראשון עם מטריקס חיתוך (O.C.T.) לטמפרטורה אופטימלית, מניחים פרוסות המוח עם הצד הקדמי של כל חתיכה המוח פונה כלפי מטה לתוך cryomold, ו כיסוי רקמות לחלוטין עם O.C.T. מטריקס.
  6. מניחים את cryomold עם רקמת כיוון אופקי לתוך האמבט 2-Methylbutane ולוודא כי הרקמה קופא מלמטה למעלה בתוך דקה 1 על ידי הימנעות טובלים את הבלוק כולו רקמה לתוך האמבט.
  7. העברת רקמות קפוא-80 מעלות לאחסון והמשך עם סעיף 7.

7. הכנת קטעי רקמה קפוא

  1. Equilibrate טמפרטורה מרקמות קפוא מ-80 מעלות צלזיוס ל-20 ° C ב- cryostat למשך 30 דקות.
  2. הסרת רקמת לחסום cryomold ואת הר על בעל רקמה cryostat (מוגדר לטאוואנג) באמצעות מטריצת O.C.T..
  3. לקצץ את הקצוות של רקמה מבלוק את המחזיק cryostat באזמל חד, להתחיל לחתוך לתוך הרחוב רקמות על-ידי הסרת סעיפים 20 מיקרומטר עם הסכין cryostat עד הרקמה יהיה גלוי.
  4. לניתוח של חדירות BBB ויוו:
    1. לחתוך 6-10 מיקרומטר רקמות מקטעים, לאסוף אותם בשקופיות זכוכית אדהזיה, מיד תמונה הסעיפים מכוסה עם מכסה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    2. להעריך את המראה של כלי הדם במוח (לשים לב חדה גבולות של כלי הדם הלא-דולפים לעומת טשטוש פלורסצנטיות דפוסים שנצפו כלי הדם דולפים). כפקד חיובית, ודא לדליפת רכיב המעקב לתוך stroma של האברים circumventricular או מקלעת דמית העין שחסרה של BBB.
  5. עבור בחיי עיר zymography:
    1. לחתוך 6 מקטעים רקמות של מיקרומטר, באמצעות cryostat לאסוף אותם בשקופיות זכוכית אדהזיה, הקפאת רקמת סעיפים ב-20 ° C בתוך קופסה מקפיא המכילה סיליקה ג'ל במכסה.

8. בחיי עיר zymography בשילוב עם laminin/CD45 immunofluorescence מכתים

  1. הכן פתרונות:
    1. להכין פתרון ההטבעה:
      1. מערבבים 6 גר' גליצרול (אנליטית כיתה), 2.4 g של פולי (ויניל אלכוהול), 6 מ של ddH2O ו- 12 מ ל 0.2 מ' טריס מאגר, pH 8, ומערבבים (פגים) הפתרון במשך 4 שעות ב- RT.
      2. להעביר את הפתרון שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל ולתת לו לנוח 2 h-RT. לאחר מכן דגירה הפתרון עבור 10 דקות ב 50 מעלות צלזיוס (אמבט מים), צנטריפוגה כעשרים דקות ב g x 2,700 בטמפרטורת החדר.
      3. . קח את תגובת שיקוע ומקפיאים ב- aliquots ב-20 ° C.
    2. להכין פתרון ג'לטין קר:
      1. להמיס 0.1 גר' ג'לטין קר מן העור שור ב- 10 מ"ל של ddH2O.
      2. תן לזה משרים למשך לפחות יום אחד ולאחסן aliquots ב 4 º C.
    3. הכנת קרח מתנול (-20 ° C):
      1. שמים 100% מתנול בצנצנת coplin ומגניב ל-20 ° C.
    4. להכין פתרון מניות של אזיד הנתרן של 10%:
      1. להוסיף 10 מ של ddH2O 1g של אזיד הנתרן ולאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. הכנת 0.1% נתרן אזיד הפתרון עובד:
      1. מיקס 99 µL של ddH2O עם µL 1 של פתרון מניות של אזיד הנתרן של 10%.
    6. להמיס 1 מ ג של fluorescein מצומדת מתרצה-צבען (DQ) ג'לטין מן חזיר העור ב 1 מ"ל של אזיד הנתרן עובד פתרון וחנות aliquots µL 100 מוגן מפני אור ב 4 º C.
    7. לפזר 30 מ"ג של 1,10-phenanthroline monohydrate ב µL 76 של אתנול וביו -חנות ב-20 ° C.
    8. להכנת 25 x מעכב פרוטאז פתרון:
      1. להוסיף 1 טבליה של EDTA מעכב פרוטאז חינם 2 מ של ddH2O. חנות ב-20 ° C.
    9. לפני השימוש, הכנת התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. Centrifuge הפתרון ג'לטין 1 מ"ג/מ"ל DQ 5 דקות ב x ומכרה כ-13,300 g.
      2. מיקס 127.2 µL של ddH2O, 15 µL של 10 x מאגר התגובה (Gelatinase/Collagenase Assay קיט; ראה טבלה של חומרים), µL 0.3 של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל, µL 1.5 של 1 מ"ג/מ"ל DQ ג'לטין ו 6 µL של 25 x פתרון מעכב פרוטאז.
    10. לפני השימוש, הכן phenantroline שליטה שלילי התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. מיקס 125.2 µL של ddH2O, 15 µL של 10 x תגובת מאגר, 0.3 µL של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל, µL 1.5 של 1 מ"ג/מ"ל DQ ג'לטין, µL 6 של 25 x מעכב פרוטאז EDTA חינם 2 µL של 2 מ' 1,10-phenantroline (MMP מעכב).
    11. לפני השימוש, הכן ג'לטין קר בקרה שלילית (שאינם פלורסנט) התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. מיקס 128.7 µL ddH2O, µL 15 של 10 x תגובת מאגר, 0.3 µL של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל ו 6 µL של מעכב פרוטאז 25 x ללא EDTA.
    12. להכין נוגדן ראשוני קוקטייל עבור counterstaining, לדוגמה, 0.95 נוגדן anti-laminin ארנב polyclonal µg/mL, נוגדן anti-CD45 עכברוש polyclonal µg/מ"ל ב- BSA 1% ב- PBS, ולהכין isotype המתאים שליטה נוגדן ראשוני קוקטיילים.
    13. להכין נוגדן משני פתרון, לדוגמה, 7.5 µg/mL Cy3 עז אנטי חולדה + 15 µg/mL אנטי-ארנב AMCA ב- BSA 1% ב- PBS (להגן מפני אור).
  2. הפשרת מקטעים רקמת מוח שאינו קבוע מיקרומטר 6 מ EAE עכברים בתוך הקופסה מקפיא פלסטיק המכילה סיליקה ג'ל במכסה בשכונה fume למנוע שמירה של מים ברקמות ולהפריד 2 סעיפים רקמות על שקופית אחת על ידי ציור קווים עם מים לדחיית עט
  3. הכנת התגובה פתרונות (צעדים 8.1.9-8.1.11), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 13,400 x g -בטמפרטורת החדר, וחמים מראש עד 37 ° C שימוש באמבט מים.
  4. נתרענן הסעיפים רקמות עבור 5 דקות ב 37 ° C באמצעות 1 x תגובת מאגר. לאחר מכן, יוצקים את ה 1 x תגובת מאגר להוסיף תגובה פתרון על הסעיפים רקמות, דגירה במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. שטיפת שקופיות 5 פעמים ב- ddH2O.
  5. לתקן מקטעים עבור 5 דקות עם מתנול כקרח ב-20 ° C, אחר כך לשטוף חלקים פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר.
  6. מוסיפים 1% BSA PBS לסעיפים, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור). לאחר מכן, למחוק BSA 1% ב- PBS מן הסעיפים על ידי flipping השקופיות על רקמות, להוסיף קוקטייל נוגדן ראשוני ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור).
  7. לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS, להוסיף נוגדנים משניים קוקטייל ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור).
  8. לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS, הר של השקופיות עם הטמעת פתרון, תן הנטען בסעיפים יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור). לבסוף, לנתח סעיפים מוכתמים רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכה של מהלך קליני EAE בעכברים C57BL/6 צריך לגרום בעקומה המחלה כפי שהיא מתוארת דמות 2A ושינויים במשקל הגוף העכבר כפי שהוצג באיור 2B. עכברים C57BL/6 חיסון עם MOGaa35-55 בדרך כלל להתחיל לפתח תסמיני המחלה סביב 10-12 יום לאחר חיסון פעיל (איור 1 א'). בדרך כלל, עכברים לחסן מראים ירידה ארעית של משקל הגוף יום לאחר ההזרקה של האמולסיה והמנה הראשונה של שעלת רעלן (איור 1B). מיום 2 לאחר EAE אינדוקציה, משקל הגוף של עכברים חיסון ואז עולה בהדרגה עד שמתחיל המחלה, כאשר משקל הגוף בדרך כלל טיפות יום אחד לפני התפתחות סימפטומים קליניים וממשיך להקטין את מתאם הגדלת תסמיני המחלה (איור 1 א',ב'). לחומרת המחלה EAE מגדיל עד הפסגה של המחלה, אשר צפויים בין ימים 16 ו- 20 לאחר EAE אינדוקציה (איור 2 א). בשיאו של EAE קליני, עכברים גם מראים הנמוך משקל הגוף (איור 2B), אשר מגביר את מתאם כדי amelioration של EAE בשלב רמיסיה של המחלה (איור 2 א,ב'). אינדוקציה EAE בעכברים C57BL/6 באמצעות MOGaa35-55 תוצאות פתולוגיה מחלה כרונית, ועכברים בדרך כלל משחזר באופן מלא (איור 1 א').

איור 3A מציגה תמונה ייצוגית של מקלעת דמית העין ואת parenchyma סמוכים מוח של עכבר C57BL/6 הסובלים EAE זה דרך הווריד הוזרק עם פלורסנט 3 kDa לתוספי (אדום) ו- 10 kDa לתוספי (ירוק) 15 דקות לפני להקריב ; קנה המידה בר 50 מיקרומטר. כמו בעבר הראו, המשדרים ברצון מפוזר על פני microvessels fenestrated לתוך פיונית של מקלעת דמית העין (התמונה הימנית והאמצעית), בעוד BBB אינו מאפשר פעפוע של מחזורי המשדרים אל parenchyma המוח, המצוין על ידי הקו המקווקו (התמונה הזכות), אשר היא לפיכך ללא כל אות ניאון. איור 3B מראה נציג כלי הדם דולפים המוח הקטן של עכבר C57BL/6 הסובלים EAE זה דרך הווריד הוזרק עם פלורסנט 3 kDa לתוספי (אדום) ו- 10 kDa לתוספי (ירוק) 15 דקות לפני להקריב. ראשי החצים מצביעים על המשדרים ' מאטום לשקוף ' מעבר microvessels המוח אל parenchyma CNS (התמונה הימנית והאמצעית), רומז כי הפונקציה BBB הוא לקוי בכלי אלה. ב- CNS parenchyma, אות ניאון ירוק ואדום הוא נראה לעין מחוץ לחומות כלי דם, אשר מסומנים באמצעות קווים מקווקווים. ב- EAE, המוח הקטן שבו האזיקים דלקתיות להופיע המשדרים ניתן למצוא גם בחלל perivascular בין קרום המרתף אנדותל את limitans עכשיו, דונלד המציין פונקציונלי אובדן שלמות BBB אנדותל. אם מעקב נמצא לנטרל את parenchyma המוח, זה מראה תפקוד נוספים גליה מחסום12.

איור 4 מציג תמונות נציג של הניתוח של פעילות gelatinase (MMP) במוח EAE של עכבר C57BL/6 דמיינו ידי zymography באתרו ו מקומית ספציפיים במוח תאים מחסום אנטי-pan-laminin (כחול), לנוכחות של תאים דלקתיים על ידי צביעת immunofluorescence אנטי-CD45 (אדום). פצילות הפרוטאוליטי של ג'לטין (DQ) מתרצה-צבע unquenches אות fluorescein, אשר מאפשר לוקליזציה של הפעילות gelatinase על סעיף הרקמה. כאשר קר ג'לטין (הלא-פלורסנט פקד) מודגרת, אף ירוק ניאון האות יכול להתגלות בסעיפים המוח של העכברים EAE (בשורה העליונה), כמו גם בסעיפים זה יש כבר מתפשט עם ג'לטין DQ בשילוב עם phenantroline, Zn חזק +- סוכן complexing ו- MMP מעכב (בשורה האמצעית). בשורה התחתונה, מוקד פעילות gelatinase/MMP מוצגת בתור אות פרטנית טיפוסי-קרינה פלואורסצנטית ירוק בהיר, כפי שמודגש על ידי ראשי חץ. אזיקים דלקתיות המוח הקטן של EAE על העכבר, פעילות MMP ספציפית מתרחש מעבר limitans עכשיו, דונלד (כחול) באתרים של תאים דלקתיים חדירה (אדום).

Figure 1
איור 1 : ייצוג גרפי של אתרי הזרקה עבור אינדוקציה EAE. ההזרקה 1) עבור 30 µL ש א-אמולסיה לתוך באגף הימני, אתר 2) הזרקת 30 µL ש א-אמולסיה לתוך לאגף השמאלי, 3) ההזרקה עבור 20 µL ש א-אמולסיה לתוך שורש הזנב שמאלה, 4) ההזרקה עבור 30 µL ש א-אמולסיה לתוך הבסיס פלי צודקת 5) ההזרקה עבור droplet הקטן של ש א-אמולסיה לתוך הצוואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : קורס נציג של EAE. (א) תסמיני המחלה של EAE בעכברים C57BL/6 לאורך זמן. מוצג ממוצע + /-SEM. (B) שינוי במשקל הגוף במהלך EAE לאורך זמן. מוצג ממוצע + /-SEM.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תמונה ייצוגית של חדירות ויוו. התמונה משמאל (A): ירוק ניאון לתוספי kDa 10 ברמה של מקלעת דמית העין. במרכז התמונה: אדום פלואורסצנטי 3 kDa לתוספי ברמה של מקלעת דמית העין. התמונה הזכות: מיזוג התמונות הימנית והאמצעית. סולם בר 50 מיקרומטר. (B) שמאל תמונה: ירוק ניאון 10 kDa לתוספי המוח הקטן העכבר. במרכז התמונה: אדום פלואורסצנטי 3 kDa לתוספי המוח הקטן העכבר. התמונה הזכות: מיזוג התמונות הימנית והאמצעית. קווים מקווקווים מצביעים על קירות כלי דם; ראשי חץ הצבע המשדרים פלורסנט ב- CNS parenchyma. סולם בר 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : תמונות נציג בחיי עיר zymography. העמודה הראשונה: ערוץ פלואורסצנטי ירוק (הפצועות אות של ג'לטין (DQ) מתרצה-צבע). העמודה השניה: ערוץ הניאון הכחול (laminin). עמודה שלישית: ערוץ ניאון אדום (CD45). העמודה הרביעית: מיזוג של ערוצי פלורסנט. בשורה העליונה: שליטה שלילי קר ג'לטין (שאינם פלורסנט). בשורה האמצעית: שליטה שלילי phenantroline (MMP-מעכב). שורה הנמוך: DQ ג'לטין. סולם בר 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

0 עד 3 נקודות קריטריונים משקל משתנה
0 . אין סימנים במשקל תקין
~ חלש הזנב (טונוס חלש) - inhouse קריטריונים: אינה כלולה הבקיע מתועדת ירידה במשקל (מעיד לבדיקת ה-2)
0.5 צליעה זנב (זנב טיפות) ירידה במשקל
1 חולשה hindleg, ההליכה לא יציב (העכבר הולך על הספסל כמו ברווז) ירידה במשקל
2 hindleg גפיים (העכבר לא זז hindlimbs שלה) הרזיה חמורה (מעיד לבדיקת ה-2)
3 hindleg גפיים, בריחת שתן אובדן שליטה גופנית נמוכה יותר (בעכבר נופל לאחד בצד אבל יכול להזיז בכלוב בעזרת ist frontlegs + שתן; אדעך) משקל גוף נמוך מאוד (מעיד לבדיקת ה-2)

טבלה 1: הניקוד קריטריונים להערכה של EAE חומרת המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זירוז ולפקח EAE בעכברים C57BL/6 הנשי. נקבות מעדיפים נבחרו, ואין שיעור של נשים: הגברים של 3:1 ב- MS. כדי להעריך את חומרת EAE, עשינו שימוש גיליון הבקיע 3 נקודות. חומרת EAE הוא הבקיע בדרך כלל ביחס לחומרת בתפקוד מוטורי. עכברים עם מתקדמים בשלבים של EAE, קרי מפגין ציון מעל 2 צריך להקריב כדי למנוע סבל מיותר של בעלי החיים. לפיכך, מומלץ לצבור העכברים במרווחים קרובים למשל פעמיים ביום כפי שהוסבר בפרוטוקול.  ישנם מספר הבקיע רוטינות המועסקים, להגיע מגיל 0-3 נקודות 0-6 נקודות16,17,18,19 או אפילו יותר subpoints20. עם זאת, אנחנו בעבר הראו כי הניקוד EAE כביכול מעודן שאינו מוביל אל כל שיפור בקביעת הבדלים משמעותיים סטטיסטית פוטנציאליים מחלה ציונים בין קבוצות, כאשר בוחנים את חומרת המחלה הכוללת15. על סמך התבוננות זו שעשינו שימוש בסולם 3 נקודות כדי להעריך את התקדמות המחלה ב- EAE במטרה לצמצם את העכבר טיפול זמן ומצוקה. לפיכך, עבור עכברים יישום החוקים 3R. עוד נקודה קריטית באמצעות מודל EAE ללמוד על ההבדלים בין נוקאאוט פראי-סוג עכברים או הבדלים בין קבוצות הטיפול מסדר תכנון מדויק ניסיוני כאשר פראי-סוג עכברים הם לעומת עכברים knockout, זה חיוני כדי להשוות הארנבונים מאותה שמקורן matings משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים כדי להבטיח רקע גנטי זהה של העכברים פראי-סוג של נוקאאוט לעומת הניסוי EAE. זה חשוב גם לשמור על התנאים זהה עבור כל העכברים הכלולים ניסוי, למשל כלוב שינויים, ניהול של מזון רטוב, ועכבר במיוחד (מצב בריאות) מתנאי הדיור. כדי למנוע תופעות ספציפיות כלוב המושרה על ידי החוקר, קרוס-חיסונים יש לבצעו. ליתר דיוק, אם מזרק אחד או יותר יש צורך לחסן את מספר מסוים של עכברים, הם צריכים באופן אקראי להקצות מזרקים שונים בשימוש. האחרון כנ ל צריך להיות מוחל על הביצועים של לימודי טיפול. ואחרון אחרון חביב, מצב בריאותו של עכברים שוכנים במתקנים בעלי חיים שונים העלולים להשפיע על מחלות שכיחות וחומרת, ובכך יותר21 או פחות שחפת Mycobacterium22 ייתכן שתידרש לזירוז נאותה קליני המחלה. יתר על כן, האתר של הזרקת עשוי להשפיע על התפתחות המחלה. ב פרוטוקול זה אנו מציעים להחדיר אמצעי אחסון קטן יחסית אל תוך חמישה אתרים שונים תת עורית: 30 µL לתוך שני האגפים, µL 20 לתוך שורש זנב ישר ושמאלה, טיפונת קטן לתוך הצוואר. פרוטוקולים אחרים, מחסני µL 50 ממוקמים subcutaneously את הזנב שורש היחידה23 או לתוך ארבעת האגפים21. זריקות של מחסני קטן יותר, עם זאת, למזער את הסיכון לגרום לגירוי העור, אילו עכברים עלולים לנסות לגרד.

חדירות in vivo עשוי להתבצע כדי להעריך את זליגת BBB במהלך EAE אלא גם כדי להעריך אם המחיקה גנטי מסוים של מולקולה או טיפול תרופתי משפיע על תקינות BBB ויוו. זה יכול להיות גם המבוצעים על ידי הגילוי של פלזמה אנדוגני המשדרים כגון הפקדות IgG12 או אקסוגני טראנסים המוחלות למחזור העכבר חי24. ב פרוטוקול זה עשינו שימוש שני שונים אקסוגני המשדרים (3 kDa ו 10 kDa לתוספי) היו בו זמנית מוזרק, מותר להסתובב במשך תקופה מוגדרת של 15 דקות באמצעות שני המשדרים בגדלים שונים מאפשר לקבוע את חומרת BBB תפקוד ועשויה לאפשר להגדיר ניתוק לגדלים מעקב זה מפוזר או לא על-פני BBB. נמוכה יחסית immunogenicity, הינם פוליסכרידים הידרופילית מאופיין על ידי מים טובים מסיסות, רעילות נמוכה, dextrans פלורסנט. יתר על כן, dextrans מורכבים פולי-(α-D-1, 6 גלוקוז), אשר הם עמידים בפני המחשוף מאת glycosidases הסלולר אנדוגני. כאן השתמשנו גרסאות לתוספי שיש שאריות ליזין שולבו את המספר לתוספי המשלים. Lysinated dextrans הם אלדהיד ניתן לתיקון, המאפשר לתקן את רכיב המעקב ברקמה. חוץ dextrans fluorescently שכותרתו, כימיקלים אחרים ניתן להשתמש כדי להעריך את חדירות ויוו, למשל, Hoechst לצבוע בשילוב עם הכחול של אוון, נקשר חלק גדול כדי אלבומין. Hoechst כתמי גרעינים תא אנדותל BBB רירית מערכת העצבים המרכזית microvessels, הכחול של אוון יכול להתגלות במרחב perivascular על תפקוד לקוי של BBB ו מפזרת עוד יותר כאשר limitans עכשיו, דונלד הוא מופרע25,26. לעומת זאת, הערכת ויוו חדירות על ידי צביעת immunofluorescent של סמני אנדוגני מספק תובנה הצטברות של, למשל, IgG מולקולות או פיברינוגן, גליקופרוטאין אשר מסתובב בדם, לאורך זמן. בתנאים בריא, החלל perivascular הוא צר מאוד, קרום המרתף אנדותל, את limitans עכשיו, דונלד קשורים קשר הדוק ודורש, לפיכך, להמחיש את המחסומים ECM שני של NVU laminin נוגדן ספציפי isoform מכתים27 .

מולקולות IgG אנדוגני נוכחים במהלך מחלה בתוך כלי דם כמו גם ובריאות כמו הרקמה איברים circumventricular, איפה אין BBB הוקמה12. בגן לשנותם עכברים עם מוח מחסום פגמים, במהלך הטיפול בתרופה, או במהלך neuroinflammation מולקולות אנדוגני, כי בדרך כלל במחזור הדם עלול להיות שהופקדו parenchyma CNS, אשר ניתן לאבחן על ידי counterstaining עם אנטי-laminin נוגדנים גם לזהות כל אורח/ים ילד/laminin איזופורמים (פאן-laminin נוגדנים) או נוגדנים ספציפיים isoform laminin המאפשר להבחין laminins, laminin α4, α5 מן קרום המרתף אנדותל, laminin α1 ו α2 laminin של עכשיו, דונלד limitans. במהלך neuroinflammatory תנאי המרחב perivascular עשוי להיות העליות שחדר תאים חיסוניים המאפשר לזהות, קרום המרתף אנדותל והן את limitans עכשיו, דונלד באמצעות נוגדן פאן-laminin. Counterstaining של laminins נוכח NVU מאפשר להעריך אנדוגני אבל גם אקסוגני המשדרים מופקדים CNS parenchyma, counterstaining של CD45 מאפשר להעריך מוקד דליפה של BBB משויך תא החיסון הסתננות.

נדידת תאים חיסוניים אל CNS parenchyma דורש מעבר רציף של שני מחסומים ברורים בתוך את NVU, BBB אנדותל, ולאחר מכן של עכשיו, דונלד limitans28. חוצים את עכשיו, דונלד limitans ואת מערכת העצבים המרכזית כניסתם של תאים חיסוניים בקורלציה עם תחילתה של EAE קליניים29, תוך CNS הסתננות התאים לכוד בתוך leptomeningeal, perivascular רווחים אינם מפעילים EAE קליניים. תא החיסון השמנה בחללים leptomeningeal ו- perivascular בין ממברנות המרתף נצפתה מספר מודלים מהונדס גנטי העכבר למשל בחירת שמלות L נוק אאוט עכברים30, עכברים knockout TNF23, MMP2/MMP9 הסתרה כפולה עכברים10 , ריבה-B נוקאאוט עכברים12. אלה ממצאים תחתון כי חוסר של מולקולות אלה אינה משפיעה על נדידת תאים חיסוניים מעבר BBB אבל מעדיף על פני את limitans עכשיו, דונלד, דבר המלמד כי הם המנגנונים המולקולריים תיווכה נדידת תאים חיסוניים מעבר BBB, את limitans עכשיו, דונלד ברורים. המוח בחיי עיר zymography היא מתודולוגיה לחקור gelatinase מוקד פעילות בסעיף רקמות מדויק קורלציה מרחבית לפתולוגיה CNS. זיהוי של חדירות BBB ויוו יחד עם ביצוע zymography באתרו לזהות פעילות MMP2/MMP9 ובכך מאפשרת להתוות אנדותל לעומת עכשיו, דונלד מכשול הפרעה מתאם תא החיסון הסתננות. בשילוב עם פאן-laminin immunofluorescence CD45 מכתים במקטעי EAE המוח, היא מאפשרת לוקליזציה של פעילות gelatinase על-ידי DQ unquenching-ג'לטין והן לוקליזציה של הסתננות התאים החיסוניים באותו זמן. Unquenching של fluorescein מתוצאות DQ-ג'לטין ב אות פרטנית טיפוסי-קרינה פלואורסצנטית ירוק בהיר, בעוד אחידה אזורים ניאון ירוק במעומעם במקטעי רקמות צריך להיחשב כמו האות לא ספציפי12. לפיכך, הערכה זהירה של רקמות במקטעים ובפקדים נאותה הן תנאי הכרחי בעת ביצוע בחיי עיר zymography. ב פרוטוקול זה, ביצענו בחיי עיר zymography בשילוב עם CD45 laminin מכתים. ראשי נוגדנים נגד CD45 והן laminin היו מתפשט כמו שילוב באותו זמן. באופן דומה, נוגדנים משניים היו מתפשט כמו שילוב של שלב צביעת השני. שילוב כזה של נוגדנים צריך בדיקה כדי להבטיח כי נוגדנים בשלב השני נספגים נגד אחרים IgGs על-מנת למנוע אשיג.

הפרוטוקולים המובאת כאן יחדיו, לספק כלים לחקור בפירוט את הרכיב של NVU היא לקוי בתנאים neuroinflammatory של EAE. חדירות in vivo הערכה על ידי קליעים נותבים אקסוגני מאפשר לזהות לקות הנוכחי של תאי אנדותל microvascular שלמות או ירידת ערך נוכחי של NVU. בנוסף, הקדמה של המשדרים עם גדלים שונים מאפשר להעריך את חומרת ליקוי BBB. Zymography באתרו נוספים חושפת gelatinase מוקד פעילות האסטרוציטים ותאים דלקתיים שעלולים, אשר יש צורך לפרוץ את limitans עכשיו, דונלד כמחסום אחרון לפני קבלת גישה אל parenchyma CNS10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה לידיה סורוקין, מי שיתף אותה המקורי באתרו zymography פרוטוקול10 איתנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113, (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48, (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics