Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

Immunology and Infection

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Summary

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

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Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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Abstract

혈관 단위 (NVU)는 혈액-뇌 장벽 (BBB), 포함 된 pericytes와 내 피 지하실 막 형성 microvascular 내 피 세포의 구성 및 명과 limitans 구성 parenchymal 지하실 막 그리고 astrocytic 끝-피드 중앙 신경 시스템 (CNS) microvessels의 abluminal 측면을 수용. CNS 유지 이외에 항상성은 NVU 면역 세포 CNS에 밀매 제어 합니다. CNS의 immunosurveillance 동안 활성화 된 림프 톨의 낮은 수 BBB 부전 또는 임상 질병을 유발 하지 않고 내 피 방 벽을 교차 수 있습니다. 대조적으로, 다 발성 경화 증 또는 그것의 동물 모델에서와 같은 neuroinflammation 동안 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 면역 세포의 많은 교차 BBB와 이후 결국 CNS 실질 도달 명과 limitans 임상 질병을 선도. 면역 세포 마이그레이션 CNS 실질에 이렇게 독특한 분자 메커니즘을 채용 하는 NVU의 내 피와 폐해 장벽을 가로질러 순차적 마이그레이션을 포함 하는 2 단계 프로세스 이다. 만약 내 피 장벽을 가로질러 그들의 통행 다음, T 세포 발생 그들의 현지 재 gelatinases의 초점 활성화로 이어지는 후속 메커니즘을 시작할 것 이다 혈관 주위 항 원 제시 세포에 그들의 동족 항 원 하 폐해 방 벽을 교차 하 여 CNS 실질 입력 T 셀 수 있게 된다. 따라서, BBB 침투성 및 MMP 활동 EAE 동안 CNS에 면역 세포 축적에 공간 상관 관계에서 모두, 평가 NVU의 내 피와 폐해 장벽의 무결성의 손실을 지정할 수 있습니다. 우리는 여기 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법과 이후에 BBB 침투성 생체 조건 exogenous 형광 추적기의 조합을 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여줍니다. 우리 더 쇼, 시각화 하 고 현장에서 zymogaphy immunofluorescent stainings BBB 지하실 막과 CD45 + 침입 면역 세포의 결합에 의해 EAE 두뇌에 gelatinase 활동을 지역화 하는 방법.

Introduction

모든 신체 및 척추 동물, 정신 기능을 조정 하는 중앙 신경 시스템 (CNS) 그리고 CNS 항상성 뉴런의 적절 한 의사 소통을 위해 필수적 이다. CNS 항상성 neurovascular 단위 (NVU) CNS의 혈 류 변화 환경에서 보호에 의해 보증 된다. NVU 2 설정 CNS microvascular 내 피 세포의 화학적 고유 하 고 지속적인 누화와 pericytes, 이다, 신경, 세포 외 기질 (ECM) 구성 요소에에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 설정, 구성 고유한 지하실 막1. 내 피 지하실 막 BBB 내 피 세포의 abluminal 측면 pericytes의 높은 수 항구 이며 laminin α4와 다른 ECM 단백질2뿐만 아니라 laminin α5는 ensheathes. 반면, parenchymal 지하실 멤브레인 laminin α1 및 laminin α2의 구성 되어 있으며 astrocytic 끝-피트에 의해 포용입니다. 사이토 끝-피트 함께 parenchymal 지하실 멤브레인 가득 척수 혈관 주위 또는 거미 막 밑 공간3에서 CNS 신경 네트워크 분리 명과 limitans를 작성 합니다. NVU의 독특한 구조 때문에 CNS에 밀매 하는 면역 세포는 다릅니다 그 주변 조직으로 면역 세포는 2 단계 과정을 필요로 하 고, 먼저 위배 내 피 BBB와 그 후에 명과 limitans CNS 실질에 도달 합니다.

다 발성 경화 증 (MS)은 CNS, 순환 하는 면역 세포의 많은 CNS 입력 한 neuroinflammation, demyelination, 및 BBB 무결성4의 초점 손실의 일반적인 neuroinflammatory 질병 이다. BBB 무결성의 손실 가돌리늄 대조 자기 공명 영상 (MRI)5시각으로 CNS 병 변 강화의 존재에 의해 나타나는 것과 같이, MS의 초기 특징입니다. Postcapillary venules;의 수준에서 발생 하는 CNS에 백혈구 넘쳐 흐름 그러나, 면역 세포 diapedesis BBB 지하실 멤브레인와 이후 폐해 장벽에에서 관련 된 정확한 메커니즘 탐험 남아 있다. 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) ms는 동물 모델 역할 하 고 MS 병 인에 대 한 우리의 현재 지식에 크게 기여 했다. 예를 들어, EAE 모델을 사용 하 여 그것 발견 되었습니다 백혈구 넘쳐 흐름 초기 캡처를 포함 한 다단계 프로세스에서 발생 하 고 풀과 P selectin 당단백질 리간드 (PSGL)-1, 같은 mucin 같은 분자에 의해 중재 단계를 압 연 integrin 종속 회사 체포와 diapedesis6관대 면 BBB 내 피 세포에서 T 세포의 크롤 링에 의해 따라.

일단 T 세포는 내 피 BBB와 내 피 지하실 막 넘어, 그들은 그들의 동족 항 원 대 식 세포 나 수지상 세포를 환자의 또는 혈관 주위 공간에 전략적으로 지역화를 발생 해야 합니다. 이 상호 작용 그 트리거 후속 메커니즘 명과 limitans7,,89통해 면역 세포의 CNS 조직 침공에 필요한 프로-염증 성 중재자의 초점 생산을 유도 합니다. 매트릭스-metalloproteinases (MMP)-2 및 MMP 9의 초점 활성화 chemokine 활성화를 유도 하는 면역에 대 한 전제 조건 인 사이토 끝-피트, 수용 체 세포 외 매트릭스의 저하로 명과 limitans에서 마이그레이션 셀은 CNS 실질 EAE10,11의 임상 증상의 발병을 유도 하 고.

BBB와 면역 세포를 침투 하는 CNS의 탐지를 결합 하 여 CNS 조직 섹션에서 누설 및 gelatinase 활동 neuroinflammation의 맥락에서 내 피 및 폐해 장벽의 기능 무결성에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 최근 내 피 꽉 접합 분자 접합 접착 분자 (잼)의 제정 손실 조사-B 면역 세포 EAE의 맥락에서 CNS에 인신 매매. 건강 한 야생-타입 C57BL/6 마우스에 비해, vivo에서 침투성 평가 생 뿐만 아니라 외 인 추적기12를 사용 하 여 같이 건강 한 잼-B-결핍 littermates BBB 무결성의 아무 장애를 보였다. EAE의 맥락에서 잼 B 불충분 한 C57BL/6 마우스 환자 및 혈관 주위 공간12염증 성 세포 트래핑와 연결 했다 ameliorated 질병 증상을 보였다. 이 현상 검사 우리가 적용 현장에서 zymography, 잼-B-불충분 한 쥐에 gelatinase 활동의 부족은 면역 세포 위반 수의 감소 된 숫자에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 하는 경우 테스트 하기 위해 gelatinase 활동의 식별을 허용 합니다 명과 limitans12.

가용성을 감안할 때 다른 유전자 수정 마우스 모델 부족, 예를 들어, BBB 기능에 변화를 일으킬 수 있는 다른 BBB 꽉 접합 분자 BBB 무결성 조사 방법론은 중요 하다. 또한, 새로 개발된 된 약물 NVU 장벽에 영향을 줄 수 있습니다. 여기 우리가 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)와 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법을 보여줍니다-완전 한 Freund adjuvants에서 펩 티 드 aa35-55. 우리 다음 exogenous 추적기와 gelatinase 활동의 현장에서 감지 하 여 각각 vivo에서 내 피 및 폐해 장벽 무결성을 공부 하는 방법은 NVU의 내 피 및 폐해 장벽을 통해 면역 세포 침투를 지역화 하는 방법을 설명 합니다.

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Protocol

모든 연구 동물의 보호에 스위스 법률에 따라 지침에 따라 실시 했다 고 구획의 베른, 스위스의 수의 사무실에 의해 승인 (허가 번호: 31/17 수 고 수 77/18).

1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 C57BL/6 마우스의 주택

  1. 집 쥐 개별 환기 케이지 12/12 h 빛-어둠에에서 주기. 음식을 제공 하 고 광고 libidum 물. 쥐의 미생물 품질 감독, 실험 코 호트 분기 상태 모니터링 더러운 침구 넬 FELASA 추천13다음으로 받았다.
  2. 개별적으로 마크 8-12 주 오래 된 여성 C57BL/6 쥐 귀 펀치를 사용 합니다.

2입니다. C57BL/6 마우스의 면역

  1. 솔루션14의 준비:
    1. 대 한 완전 한 Freund의 보조 제 (CFA), 혼합 갓 pestled 열 120 mg와 불완전 한 Freund의 보조의 30 mL 비활성화 증기 두건에서 결핵균 (H37RA). 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    2. MOGaa35-55-펩타이드 재고 솔루션에 대 한 MOGaa35-55-펩타이드 살 균 PBS (4 mg/mL)에 녹이 고-80 ° c.에 저장
    3. 집 고 양이 유제 준비:
      1. CFA 1:2 2 mL microtube MOG 펩타이드 재고 솔루션을 희석.
      2. microtube 씰링 필름으로 밀봉 하 고 완전히 접착 테이프를 가진 튜브를 취재 하 여 소용돌이 믹서에 수정. 4 h 4 ° c.에 대 한 소용돌이 유제
    4. 안정 된 에멀젼과 주사기를 준비:
      1. microtube 하 고 신속 하 게 작은 테이블 원심 분리기를 사용 하 여 유제 아래로 회전. 18G x 1½' (1.2 m m x 40 m m) 주사 바늘을 사용 하 여 주사기로 유제를 수집 합니다.
      2. 쥐의 수에 따라 주사기 (100 µ L/마우스)에서 에멀젼 볼륨을 조정 하 고 18 G 바늘 27G x ¾' (0.4 m m x 19 m m) 주사 바늘으로 교체. 씰링 필름으로 주사기에 연결 된 주사 바늘을 봉인.
    5. 백 일 해 독 소 (PTx) 재고 솔루션에 대 한 분해 살 균 PBS의 500 µ L에 동결 건조 된 PTx의 50 µ g (100 ng / µ L). 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    6. PTx 작업 솔루션에 대 한 살 균 PBS의 97 µ L 3 µ L 마우스 (용 복 주사 바늘 30G x ½' (0.3 m m x 13 m m)) 당 PTx 재고 솔루션 (300 ng/100 µ L)의 혼합.
  2. EAE 유도
    1. C57BL/6 마우스 기화 기 시스템을 사용 하 여 isofluorane와 anesthetize. 마우스 마 취 유도, 2.1 %isofluorane 안 면을 마우스를 전송 하기 전에 마우스는 작은 인큐베이션 챔버에 산소에 4.5 %isofluorane 노출. 패드 난방 장치를 갖추고 마 취 단위를 사용 하 여 마우스의 저체온증을 방지 하기 위해.
    2. 한 손으로 마 취 마우스를 수정 하 고 먼저 뒷 다리 측면에 MOG35-55/CFA-유제의 30 µ L를 피하 주사 (그림 1: 1 + 2; 총 60 µ L, 왼쪽 측면 30 µ L과 오른쪽 측면 30 µ L) 사 타 구니 림프절에 가까운.
    3. 마우스는 배꼽에 놓고 꼬리 루트에서 왼쪽 및 오른쪽 소프트 지방 조직으로 MOGaa35-55/CFA-유제의 20 µ L를 주사 (그림 1: 3 + 4; 40 µ L 총; 왼쪽 꼬리 루트 20 µ L와 오른쪽 꼬리 루트 20 µ L)와 MOGaa35-55/CFA-유제 int의 작은 방울 o 마우스의 목 (그림 1: 5).
    4. 마우스에 intraperitoneally PTx 솔루션의 100 µ L를 주입 수 있습니다. 소장으로 주사를 피하는 몸 센터 아래 마우스의 머리를 잡으십시오.
    5. 유지 다이어트를 대체 (한다 주요 영양소: 조 단백질 18.5%, 조 지방 4.5%, 조 섬유 4.5%, 원유 재 6.5%; 전 분 35%, 대사 에너지: 13.1 MJ/kg) 다이어트를 번 식 하 (한다 주요 영양소: 조 단백질 23.5%, 조 지방 5.5%, 조 섬유 3%; 원유 재 5.7%; 전 분 36%; 대사 에너지: 14.3 MJ/kg) 전에, 예상된 임상 질병 중 쥐 높은 에너지 콘텐츠는 음식 제공.
    6. 얼굴 마스크를 제거 하 고 지구 온난화 패드의 홈 케이지를 마우스를 전송. 마우스는 완전히 깨어 운동 10 분 후에 다는 것을 확인 하십시오.
    7. PTx 주사 (2.2.4) 48 h 첫 번째 치료 후 반복 합니다.

3. 점수 EAE 쥐의

  1. 감 금 소 내 통해 매일 아침 EAE 쥐의 건강 상태를 확인 하십시오.
  2. EAE 쥐 매일 오후 점수.
  3. 꼬리에 tonus는 손가락으로 위쪽으로 이동 하 여 감 금 소 및 확인 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스를 가져가 라. 건강 한 마우스 꼬리를 유지할 것 이다 (꼬리는 tonus는). 임상 EAE 시작 했다 꼬리 tonus 낮은, 꼬리의 점진적 하락으로 표시 될 것입니다. 결국 마우스에 꼬리 리프트 수 없습니다.
  4. 깨끗 한 벤치에 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스 관찰 하 고 걷는 동작을 문서화. 질병의 심각도 평가 기준 점수 표 115 참조 (EAE 점수).
  5. 평가 하는 실험에 포함 된 모든 마우스의 무게를 문서화 합니다.
  6. 마우스 임상 EAE를 표시 하 여 적절 한 음식과 물 통풍 관을 위해 1의 점수는 감 금 소의 바닥에 플라스틱 접시에 moistened 식품을 공급 하 고 매일 새로 고침.

4. vivo에서 침투성 분석 결과

  1. 솔루션의 준비:
    1. Dextran 재고 솔루션, 0.9% 염화 나트륨 용액 (20 mg/mL)의 500 µ L에서 3 kDa Dextran 텍사스 레드 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 10 mg을 디졸브.
    2. Dextran 작업 솔루션에 대 한 주입 피펫으로 55 µ L 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 전에 영화 씰링의 조각에 솔루션 (20 mg/mL)을 재고 하 고 3 kDa dextran 텍사스 레드 재고 솔루션 (20 mg/mL)의 55 µ L를 추가 합니다. 혼합 및 일회용 미세 주사기 (최종 농도 2 mg/100 µ L)으로 100 µ L를 수집 합니다.
    3. 10% 포름알데히드 (PFA) 재고 솔루션에 대 한 결합 10 g 100 mL PBS의 여분의 퓨어 파우더 PFA, 깨끗 한 유리 비이 커에 정확 하 게 56 ° C에서 자력;를 사용 하 여 교 반까지 열 1N NaOH의 200 µ L의 PFA는 완전히 해산; 때까지 30 분 동안 56 ° C에서 유지 실내 온도;에 진정 pH 7.4;를 조정합니다 고 종이 필터를 통해 필터링 합니다. -20 ° c.에 게 PBS를 사용 하 여 추가 재고 솔루션을 희석 수 있습니다.
  2. 곧 건강 한 C57BL/6 쥐 또는 C57BL/6 마우스 (마우스는 약 1 분 동안 진정 될 것입니다) isoflurane EAE에서 고통 anesthetize. 2.2.1 (쥐 4.5 %isoflurane 유도 실에서 산소에서에 노출 되며 2.1 %isoflurane 안 면을 전송) 단계에서 자동화 된 시스템을 사용 합니다.
  3. 마 취 마우스 위치에 배치 측면, 테이블에 다음 정 맥 (예: 복고풍 orbitally) 형광 추적기의 100 µ L을 마우스 주입 전에 마우스 깨어나면.
  4. 바로 안 면을 제거 하 고 마우스는 완전히 깨어 메구미 짧은 마 취 후 다는 것을 확인 한다. 15 분 순환 추적 하자.
  5. 5.1 단계 진행.

5입니다. 마우스의 관류

  1. Vivo에서 침투성 평가:
    1. 깊은 isoflurane 마 취 유도 형광 추적 프로그램 삽입 후 15 분 절차를 시작 합니다. 유도 하기 위해 쥐에 깊은 마 취 산소에서 isoflurane의 2.3%를 사용 합니다. 발 철수 반사를 사용 하 여 마 취의 깊이 판단 (발가락 사이 피부를 꼬집어, 굴곡의 부족 충분 한 깊이 나타냅니다), forelimb와 쥐 EAE 대상이 hindlimb의 반사를 조사 하 고.
    2. 그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 뒤에 4%의 10 mL PBS의 10 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스 perfuse PFA PBS에.
      주의: PFA 흡입을 방지 하는 증기 두건에서 마우스 perfuse.
    3. 섹션 6로 이동 합니다.
  2. 제자리에서 zymography에 대 한:
    1. EAE에서 고통을 마우스에 산소에 2.3 %isoflurane 사용 하 여 깊은 isoflurane 마 취를 유발 하 고 단계 5.1.1에서 마 취의 깊이 확인.
    2. 다음, 그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 PBS의 20 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스를 perfuse.
    3. 섹션 6로 이동 합니다.

6. 해 부와 두뇌의

  1. 냉각 목욕의 준비:
    1. 짓 눌린된 드라이 아이스와 플랫 dewar 용기와 액체 드라이 아이스 팩 위에 약 1 cm를 도달할 때까지 2-methylbutane (Isopentane) 추가. 커버는 느슨한 뚜껑-예를 들어, 얼음 양동이 커버.
  2. 날카로운가 위 perfused 마우스의 머리 공간이 부족 잘라냅니다 고 피부와 귀가 위의 작은 세트를 사용 하 여 제거 합니다.
  3. 왼쪽 및 오른쪽 뇌에 upfold skullcap를 수 있도록 전면 구멍 매그넘에서 절단 하 여 신중 하 게는 skullcap를 해 부. 다음, 조심 스럽게 들어올립니다 그대로 뇌를 두개골의 기지에서 밖으로 평면 금속 주걱을 사용 하 여 광학 신경을 절단 하는 동안.
  4. 알루미늄 호 일에 두뇌를 놓고 두 코로나 컷을 배치 하 여 3 개의 조각 (정면 뇌, 중간 뇌 및 소 뇌 + 뇌 줄기)에서 뇌를 잘라.
  5. Cryomold (25 m m x 20 m m x 5 m m) 1 분기에 최적의 온도 절단 (O.C.T.) 매트릭스, cryomold에 아래쪽으로 직면 하 고 각 뇌의 앞쪽 측면 뇌 조각 장소를 커버 O.C.T. 매트릭스와 완전히 조직.
  6. 2 Methylbutane 목욕으로 수평 방향으로는 조직으로 cryomold를 놓고는 조직을 동결 하단에서 상단에 1 분 이내 목욕으로 전체 조직 블록을 찍기 피하 여 다는 것을 확인 합니다.
  7. 저장용-80 ° c 냉동된 조직 전송 및 섹션 7 진행.

7입니다. 언된 조직 단면도의 준비

  1. 온도-20 ° c에서 30 분 동안 cryostat-80 ° C에서 냉동된 조직에서 equilibrate
  2. Cryomold와 cryostat 조직 홀더 (-15 ° C로 설정)에 산에서 조직 블록 제거 O.C.T. 매트릭스를 사용 하 여.
  3. 날카로운 메스로 cryostat의 소유자 조직 블록의 가장자리를 트림 하 고 조직 표시 될 때까지 cryostat 칼으로 20 µ m 섹션을 제거 하 여 조직 블록으로 절단 시작 합니다.
  4. Vivo에서 BBB 침투성의 분석:
    1. 6-10 µ m 조직 단면도 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 즉시 이미지 섹션 형광 현미경을 사용 하 여 커버 슬립으로 덮여.
    2. 뇌 (형광 패턴 새 혈관에 대 한 관찰을 확산에 비해 비 새는 혈관의 날카로운 주의)에서 혈관의 모양을 평가 합니다. 긍정적인 컨트롤로 circumventricular 장기 또는 부족 한 BBB 맥락 막 신경 총의 기질에는 추적의 누설을 확인 합니다.
  5. 제자리에서 zymography에 대 한:
    1. 6 µ m 조직 단면도 cryostat를 사용 하 여 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 동결 조직 섹션-20 ° c에서 냉동 상자 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하.

8. 현장에서 zymography laminin/CD45 면역 형광 얼룩과 결합

  1. 솔루션을 준비:
    1. 포함 한 솔루션을 준비:
      1. 글리세롤 (분석 등급)의 6 g, 폴 리 (비닐 알코올)의 2.4 g, ddH2O의 6 mL과 0.2 M Tris 버퍼, pH 8의 12 mL를 혼합 하 고 실시간에 4 h에 대 한 솔루션 (자력)를 저 어
      2. 솔루션 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 실시간에서 2 h 동안 휴식 그 후 50 ° C (물 탕)에 10 분에 대 한 솔루션 및 실 온에서 2700 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 품 어.
      3. 상쾌한 고-20 ° c.에 aliquots에 고정
    2. 차가운 젤라틴 솔루션을 준비:
      1. DdH2O의 10 ml에서 소 피부에서 차가운 젤라틴의 0.1 g을 분해.
      2. 그것은 적어도 1 일 동안 담가 4 ° c.에 aliquots를 저장 하자
    3. 준비 얼음 메탄올 (-20 ° C):
      1. Coplin jar에 100% 메탄올을 넣고-20 ° c.까지 냉각
    4. 10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션을 준비:
      1. DdH2O의 10 mL를 1 g의 나트륨 아 지 드를 추가 하 고 상 온에서 저장.
    5. 0.1% 나트륨 아 지 드 작업 솔루션을 준비:
      1. 10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션의 1 µ L와 믹스 99 µ L의 ddH2O.
    6. 나트륨 아 지 드 솔루션 및 저장소 100 µ L aliquots 4 ° c.에 빛에서 보호 작업의 1 mL에 돼지 피부에서 활용 된 fluorescein 염료 침묵 (DQ) 젤라틴의 1 마그네슘을 분해
    7. 30 mg의 에탄올과-20 ° c.에 게 76 µ L에서 1,10 phenanthroline 토스의 분해
    8. 프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25를 준비:
      1. DdH2O의 2 개 mL를 EDTA 무료 protease 억제제의 1 태블릿을 추가 합니다. -20 ° c.에 게
    9. 그냥 사용 하기 전에, 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. 1 mg/mL DQ 젤라틴 솔루션 13300 x g에 5 분 동안 원심
      2. DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 (Gelatinase/콜라 분석 결과 키트, 참조 테이블의 재료) x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L 및 프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25의 6 µ L의 믹스 127.2 µ L.
    10. 그냥 사용 하기 전에 phenantroline 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. DdH2O, 반응 버퍼, 20 mg/mL 차가운 젤라틴, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L, protease 억제제 EDTA 무료, x 25의 6 µ L의 0.3 µ L x 10의 15 µ L 2 M 1,10-phenantroline (MMP 억제제)의 2 µ L의 믹스 125.2 µ L.
    11. 그냥 사용 하기 전에 차가운 젤라틴 (비 형광) 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L EDTA 무료 25 x protease 억제제의 6 µ L의 믹스 128.7 µ L.
    12. 1 차적인 항 체 칵테일 counterstaining, 예를 들어 위한, 0.95 µ g/mL polyclonal 토끼 안티 laminin 항 체와 10 µ g/mL PBS에 1 %BSA polyclonal 쥐 안티 CD45 항 체를 준비 하 고 적절 한 isotype 제어 1 차적인 항 체 칵테일을 준비.
    13. 준비 2 차 항 체 해결책, 예를 들어 7.5 µ g/mL Cy3 염소 반대로 쥐 + 15 µ g/mL PBS에서 1 %BSA AMCA 안티 토끼 (빛에서 보호).
  2. 피하 조직에 물을 보존 하 고 펜을 격퇴 하는 물으로 라인을 그려서 하나의 슬라이드에 2 조직 단면도 분리 하는 증기 두건에서 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하는 플라스틱 냉동 상자 안에 EAE 쥐에서 6 µ m 비 고정 뇌 조직 단면도 녹여
  3. 반응 솔루션 (단계 8.1.9-8.1.11) 준비, 실내 온도, 그리고 사전 따뜻한 물 목욕을 사용 하 여 37 ° c에서 13,400 x g 에 5 분 동안 원심.
  4. 1x 반응 버퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 5 분에 대 한 조직 단면도 리하이드레이션 다음, 반응 버퍼 x 1 부 조직 단면도에 반응 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 DdH2O에서 슬라이드 5 번을 씻어.
  5. -20 ° C에서 얼음 처럼 차가운 메탄올을 가진 5 분에 대 한 섹션을 수정 하 고 나중 섹션 한 번 실 온에서 PBS 씻어.
  6. 섹션에 PBS에서 1 %BSA 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (빛에서 보호). 다음, 조직에 슬라이드를 틀 지 하 여 섹션에서 PBS에서 1 %BSA 삭제, 기본 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).
  7. 섹션 PBS로 두번 세척, 이차 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).
  8. 섹션 PBS로 두번 세척, 솔루션에 포함 된 슬라이드를 탑재, 건조 한 실 온에서 밤에 탑재 된 섹션 (빛에서 보호). 마지막으로, 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 섹션 분석.

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Representative Results

C57BL/6 쥐에서 EAE의 임상 과정의 평가 질병 곡선 그림 2A그림 2B에 제시 된으로 마우스 몸 무게 변화에 묘사 된 대로 발생 한다. MOGaa35-55 일반적으로 접종 하는 C57BL/6 마우스 활성 예방 접종 (그림 1A) 후 하루 10-12 주위 질환 증상을 개발 하기 시작 합니다. 일반적으로, 면역된 생쥐 유제의 주입 및 백 일 해 독 소 (그림 1B)의 첫 번째 접종 후 하루 체중의 과도 한 방울을 표시합니다. EAE 유도 후 하루 2에서에서 다음 면역된 생쥐의 몸 무게 점차 증가 질병 시작까지 몸 무게 일반적으로 임상 증상의 개발에 앞서 1 일 삭제 하 고 계속 증가에 연관 감소 하 질병 증상 (그림 1A,B). EAE 질병 심각도 16 EAE 유도 (그림 2A) 후 20 일 예상 될 수 있는 질병의 첨단까지 증가 합니다. 임상 EAE의 첨단에, 마우스 또한 최저 몸 무게 (그림 2B), 죄 사 함 단계에서 EAE의 개량에 상관 관계 (그림 2A,B) 질병의 증가 보여줍니다. EAE 유도 C57BL/6 쥐 MOGaa35-55 결과 만성 질환 병 리에 마우스를 사용 하 여 일반적으로 완전히 복구할 수 없습니다 (그림 1A).

그림 3A 맥락 막 신경 총의 대표적인 그림과 희생 하기 전에 형광 3 kDa Dextran (빨간색)와 10 kDa Dextran (녹색) 15 분 정 맥 주사 EAE에서 고통을 C57BL/6 마우스의 인접 한 뇌 실질을 보여줍니다. ; 50 µ m 바 확장. 와 같이 우리는 이전, 맥락 막 신경 총 (왼쪽, 가운데 사진), stoma에 fenestrated microvessels에서 쉽게 확산 추적기 BBB 뇌 실질에 추적기를 순환의 확산을 허용 하지 않습니다 표시 점선 라인 (오른쪽 그림)는 따라서 어떤 형광 신호 없는 상태입니다. 그림 3B EAE 희생 하기 전에 형광 3 kDa Dextran (빨간색)와 10 kDa Dextran (녹색) 15 분 정 맥 주사에서 고통을 C57BL/6 마우스의 뇌에 대표 새 혈관을 보여줍니다. 화살표 머리 나타냅니다 추적기 CNS 실질 (왼쪽 및 가운데 그림)으로 뇌 microvessels에 걸쳐 확산 BBB 함수가이 혈관에 손상 하는 것을 건의. CNS 실질에서 녹색과 적색 형광 신호 파선으로 표시 됩니다, 혈관 벽의 이상으로 표시 됩니다. EAE에서 소 뇌 염증 수 갑에 추적기를 표시 하는 어디에 찾을 수 있습니다 내 피 지하실 막과 내 피 BBB 무결성의 기능 손실을 나타내는 명과 limitans 사이 혈관 주위 공간에. 추적 프로그램 발견 되 면 뇌 실질에 확산, 폐해 장벽12의 추가 부전을 보여준다.

그림 4 는 gelatinase (MMP) 활동의 분석의 대표적인 사진을 현장에서 zymography에 의해 시각의 존재와 안티-냄비 laminin (청색)에 의해 특정 뇌 장벽 구획을 지역화 C57BL/6 마우스의 EAE 뇌에 안티-CD45 (레드) 면역 형광 염색 하 여 염증 세포. (DQ) 젤라틴 염료 침묵의 분해 분열 조직 섹션에 gelatinase 활동의 지역화를 허용 fluorescein 신호 unquenches. 차가운 젤라틴 (비 형광 제어)를 incubated 면 녹색 형광 신호 DQ 젤라틴으로 인 큐베이 팅 섹션에서 뿐만 아니라 EAE 쥐 (위쪽 행)에서 뇌 섹션에서 검출 될 수 있다 phenantroline, 강력한 Zn +와 결합- complexing 에이전트 고 MMP 억제제 (중간 줄). 아래쪽 행에서 초점 gelatinase/MMP 활동 전형적인 세분화 된 밝은 녹색 형광 신호, 화살촉에 의해 강조 표시 됩니다. EAE 마우스의 뇌에 염증 수 갑, 특정 MMP 활동 넘어 명과 limitans (블루) (적색) 선 동적인 세포 침투의 사이트에서 발생합니다.

Figure 1
그림 1 : EAE 유도 사출 사이트의 그래픽 표현. 30 µ L에 대 한 1) 사출 사이트 오른쪽 측면에 MOG 유제, 30 µ L 2) 사출 사이트 왼쪽된 측면에 MOG 유제, 20 µ L 3) 사출 사이트 왼쪽된 꼬리 루트에 MOG 유제, 30 µ L 4) 사출 사이트 오른쪽 꼬리 루트에 MOG 유제 목에 MOG 유제의 작은 물방울에 대 한 5) 사출 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : EAE의 대표 코스. (A) 시간이 지남에 C57BL/6 쥐 EAE의 질병 증상. Sem의 + 뜻 표시 됩니다. (B) 시간이 지남에 EAE 동안 몸 무게의 변화. Sem의 + 뜻 표시 됩니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Vivo에서 침투성의 대표 그림. (A) 왼쪽된 그림: 맥락 막 신경 총의 수준에서 형광 10 kDa dextran을 그린. 가운데 그림: 빨간 형광 3 kDa dextran 맥락 막 신경 총의 수준에서. 오른쪽 그림: 왼쪽 및 가운데 그림의 병합. 스케일 바 50 µ m. (B) 왼쪽된 그림: 마우스 소 뇌에 형광 10 kDa dextran을 그린. 가운데 그림: 빨간 형광 3 kDa dextran 마우스 소 뇌에. 오른쪽 그림: 왼쪽 및 가운데 그림의 병합. 파선은 혈관 벽;에 대 한 지표 화살표 머리 CNS 실질에서 형광 추적기를 가리킵니다. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 제자리에서 zymography의 대표 사진. 첫 번째 열: 녹색 형광 채널 (염료 침묵 (DQ) 젤라틴의 unquenched 신호). 두 번째 열: 블루 형광 채널 (laminin). 제 3 열: 레드 형광 채널 (CD45). 4 열: 형광 채널의 병합. 위 행: 차가운 젤라틴 (비 형광) 부정적인 제어. 가운데 행: phenantroline (MMP 억제제) 부정적인 제어. 가장 낮은 행: DQ 젤라틴. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

0 ~ 3 포인트 점수 기준 무게 변화
0 흔적 정상 체중
~ 약한 꼬리 (약한 tonus)-사내 기준: 문서화 된 점수에 포함 되지 무게 손실 (2 검사 표시)
0.5 꼬리를 미약 (꼬리 방울) 체중 감소
1 hindleg 약점, 불안 정한 걸음 걸이 (마우스는 오리 처럼 벤치에 산책) 체중 감소
2 hindleg 하반신 마비 (마우스의 hindlimbs를 이동 하지 않습니다) 심한 체중 감소 (2 검사 표시)
3 hindleg 하반신 마비, 요 실 금 낮은 몸 통제의 손실 (마우스 폭포 하나를 측면 하지만 인도 표준시 frontlegs + 요 실 금;를 사용 하 여 장에 이동할 수 죽어가는) 매우 낮은 체중 (2 검사 표시)

표 1: EAE 질병 심각도 평가 기준 점수.

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Discussion

여기, 선물이 유도 하 고 여성 C57BL/6 쥐에서 EAE 모니터링 프로토콜. 여성은 우선적으로 선택 하 고, 그리고 여자의 발생률: MS에서 3: 1의 남자. 우리가 만든 EAE의 심각도 평가 하기 위해 3-포인트 점수 시트의 사용. EAE 심각도 모터 장애의 심각도 관하여 일반적으로 득점 된다. 마우스와 고급 EAE의 단계, 즉 2 위 점수를 전시 동물의 불필요 한 고통을 피하기 위해 희생 되어야 한다. 따라서,는 것이 좋습니다 예: 가까운 간격으로 쥐를 득점 하는 프로토콜에 설명 된 대로 두 번 매일.  여러 개의 0-6 포인트 0-3에서 도달 점수 루틴을 고용,16,17,,1819 또는 더 많은 subpoints20포인트. 그러나, 우리는 이전 살 일 걸 요 세련 된 EAE 점수 결정 하는 잠재적인 통계적 차이 질병 점수 그룹, 전체 질병 심각도15를 고려할 때에 어떤 개선으로 이어질 하지 않는 표시는. 3-포인트 규모의 마우스 처리 시간을 줄이기 위해 EAE에서 질병의 진행을 평가 하기 위해 사용 하 고 따라서, 3R 규칙을 구현 하는 마우스에 대 한 조 난 우리가 만든이 관찰을 기반으로 합니다. EAE 모델을 사용 하 여 녹아웃와 야생-타입 마우스의 차이 또는 치료 그룹 간의 차이 공부 하는 다른 중요 한 포인트는 정확한 실험 계획 설정 합니다. 야생-타입 마우스 녹아웃 쥐에 비해 때 EAE 실험에 비해 야생-타입 및 녹아웃 쥐의 동일한 유전적 배경이 되도록 heterozygous matings에서 발생 littermates 비교 필수적 이다. 그것은 또한 중요 한 실험, 예: 케이지 변경, 젖은 음식 관리에에서 포함 된 모든 마우스에 대 한 동일한 조건을 유지 하 고 특히 주택 (건강 상태) 조건 마우스. 케이지 관련 현상 수 사관에 의해 유도 된을 피하려면, 교차 접종 수행 되어야 한다. 더 정확 하 게, 이상의 주사기 필요한 경우 면역 생쥐의 특정 번호를, 그들은 할당 되어야 합니다 무작위로 다른 주사기 사용에. 후자는 마찬가지로 적용 되어야 한다 치료 연구의 성과 위해. 마지막으로, 다른 동물 시설에 쥐의 건강 상태 질병 부각 그리고 엄격에 영향을 줄 수 및 따라서 더 많은21 또는 더 적은 결핵균22 수 있습니다 적절 한 임상을 유도 하는 데 필요한 질병입니다. 또한, 주사의 사이트 질병 개발에 떨어질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 5 개의 다른 피하 사이트에 비교적 작은 볼륨을 주입 하 제안: 30 µ L 두 측면, 왼쪽 및 오른쪽 꼬리 루트 20 µ L, 목에 작은 물방울으로. 다른 프로토콜 50 µ L 창 고 꼬리 루트만23 또는 4 개의 측면21피하 배치 됩니다. 그러나 작은 저장소의 어떤 마우스 처음 하려고 할 수 있습니다 피부 자극을 일으키는 원인이 되기의 위험을 최소화 합니다.

Vivo에서 침투성 분자 또는 약물 치료의 특정 유전자 삭제 vivo에서 BBB 무결성에 영향을 뿐만 아니라 EAE 중 BBB 누설을 평가 하기 위해 수행할 수 있습니다. IgG 예금12 등 생 플라즈마 추적기의 탐지에 의해 하거나 수행 또는 외 인 보물 살아 마우스24의 순환으로 적용 되는 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 만든 두 명의 다른 exogenous 추적기 (3 kDa과 10 kDa Dextran)을 동시에 주입 15 분 두 추적기를 사용 하 여 다른 크기의 정의 시간 BBB의 심각도 결정 하는 수 있습니다 순환 수의 사용 부전 고 추적 프로그램 크기는 확산 또는 BBB는 적용 되지 않습니다 휴즈를 정의 하기 위해 허용할 수 있습니다. 형광 dextrans 친수성 다 당 류 좋은 물 가용성, 낮은 독성, 특징 그리고 상대적으로 낮은 immunogenicity. 또한, dextrans 구성 됩니다 폴 리-(포도 당 α-D-1, 6), 생 세포 glycosidases에 의해 분열에 있는. 우리는 여기 dextran 변종 dextran 켤레에 통합 하는 리 진 잔류물을 사용 합니다. Lysinated dextrans는 알데하이드 고칠 수, 조직에는 추적 프로그램을 해결 하기 위해 수 있습니다. 붙일 레이블된 dextrans 외 다른 화학 vivo에서 침투성, 혈 청 알 부 민에 큰 부분에 반의 블루와 함께에서 예를 들어, Hoechst 염료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. Hoechst 얼룩 CNS microvessels, 안 감 BBB 내 피 세포 핵 그리고 반의 블루 BBB 부전 시 혈관 주위 공간에서 검출 될 수 있다 고 명과 limitans 방해25,26을 더 확산. 대조적으로, immunofluorescent 생 마커 얼룩에 의해 vivo에서 침투성을 평가, 예를 들어, IgG 분자 또는 fibrinogen, 시간이 지남에, 혈액에서 회람 하는 당단백질의 축적에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 건강 한 조건에서 혈관 주위 공간은 매우 좁은 및 내 피 지하실 막과 명과 limitans 밀접 하 게 연결 하며, 따라서, 시각화는 NVU의 두 개의 ECM 장벽을 laminin isoform 특정 항 체27 얼룩 .

내 생 IgG 분자는 아무 BBB가 설립된12circumventricular 장기의 조직에서 건강 및 혈관 뿐 아니라 내부 질병 동안에 존재. 유전자에서 약물 치료, 중 뇌 장벽 결함, 마우스 수정 또는 일반적으로 혈액에 순환 neuroinflammation 생 분자 중 안티 laminin와 counterstaining에 의해 구상 될 수 있다 CNS 실질에서 예금 될 수 있습니다. 도 모든 laminin isoforms (팬 laminin 항 체) 또는 내 피 지하실 멤브레인와 laminin α1은 명과에서 laminin α2 laminins, laminin α4 및 α5를 차별화 하는 수 있도록 laminin isoform 특정 항 체를 인식 하는 항 체 limitans입니다. Neuroinflammatory 조건 지정, 내 피 지하실 막 팬 laminin 항 체를 사용 하 여 명과 limitans를 허용 하는 면역 세포를 침투 하 여 혈관 주위 공간을 확대 수 있습니다. 생 수 laminins는 NVU에의 counterstaining 하지만 또한 exogenous 추적기 CNS 실질에서 입금 됩니다 있으며 BBB의 초점 누설은 면역 세포와 연결 있습니다 CD45의 counterstaining 침투입니다.

면역 세포 마이그레이션 CNS 실질으로는 NVU, 내 피 BBB와 이후28명과 limitans 두 가지 장벽의 순차적 교차점을 필요합니다. 임상 EAE29의 증상과 연관 명과 limitans 및 면역 세포의 CNS 항목을 건너, CNS 동안 환자의에 갇혀 세포 침투 및 혈관 주위 공간 임상 EAE 트리거되지 않습니다. 지하실 막 사이 환자의 혈관 주위 공간에 면역 세포 트래핑에에서 관찰 되었습니다 몇 가지 유전자 수정 마우스 모델 예: L selectin 녹아웃 쥐30, TNF 녹아웃 쥐23, MMP2/MMP9 더블 녹아웃 쥐10 , 그리고 잼 B 녹아웃 쥐12. 이 분자의 부족 영향을 주지 않습니다 면역 세포 마이그레이션 BBB에서 하지만 명과 limitans, BBB와 명과 limitans 면역 세포 마이그레이션을 중재 하는 분자 메커니즘은 강조를 통해 오히려 이러한 결과 밑줄 고유한. 뇌 제자리에서 zymography은 초점 gelatinase 활동 CNS 병 리 정확한 공간 상관 관계에서 조직 섹션에 대 한 조사 방법입니다. 현장에서 zymography MMP2/MMP9 활동 감지를 수행 함께 vivo에서 BBB 침투성의 따라서 수 있습니다 윤곽을 그리 다 명과 장벽 소요 대 내 피 면역 세포 침투를. EAE 뇌 섹션에 얼룩 CD45 면역 형광 팬 laminin와 결합, unquenching DQ-젤라틴에 의해 gelatinase 활동의 지역화 및 지역화의 동시에 면역 세포에 침투 수 있습니다. 조직 섹션에 누 덕 누 덕 어렴풋이 녹색 형광 지역 난다 신호12로 간주 하는 동안 일반적인 세부적 밝은 녹색 형광 신호에서 DQ 젤라틴 fluorescein의 unquenching. 따라서, 제자리에서 zymography를 수행할 때에 조직 섹션 및 적절 한 컨트롤의 주의 평가 불가결 하지 않습니다. 이 프로토콜에서는 우리 CD45 laminin 얼룩이 함께에서 zymography 현장에서 수행합니다. CD45와 laminin에 대 한 기본 항 체 동시에 혼합으로 인 큐베이 팅 했다. 마찬가지로, 2 차 항 체는 두 번째 얼룩 단계에서 혼합으로 incubated 했다. 이러한 항 체의 조합 2 단계 항 체는 분 피하기 위하여 다른 IgGs에 대 한 흡수 되도록 테스트 해야 합니다.

함께 찍은, 여기에 제시 된 프로토콜 도구는 NVU의 요소 EAE의 neuroinflammatory 조건에서 장애인은 자세히 조사를 제공 합니다. 외 인 추적기에 의해 vivo에서 침투성 평가 microvascular 내 피 세포 무결성의 현재 장애는 NVU의 현재 장애를 식별 수 있습니다. 또한, 서로 다른 크기와 추적기의 소개 BBB 장애의 심각도 예측할 수 있습니다. 추가 현장에서 zymography CNS 실질10에 대 한 액세스를 하기 전에 마지막 장벽 명과 limitans을 위반 하는 데 필요한 이다에 잠재적으로 염증 세포, 초점 gelatinase 활동을 폭로 한다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 우리와 함께 그녀의 원래 제자리에 zymography 프로토콜10 공유는 리 디 아 Sorokin 인정 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

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