Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Biochemistry

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Summary

Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.

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Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

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Abstract

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) sono dei carboidrati complessi componenti del latte materno umano che presentano abbondanti benefici sulla salute infantile. Tuttavia, ottimizzazione della loro sintesi biotecnologica è limitata dalla relativamente bassa velocità effettiva di rilevazione e quantificazione di monosaccaride e collegamenti. Le tecniche convenzionali di analisi glycan includono metodi cromatografici/massa-spettrometria con velocità di trasmissione dell'ordine di centinaia di campioni al giorno senza automazione. Qui, dimostriamo un biosensore batterico geneticamente codificato per la rilevazione di alto-rendimento, specifiche del sollevatore e quantificazione delle strutture fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, che abbiamo raggiunto via eterologa espressione di fucosidases. Come la presenza di lattosio nel latte o in processi biotecnologici potrebbe portare a falsi positivi, dimostriamo anche la riduzione del segnale da lattosio utilizzando diverse strategie. Dovuto l'alta velocità effettiva di questa tecnica, molte condizioni di reazione o bioreattore parametri potrebbero essere analizzati in parallelo in poche ore, consentendo l'ottimizzazione della produzione di HMO.

Introduction

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) Sono oligosaccaridi lattosio-derivato, solitamente composto da tre a otto monomeri di zucchero. Essi hanno una riduzione del lattosio (Gal-β1, 4-Glc) fine e sono ulteriormente allungate da legami glicosidici (β-1,3 - o β-1,6-) di glucosio (cromatografia gaseoliquido), galattosio (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Inoltre, fucosio (Fuc, α-1,2 - o α-1,3-) o acido sialico (Sia o NeuAc, α-2,3 - o α-2,6-) residui vengono spesso aggiunti1.

Analisi corrente di oligosaccaridi e altri carboidrati sono limitato a velocità effettiva e la portata dalla necessità per spettrometria cromatografico/massa (MS) tecnologia di2,4,3,5, 6 , 7, che può durare circa un'ora per campione, per non parlare della necessità di attrezzature costose, colonne specializzate e agenti derivatizzanti e competenza sul funzionamento di questa apparecchiatura8. Oligosaccaride collegamenti sono particolarmente difficili da determinare, che richiede avanzate MS9,10 o di tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR)11. Rapida ottimizzazione di sintesi di questi oligosaccaridi è così limitato dalla velocità effettiva di questo lento passaggio analitico.

In questo studio, dimostriamo rilevazione sollevatore-specifica del trisaccaride fucosylated basati su lattosio HMOs, concentrandosi su 2'-fucosyllactose (2'-FL) che è il HMO più abbondante nel latte umano, utilizzando un codificato geneticamente Escherichia coli cellule intere biosensore con un limite di rilevazione 4 mg/l. Una caratteristica importante di questo biosensore è la sua capacità di distinguere tra trisaccaridi isomerica. Il principio di progettazione si basa sull'espressione di specifiche fucosidases in e. coli che liberare il lattosio da HMOs, la cui presenza è rilevata da operone lac , che a sua volta genera un segnale fluorescente. Raggiungiamo questo con la costruzione di un sistema di due-plasmide, uno che harboring il fucosidase specifiche del sollevatore e l'altra una proteina reporter fluorescente. Questa piattaforma di biosensore è adatta per high throughput screening di citometria a flusso o lettore di micropiastre. Inoltre dimostriamo l'utilizzo del biosensore nella quantificazione del 2'-FL prodotto da un ceppo derivati dal12. All'interno di questo studio, presentiamo anche tre strategie su rimozione selettiva di lattosio che può causare segnali positivi da biosensore, dato che il ceppo di derivati dal produttore viene coltivato il lattosio.

Presi insieme, i biosensori codificati geneticamente ci permettono di rilevare e quantificare HMOs in maniera sollevatore-specifica, che è difficile anche con cromatografica, MS, o NMR tecniche. Grazie alla sua alta produttività e facilità d'uso, questo metodo dovrebbe avere applicazioni diffuse nell'ingegneria metabolica e la sintesi di HMOs.

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Protocol

1. cella condizioni di cultura e induzione

Nota: Negli esperimenti seguenti, vengono utilizzati tre ceppi: e. coli BL21 (DE3) con un vettore vuoto, e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcA14 e pET28:green proteina fluorescente (GFP) ed e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcB14 e pET28:GFP. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo di Luria-Bertani (LB) o media minimi con gli antibiotici adatti. Preparare soluzioni di riserva di 1.000 x kanamicina (50 mg/mL) e carbenicillina (100 mg/mL) in deionizzata (DI) di acqua.

  1. Preparazione dei terreni
    1. Preparare i supporti LB aggiungendo 25 g di brodo in polvere LB a 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 20 min sterilizzare. Attendere che la temperatura del fluido LB sterilizzata è inferiore a 60 ° C prima dell'aggiunta di 1 µ l di antibiotico stock ogni 1 mL di LB media.
    2. Per preparare piatti della libbra, aggiungere 15 g di agar ai media LB prima della sterilizzazione. Attendere che la temperatura di agar LB sterilizzata è sotto i 60 ° C prima dell'aggiunta di antibiotico.
    3. 1.1.3 per le celle di biosensori, preparare o piastre con antibiotici dual, kanamicina e carbenicillina.
  2. Induttori di carboidrati
    1. Preparare soluzioni di riserva di induttori di carboidrati al molari equivalenti a 20 g/L di lattosio: 29 g/L di 2'-FL e 3-FL.
      Nota: Ogni 200 µ l di cellule richiederà 20 µ l di 2'-FL o 3-FL.
    2. Indurre 200 µ l di cellule con 2,0 g/L di concentrazione finale di lattosio o 2,9 g/L di concentrazione finale di 2'-FL/3-FL. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere durante la notte.
  3. Coltura cellulare
    1. Il giorno prima dell'esperimento del seme 5 mL di LB supplementato con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca, utilizzando una tecnica sterile.
    2. Incubare tutte le colture a 37 ° C con agitazione e far crescere le colture durante la notte.
    3. Trasferire 50 µ l della coltura durante la notte in 5 mL di fresca LB/M9 media con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e crescere fino a quando la cultura ha raggiunto la densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,5 – 0,7. In questa fase di Mid-registro, le cellule possono essere indotte.

2. misurazione della fluorescenza e limiti di rilevazione

  1. Preparazione delle cellule per citometria a flusso
    1. Trasferire le culture durante la notte per provette da 1,5 mL e centrifugare a 12.500 x g per 1 min.
    2. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di soluzione 1x tampone fosfato (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in acqua deionizzata, pH 7.2) per preparare una sospensione di singola cellula e trasferire la singola cella sospensione in provette da 5 mL flusso cytometry.
    3. Mantenere le cellule al buio a 4 ° C fino a in esecuzione i campioni su un citometro a flusso. Per risultati ottimali, è necessario analizzare le cellule appena possibile.
    4. Selezionare 488 nm laser per eccitare la GFP. Raccogliere i livelli di fluorescenza della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) (20.000-40.000 eventi, gated per dispersione avanti e laterali evitare i detriti e cellule aggregate) con un filtro passa-banda di 525/50 nm.
  2. Calibrare il biosensore
    1. Per rendere una curva di calibrazione, fare 8 – 10 diluizioni dello standard 2'-FL nel range 0-2.500 mg/L.
    2. Le cellule di biosensori di 2'-FL (contenente pAfcA e pET28:GFP) della cultura e indurli con le diluizioni standard, come descritto in precedenza nella sezione 1.3. Eseguire tre replicati biologici per ogni diluizione.

3. rilevazione e quantificazione della 2'-FL in un ceppo produttore

  1. Coltivazione del ceppo produttore
    1. Per rendere minimo media, preparare soluzioni separate di 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e 1m tiamina-HCl. sterilizzare le soluzioni usando un filtro da 0,22 µm. Mescolare M9 media brodo in polvere con 1 L di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione M9 a 121 ° C per 15 min. raffreddare la soluzione fino a 50 ° C. Aggiungere MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e tiamina a concentrazioni finali di 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, rispettivamente.
    2. Avviare una cultura della 2'-FL producendo ceppo, ad es., JM109 gwBC-F2, in 5 mL di LB media e lasciarlo crescere durante la notte a 37 ° C, come descritto in Baumgartner et al.12.
    3. Sottocultura all'1% come descritto in precedenza punto 1.3.3 in 250 mL dei media minimi preparati al punto 3.1.1. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 g/L e incubare la coltura a 37 ° C.
    4. Quando la cultura raggiunge un OD600 di 0,5 – 0,7, aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM e lattosio a una concentrazione finale di 2 g/L.
    5. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere per 24 h.
  2. Estrazione di 2'-FL
    1. Trasferire le culture durante la notte a provette sterili da 50 mL e centrifugare a 900 x g per 15 min.
    2. 3.2.2 eliminare il surnatante e risospendere il pellet in acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavare tre volte per rimuovere il lattosio residuo e infine risospendere in 5 mL di acqua deionizzata.
    3. Per lisare la sospensione cellulare, è necessario utilizzare un sonicatore al 30% di potenza, in 30 s Pulse. Mantenere le cellule sul ghiaccio in ogni momento.
    4. Centrifugare le cellule lisate per 25 min a 2.000 x g. Eliminare il surnatante, passare attraverso una sterile (ad es., da 0,22 µm) filtrare e conservare a 4 ° C fino all'analisi.
  3. Quantificazione con biosensore
    1. Inoculare una cultura di 2'-FL biosensoristica cellule e nella fase Mid-registro, indurre con equivalente lysate delle cellule alle concentrazioni stimate di 2'-FL utilizzato per rendere la curva di taratura come descritto nella sezione 2.2. Eseguire la calibrazione nell'ambiente stesso come il campione da analizzare (ad esempio, lisato cellulare) aggiungendo diluizioni di 2'-FL a controllo (cioè, non produttori) lysate prima di indurre le cellule biosensore filtrata delle cellule.
    2. Eseguire gli esempi su un citometro a flusso. Generare una curva dose-risposta tracciando l'output di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride. Confrontare la risposta degli standard per il lysate delle cellule.

4. selettiva rimozione di lattosio

Nota: Le cellule di biosensori sono sensibili al lattosio ed è auspicabile che il biosensore rilevare selettivamente HMOs su lattosio. Una strategia include lavaggio delle cellule come descritto nella sezione 3.2. Tre altre strategie sono descritte di seguito.

  1. Trattamento con commerciale purificato β-galattosidasi
    1. Sciogliere il liofilizzato di β-galattosidasi per 1.000 (lattasi FCC) unità/mL, a 1 mM MgCl2 o uso commerciale di β-galattosidasi in soluzione.
    2. Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, crescere un inoculo di cellule biosensoristica 2'-FL e indurre con 2 g/L lattosio e 2,9 g / L 2'-FL a metà fase di log.
    3. A 100 culture µ l, aggiungere quantità variabili di β-galattosidasi, fino a 12 unità e lasciare che le colture crescono durante la notte a 37 ° C con agitazione continua.
    4. Misurare la fluorescenza come descritto nella sezione 2.1 e calcolare le unità ottimale dell'enzima necessario determinando la concentrazione di enzima minimo per raggiungere desiderato attenuazione del segnale.
    5. A 2'-FL producendo cellule coltivate per 24 h, aggiungere unità ottimale di β-galattosidasi e incubare per una notte a 37 ° C. Procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.
  2. Pre-trattamento con LacZ + ceppo
    1. Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare la coltura a 37 ° C per 24 h.
    2. Inoculare un e. coli BL21 (DE3) cultura in LB, crescere alla fase di Mid-registro a 37 ° C e aggiungere 50 mL della cultura (2:1) alla cultura 24h.
    3. Incubare a 37 ° C per 3 h. procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.
  3. Precipitazione di lattosio con etanolo
    Nota: Questa sezione è adattata da Matsuki et al.12.
    1. Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare a 37 ° C per 24 h.
    2. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla cultura, agitare bene e incubare a 37 ° C per 4 ore.
    3. Centrifugare la sospensione a 900 x g per 15 min. raccogliere il surnatante e incubare per una notte a 4 ° C, che precipita il lattosio.
    4. Rimuovere il lattosio precipitato passando la soluzione attraverso un filtro di carta (11 µm). Raccogliere il filtrato che rappresenta la cella lysata contenente la 2'-FL, che può essere quantificata dalla seguente sezione 3.3.

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Representative Results

Abbiamo progettato un biosensore intera cellula specifico a 2'-FL che può essere utilizzato in combinazione con la produzione biotecnologica dell'oligosaccaride. Questo si basa sulla scissione enzimatica specifica di modificare terminali zuccheri generazione di lattosio e quindi l'attivazione dell'operone lac , che conduce all'espressione di una proteina fluorescente reporter sotto un promotore inducibile di lattosio, in proporzione alla quantità di 2'-FL. Per dimostrare la sua specificità di sollevatore, 3-fucosyllactose (3-FL), un isomero, inoltre è stato provato. Il circuito genetico contiene due parti: un gene fucosidase, afcA o afcB, guidato da un promotore costitutivo conseguente espressione costitutiva clonato a un vettore con una sequenza di segnale di pelB codificati a Monte del gene fucosidase a facilitare l'esportazione periplasmico, come pure un sistema di reporter fluorescente contenente il promotore T7 guida espressione della GFP. La prima parte è espresso il plasmide pAfcA e il secondo sistema di reporter il plasmide pET28:GFP. Il costrutto finale è stato trasformato in e. coli BL21 (DE3), un ceppo ampiamente disponibile che ha la T7 RNA polimerasi integrata nel genoma sotto il controllo del promotore pLacUV5 lattosio-sensible a reagire. Figura 1A Mostra il disegno schematico in modo che il lettore possa seguire il principio di funzionamento del biosensore. Figura 1B illustra il segnale fluorescente nelle diverse condizioni d'induzione come analizzato su un citometro a flusso. Coerentemente con la nostra ipotesi, sopra un aumento di 100 volte in fluorescenza è stata osservata con il biosensore 2'-FL rispetto al controllo vettoriale-solo o con il biosensore per 3-FL. Questo dimostra l'elevata specificità di legame del biosensore. Per garantire che il segnale è davvero a causa di defucosylation, abbiamo eseguito un controllo aggiungendo commerciale α-1,2-fucosidase alla cultura durante l'induzione, che è confermato come testimoniano le barre a destra. La sensibilità del dosaggio può essere determinata tramite la generazione di una curva dose-risposta con diversi livelli di carboidrati (Figura 2A). Dalla trama, la gamma dinamica lineare di 2'-FL rilevazione è tra 40 e 400 mg/L e il limite di rilevazione è di 4 mg/L. Questo test può essere effettuato nel corso di una giornata di lavoro, come dimostrano le misurazioni di snapshot delle dinamiche di espressione reporter (Figura 2B).

Infine, vi presentiamo come la biosensoristica cellule possono essere utilizzate per rilevare e quantificare la 2'-FL da un ceppo produttore di derivati dal 2'-FL. Poiché questo ceppo utilizza lattosio come substrato, abbiamo sviluppato strategie per ridurre il segnale da lattosio esogeno affinché la lettura del segnale corrisponderebbe direttamente alla concentrazione di 2'-FL (Figura 3A). Una strategia è enzimaticamente degradano il lattosio utilizzando una β-galattosidasi che non agisce su lattosio modificato. Questo può essere raggiunto utilizzando commerciale β-galattosidasi che agisce preferenzialmente il lattosio, riducendo il segnale di lattosio al 20% dell'originale (Figura 3B) o tramite incubazione con un LacZ + ceppo, selvaggio-tipo BL21 (DE3), che in tre ore scende il lattosio segnale ai livelli di fondo (Figura 3). L'ultima strategia utilizza l'etanolo, che non solo selettivamente precipita lattosio ma anche Lisi il produttore cellule, la lisi delle cellule, essendo un necessario passo a valle (Figura 3D). Si tratta di un processo di estrazione semplice, ma deve prestare attenzione a causa della minor recupero di 2'-FL rispetto ad altri metodi, possibilmente da perdite a causa di alcuni cristallizzazione di 2'-FL. Nonostante l'aggiunta di etanolo, non abbiamo osservato l'inibizione significativa di crescita delle cellule di biosensori, probabilmente perché le concentrazioni di etanolo finale sono basse (< 2%, v/v) nelle culture. Infine, il metodo più efficace, ma richiede tempo, che dimostriamo è quello della pallina e lavare le cellule prima della lisi cellulare per rilasciare l'intracellulare 2'-FL (Figura 3E). Si consiglia al lettore di usare discrezione per selezionare il metodo appropriato per la rimozione di lattosio basata sull'efficienza e disponibilità di tempo e reagenti.

3E figura dimostra anche la nostra capacità di quantificare in modo affidabile 2'-FL in ambito biotecnologico. Abbiamo coltivato un ceppo 2'-FL-produzione derivati dal11 o un fucosiltransferasi negativo mutante (controllo negativo) con lattosio per monitorare la produzione di 2'-FL a lysate delle cellule. Dopo la coltura delle cellule, abbiamo misurato la concentrazione utilizzando il biosensore e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per la convalida (complementare figura 1). Le curve di risposta dose per produttore lisato e controllo lisato addizionati con 2'-FL sono molto simili, che dimostra la misurazione quantitativa della 2'-FL nel contesto del lysate delle cellule.

Figure 1
Figura 1: schema dei dati di progetto e rappresentante del biosensore 2'-FL. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) entra il Periplasma batterica e viene convertito in lattosio da fucosidase heterologously espressi. Lattosio viene trasportato nel citoplasma e convertito in allolactose. Questo attiva il promotore nativo di LacUV5 in e. coli BL21 (DE3), producendo RNAP T7, che trascrive GFP sotto il promotore T7, che conduce all'espressione della proteina fluorescente. (B) rilevazione di 2'-FL e 3-FL. celle contenente pET28:GFP e pAfcA (verde), pAfcB (magenta) o un controllo di vettore vuoto (blu) sono stati indotti durante la notte senza zucchero, 2'-FL, 2'-FL con esogenicamente aggiunto α-1,2-fucosidase, 3-FL o lattosio. Tutti i dati sono una media di tre replicati biologici che ciascuno analizzato in triplice copia, dove barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media. Significatività statistica è stata determinata mediante il test di confronto più di Tukey e * * è indicativa di p < 0.01.  Questa figura in primo luogo è comparso Enam e Mansell14 e viene riutilizzata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: caratterizzazione di biosensori per la rilevazione di 2'-FL. (A) limiti di funzioni di rilevamento e trasferimento di biosensori. Curve di risposta raffigurante media di fluorescenza per pAfcA/2 ' FL (cerchio verde) o vettore di controllo vuoto (diamante blu) alle diverse quantità di 2'-FL coltivate. (B) corso di tempo dell'espressione di reporter. Ceppo pAfcA è stato incubato con 2'-FL (quadrato verde) e fluorescenza è stata monitorata oltre 8 h di induzione. Ceppo pAfcA incubato con lattosio è incluso come un controllo. Tutti i dati sono una media di tre replicati biologici che ciascuno analizzato in triplice copia, dove barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media. Questa figura in primo luogo è comparso Enam e Mansell14 e viene riutilizzata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: rilevazione e quantificazione della 2'-FL da un ceppo produttore. Flusso di lavoro (A) che illustra l'utilizzo del biosensore in un semplice protocollo con chiave focus sulla rimozione rumore residuo contiene lattosio. (B) rimozione di lattosio per digestione enzimatica di β-galattosidasi. Colture contenenti 0,3% 2'-FL (quadrato verde) o 0.2% lattosio (cerchio blu) sono stati incubati con culture di biosensore che contengono quantità variabili di β-galattosidasi esogena al tempo di induzione sono stati analizzati per fluorescenza dopo incubazione durante la notte. (C) rimozione di lattosio tramite incubazione con selvaggio-tipo LacZ + sforzo. LB contenenti 0,3% 2'-FL (cerchio verde), 0,2% lattosio (quadrati blu) o una miscela di 1:1 (0,2% lattosio equivalente, vale a dire, lattosio 0,1% + 0,15% 2'-FL, triangolo rosso magenta) è stato incubato per varie volte con BL21 (DE3) cellule e quindi aggiunto alla culture biosensore per misura di fluorescenza dopo incubazione durante la notte. (D) precipitazioni di lisi delle cellule e lattosio tramite pretrattamento di etanolo. Fermentazioni di JM109 gwBC-F2 (cerchio rosso magenta) o JM109 gwBC (triangolo blu) cellule erano incubati con 2 volumi di etanolo e filtrate prima dell'incubazione con le cellule biosensore fluorescente e rispetto con fluorescenza da non trattata JM109 gwBC-F2 cultura ( quadrato verde). (E) quantificazione della 2'-FL a lysate delle cellule. Il biosensore è stato valutato per la sua capacità di rilevare 2'-FL da un ceppo di metabolicamente derivati dal produttore. Misure di fluorescenza generate tramite l'aggiunta di entrambi greggio lisato di JM109 gwBC-F2 (cerchio rosso magenta, 2'-FL quantificata mediante LC-MS), 2'-FL in quantità definite di ceppo nonproducer JM109 gwBC cella lysate (quadrato verde) o greggio lisato di JM109 gwBC ceppo (blu diamante). Risultati sono stati convalidati da quantificazione di HPLC di 2'-FL nel ceppo produttore. Tutti i dati sono una media di tre replicati biologici ciascuno analizzato in triplice copia, dove errore verticale barre rappresentano la deviazione standard dalla media di fluorescenza e barre di errore orizzontale rappresentano la deviazione standard a 2'-FL misurata da HPLC nella triplici copie. Questa figura in primo luogo è comparso Enam e Mansell14 e viene riutilizzata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare figura 1: analisi di HPLC-MS di 2'-FL. (A) estratte cromatogrammi di ioni di 2'-FL (m/z 511). Cromatogramma di livello commerciale è mostrato in alto a sinistra. Cromatogramma di 2'-FL dal ceppo JM109gwBC-F2 (diluizione 10 volte) è mostrato nella parte inferiore. Il picco a 511 m/z è il sodio addotto. (B) un ampliamento di spettro di massa m/z da 300−800, dove si concentravano i segnali più abbondanti è indicato per lo standard commerciale (in alto) e la 2'-FL dal ceppo produttore (in basso). (C) A curva standard è stato creato da analisi LC-MS con diversi livelli di commerciale 2'-FL. Barre di errore rappresentano deviazioni standard da misurazioni in triplice copia. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Vi presentiamo una strategia ad alta produttività per la rilevazione di specifici del sollevatore di fucosylated gli oligosaccaridi del latte umano. Ciò è stata compiuta con la costruzione di biosensori di cellule intere di genetica e. coli che dopo induzione con specifici glicani rispondere con un segnale fluorescente. Il protocollo inoltre dettagli su come il biosensore può essere utilizzato per rilevare e quantificare HMOs in un metabolicamente derivati dal ceppo batterico.

Il nostro protocollo offre vantaggi rispetto ai metodi alternativi a causa del suo elevato throughput oltre alla sua sollevatore-specificità rispetto ai metodi cromatografici/MS. Il limite minimo di rilevamento e ampia gamma dinamica consente la misura diretta di HMOs.

Punti critici in questo protocollo si verificano nella preparazione della cella lysata di ceppi di produttore. Per garantire il massimo titolo di 2'-FL, è fondamentale fornire le condizioni ottimali. Variabilità in lotti possono sorgere a causa di parametri di sonicazione o tempi di induzione. Cura dovrebbe essere presa durante la caratterizzazione del biosensore. Si consiglia inoltre di eseguire controlli adeguati per tutti i passaggi nell'esperimento per garantire risultati coerenti.

Una limitazione del nostro protocollo è la sua dipendenza dal lattosio per induzione, che diventa un collo di bottiglia quando lattosio naturalmente presenti, come nel latte materno, o usato come il substrato in produzione biotecnologica di HMOs. Abbiamo affrontato questo con quattro distinte strategie per rimuovere il rapporto segnale-rumore in modo che il biosensore è in grado di rilevare selettivamente HMOs su lattosio.

Il biosensore intero-cellula geneticamente codificato presentato qui vi permetterà di ottimizzazione per la fabbricazione di HMOs, come molte condizioni di reazione o bioreattore parametri possono essere analizzati in parallelo in una questione di ore. Quando eseguito in piastre da 96 o 384 pozzetti, il metodo Mostra il potenziale di schermo migliaia di campioni al giorno.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio di Iowa State University. F.E. è stato parzialmente finanziato dal NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cattedra. T.J.M. è stato parzialmente sostenuto da Karen e Denny Vaughn Facoltà Fellowship. Gli autori ringraziano Iowa State University flusso Cytometry Facility e il laboratorio di ricerca metabolomica W.M. Keck per assistenza con fluorescenza e studi di LC-MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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