Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)는 복잡 한 탄수화물의 구성 요소 인간의 모유는 유아 건강에 많은 혜택. 그러나, 그들의 바이오 합성의 최적화는 탐지의 상대적으로 낮은 처리량 및 단 당 류와 연계의 정량화에 의해 제한 됩니다. Glycan 분석의 전통적인 기술을 자동화 없이 하루 샘플 수백 순서 처리량 크로마/질량-spectrometric 메서드가 포함 됩니다. 여기, 높은 처리량, 연계 관련 검색 및 fucosylated HMO 구조, 2'-fucosyllactose와 3-fucosyllactose, 우리는 분리를 통해 달성의 정량화에 대 한 유전자 인코딩된 세균성 바이오 센서 설명 fucosidases의 표현입니다. 으로 유 당 우유 또는 바이오 프로세스의 존재는 가양성으로 이어질 수 있는, 우리 또한 다른 전략을 사용 하 여 유 당에서 신호 감소를 보여줍니다. 이 기술은 높은 처리량으로 인해 많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수 HMO 제조의 최적화에 대 한 허용 하는 시간의 문제에 동시에 분석 될 수 있습니다.

Introduction

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo) 유 당 파생 oligosaccharides, 일반적으로 3 ~ 8 설탕 단위체로 구성 된 있습니다. 그들은 끝 (Gal β1, 4-Glc) 유 당 감소 그리고 더 glycosidic 링크에 의해 길쭉한 (β-1, 3-또는 β-1, 6-) 포도 당 (Glc), 갈 락 토스 (Gal), 또는 N-acetylglucosamine (GlcNAc). 또한, fucose (Fuc, α-1, 2-또는 α-1, 3-) 또는 sialic acid (Sia 또는 NeuAc, α-2, 3-또는 α-2, 6-) 잔류물은 종종1추가.

Oligosaccharides과 다른 탄수화물의 현재 분석 크로마/질량 spectrometric (MS) 기술2,3,,45, 에 대 한 필요에 의해 처리량 그리고 범위에 제한 됩니다. 6 , 7, 대략 걸릴 수 있는이 장비8의 가동에 고가의 장비, 특수 열과 derivatizing 에이전트 및 전문성에 대 한 필요성을 언급 하지 않기 위하여 샘플 당 한 시간. 올리고 당 연계는 특히 어려운 결정, 고급 MS9,10 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기법11. 이러한 oligosaccharides의 합성의 빠른 최적화 따라서이 느린 분석 단계의 처리량에 의해 제한 됩니다.

이 연구에서 설명 하는 fucosylated trisaccharide의 연계 관련 검색 유 기반 Hmo, 2'-fucosyllactose (2'-플로리다) 인간의 우유에 있는 가장 풍부한 HMO에 초점을 맞추고, 유전자 암호화를 사용 하 여 대장균 전체 셀 4 mg/l.에서 검출 한도 바이오 센서 이 바이오 센서의 중요 한 기능은 이성질체 trisaccharides 사이 구별 하는 기능입니다. 디자인 원리는 존재에 형광 신호를 생성 하는 오 페론에 의해 검출 된다 Hmo에서 유 당을 해방 하는 대장균 의 특정 fucosidases의 식을 기반으로 합니다. 우리는 링크 전용 fucosidase와 다른 형광 기자 단백질을 품고 하나 2-플라스 미드 시스템을 구축 하 여 이것을 달성. 이 바이오 센서 플랫폼은 높은 처리량 검열 cytometry 또는 마이크로 플레이트 리더에 적합 합니다. 우리는 또한 2'-플로리다 설계 변형12제작한 측정에 바이오 센서의 활용을 보여 줍니다. 이 연구에서 또한 선물이 세 가지 전략, 바이오 센서에서 거짓 긍정적인 신호에서 발생할 수 있는 유 당의 선택적 제거에 조작된 프로듀서 스트레인 성장 유 당에는.

함께 찍은, 유전자 인코딩된 바이오 센서 수 감지 하 고도 어려운 연계 특정 방식으로 Hmo를 계량 컬럼에, MS, 또는 NMR 기법. 높은 처리량 및 사용의 용이성,이 메서드는 대사 공학 및 Hmo의 합성에 광범위 하 게 응용 프로그램 있어야 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 세포 문화와 유도 조건

참고: 다음 실험에 세는 사용: 대장균 BL21 (DE3)와 빈 벡터, 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드 pAfcA14 와 pET28:green 형광 단백질 (GFP)와 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드와 pAfcB14 그리고 pET28:GFP입니다. 모든 종자는 Luria Bertani 국물 (파운드) 또는 적절 한 항생제로 최소한의 미디어에서 재배 됩니다. 물 이온 (디) 1000 x 대 (50 mg/mL) 및 carbenicillin (100mg/mL)의 재고 솔루션을 준비 합니다.

  1. 미디어 준비
    1. 디 물 1 l 파운드 분말 주식의 25 g을 추가 하 여 파운드 미디어를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독을 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션. 멸 균된 파운드 미디어 온도 60 ° c 파운드 미디어의 모든 1 mL에 대 한 항생제의 1 µ L의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    2. 파운드 플레이트를 준비 하려면 15 g 천 살 균 전에 파운드 미디어를 추가 합니다. 멸 균된 파운드 agar 온도 60 ° c 항생제의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    3. 1.1.3 바이오 센 싱 셀에 대 한 미디어 또는 듀얼 항생제, 대와 carbenicillin 접시를 준비 합니다.
  2. 탄수화물 inducers
    1. 20 g/L의 유 당을 어 금 니 동등 물에서 탄수화물 inducers의 재고 솔루션을 준비: 2'-플로리다와 3 층의 29 g/L
      참고: 셀의 각 200 µ L 2'-층 또는 3 층의 20 µ L 필요 합니다.
    2. 유 당 또는 2.9 g/L 2'-플로리다/3-층 품 연속 떨고와 37 ° C에서의 최종 농도의 2.0 g/L 최종 농도와 셀의 200 µ L를 유도 하 고 밤새 껏 성장 하는 문화.
  3. 세포 배양
    1. 실험 전에 하루 씨 대와 무 균 기술을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 carbenicillin 보충 파운드 매체의 5 mL.
    2. 동요와 함께 37 ° C에서 모든 문화를 품 어 하룻밤 문화를 성장 하 고.
    3. 신선한 파운드/M9 미디어 대와 carbenicillin의 5 mL로 50 µ L의 숙박 문화를 전송 합니다. 문화에는 600에서 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 지속적인 동요를 37 ° C에서 품 어 성장과 0.5-0.7 nm (OD600). 이 중간 로그 단계에서 세포 유도 될 수 있다.

2. 측정 형광의 탐지의 한계

  1. Cytometry 셀의 준비
    1. 1.5 mL 튜브를 1 분 동안 12500 x g 에서 원심 분리기 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 상쾌한 삭제 하 고 다시 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 단일 셀을 전송 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH24, 145 m NaCl 디 물, pH 7.2 m)의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중지 현 탁 액 5 mL 흐름 cytometry 관에.
    3. 교류 cytometer에서 샘플을 실행까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀 유지. 최상의 결과 얻으려면 가능한 한 빨리 셀을 분석 합니다.
    4. GFP 자극 488 nm 레이저를 선택 합니다. 525/50 nm 대역 통과 필터 fluorescein isothiocyanate (FITC) 형광 레벨 (20000-40000 이벤트, 문이 집계 셀과 파편을 피하기 위해 앞으로 옆 분산에 대 한)를 수집 합니다.
  2. 바이오 센서 보정
    1. 보정 곡선을 범위 0-2500 mg에는 표준 2'-플로리다의 8-10 희석을 확인/l.
    2. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 (pAfcA 및 pET28:GFP를 포함 하는) 문화 하 고 이전 섹션에서에서 설명한 대로 1.3 표준 희석으로 유도. 각 희석에 대 한 3 개의 생물 복제를 실시 합니다.

3. 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 스트레인에서

  1. 프로듀서 긴장의 경작
    1. 최소한의 미디어를 만들기 위한 준비 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 1 M의 별도 솔루션-HCl. 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션. 디 물 1 L 국물 분말 M9 미디어 믹스. 압력솥 15 분을 위한 121 ° C에서 M9 솔루션 쿨 50 ° c.까지 솔루션 추가 MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 2 m m, 0.1 m m, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L의 최종 농도 7.5 µ g/L, 각각.
    2. 2'-플로리다 스트레인, 예를 들어, JM109 gwBC-F2, 파운드 미디어의 5 ml에서을 생산 하 고 성장 하룻밤에 37 ° C, 바 움 가트너 외.12에 설명 된 대로 그것의 문화를 시작 합니다.
    3. 하위 1% 단계 1.3.3에서 250 mL 단계 3.1.1에서에서 준비 하는 최소한의 미디어의 앞부분에서 설명한 대로. 최종 농도 10 g/L의 글리세롤을 추가 하 고 37 ° c.에 문화를 품 어
    4. 문화에서 0.5-0.7의 OD600 에 도달 하면 0.5 m m와 유 당 2 g/l.의 최종 농도에 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 추가
    5. 연속 떨고와 37 ° C에서 품 어 고 24 h에 대 한 성장 하는 문화.
  2. 2'-플로리다의 추출
    1. 살 균 50 mL 튜브와 15 분 동안 900 x g 에서 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 3.2.2 상쾌한 삭제 하 고 다시 디 물에 펠 릿을 일시 중단. 잔여 유 당을 제거 하 고 마지막으로 다시 디 물 5 mL에 일시 중지를 세척 단계 세 번을 반복 합니다.
    3. Lyse 세포 현 탁 액, 한 sonicator 30 s 펄스에서 30% 전력에서 사용 합니다. 모든 시간에 얼음에 셀을 계속.
    4. 2000 x g에 25 분 lysed 세포 원심 제거는 상쾌한, 한 살 균을 통해 전달 (예: 0.22 μ m) 필터링 및 분석까지 4 ° C에서 그것을 저장.
  3. 바이오 센서와 정량화
    1. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 및 중간 로그 단계에서 문화를 접종, 2'-플로리다 섹션 2.2에에서 설명 된 대로 보정 곡선을 만드는 데 사용의 예상된 농도에 세포 lysate 동일 유도. 분석할 샘플으로 동일한 환경에서 보정을 수행 (예: 세포 lysate) 2'-플로리다의 희석 컨트롤에 추가 하 여 (즉, 비-프로듀서) 필터링 된 셀 바이오 센서 세포를 유도 하기 전에 lysate.
    2. 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 올리고 당 농도 대 한 형광 출력을 그려서 복용량 응답 곡선을 생성 합니다. 세포 lysate를 기준의 응답을 비교 합니다.

4. 선택적 유 당 제거

참고: 바이오 센 싱 세포는 유 당에 과민 한 그리고 그것은 선택적으로 Hmo 유 당 감지를 바이오 센서에 대 한 바람직한. 한 전략 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 셀의 세척을 포함할 것입니다. 3 개의 다른 전략은 아래 설명 되어 있습니다.

  1. 상업적인 정화 β-galactosidase 치료
    1. 동결 건조 된 β-galactosidase 1000 (FCC lactase) 단위/mL, 1 mm MgCl2 를 분해 하거나 솔루션에서 상업 β-galactosidase를 사용 합니다.
    2. 필요한 효소의 최적 농도 확인 하려면 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 inoculum 성장과 유 당 2 g/L 및 2.9 g/L 2' 유도-중간 로그 단계에서 플로리다.
    3. 100 µ L 문화, β-galactosidase, 최대 12 단위, 양의 추가 하 고 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 성장 문화를 보자.
    4. 섹션 2.1에에서 설명 된 대로 형광을 측정 하 고 최소 효소 농도 결정 하 여 원하는 신호 감쇄를 달성 하는 데 필요한 효소의 최적 단위 계산.
    5. 2'-플로리다 생산 셀 24 h에 대 한 성장, β-galactosidase의 최적의 단위를 추가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 진행.
  2. LacZ + 스트레인와 전처리
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화를 품 어.
    2. 접종 한 대장균 BL21 (DE3), 파운드에서 37 ° C에서 중간 로그 단계로 성장 문화와 24 h 문화를 문화 (2:1) 50 mL를 추가.
    3. 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 3 h. 진행에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  3. 유 강 수 에탄올
    참고:이 섹션은 타 외.12에서 적응.
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
    2. 문화, 100% 에탄올의 두 개의 볼륨, 동요 4 h 37 ° C에서 품 어 추가 합니다.
    3. 원심 900 x g 15 분 수집에서 정지는 상쾌한 고는 유 당을 침전 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
    4. 필터 종이 (11 µ m)를 통해 솔루션을 전달 하 여 침전 된 유 당을 제거 합니다. 세포 lysate 2'-플로리다, 다음 섹션 3.3으로 양이 정해질 수 있는 포함 하는 filtrate를 수집 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

우리는 전체 셀 바이오 센서를 2'-플로리다는 올리고 당의 biotechnological 생산와 함께에서 사용할 수 있는 특정 설계 되었습니다. 이 유 당을 생성 하는 터미널 설탕 수정 특정 효소 분열에 의존 함으로써 선도 유 당 유도할 수 있는 발기인에서 기자 형광 단백질의 표현에 걸리면 lac 오 페론의 활성화는 2'-플로리다의 수량 그것의 결합 특이성, 3-fucosyllactose (3 층), 한 이성질체를 보여 주기 위해 테스트도 했다. 두 부분을 포함 하는 유전자 회로: fucosidase 유전자, afcA 또는 afcB제정 식 결과 제정 발기인에 의해 구동 인코딩된 pelB의 신호 순서 벡터에 복제 하는 fucosidase 유전자의 상류 GFP의 식 운전 T7 발기인을 포함 하는 형광 기자 시스템 뿐만 아니라 periplasmic 수출을 촉진 한다. 첫 번째 부분은 플라스 미드 pAfcA 및 플라스 미드 pET28:GFP에 두 번째 기자 시스템에 표현 된다. 마지막 구조는 대장균 BL21 변모 했다 (DE3), 유 당 반응 pLacUV5 발기인의 통제 게놈으로 통합 T7 RNA 중 합 효소는 널리 스트레인. 그림 1A 는 리더는 바이오 센서의 작동 원리를 따를 수 있다 그래야 회로도 디자인을 보여 줍니다. 그림 1B 교류 cytometer에 분석으로 유도의 다른 조건 하에서 형광 신호를 보여 줍니다. 3 층에 대 한 바이오 센서 또는 벡터 전용 제어에 비해 2'-플로리다 바이오 센서와 형광에 100 증가 통해 우리의 가설과 일관 관찰 되었다 이것은 바이오 센서의 높은 결합 특이성을 보여준다. 신호는 실제로 defucosylation 인 되도록 유도, 오른쪽에 막대에 의해 것과 같이 확인 되는 동안 문화 상업 α-1, 2-fucosidase를 추가 하 여 컨트롤을 실행 했습니다. 다양 한 수준의 탄수화물 (그림 2A)와 복용량 응답 곡선을 생성 하 여 분석 결과의 감도 확인할 수 있습니다. 줄거리에서 2'-플로리다 탐지의 동적 선형 범위 40 사이 이며 400 mg/L 및 검색 제한 4 mg/l. 이 분석 결과 수 있습니다 실행 될 작업 일의 과정을 통해 기자 식 (그림 2B)의 역학의 스냅숏 측정에 의해 표시 된 것 처럼.

마지막으로, 우리는 감지 하 고 계량 2'-플로리다 설계 2'-플로리다 프로듀서 긴장에서 바이오 센 싱 셀을 사용 하는 방법을 제시. 이 긴장 한 기판으로 유 당을 사용, 우리 하기 신호 판독 2'-FL 농도 (그림 3A)에 직접 대응할 exogenous 유 당에서 신호를 위해 전략을 개발 했다. 한 전략 수정된 유 당에 β-galactosidase는 작동 하지 않습니다을 사용 하 여 유 당 효소 저하입니다. 이 유 당, 유 당 신호 (그림 3B) 원본 또는 LacZ + 스트레인, 야생-타입 BL21 가진 외피를 통해 20% 감소에 상업 β-galactosidase 우선적으로 역할을 사용 하 여 달성 될 수 있다 (DE3), 3 시간에는 유 당 상품 배경 수준 (그림 3C) 신호. 마지막 전략 선택적으로 유 당을 침전 물 뿐만 아니라 또한 프로듀서 셀, 필요한 단계 다운스트림 (그림 3D) 되 고 세포 세포 lyses 에탄올을 이용 한다. 이것은 간단한 추출 과정, 하지만 주의으로 2'-2'-층의 일부 결정으로 인해 손실에서 가능 하 게 다른 방법에 비해 낮은 회복 해야 에탄올의 추가도 불구 하 고 우리 않았다 관찰 하지 가능성이 바이오 센 싱 세포의 성장 크게 억제 때문에 최종 에탄올 농도 낮은 (< 2%, v/v) 문화에서. 마지막으로, 우리가 가장 효과적인 하지만 시간이 걸리는 방법 작은 세포내 2'-플로리다 (그림 3E)를 출시 세포 세포의 용 해 이전 셀 세척 하입니다. 유 당 제거 효율성과 시간 및 시 약의 가용성에 따라 적절 한 방법을 선택 하기 위한 재량을 사용 하는 독자 들이 좋습니다.

그림 3E 2'-플로리다 바이오 컨텍스트에서 안정적으로 계량 하는 우리의 능력을 보여 줍니다. 우리 중 하나는 설계 2'-플로리다-생산 스트레인 교양11 또는 2'-플로리다에 세포 lysate의 생산을 모니터링 하는 데 유 당으로 돌연변이 (부정적인 제어)을 부정 하는 fucosyltransferase. 세포 배양, 후 검증 (보충 그림 1)에 대 한 바이오 센서와 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 농도 측정 했습니다. Lysate 프로듀서 및 제어 lysate 2'-플로리다와 아군에 대 한 복용량 응답 곡선을 보여줍니다 양적 측정의 2'-세포 lysate의 맥락에서 매우 유사 하다.

Figure 1
그림 1: 2'-플로리다 바이오 센서 설계 및 대표 데이터의 도식. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-플로리다) 세균성 periplasm 들어가고 heterologously 표현된 fucosidase 유 당으로 변환 됩니다. 유 당 세포질에 수송 하 고 allolactose 변환. 이 대장균 BL21에서 네이티브 LacUV5 발기인 활성화 (DE3), T7 발기인, 형광 단백질 식 선도에서 GFP를 transcribes T7 RNAP를 생산. 2'-플로리다의 (B) 검출 및 3 층 셀 pET28:GFP pAfcA (녹색), (자홍), pAfcB 및 빈 벡터 제어 (파란색)를 포함 하는 설탕, 2'-플로리다, 2'-플로리다 것 추가 α-1, 2-fucosidase, 3-층 또는 유 당, 하룻밤 유도 했다. 모든 데이터는 각 분석 오차 막대는 평균에서 표준 편차를 대표 하는 3 중 3 생물 복제의 평균. 통계적 의미는 Tukey의 다중 비교 테스트에 의해 결정 되었다 고 * * p < 0.01의 지표입니다.  이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 2'-플로리다 감지 바이오 센서의 특성. 바이오 센서의 기능을 검색 및 전송의 한계를 (A). 응답 곡선 pAfcA/2에 대 한 묘사 의미 형광 ' FL (녹색 원) 또는 빈 제어 벡터 (블루 다이아몬드) 다양 한 양의 2'-플로리다 경작. (B) 기자 식의 시간 과정. 스트레인 pAfcA FL (녹색 사각형)-2'와 함께 알을 품는 그리고 형광 유도의 이상의 8 h를 모니터링 했다. 유 당으로 인 큐베이 팅 스트레인 pAfcA 컨트롤로 포함 되어 있습니다. 모든 데이터는 각 분석 오차 막대는 평균에서 표준 편차를 대표 하는 3 중 3 생물 복제의 평균. 이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 긴장에서. (A) 워크플로 잔류 유 당에서 노이즈를 제거 하는 주요 초점 간단한 프로토콜에 바이오 센서의 사용을 보여주는. (B) 유 당 β-galactosidase 효소 소화에 의해의 제거. 문화 0.3 %2'-플로리다 (녹색 사각형) 또는 0.2% 유 당 (파란색 원)를 포함 하는 바이오 센서 문화 유도 시간에 외 인 β-galactosidase의 다양 한 금액을 포함 하는 인큐베이션 하룻밤 후 형광에 대 한 분석 했다 incubated 했다. 야생-타입 LacZ + 긴장으로 부 화 하 여 유 당 (C) 제거. 파운드 0.3 %2'-플로리다 (녹색 원), 0.2% 유 당 (파란색 사각형), 또는 1:1 혼합물 (0.2% 유 당, 유 당 0.1% + 0.15 %2'-플로리다, 마젠타 삼각형 즉,)를 포함 하는 인 큐베이 팅에 대 한 다양 한 시간 BL21와 (DE3) 세포, 및 다음 추가 바이오 센서에 대 한 하룻밤 사이 부 화 후 형광 측정입니다. (D) 에탄올 전처리에 의해 유 당 및 세포 세포의 용 해의 강 수. JM109 gwBC-F2 (마젠타 원) 또는 JM109 gwBC (파란색 삼각형) 세포의 발효 에탄올의 2 양으로 incubated 형광 바이오 센서 셀과 부 화 하기 전에 필터링 그리고 치료 JM109 gwBC F2 문화 (에서 형광과 비교 녹색 광장)입니다. (E) 2'-플로리다에 세포 lysate의 정량화. 바이오 센서는 2'-플로리다 metabolically 조작된 프로듀서 긴장에서 감지 하는 기능에 대 한 평가 했다. 형광 측정 중 원유 JM109 gwBC-F2 (마젠타 원, 2'-플로리다 LC MS에 의해 정량으로), 2'-플로리다 nonproducer 긴장 JM109 gwBC 세포 lysate (녹색 사각형), 정의 된 금액에서 또는 원유 JM109 gwBC 스트레인 (블루의 lysate lysate의 추가 의해 생성 된 다이아몬드)입니다. 결과 HPLC 정량화의 2'-프로듀서 긴장에 의해 검증 되었다. 모든 데이터는 각 3 중, 어디 수직 오차 막대 표준 편차 평균 형광에서 나타내고 가로 오차 막대를 나타냅니다 2'-플로리다에서 HPLC에 의해 측정 표준 편차 분석 3 생물 복제의 평균에 triplicates. 이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 2'-층의 HPLC MS 분석 (A)의 2'-(m/z 511) 이온 chromatograms 추출. 크로마 상업 표준의 상단에 표시 됩니다. 2'-플로리다 JM109gwBC F2 스트레인 (10 희석)에서 크로마는 하단에 표시 됩니다. 511 m/z에서 피크 나트륨 adduct 이다. (B) 300−800, 가장 풍부한 신호 했다 집중에서 질량 스펙트럼 m/z의 확대는 상업 표준 (맨 위)와 2'-플로리다 프로듀서 스트레인 (아래)에서 표시 됩니다. (C) 표준 곡선 상업 2'-층의 다양 한 수준과 LC MS 분석에 의해 만들어진 오차 막대 triplicate 측정에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

우리는 인간 우유 oligosaccharides fucosylated의 연계 관련 검색에 대 한 높은 처리 전략 제시. 이 특정 glycans와 유도 따라 형광 신호 응답 대장균 유전자 공학에 의해 전체 셀 바이오 센서를 구축 하 여 달성 되었다. 프로토콜 또한 감지 metabolically 조작된 세균성 긴장에 Hmo를 계량 하는 바이오 센서를 사용 하는 방법에 자세히 설명 합니다.

우리의 프로토콜 크로마/MS 방법에 비해 그 결합 특이성에 뿐만 아니라 그것의 높은 처리량으로 인해 다른 방법 이상의 장점을 제공 합니다. 감지 및 광범위 한 다이나믹 레인지의 낮은 한계 Hmo의 직접 측정 할 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계 세포 lysate 프로듀서 종자의 준비에서 발생합니다. 2'-플로리다의 최대 titer를 보장 하기 위한 최적의 조건을 제공 하 결정적 이다. 일괄 처리에서 variabilities 쥡니다 매개 변수 또는 유도 시간 발생할 수 있습니다. 바이오 센서의 특성 중 주의 해야 합니다. 그것은 또한 일관 된 결과 보장 하기 위해 실험에 적절 한 컨트롤에 대 한 모든 단계를 실행 하는 것이 좋습니다.

우리의 프로토콜의 한계가 유도 유 당 자연스럽 게 제시, 모유에서 병목 또는 Hmo의 biotechnological 생산에서 기판으로 사용 되는 유 당에 그것의 신뢰입니다. 우리가 언급 이것으로 4 개의 다른으로 신호 대 잡음 비를 제거 하는 바이오 센서 유 당에 Hmo를 선택적으로 검색할 수 있습니다.

많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수는 시간의 문제에 병렬로 분석 수로 여기에 제시 된 유전자 인코딩된 전체 셀 바이오 센서 Hmo의 제조를 위한 최적화를 허용할 것 이다. 96-또는 384-잘 접시에서 수행 하는, 경우 메서드 화면 수천 하루 샘플을 보여 줍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 아이오와 주립 대학 시작 기금에 의해 지원 되었다. F.E.는 NSF Trinect 친교와 맨리 Hoppe 교수에 의해 부분적으로 투자 되었다. T.J.M. 카 렌과 데 니 본 학부 친목에 의해 부분적으로 지원 되었다. 저자 형광와 LC MS 연구 아이오와 주립 대학 Flow Cytometry 시설 및 W.M. 켁 대사체학 연구 실험실 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics