Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Biochemistry

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Summary

우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.

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Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

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Abstract

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)는 복잡 한 탄수화물의 구성 요소 인간의 모유는 유아 건강에 많은 혜택. 그러나, 그들의 바이오 합성의 최적화는 탐지의 상대적으로 낮은 처리량 및 단 당 류와 연계의 정량화에 의해 제한 됩니다. Glycan 분석의 전통적인 기술을 자동화 없이 하루 샘플 수백 순서 처리량 크로마/질량-spectrometric 메서드가 포함 됩니다. 여기, 높은 처리량, 연계 관련 검색 및 fucosylated HMO 구조, 2'-fucosyllactose와 3-fucosyllactose, 우리는 분리를 통해 달성의 정량화에 대 한 유전자 인코딩된 세균성 바이오 센서 설명 fucosidases의 표현입니다. 으로 유 당 우유 또는 바이오 프로세스의 존재는 가양성으로 이어질 수 있는, 우리 또한 다른 전략을 사용 하 여 유 당에서 신호 감소를 보여줍니다. 이 기술은 높은 처리량으로 인해 많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수 HMO 제조의 최적화에 대 한 허용 하는 시간의 문제에 동시에 분석 될 수 있습니다.

Introduction

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo) 유 당 파생 oligosaccharides, 일반적으로 3 ~ 8 설탕 단위체로 구성 된 있습니다. 그들은 끝 (Gal β1, 4-Glc) 유 당 감소 그리고 더 glycosidic 링크에 의해 길쭉한 (β-1, 3-또는 β-1, 6-) 포도 당 (Glc), 갈 락 토스 (Gal), 또는 N-acetylglucosamine (GlcNAc). 또한, fucose (Fuc, α-1, 2-또는 α-1, 3-) 또는 sialic acid (Sia 또는 NeuAc, α-2, 3-또는 α-2, 6-) 잔류물은 종종1추가.

Oligosaccharides과 다른 탄수화물의 현재 분석 크로마/질량 spectrometric (MS) 기술2,3,,45, 에 대 한 필요에 의해 처리량 그리고 범위에 제한 됩니다. 6 , 7, 대략 걸릴 수 있는이 장비8의 가동에 고가의 장비, 특수 열과 derivatizing 에이전트 및 전문성에 대 한 필요성을 언급 하지 않기 위하여 샘플 당 한 시간. 올리고 당 연계는 특히 어려운 결정, 고급 MS9,10 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기법11. 이러한 oligosaccharides의 합성의 빠른 최적화 따라서이 느린 분석 단계의 처리량에 의해 제한 됩니다.

이 연구에서 설명 하는 fucosylated trisaccharide의 연계 관련 검색 유 기반 Hmo, 2'-fucosyllactose (2'-플로리다) 인간의 우유에 있는 가장 풍부한 HMO에 초점을 맞추고, 유전자 암호화를 사용 하 여 대장균 전체 셀 4 mg/l.에서 검출 한도 바이오 센서 이 바이오 센서의 중요 한 기능은 이성질체 trisaccharides 사이 구별 하는 기능입니다. 디자인 원리는 존재에 형광 신호를 생성 하는 오 페론에 의해 검출 된다 Hmo에서 유 당을 해방 하는 대장균 의 특정 fucosidases의 식을 기반으로 합니다. 우리는 링크 전용 fucosidase와 다른 형광 기자 단백질을 품고 하나 2-플라스 미드 시스템을 구축 하 여 이것을 달성. 이 바이오 센서 플랫폼은 높은 처리량 검열 cytometry 또는 마이크로 플레이트 리더에 적합 합니다. 우리는 또한 2'-플로리다 설계 변형12제작한 측정에 바이오 센서의 활용을 보여 줍니다. 이 연구에서 또한 선물이 세 가지 전략, 바이오 센서에서 거짓 긍정적인 신호에서 발생할 수 있는 유 당의 선택적 제거에 조작된 프로듀서 스트레인 성장 유 당에는.

함께 찍은, 유전자 인코딩된 바이오 센서 수 감지 하 고도 어려운 연계 특정 방식으로 Hmo를 계량 컬럼에, MS, 또는 NMR 기법. 높은 처리량 및 사용의 용이성,이 메서드는 대사 공학 및 Hmo의 합성에 광범위 하 게 응용 프로그램 있어야 합니다.

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Protocol

1. 세포 문화와 유도 조건

참고: 다음 실험에 세는 사용: 대장균 BL21 (DE3)와 빈 벡터, 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드 pAfcA14 와 pET28:green 형광 단백질 (GFP)와 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드와 pAfcB14 그리고 pET28:GFP입니다. 모든 종자는 Luria Bertani 국물 (파운드) 또는 적절 한 항생제로 최소한의 미디어에서 재배 됩니다. 물 이온 (디) 1000 x 대 (50 mg/mL) 및 carbenicillin (100mg/mL)의 재고 솔루션을 준비 합니다.

  1. 미디어 준비
    1. 디 물 1 l 파운드 분말 주식의 25 g을 추가 하 여 파운드 미디어를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독을 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션. 멸 균된 파운드 미디어 온도 60 ° c 파운드 미디어의 모든 1 mL에 대 한 항생제의 1 µ L의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    2. 파운드 플레이트를 준비 하려면 15 g 천 살 균 전에 파운드 미디어를 추가 합니다. 멸 균된 파운드 agar 온도 60 ° c 항생제의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    3. 1.1.3 바이오 센 싱 셀에 대 한 미디어 또는 듀얼 항생제, 대와 carbenicillin 접시를 준비 합니다.
  2. 탄수화물 inducers
    1. 20 g/L의 유 당을 어 금 니 동등 물에서 탄수화물 inducers의 재고 솔루션을 준비: 2'-플로리다와 3 층의 29 g/L
      참고: 셀의 각 200 µ L 2'-층 또는 3 층의 20 µ L 필요 합니다.
    2. 유 당 또는 2.9 g/L 2'-플로리다/3-층 품 연속 떨고와 37 ° C에서의 최종 농도의 2.0 g/L 최종 농도와 셀의 200 µ L를 유도 하 고 밤새 껏 성장 하는 문화.
  3. 세포 배양
    1. 실험 전에 하루 씨 대와 무 균 기술을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 carbenicillin 보충 파운드 매체의 5 mL.
    2. 동요와 함께 37 ° C에서 모든 문화를 품 어 하룻밤 문화를 성장 하 고.
    3. 신선한 파운드/M9 미디어 대와 carbenicillin의 5 mL로 50 µ L의 숙박 문화를 전송 합니다. 문화에는 600에서 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 지속적인 동요를 37 ° C에서 품 어 성장과 0.5-0.7 nm (OD600). 이 중간 로그 단계에서 세포 유도 될 수 있다.

2. 측정 형광의 탐지의 한계

  1. Cytometry 셀의 준비
    1. 1.5 mL 튜브를 1 분 동안 12500 x g 에서 원심 분리기 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 상쾌한 삭제 하 고 다시 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 단일 셀을 전송 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH24, 145 m NaCl 디 물, pH 7.2 m)의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중지 현 탁 액 5 mL 흐름 cytometry 관에.
    3. 교류 cytometer에서 샘플을 실행까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀 유지. 최상의 결과 얻으려면 가능한 한 빨리 셀을 분석 합니다.
    4. GFP 자극 488 nm 레이저를 선택 합니다. 525/50 nm 대역 통과 필터 fluorescein isothiocyanate (FITC) 형광 레벨 (20000-40000 이벤트, 문이 집계 셀과 파편을 피하기 위해 앞으로 옆 분산에 대 한)를 수집 합니다.
  2. 바이오 센서 보정
    1. 보정 곡선을 범위 0-2500 mg에는 표준 2'-플로리다의 8-10 희석을 확인/l.
    2. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 (pAfcA 및 pET28:GFP를 포함 하는) 문화 하 고 이전 섹션에서에서 설명한 대로 1.3 표준 희석으로 유도. 각 희석에 대 한 3 개의 생물 복제를 실시 합니다.

3. 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 스트레인에서

  1. 프로듀서 긴장의 경작
    1. 최소한의 미디어를 만들기 위한 준비 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 1 M의 별도 솔루션-HCl. 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션. 디 물 1 L 국물 분말 M9 미디어 믹스. 압력솥 15 분을 위한 121 ° C에서 M9 솔루션 쿨 50 ° c.까지 솔루션 추가 MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 2 m m, 0.1 m m, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L의 최종 농도 7.5 µ g/L, 각각.
    2. 2'-플로리다 스트레인, 예를 들어, JM109 gwBC-F2, 파운드 미디어의 5 ml에서을 생산 하 고 성장 하룻밤에 37 ° C, 바 움 가트너 외.12에 설명 된 대로 그것의 문화를 시작 합니다.
    3. 하위 1% 단계 1.3.3에서 250 mL 단계 3.1.1에서에서 준비 하는 최소한의 미디어의 앞부분에서 설명한 대로. 최종 농도 10 g/L의 글리세롤을 추가 하 고 37 ° c.에 문화를 품 어
    4. 문화에서 0.5-0.7의 OD600 에 도달 하면 0.5 m m와 유 당 2 g/l.의 최종 농도에 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 추가
    5. 연속 떨고와 37 ° C에서 품 어 고 24 h에 대 한 성장 하는 문화.
  2. 2'-플로리다의 추출
    1. 살 균 50 mL 튜브와 15 분 동안 900 x g 에서 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 3.2.2 상쾌한 삭제 하 고 다시 디 물에 펠 릿을 일시 중단. 잔여 유 당을 제거 하 고 마지막으로 다시 디 물 5 mL에 일시 중지를 세척 단계 세 번을 반복 합니다.
    3. Lyse 세포 현 탁 액, 한 sonicator 30 s 펄스에서 30% 전력에서 사용 합니다. 모든 시간에 얼음에 셀을 계속.
    4. 2000 x g에 25 분 lysed 세포 원심 제거는 상쾌한, 한 살 균을 통해 전달 (예: 0.22 μ m) 필터링 및 분석까지 4 ° C에서 그것을 저장.
  3. 바이오 센서와 정량화
    1. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 및 중간 로그 단계에서 문화를 접종, 2'-플로리다 섹션 2.2에에서 설명 된 대로 보정 곡선을 만드는 데 사용의 예상된 농도에 세포 lysate 동일 유도. 분석할 샘플으로 동일한 환경에서 보정을 수행 (예: 세포 lysate) 2'-플로리다의 희석 컨트롤에 추가 하 여 (즉, 비-프로듀서) 필터링 된 셀 바이오 센서 세포를 유도 하기 전에 lysate.
    2. 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 올리고 당 농도 대 한 형광 출력을 그려서 복용량 응답 곡선을 생성 합니다. 세포 lysate를 기준의 응답을 비교 합니다.

4. 선택적 유 당 제거

참고: 바이오 센 싱 세포는 유 당에 과민 한 그리고 그것은 선택적으로 Hmo 유 당 감지를 바이오 센서에 대 한 바람직한. 한 전략 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 셀의 세척을 포함할 것입니다. 3 개의 다른 전략은 아래 설명 되어 있습니다.

  1. 상업적인 정화 β-galactosidase 치료
    1. 동결 건조 된 β-galactosidase 1000 (FCC lactase) 단위/mL, 1 mm MgCl2 를 분해 하거나 솔루션에서 상업 β-galactosidase를 사용 합니다.
    2. 필요한 효소의 최적 농도 확인 하려면 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 inoculum 성장과 유 당 2 g/L 및 2.9 g/L 2' 유도-중간 로그 단계에서 플로리다.
    3. 100 µ L 문화, β-galactosidase, 최대 12 단위, 양의 추가 하 고 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 성장 문화를 보자.
    4. 섹션 2.1에에서 설명 된 대로 형광을 측정 하 고 최소 효소 농도 결정 하 여 원하는 신호 감쇄를 달성 하는 데 필요한 효소의 최적 단위 계산.
    5. 2'-플로리다 생산 셀 24 h에 대 한 성장, β-galactosidase의 최적의 단위를 추가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 진행.
  2. LacZ + 스트레인와 전처리
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화를 품 어.
    2. 접종 한 대장균 BL21 (DE3), 파운드에서 37 ° C에서 중간 로그 단계로 성장 문화와 24 h 문화를 문화 (2:1) 50 mL를 추가.
    3. 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 3 h. 진행에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  3. 유 강 수 에탄올
    참고:이 섹션은 타 외.12에서 적응.
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
    2. 문화, 100% 에탄올의 두 개의 볼륨, 동요 4 h 37 ° C에서 품 어 추가 합니다.
    3. 원심 900 x g 15 분 수집에서 정지는 상쾌한 고는 유 당을 침전 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
    4. 필터 종이 (11 µ m)를 통해 솔루션을 전달 하 여 침전 된 유 당을 제거 합니다. 세포 lysate 2'-플로리다, 다음 섹션 3.3으로 양이 정해질 수 있는 포함 하는 filtrate를 수집 합니다.

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Representative Results

우리는 전체 셀 바이오 센서를 2'-플로리다는 올리고 당의 biotechnological 생산와 함께에서 사용할 수 있는 특정 설계 되었습니다. 이 유 당을 생성 하는 터미널 설탕 수정 특정 효소 분열에 의존 함으로써 선도 유 당 유도할 수 있는 발기인에서 기자 형광 단백질의 표현에 걸리면 lac 오 페론의 활성화는 2'-플로리다의 수량 그것의 결합 특이성, 3-fucosyllactose (3 층), 한 이성질체를 보여 주기 위해 테스트도 했다. 두 부분을 포함 하는 유전자 회로: fucosidase 유전자, afcA 또는 afcB제정 식 결과 제정 발기인에 의해 구동 인코딩된 pelB의 신호 순서 벡터에 복제 하는 fucosidase 유전자의 상류 GFP의 식 운전 T7 발기인을 포함 하는 형광 기자 시스템 뿐만 아니라 periplasmic 수출을 촉진 한다. 첫 번째 부분은 플라스 미드 pAfcA 및 플라스 미드 pET28:GFP에 두 번째 기자 시스템에 표현 된다. 마지막 구조는 대장균 BL21 변모 했다 (DE3), 유 당 반응 pLacUV5 발기인의 통제 게놈으로 통합 T7 RNA 중 합 효소는 널리 스트레인. 그림 1A 는 리더는 바이오 센서의 작동 원리를 따를 수 있다 그래야 회로도 디자인을 보여 줍니다. 그림 1B 교류 cytometer에 분석으로 유도의 다른 조건 하에서 형광 신호를 보여 줍니다. 3 층에 대 한 바이오 센서 또는 벡터 전용 제어에 비해 2'-플로리다 바이오 센서와 형광에 100 증가 통해 우리의 가설과 일관 관찰 되었다 이것은 바이오 센서의 높은 결합 특이성을 보여준다. 신호는 실제로 defucosylation 인 되도록 유도, 오른쪽에 막대에 의해 것과 같이 확인 되는 동안 문화 상업 α-1, 2-fucosidase를 추가 하 여 컨트롤을 실행 했습니다. 다양 한 수준의 탄수화물 (그림 2A)와 복용량 응답 곡선을 생성 하 여 분석 결과의 감도 확인할 수 있습니다. 줄거리에서 2'-플로리다 탐지의 동적 선형 범위 40 사이 이며 400 mg/L 및 검색 제한 4 mg/l. 이 분석 결과 수 있습니다 실행 될 작업 일의 과정을 통해 기자 식 (그림 2B)의 역학의 스냅숏 측정에 의해 표시 된 것 처럼.

마지막으로, 우리는 감지 하 고 계량 2'-플로리다 설계 2'-플로리다 프로듀서 긴장에서 바이오 센 싱 셀을 사용 하는 방법을 제시. 이 긴장 한 기판으로 유 당을 사용, 우리 하기 신호 판독 2'-FL 농도 (그림 3A)에 직접 대응할 exogenous 유 당에서 신호를 위해 전략을 개발 했다. 한 전략 수정된 유 당에 β-galactosidase는 작동 하지 않습니다을 사용 하 여 유 당 효소 저하입니다. 이 유 당, 유 당 신호 (그림 3B) 원본 또는 LacZ + 스트레인, 야생-타입 BL21 가진 외피를 통해 20% 감소에 상업 β-galactosidase 우선적으로 역할을 사용 하 여 달성 될 수 있다 (DE3), 3 시간에는 유 당 상품 배경 수준 (그림 3C) 신호. 마지막 전략 선택적으로 유 당을 침전 물 뿐만 아니라 또한 프로듀서 셀, 필요한 단계 다운스트림 (그림 3D) 되 고 세포 세포 lyses 에탄올을 이용 한다. 이것은 간단한 추출 과정, 하지만 주의으로 2'-2'-층의 일부 결정으로 인해 손실에서 가능 하 게 다른 방법에 비해 낮은 회복 해야 에탄올의 추가도 불구 하 고 우리 않았다 관찰 하지 가능성이 바이오 센 싱 세포의 성장 크게 억제 때문에 최종 에탄올 농도 낮은 (< 2%, v/v) 문화에서. 마지막으로, 우리가 가장 효과적인 하지만 시간이 걸리는 방법 작은 세포내 2'-플로리다 (그림 3E)를 출시 세포 세포의 용 해 이전 셀 세척 하입니다. 유 당 제거 효율성과 시간 및 시 약의 가용성에 따라 적절 한 방법을 선택 하기 위한 재량을 사용 하는 독자 들이 좋습니다.

그림 3E 2'-플로리다 바이오 컨텍스트에서 안정적으로 계량 하는 우리의 능력을 보여 줍니다. 우리 중 하나는 설계 2'-플로리다-생산 스트레인 교양11 또는 2'-플로리다에 세포 lysate의 생산을 모니터링 하는 데 유 당으로 돌연변이 (부정적인 제어)을 부정 하는 fucosyltransferase. 세포 배양, 후 검증 (보충 그림 1)에 대 한 바이오 센서와 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 농도 측정 했습니다. Lysate 프로듀서 및 제어 lysate 2'-플로리다와 아군에 대 한 복용량 응답 곡선을 보여줍니다 양적 측정의 2'-세포 lysate의 맥락에서 매우 유사 하다.

Figure 1
그림 1: 2'-플로리다 바이오 센서 설계 및 대표 데이터의 도식. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-플로리다) 세균성 periplasm 들어가고 heterologously 표현된 fucosidase 유 당으로 변환 됩니다. 유 당 세포질에 수송 하 고 allolactose 변환. 이 대장균 BL21에서 네이티브 LacUV5 발기인 활성화 (DE3), T7 발기인, 형광 단백질 식 선도에서 GFP를 transcribes T7 RNAP를 생산. 2'-플로리다의 (B) 검출 및 3 층 셀 pET28:GFP pAfcA (녹색), (자홍), pAfcB 및 빈 벡터 제어 (파란색)를 포함 하는 설탕, 2'-플로리다, 2'-플로리다 것 추가 α-1, 2-fucosidase, 3-층 또는 유 당, 하룻밤 유도 했다. 모든 데이터는 각 분석 오차 막대는 평균에서 표준 편차를 대표 하는 3 중 3 생물 복제의 평균. 통계적 의미는 Tukey의 다중 비교 테스트에 의해 결정 되었다 고 * * p < 0.01의 지표입니다.  이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 2'-플로리다 감지 바이오 센서의 특성. 바이오 센서의 기능을 검색 및 전송의 한계를 (A). 응답 곡선 pAfcA/2에 대 한 묘사 의미 형광 ' FL (녹색 원) 또는 빈 제어 벡터 (블루 다이아몬드) 다양 한 양의 2'-플로리다 경작. (B) 기자 식의 시간 과정. 스트레인 pAfcA FL (녹색 사각형)-2'와 함께 알을 품는 그리고 형광 유도의 이상의 8 h를 모니터링 했다. 유 당으로 인 큐베이 팅 스트레인 pAfcA 컨트롤로 포함 되어 있습니다. 모든 데이터는 각 분석 오차 막대는 평균에서 표준 편차를 대표 하는 3 중 3 생물 복제의 평균. 이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 긴장에서. (A) 워크플로 잔류 유 당에서 노이즈를 제거 하는 주요 초점 간단한 프로토콜에 바이오 센서의 사용을 보여주는. (B) 유 당 β-galactosidase 효소 소화에 의해의 제거. 문화 0.3 %2'-플로리다 (녹색 사각형) 또는 0.2% 유 당 (파란색 원)를 포함 하는 바이오 센서 문화 유도 시간에 외 인 β-galactosidase의 다양 한 금액을 포함 하는 인큐베이션 하룻밤 후 형광에 대 한 분석 했다 incubated 했다. 야생-타입 LacZ + 긴장으로 부 화 하 여 유 당 (C) 제거. 파운드 0.3 %2'-플로리다 (녹색 원), 0.2% 유 당 (파란색 사각형), 또는 1:1 혼합물 (0.2% 유 당, 유 당 0.1% + 0.15 %2'-플로리다, 마젠타 삼각형 즉,)를 포함 하는 인 큐베이 팅에 대 한 다양 한 시간 BL21와 (DE3) 세포, 및 다음 추가 바이오 센서에 대 한 하룻밤 사이 부 화 후 형광 측정입니다. (D) 에탄올 전처리에 의해 유 당 및 세포 세포의 용 해의 강 수. JM109 gwBC-F2 (마젠타 원) 또는 JM109 gwBC (파란색 삼각형) 세포의 발효 에탄올의 2 양으로 incubated 형광 바이오 센서 셀과 부 화 하기 전에 필터링 그리고 치료 JM109 gwBC F2 문화 (에서 형광과 비교 녹색 광장)입니다. (E) 2'-플로리다에 세포 lysate의 정량화. 바이오 센서는 2'-플로리다 metabolically 조작된 프로듀서 긴장에서 감지 하는 기능에 대 한 평가 했다. 형광 측정 중 원유 JM109 gwBC-F2 (마젠타 원, 2'-플로리다 LC MS에 의해 정량으로), 2'-플로리다 nonproducer 긴장 JM109 gwBC 세포 lysate (녹색 사각형), 정의 된 금액에서 또는 원유 JM109 gwBC 스트레인 (블루의 lysate lysate의 추가 의해 생성 된 다이아몬드)입니다. 결과 HPLC 정량화의 2'-프로듀서 긴장에 의해 검증 되었다. 모든 데이터는 각 3 중, 어디 수직 오차 막대 표준 편차 평균 형광에서 나타내고 가로 오차 막대를 나타냅니다 2'-플로리다에서 HPLC에 의해 측정 표준 편차 분석 3 생물 복제의 평균에 triplicates. 이 그림 처음 Enam 및 Mansell14 에 등장 하 고 허가 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 2'-층의 HPLC MS 분석 (A)의 2'-(m/z 511) 이온 chromatograms 추출. 크로마 상업 표준의 상단에 표시 됩니다. 2'-플로리다 JM109gwBC F2 스트레인 (10 희석)에서 크로마는 하단에 표시 됩니다. 511 m/z에서 피크 나트륨 adduct 이다. (B) 300−800, 가장 풍부한 신호 했다 집중에서 질량 스펙트럼 m/z의 확대는 상업 표준 (맨 위)와 2'-플로리다 프로듀서 스트레인 (아래)에서 표시 됩니다. (C) 표준 곡선 상업 2'-층의 다양 한 수준과 LC MS 분석에 의해 만들어진 오차 막대 triplicate 측정에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

우리는 인간 우유 oligosaccharides fucosylated의 연계 관련 검색에 대 한 높은 처리 전략 제시. 이 특정 glycans와 유도 따라 형광 신호 응답 대장균 유전자 공학에 의해 전체 셀 바이오 센서를 구축 하 여 달성 되었다. 프로토콜 또한 감지 metabolically 조작된 세균성 긴장에 Hmo를 계량 하는 바이오 센서를 사용 하는 방법에 자세히 설명 합니다.

우리의 프로토콜 크로마/MS 방법에 비해 그 결합 특이성에 뿐만 아니라 그것의 높은 처리량으로 인해 다른 방법 이상의 장점을 제공 합니다. 감지 및 광범위 한 다이나믹 레인지의 낮은 한계 Hmo의 직접 측정 할 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계 세포 lysate 프로듀서 종자의 준비에서 발생합니다. 2'-플로리다의 최대 titer를 보장 하기 위한 최적의 조건을 제공 하 결정적 이다. 일괄 처리에서 variabilities 쥡니다 매개 변수 또는 유도 시간 발생할 수 있습니다. 바이오 센서의 특성 중 주의 해야 합니다. 그것은 또한 일관 된 결과 보장 하기 위해 실험에 적절 한 컨트롤에 대 한 모든 단계를 실행 하는 것이 좋습니다.

우리의 프로토콜의 한계가 유도 유 당 자연스럽 게 제시, 모유에서 병목 또는 Hmo의 biotechnological 생산에서 기판으로 사용 되는 유 당에 그것의 신뢰입니다. 우리가 언급 이것으로 4 개의 다른으로 신호 대 잡음 비를 제거 하는 바이오 센서 유 당에 Hmo를 선택적으로 검색할 수 있습니다.

많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수는 시간의 문제에 병렬로 분석 수로 여기에 제시 된 유전자 인코딩된 전체 셀 바이오 센서 Hmo의 제조를 위한 최적화를 허용할 것 이다. 96-또는 384-잘 접시에서 수행 하는, 경우 메서드 화면 수천 하루 샘플을 보여 줍니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 아이오와 주립 대학 시작 기금에 의해 지원 되었다. F.E.는 NSF Trinect 친교와 맨리 Hoppe 교수에 의해 부분적으로 투자 되었다. T.J.M. 카 렌과 데 니 본 학부 친목에 의해 부분적으로 지원 되었다. 저자 형광와 LC MS 연구 아이오와 주립 대학 Flow Cytometry 시설 및 W.M. 켁 대사체학 연구 실험실 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

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