التعبير عابر في البنجر الأحمر لقاح مرشح الصيدلانية البيولوجية لمرض السكري نوع 1

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج مرشح لقاح الفموي ضد داء السكري نوع 1 في مصنع للأكل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الزراعة الجزيئية النباتية هو استخدام النباتات إنتاج جزيئات ذات الاهتمام. من هذا المنظور، النباتات قد تستعمل كالمفاعلات الحيوية لإنتاج وتنقية اللاحقة للمنتج النهائي والتسليم الشفوي المباشر من البروتينات مغايرة عند استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل. في هذا العمل، نقدم تطوير اللقاح الفموي ضد داء السكري من النوع 1 (T1D) المرشح في النظم النباتية الصالحة للأكل باستخدام تكنولوجيا المستندة إلى فيروس الحمض النووي المؤتلف مصنع فككت تسليمها مع تسلل الفراغ. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن بنجر أحمر مضيف مناسب للتعبير عابرة من أوتوانتيجين المشتقة البشرية المرتبطة T1D، يعتبر مرشح واعدة كلقاح T1D. اتسمت الأوراق المنتجة أوتوانتيجين دقة لمقاومتهم لهضم المعدة ووجود تهمة البكتيرية المتبقية لصورتهم الأيضية الثانوية، إعطاء لمحة عامة عن عملية الإنتاج للاستخدام المحتمل محطات للتسليم الشفوي المباشر بروتين مغايرة. وأظهر تحليل لدينا تدهور شبه كامل من اللقاح الفموي المرشح المعصوفه بعد هضم المعدة محاكاة، مما يوحي بأن استراتيجية تغليف في تصنيع اللقاح جاد المشتقة من النباتات مطلوب.

Introduction

ومنذ ثورة البيولوجيا الجزيئية النباتية في الثمانينات، يمكن اعتبار الأنظمة المستندة إلى مصنع لإنتاج صيدلية كبديل للنظم التقليدية القائمة على الخلايا الجرثومية والثدييات1. عرض النباتات العديد من المزايا عبر الأنظمة الأساسية التقليدية، مع قابلية التطوير والفعالية من حيث التكلفة والسلامة هي الأكثر صلة بالموضوع2. يمكن تنقيته من الأنسجة النباتية تحول المنتج المؤتلف وثم إدارته، أما الحقن أو شفويا، وعلاوة على ذلك، تحولت النباتية الصالحة للأكل يمكن أن تستخدم مباشرة للتسليم عن طريق الفم. الطريق الفموي في الوقت نفسه يعزز حصانة المخاطية والجهازية، وأنه يلغي الحاجة للابر والموظفين الطبية المتخصصة. وعلاوة على ذلك، يلغي التسليم الشفوي التجهيز النهائي المعقدة، التي عادة ما تمثل 80 في المائة تكلفة التصنيع الكلي من البروتين المؤتلف3. يمكن ترجمة جميع هذه المزايا إلى تحقيق وفورات في الإنتاج والإمدادات والعمل على الحد من التكاليف لكل جرعة، جعل الدواء بأسعار معقولة لمعظم سكان العالم.

ووضعت العديد من الاستراتيجيات، سواء بالنسبة للتحول مستقرة والتعبير عابرة، لإنتاج البروتينات المؤتلف في النباتات. فيما بينها، نظام تعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت الغلة (مثلاً، ماجنيكون) يوفر أداء متفوق يؤدي عالية الغلة من البروتينات المؤتلف على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا4. وترد أمثلة كثيرة لتعبير عابر باستخدام نظام التعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية في النباتات بينثاميانا نيكوتيانا ، يجري المضيف الإنتاج معيار الذهب. ومع ذلك، لا يعتبر هذا المصنع النموذجي أنواع الصالحة للأكل نتيجة القلويات وغيرها من الأيض السامة التي تتراكم في أوراقها.

في هذا العمل، ويصف لنا المقارنة بين نظامين النباتية الصالحة للأكل، البنجر الأحمر (الشائع بيتا السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (سبيناسيا حمقاء السيرة الذاتية اندستريا)، للتعبير عن شكلين مرشح من isoform كاتشين 65 من حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاسي (GAD65)، التي تقوم بها المصنع القائم على الفيروس متجهات5. GAD65 أوتوانتيجين رئيسية المرتبطة بداء السكري من النوع 1 (T1D)، وحاليا قيد التحقيق في التجارب السريرية البشرية منع أو تأخير T1D بحمل التسامح6. ودرست إنتاج GAD65 في النباتات على نطاق واسع في الأنواع النباتية النموذجية نيكوتيانا تاباكوم و بينثاميانا أ4،5،،من67. وهنا يصف لنا استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل لإنتاج جزيء في الأنسجة التي يمكن أن تعني لتسليم مباشر عن طريق الفم. من وجهة نظر تقنية، بدراسة وتحديد نظام أجروينفيلتريشن النباتية ومنهاج GAD65 إنتاج زيوت الطعام النباتية من خلال تقييم معلمات مختلفة: تعبير البروتين المؤتلف المستويات، تهمة الميكروبية المتبقية في المصنع الأنسجة يعني للتسليم الشفوي، ومقاومة GAD65 لهضم المعدة، والتكافؤ للنباتات تحول مع نوع البرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-أحمر زراعة البنجر والسبانخ

  1. زراعة البنجر الأحمر (الشائع باء-السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (S. حمقاء السيرة الذاتية اندستريا) النباتات في غرفة لنمو، باستخدام µE 150 من شدة الضوء، 65% رطوبة نسبية، ح 12 دورة الضوء/الظلام في 23/21 درجة مئوية، على التوالي.
  2. بعد إنبات البذور، تسميد النباتات مرتين في أسبوع مع حل 1 غرام/لتر من الأسمدة المتاحة تجارياً (جدول المواد). أجروينفيلتراتيون استخدام السبانخ عمره خمسة في الأسبوع ونباتات البنجر الأحمر عمرها ست الأسبوع.

2-عابر التعبير من خلال التكنولوجيا المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت

  1. بناء ناقلات التعبير النبات
    1. إدخال الناقلات-3 'الوحدات النمطية (pICH31070.GAD65mut و pICH31070.∆87G65mut و pICH7410.eGFP)، أعدت كما هو موضح سابقا1،2،7، 5' الوحدة النمطية (pICH20111) ووحدة إينتيجراسي (pICH14011)- سلالة GV3101 tumefaciens المتبعة في استخدام التقنيات القياسية. تنمو على رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل والريفامبيسين ومناسبة من المضادات الحيوية الخاصة بمكافحة ناقلات (50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين، pICH20111، pICH14011 و pICH7410.eGFP)، 50 ميكروغرام/مل كاناميسين ل pICH31070 لمدة يومين في 28 درجة مئوية.
    2. شاشة المستعمرات بمستعمرة PCR استخدام الإشعال المحددة التالية لكل ناقل: 5 '-أتكتاجكتاججتاككتكج-3' و 5 '-أكاككجتاجتكتاتكتكتك-3' 3 ' وحدات pICH31070.GAD65mut و pICH31070.∆87G65mut، مع درجة حرارة انلينغ 55 درجة مئوية و وقت استطالة من 110 ق، 5 '-تجاجتكاتكتجكاككاك-3' و 5 '-أكاككجتاجتكتاتكتكتك-3' للثالثة 3 'pICH7410.eGFP الوحدة النمطية، مع درجة حرارة انلينغ 53 درجة مئوية ووقت استطالة من 30 s، 5'-آتجتكجاتاجتكتكجتاكج-3 'و 5'-تككاككتتاكجاجتكتج-3 ' 5 'الوحدة النمطية، مع درجة حرارة انلينغ 53 درجة مئوية ووقت استطالة من 20 s و 5'-جكاككجتاتجكجاتكك-3 'و 5'-جاتجكجتككجكاكجاكت-3 ' لوحدة إينتيجراسي مع درجة حرارة انلينغ 57 درجة مئوية ووقت استطالة من 45 ثانية.
    3. القيام برد فعل PCR في إجمالي حجم 20 ميكروليتر باستخدام دورة رده فعل معينة التالية: تمسخ 5 دقائق الأولى عند 95 درجة مئوية، دورات 35 من 30 s عند 95 درجة مئوية، 30 ثانية في درجة حرارة انلينغ والخطوة استطالة عند 72 درجة مئوية (الصلب درجة الحرارة واستطالة وقت إعادة محددة لكل زوجين التمهيدي) وخطوة استطالة نهائية من 7 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  2. أجروينفيلتراتيون حقنه
    1. تطعيم ترانسفورمانتس A. tumefaciens الثلاثة في 50 مل رطل متوسطة الحجم تحتوي على 50 الريفامبيسين ميكروغرام/مل والمضادات الحيوية الخاصة بناقلات المناسبة التالية: 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين A. tumefaciens تحول مع pICH20111، pICH14011 أو pICH7410.eGFP، أو 50 ميكروغرام/مل كاناميسين A. tumefaciens تحول مع pICH31070. ينمو بالمصافحة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية.
    2. بيليه الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها بالطرد المركزي في س 4,500 ز لمدة 20 دقيقة وريسوسبيند لهم في 100 مل (أو مجلدين من ثقافة البكتيرية الأولية) من تسلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 10 مم (مس؛ الرقم الهيدروجيني 5.5) و 10 مم MgSO4، دون النظر OD600- احتضان المعلقات في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 3.
    3. مزيج من كميات متساوية من المعلقات البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات الثلاث، GAD65mut، ∆87GAD65mut أو اجفب 3 'وحدة، مع 5' وحدة ووحدة إينتيجراسي. استخدام هذا المزيج تعليق لتسلل حقنه من يترك أحمر البنجر والسبانخ.
    4. ضع 5 مل التعليق في حقنه دون الإبرة. اضغط غيض المحاقن ضد الجانب السفلي النبات السبانخ والنباتات البنجر الأحمر، وفي الوقت نفسه تطبيق كونتيربريسوري لطيف على الجانب الآخر من الورقة.
    5. التسلل يترك الموسع تماما الثلاثة الأولى ابتداء من القمة لكل مصنع. قم بتسمية أوراق أجروينفيلتراتيد مع علامة ورقة على ساق نبات. إرجاع المعامل في دائرة نمو تحت الظروف القياسية.
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة، ارتداء العين حماية وقفازات أثناء عملية تسلل.
    6. أجروينفيلتراتيد جمع يترك من 4 14 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) وتجميدها في نيتروجين سائل. مخزن مصنع النسيج في-80 درجة مئوية.
  3. أجروينفيلتريشن فراغ
    1. تنمو بشكل منفصل ترانسفورمانتس A. tumefaciens الثلاثة في 50 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل والريفامبيسين والمناسبة الخاصة بمكافحة ناقلات المضادات الحيوية عن طريق المصافحة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية.
    2. ريسوسبيند بيليه في 1 لتر من المخزن المؤقت للتسلل إلى OD600 من 0.35 بيليه الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها بالطرد المركزي في س 4,500 ز عن 20 دقيقة واحتضان المعلقات في RT ح 3.
    3. إضافة 0.01% v/v للمنظفات (بوليسوربيت 20) لكل تعليق. مزيج من كميات متساوية من المعلقات البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات الثلاث، GAD65mut، ∆87GAD65mut أو اجفب 3 'وحدة، مع 5' وحدة ووحدة إينتيجراسي.
    4. إدراج مصنع واحد (عمره ست الأسبوع البنجر الأحمر النباتية، انظر القسم 1) في الحامل. عكس صاحب ثم ضعه أعلى كوب يحتوي على حمام تسلل (L 2) إلى غمر الأوراق في وقف عمليات التسلل.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع الأوراق هي انخفضت تماما في تعليق البكتيرية. رفع مستوى بالإضافة إلى وقف تسلل إضافية إذا لزم الأمر.
    5. نقل حمام التسلل مع النباتات المغمورة إلى غرفة عمليات التسلل وإغلاقه. قم بتشغيل المضخة الفراغ وفتح صمام السحب فراغ في قاعة عمليات التسلل.
    6. بمجرد الضغط في الدائرة تسلل انخفض إلى 90 [مبر]، إبقاء الفراغ للحد الأدنى 3 الإفراج عن الفراغ ل 45 ثانية. مرة واحدة قد عاد الدائرة تسلل إلى الضغط الجوي، فتح الدائرة وإزالة النبات تسلل من الحمام البكتيرية.
    7. إرجاع المعامل في دائرة نمو تحت الظروف القياسية.
    8. جمع أوراق أجروينفيلتراتيد في نقطة في البوصة التعبير الأقصى، اعتماداً على البروتين المؤتلف، وتجميدها في نيتروجين سائل. مخزن مصنع النسيج في-80 درجة مئوية.

3. تحليل التعبير البروتين المؤتلف

  1. استخراج البروتين للذوبان الكلي (ملعقة صغيرة)
    1. طحن المحاقن أو فراغ تسلل الأحمر أوراق البنجر والسبانخ، التي جمعت في الخطوات 2.2.6 و 2.3.8، إلى مسحوق ناعم في النتروجين السائل باستخدام مدافع الهاون والمدقة. نقل المسحوق في أنابيب بلاستيكية 15 مل وتخزين المواد في-80 درجة مئوية.
    2. إضافة 900 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت (pH فوسفات الصوديوم 50 ملم 8.0، ميتابيسولفيتي الصوديوم 20 مم) إلى 300 ملغ مسحوق أوراق.
      ملاحظة: النسبة المحددة بين الوزن الأنسجة النباتية (ملغ) إلى حجم المخزن المؤقت (ميليلتر) هو 1:3.
    3. مجانسة الخليط من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 30,000 س ز لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. جمع المادة طافية في أنبوب نظيف وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. نبات اجفب التصور والتقدير الكمي
    1. تحميل 100 ميليلتر لاستخراج ملعقة صغيرة كل التي تم الحصول عليها من اجفب الإعراب عن يترك، في replicates التقنية الثلاث، على لوحة 96-جيدا.
    2. وضع لوحة 96-جيدا في قارئ الأسفار وبدء القياس. استخدام عامل تصفية 485/535 نانومتر مجموعة مطلوبة من أجل الكشف عن الأسفار اجفب.
    3. للتحديد الكمي المطلق، في لوحة نفس إعداد منحنى معايرة تحميل كميات مختلفة (62.5، 125، 500، 750 و 1000 نانوغرام) من اجفب المنقي.
  3. بيسينتشونينيك مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) لتحديد مقدار ملعقة صغيرة
    1. مزيج من أجزاء 50 من الكاشف A (جدول المواد) مع الجزء 1 من "كاشف ب" (جدول المواد). إعداد حجم كاف لاتفاق التعاون الأساسي الطازجة العامل الحل للعينات لتكون جزيئي ومعايير المعايرة.
      ملاحظة: حجم الحل العامل اتفاق التعاون الأساسي المطلوب لكل عينة من 1.9 مل. للإجراءات المعتادة مع المعايير 9 (بما في ذلك فارغة)، مطلوب 17.1 مل من محلول العامل اتفاق التعاون الأساسي.
    2. "الماصة؛" 0.1 مل من كل مستوى (بما في ذلك فارغة)، ومقتطفات ملعقة صغيرة في أنبوب المسمى.
      ملاحظة: إعداد مجموعة جديدة من ألبومين المصل البقري حسب معايير المعايرة، والمعايير (BSA) في نطاق ميكروغرام/مل 10-1,000، يفضل استخدام نفس مادة كعينات، مثل المياه. يتكون الفارغة من 0.1 مل مخفف المستخدمة للمعايرة القياسية، وإعداد نموذج.
    3. إضافة 1.9 مل من محلول العامل اتفاق التعاون الأساسي ومزيج دقيق. تغطي هذه الأنابيب واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. تبريد الأنابيب لتدبير الرايت امتصاص في 562 شمال البحر الأبيض المتوسط لجميع العينات غضون 10 دقيقة.
      ملاحظة: حتى في الرايت، يستمر وضع اللون. سيتم إدخال أي خطأ كبيرا إذا فعلت قياسات امتصاص جميع الأنابيب خلال 10 دقائق.
    5. طرح 562 نانومتر امتصاص قيمة الفارغة من القراءات المعايير والمقتطفات ملعقة صغيرة.
    6. شمال البحر الأبيض المتوسط مؤامرة 562 فارغة لتصحيح القراءة لكل معيار على تركيزه. تحديد تركيز البروتين لاستخراج كل ملعقة صغيرة.
  4. أداء جل أخذ تلطيخ كما هو موضح سابقا في جيكتشيلي et al.8.
  5. تحليل لطخة غربية
    1. أداء تحليل لطخة غربية كما سبق ذكره في جيكتشيلي et al.8.
    2. بعد فصل البروتينات الغرواني الكهربي، نقلها على غشاء النيتروسليلوز استخدام التقنيات القياسية. تحضير حل حظر بخلط اللبن 4% في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) الأس الهيدروجيني 7.4. كتلة الغشاء مع 10 مل من عرقلة الحل في RT ح 1.
    3. إعداد جسم الأرنب الأولية إزاء المضيفين لمكافحة--GAD65/67 ومكافحة LHCB2، و 1:20,000 لمكافحة--اجفب في 5 مل من محلول حظر مع المنظفات 0.1%. احتضان الغشاء مع حلول استعداد جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 4 ح في الرايت مع التحريض المستمر.
    4. تجاهل جسم الأولية ويغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مع حظر الحل التي تحتوي على المنظفات 0.1%.
    5. إعداد الفجل البيروكسيديز (HRP)-جسم الأرنب المضادة المتقارنة في المضيفين في عرقلة الحل مع المنظفات 0.1%. احتضان الغشاء عن 1.5 ح في الرايت مع التحريض المستمر.
    6. تجاهل جسم الثانوية ويغسل الغشاء 5 مرات لمدة كل 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني-T (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع المنظفات 0.1%).
    7. احتضان الغشاء بمحلول لومينول متاحة تجارياً اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الكشف عن إشارة استخدام نظام تصوير تشيميلومينيسسينسي.

4-محطة معالجة المواد

  1. حصاد البنجر الأحمر الإعراب عن ∆87GAD65mut أجروينفيلتراتيد فراغ يترك في ذروة التعبير (11 نقطة في البوصة) وتجميدها في نيتروجين سائل.
  2. ليوفيليزي يترك المجمدة ح 72-50 درجة مئوية و 0.04 [مبر]. تخزينها في-80 درجة مئوية.
  3. تطحن الأوراق إلى مسحوق ناعم وتخزينها في RT في حاوية مغلقة مع هلام السليكا استبعاد الرطوبة.

5-المعدة الهضم المحاكاة وخلية تحليل سلامة

  1. محاكاة عملية الهضم المعدة
    1. تزن 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه مطحون وريسوسبيند أنه في 6 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
    2. قم بضبط درجة الحموضة عينة إلى 2 مع 6 M HCl.
    3. إضافة بيبسن 4 مغ/مل من الغشاء المخاطي المعدة الخنزير في 10 ملم HCl للحصول على تركيز 1 ملغ/مل بيبسن نهائي أو بنسبة 01:20 إلى مجموع البروتينات القابلة للذوبان. هزة العينة في 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
    4. ضبط العينات لدرجة الحموضة 8 مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 لإلغاء تنشيط في محيط.
    5. الطرد المركزي 750 مختبرين ميليلتر لكل عينة في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية بشكل منفصل وريسوسبيند بيليه في مجلد واحد طافية تحميل المخزن المؤقت (1.5 م تريس HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 3% الحزب الديمقراطي الصربي ووالغليسيرول 15% 4% 2-ميركابتوثانول).
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة، ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء الدخان لإعداد نموذج.
    6. تحليل المادة طافية وبيليه ريسوسبينديد ب تحليل لطخة غربية8.
  2. تحليل سلامة الخلية
    1. إعداد نموذجين من 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه مطحون وريسوسبيند في 6 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) على حد سواء.
    2. ضبط درجة الحموضة من فقط واحدة عينة إلى 2 مع 6 M HCl. يهز كل العينات في 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
    3. الطرد المركزي 750 مختبرين ميليلتر لكل عينة في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية بشكل منفصل وريسوسبيند بيليه في مجلد واحد طافية تحميل المخزن المؤقت.
    4. تحليل المادة طافية وبيليه ريسوسبينديد بتحليل لطخة غربية.

6-بيوبوردين بالانزيم

  1. تزن 100 مغ أوراق البنجر الأحمر المعصوفه. ريسوسبيند المسحوق في 8 مل PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) ودوامه لمدة 1 دقيقة.
  2. إعداد متوسطة رطل دون المضادات الحيوية أو التي تحتوي على (ط) 50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين (ثانيا (50 ميكروغرام/مل كل الريفامبيسين وكاربينيسيلين، (ثالثا) 50 ميكروغرام/مل كل الريفامبيسين وكاناميسين أو (رابعا) 50 ميكروغرام/مل كل من الريفامبيسين وكاربينيسيلين وكاناميسين.
  3. بلايت 1 مل من كل هوموجيناتي ليف المعصوفه في واحدة من وسائل الإعلام الانتقائي 5 رطل.
  4. احتضان جميع لوحات لمدة 3 أيام في 28 درجة مئوية.
  5. عد المستعمرات المتبعة التي نمت في كل لوحة.
  6. حساب وتحديد المسؤول عن البكتيريا المتبقية كعدد وحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي) الواحد مل من نبات المعصوفه هوموجيناتي (زيمبابوي/mL).

7-المستقلب الاستخراج

  1. استخراج المستقلب الرئيسي
    1. تزن 30 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيكي 2 مل.
    2. إضافة ميليلتر 750 الباردة 70/30 (v/v) الميثانول/كلوروفورم ودوامه لإينكوباتي س. 30 في-20 درجة مئوية ح 2.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. إضافة 600 ميليلتر من الماء البارد وأجهزة الطرد المركزي في 17,900 س ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 جمع ونقل في مرحلة hydroalcoholic العلوي في أنبوب 2 مل جديدة. تجاهل مرحلة تشلوروفورميك السفلي وفي الطور البيني.
    4. وضع العينات في مركز فراغ ح 3 إلى تتبخر المذيبات.
    5. حل بيليه التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.1.4 في 300 ميليلتر من 50/50 (v/v) الاسيتو الانيتريل والماء و sonicate عينات لمدة 3 دقائق.
    6. تمرير الحلول من خلال 0.2 ميكرومتر غشاء فلاتر ووضعها موضع شفافية ثابت 300 ميليلتر إدراج أنابيب زجاجية.
  2. استخراج المستقلب الثانوية
    1. تزن 300 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيك 15 مل.
    2. أضف 3 مل ميثانول، دوامة لمدة 30 ثانية، و sonicate في 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. الطرد المركزي هذه العينات في س 4,500 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل سوبيرناتانتس في أنابيب 15 مل جديدة.
    4. ميليلتر 100 مخفف لاستخراج 1:3 (v/v) مع الماء وتمرير الحل من خلال مرشح غشاء 0.2 ميكرومتر.
    5. وضع الحل في أنبوب زجاج إدراج 300 ميليلتر ثابتة شفافة.
  3. استخراج الدهن القطبي
    1. تزن 200 ملغ-80 درجة مئوية المخزنة، وفراغ أجروينفيلتراتيد ∆87GAD65mut-الإعراب عن مسحوق نبات البنجر الأحمر في أنبوب بلاستيك 15 مل.
    2. إضافة 200 ميليلتر من الماء ومن ثم 2 مل من الميثانول، ومن ثم الحفاظ على الجليد ح 1.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات والمواد المضافة إلى الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. دوامة لمدة 30 ثانية و sonicate في 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة.
    4. الطرد المركزي على عينات في س 4,500 ز في 4 درجات مئوية عن 25 دقيقة جمع ونقل في مرحلة كلوروفورم في أنابيب 2 مل. تجاهل مرحلة hydroalcoholic العلوي وفي الطور البيني.
    5. وضع العينات في مركز فراغ ح 3 إلى تتبخر المذيبات.
    6. حل بيليه التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.3.5 مع 600 ميليلتر من الميثانول.
    7. ميليلتر 100 مخفف لاستخراج 1:5 (v/v) مع الميثانول وتمرير الحل من خلال عامل تصفية غشاء 0.2 ميكرومتر.
    8. وضع الحل في أنبوب زجاج إدراج 300 ميليلتر ثابتة شفافة.

8-السائل اللوني الكتلي تحليل ومعالجة البيانات

  1. إعداد نظام LC-مرض التصلب العصبي المتعدد حسبما أوصت به المورد.
    ملاحظة: المقطع LC يتكون من أوتوسامبلير يقترن [هبلك] مزودة بعمود حرس C18 (75 × 2.1 ملم، والجسيمات حجم 5 ميكرون) أمام عمود C18 (150 × 2.1 ملم، والجسيمات حجم 3 ميكرومتر) لتحليل نواتج الأيض الثانوية والدهون القطبية ، بينما مع عمود حرس هيليك (7.5 × 2.1 ملم، 3 ميكرومتر) أمام عمود هيليك (150 × 2.1 ملم، والجسيمات الحجم 2.7 ميكرومتر). مرض التصلب العصبي المتعدد مطياف شامل فخ أيون تزويدها تاين اليكتروسبراي (ESI) أو مصادر التأين الكيميائي (المبادرة) في ضغط الجوي.
  2. إعداد المذيبات المناسبة للتدرجات [هبلك]. لتحليل المستقلب الرئيسي، استخدم فورمات الأمونيوم عيار 20 ملم كمذيب ألف؛ الاسيتو الانيتريل 95%، 5% من المياه بالإضافة إلى فورمات الأمونيوم 10 ملم كباء المذيبات لتحليل المستقلب الثانوية، استخدام المياه بالإضافة إلى 0.05% حمض الفورميك (A) والاسيتو الانيتريل زائد حمض الفورميك 0.05% (ب). لتحليل الدهن القطبي، واستخدام المياه بالإضافة إلى 0.05% حمض الفورميك (A) و 100 ٪ الاسيتو الانيتريل (ب).
    ملاحظة: المذيبات والمواد المضافة يجب أن يكون الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
  3. استخدام التدرجات عنها في الجدول 1 شطف المستقلب. مجموعة التدفق معدل 0.2 مل/دقيقة حقن 10 ميليلتر لكل عينة لنواتج الأيض الثانوية والدهون القطبية، بينما تضخ 5 ميليلتر لنواتج الأيض الأساسي.
  4. إعداد عينة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) بخلط أجزاء متساوية من عينات مختلفة خليط ممثل لكل حالة تجريبية. تحليل عينة مراقبة الجودة أثناء التجربة لرصد فعالية الصك. على وجه التحديد، إدراج إجراء تحليل عينة مراقبة الجودة بعد كل 10 عينة--دفعة.
  5. العينات لتجنب آثار أداة يحركها بطريقة عشوائية.
  6. بعد تحليل 9، قم بإدراج عمود التنظيف الأسلوب وتحليل فارغة مباشرة بعد.
    ملاحظة: إجراء تدرج بطيء بين المذيبات اثنين مع شطف isocratic نسبة مئوية عالية من المذيب أقوى. الفراغ يتكون من حقن الميثانول النقي: المياه (50/50، v/v) لتحسين الاحتفاظ الوقت إمكانية تكرار نتائج في التحليل التالي.
  7. إعداد الأداة للحصول على الأطياف الشامل في وسائط بديلة التأين الإيجابية والسلبية باستخدام المعلمات المسرودة في الجدول 2.
    ملاحظة: معلمات أخرى تعتمد على منصة محددة.
  8. القيام بتجهيز البيانات التالية كما هو موضح في Dal سانتو et al.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في هذا العمل، وسير العمل لتطوير لقاح الشفوي في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل. أن التركيز في هذا العمل هو التعبير عن البروتين المستهدف في أنواع النباتية مضيف الصالحة للأكل، وتوصيف اللقاح الفموي المحتملة.

وشملت الخطوة الأولى في تقييم مدى ملاءمة التكنولوجيا التعبير المستندة إلى فيروس مصنع لإنتاج البروتينات المؤتلف في النظم النباتية الصالحة للأكل. لهذا الهدف، نستخدم أولاً اجفب بروتين نموذجي وأعربنا عن ذلك في زيوت الطعام النباتية المورقة نظامين: البنجر الأحمر والسبانخ. وكانت النباتات يدوياً أجروينفيلتراتيد مع تعليق من A. tumefaciens تحمل ناقلات التعبير المؤتلف اجفب. كان تصور بتحليل لطخة غربية (الشكل 1 أ، ب، د، ه) تعبير البروتينات الفلورية وكمياً تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وأظهرت النتائج أن النظام البنجر الأحمر يتميز بتعبير اجفب أعلى، تصل إلى ± 10.9 544.9 ميكروغرام/غرام من الوزن طرفية جديدة (مؤجرة) في 9 نقطة في البوصة (الشكل 1)، من السبانخ، وقيست فيها مستويات الحد الأقصى اجفب (113.4 ± 0.3 ميكروغرام/غرام مؤجرة) ب 11 نقطة في البوصة ( الشكل 1F). لهذه الأسباب اختير البنجر الأحمر المضيف التعبير لجميع التجارب اللاحقة.

ووفقا لتشن وآخرون10، تم اختبارها تعبير عابر اجفب بطريقة الشفط للتسلل، الذي أكثر ملاءمة لإنتاج اللقاحات واسعة النطاق. تخفيف آخر لبين عشية وضحاها الثقافة A. tumefaciens ، تتراوح من 10-1 إلى 10-3، وتركيزات مختلفة من المنظفات (0.005-0.05%) وقد تم اختبارها بمقارنة مستوى تراكم اجفب على التعبير الأقصى نقطة في البوصة (نقطة في البوصة 9). الاطلاع على النتائج أن أعلى التتر البكتيرية تنتج أكبر اجفب غلة (10-1 ~ 0.35). ومع ذلك، لا توجد اختلافات كبيرة عثر على استخدام المنظفات تركيزات مختلفة (البيانات لا تظهر).

ثم، كانت النباتات فراغ تسلل مع وقف A. tumefaciens في 0.35 OD600 و 0.01 في المائة من المنظفات. متى تم إنشاء منصة التعبير ونظام التسليم، التعبير عن هذين الشكلين من GAD65، GAD65mut، و N--لا شفاء منها اقتطاع النموذج (∆87GAD65mut)، تمت مقارنة في يوم تعبير الحد الأقصى، 5 و 11 نقطة لكل بوصة، على التوالي، كما سبق أنشأت11. بعد استخراج ملعقة صغيرة من أجروينفيلتراتيد يترك، جميع العينات التي تم تحليلها بواسطة لطخة غربية وكان نسبيا كمية البروتين المؤتلف بتحليل قياس كثافة (الشكل 2). أبرز نتائج برنامج أداء أعلى من النموذج ∆87GAD65mut على GAD65mut. ولذلك اختير شكل مبتوراً كمرشح مفضل من اللقاح الفموي، تتراكم عالية ك 201.4 ± 29.3 ميكروغرام/غرام مؤجرة في أوراق البنجر الأحمر ب 11 نقطة في البوصة.

وأخيراً، تم تقييم المعلمات لتطوير لقاح الشفوي المحتملة. تم تقييم سلامة البروتين المؤتلف بعد التجميد من فراغ تسلل إلى أوراق البنجر الأحمر تعرب عن ∆87GAD65mut بالمقارنة غير المعالجة (المجمدة فقط) الأنسجة، بتحليل لطخة غربية. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، أظهرت البروتين المستهدف أن تكون مستقرة بعد العملية ليوفيليزيشن.

أجريت محاكاة الهضم المعدة على المواد المعصوفه بإضافة إنزيم المعدة الخنزير بيبسن إلى تركيز نهائي 1 ملغ/مل أو بنسبة 01:20 بملعقة صغيرة. كلا الشرطين علاج الجهاز الهضمي أدى إلى تدهور البروتين المؤتلف، كما يتضح من تحليل لطخة غربية (الشكل 3، د، ه، وأفادت البيانات فقط لغرض تركيز 1 ملغ/مل النهائي بيبسن). عدم وجود إشارة محددة في عينات بيليه بعد الهضم بيبسن (الممرات بيبسن، ف 1-3)، واقترح أن الخلايا النباتية بعد التجميد العلاج، فقدت سلامتها، مما أدى إلى تدهور البروتين الهدف.

وأظهر تقييم سلامة الخلية أنه عندما كان حراكه الأنسجة النباتية المجففة في المخزن المؤقت مع الأس الهيدروجيني المحايدة (درجة الحموضة 7.4)، ∆87GAD65mut كان جزئيا سولوبيليزيد، مما يوحي بأن على الأقل بعض الخلايا قد كسر خلال أوراق الطحن والتجفيف. استثارة الأنسجة النباتية المجففة في الظروف الحمضية، وبدلاً من ذلك، أدت إلى الكشف عن ∆87GAD65mut فقط في الجزء غير قابلة للذوبان. ربما كان هذا بسبب هطول الأمطار ∆87GAD65mut الناجمة عن pH منخفضة، بالإضافة إلى محتوى البروتين من الخلايا دون انقطاع11. هذه الاختبارات تشير إلى أن تجميد التجفيف ويمكن اختيار كعلاج لإعداد لقاح مرشح.

وعلاوة على ذلك، تم تقييم التهمة الميكروبية المتبقية في أوراق البنجر الأحمر أجروينفيلتراتيد.

عرض المقايسة بيوبوردين القضاء على العلاجات استغلالها لإعداد لقاح مرشح الحمولة البكتيرية11.

قيمت التكافؤ الأيضية لنباتات البنجر الأحمر ∆87GAD65mut والتحكم ببصمات والايضات الابتدائي والثانوي والدهون القطبية تولدها LC-مرض التصلب العصبي المتعدد من تسعة مصانع البنجر الأحمر تعرب عن ∆87GAD65mut، تسعة من عناصر التحكم أجروينفيلتراتيد و تسعة البرية من نوع الضوابط. وكشف إحصاء محكمة التحكيم الدائمة مجموعة النباتات البرية من نوع فصل من جميع العينات الأخرى. وسلط بدلاً من ذلك لا توجد اختلافات كبيرة بين ∆87GAD65mut ومحطات مراقبة تسلل والسلبية. وعلاوة على ذلك، لا يوجد فرق كبير بين ثلاث مجموعات من النباتات من حيث الملامح الدهن القطبي كان حددت11.

Figure 1
رقم 1: مقارنة بين مستويات التعبير اجفب في أجروينفيلتراتيد أحمر البنجر والسبانخ يترك. الغربية لطخة تحليل (أ، د) وتحميل عناصر التحكم المقابلة (روبيسكو وحدة فرعية كبيرة) ملطخة "أخذ الرائعة الأزرق" (ب، ه) من مستخلصات البروتين من التعبير عن اجفب جمع عينات أوراق أثناء التحليل وقت الدورة من 4 إلى 14 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة). محتوى اجفب لاستخراج البروتين كل أوراق كان كمياً بالقياس الأسفار (ج، و). يتم عرض النتائج من عينات أوراق البنجر الأحمر أجروينفيلتراتيد في اللوحة اليسرى، حيث أظهرت عينات السبانخ أجروينفيلتراتيد في حق واحد. تم تحميلها كميات متساوية من مستخلصات البروتين، 3.5 ميكروغرام لوصمة عار الغربية و 30 ميكروغرام لتلطيخ أخذ. وقد استخدمت جسم اجفب المضادة كتحقيق في تحليل لطخة غربية. الجانب الأرقام تشير إلى علامات كتلة جزيئية في كاتشين. p.c.، مراقبة إيجابية، 10 نانوغرام GAD65 البشري الماشوب التجارية؛ نورث كارولاينا، المراقبة السلبية، مقتطف من أوراق تسلل فقط مع A. tumefaciens تحمل 5 '-ووحدات إينتيجراسي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من ثلاث تجارب مستقلة. لقد تم تعديل هذا الرقم من برتيني et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مستويات التعبير GAD65mut و Δ87GAD65mut في أوراق البنجر الأحمر. تحليل لطخة غربية (A) وتحميل عنصر التحكم المطابق (روبيسكو وحدة فرعية كبيرة) ملطخة "أخذ الرائعة الأزرق" (ب) البروتين مقتطفات من أوراق البنجر الأحمر ثلاثة معربا عن Δ87GAD65mut (يسار) و GAD65mut (يمين). وقد استخدمت جسم المضادة إدماج المرأة في التنمية كتحقيق في تحليل لطخة غربية (الممرات كانت محملة 20 ميكروليتر من استخراج ل GAD65mut وميكروليتر 1 لاستخراج ل Δ87GAD65mut). تم تحميل نفس الحجم من مستخلصات البروتين (10 ميكروليتر/لين) في أخذ الملون هلام، ل GAD65mut و Δ87GAD65mut. الجانب الأرقام تشير إلى علامات كتلة جزيئية في كاتشين. p.c.، مراقبة إيجابية، 10 نانوغرام GAD65 البشري الماشوب التجارية؛ نورث كارولاينا، مراقبة سلبية، وانتزاع تم الحصول عليها من أوراق تسلل فقط مع A. tumefaciens تحمل 5 '-ووحدات إينتيجراسي. (ج) استخدام رسم عنصر التحكم لطخة غربية إيجابية كمرجع لتحليل دينسيتوميتريك، مستويات التعبير النسبي من أشكال البروتين اثنين. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من ثلاث تجارب مستقلة. لقد تم تعديل هذا الرقم من برتيني et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تقييم المرشحين اللقاح الفموي. على الجانب الأيسر، تحليلات للبروتين الاستقرار بعد التجميد العلاج (أ، ب). تحليل لطخة غربية (A) وجل المقابلة ملطخة "أخذ الرائعة الأزرق" (ب) تمثل ثلاثة مقتطفات المستقلين من يترك الإعراب عن Δ87GAD65mut. يترك المقطوع مباشرة المجمدة (جديدة) أو المجففة بالتبريد في-50 درجة مئوية، 0.04 [مبر] ح 72 (تجميد المجفف). نسب مختلفة من الأنسجة: المخزن المؤقت يعملن أثناء استخراج ملعقة صغيرة من أجل النظر في فقدان المياه بسبب الجفاف. تساوي حجم مقتطفات تم تحميلها، 0.25 و 10 ميليلتر، لطخة غربية وأخذ تلطيخ على التوالي. وقد استخدمت جسم جاد لمكافحة وصمة عار الغربية سبر الجانب أرقام تشير إلى علامات كتلة جزيئية في كاتشين. نورث كارولاينا، المراقبة السلبية، مقتطف من أوراق infiltrated فقط مع A. tumefaciens تحمل 5 '-ووحدات إينتيجراسي. على الجانب الأيمن، في المختبر محاكاة الهضم المعدة من Δ87GAD65mut (ج، د، ه). تحليل لطخة غربية (ج، د) وجل المقابلة ملطخة "أخذ الرائعة الأزرق" (ه) يمثلون مقتطفات المستقلين ثلاثة أوراق معربا عن Δ87GAD65mut بعد الهضم المعدة محاكاة. 1 ملغ/مل بيبسن أضيفت إلى 100 مغ أنسجة المجففة بالتبريد، بينما عينة تحكم دون الإنزيم قد استخدمت. ميليلتر 24 و 16 ميليلتر، سوبيرناتانتس (s) والكريات (p) على التوالي التي تم الحصول عليها في الخطوة النهائية الطرد المركزي، قد استخدمت لتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. واستخدمت كتحقيقات في تحليل لطخة غربية مضادة إدماج المرأة في التنمية (ج) والأجسام المضادة--LHCB2 (د). الجانب الأرقام تشير إلى علامات كتلة جزيئية في كاتشين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الأيض الأساسي (100 دقيقة) الوقت (دقيقة) % A % ب المدة (دقيقة) نوع
الأولى 0 100 - الحالة الأولى
0 0 100 10 إيسوكراتيك
10 15 85 15 التدرج
25 15 85 5 إيسوكراتيك
30 50 50 10 التدرج
40 50 50 30 إيسوكراتيك
70 0 100 1 التدرج
71 0 100 29 Isocratic (إعادة التوازن)
نواتج الأيض الثانوية (60 دقيقة) الوقت (دقيقة) % A % ب المدة (دقيقة) نوع
الأولى 98 2 - الحالة الأولى
0 90 10 2 التدرج
2 80 20 10 التدرج
12 75 25 2 التدرج
14 30 70 7 التدرج
21 30 70 5 إيسوكراتيك
26 10 90 1 التدرج
27 10 90 14 إيسوكراتيك
41 98 2 1 التدرج
42 98 2 18 Isocratic (إعادة التوازن)
الدهون القطبية (90 دقيقة) الوقت (دقيقة) % A % ب المدة (دقيقة) نوع
الأولى 50 50 - الحالة الأولى
0 0 100 10 التدرج
10 0 100 65 إيسوكراتيك
75 50 50 1 التدرج
76 50 50 14 Isocratic (إعادة التوازن)

الجدول 1: شروط التدرج شطف المستقلب في تحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.

مطياف كتلة مكونات الدالة معلمات
والايضات الرئيسية نواتج الأيض الثانوية الدهون القطبية
مصدر التأين (ESI) اليكتروسبراي Nebulizing الغاز 50 psi 350 درجة مئوية 50 psi 350 درجة مئوية -
تجفيف الغاز 10 L دقيقة-1 10 L دقيقة-1
مصدر المواد الكيميائية التأين (المبادرة) الضغط الجوي Nebulizing الغاز - - 50 psi 350 درجة مئوية
تجفيف الغاز 10 L دقيقة-1
المرذاذ 450 درجة مئوية
فخ أيونات وكشف المسح الضوئي وضع المسح الضوئي الكامل m/z 13,000 في الثانية m/z 13,000 في الثانية m/z 13,000 في الثانية
50-1,500 m/z 50-1,500 m/z 50-1,500 m/z
مسح نطاق 200 m/z 400 m/z 700 m/z
استهداف الإعلام
الغاز الاصطدام الهيليوم
ضغط الفراغ [مبر] 1.4 × 10-5
مصدر الشعرية +4,500 الخامس +4,500 الخامس +4,000 الخامس
لوحة نهاية الإزاحة -500 الخامس -500 الخامس -500 الخامس
مقشده 40 الخامس -40 الخامس 40 الخامس
إنهاء عملية النداءات الموحدة 106 الخامس -121 الخامس 143.5 V
1 أكتوبر DC 12 V -12 V 12 V
2 أكتوبر DC 1.7 V -1.7 الخامس 2 الخامس
عدسة 1 -5 الخامس 5 الخامس -5 الخامس
عدسة 2 -60 V 60 V -60 V
المحكمة الجنائية الدولية للوضع الإيجابي التأين 20
المحكمة الجنائية الدولية لوضع التأين السلبي 7

الجدول 2: معلمات لاقتناء سبكترا الشامل في صيغ بديلة من التأين الإيجابية والسلبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واظهرنا في هذه الدراسة تحليل أولى لتصميم لقاح المرشح عن طريق الفم لمرض السكري المناعة الذاتية. البروتين المستهدف لهذه التجربة هو أحد أشكال كاتشين 65 البشرية Decarboxylase غلوتامات، هي الإنتاج والوظائف التي لا يمكن اكتشافها بسهولة وقابلة للقياس12المتحولة. في التعبير في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل مختلفة توسط ناقلات5، التي تتوسط مستوى عال من إنتاج البروتين المؤتلف في غضون فترة زمنية قصيرة جداً. اختيار أفضل مرشح النبات المضيف الصالحة للأكل وأجرى استناداً إلى تعبير اجفب في البنجر الأحمر ويترك السبانخ أجروينفيلتريشن اليدوي. يمكن أن تكون هذه الخطوة الحاسمة للارتقاء الصناعي بسبب إجراءات تستغرق وقتاً طويلاً أجروينفيلتريشن اليدوي والصلابة في تسلل أنسجة نبات السبانخ.

تحديد نقطة في البوصة المحددة للحصاد الذي يعطي أعلى مستوى تراكم البروتين المؤتلف لبروتين المؤتلف خطوة بالغة الأهمية، وتحتاج إلى اختبار واختيار على أساس حالة بحالة. تحليل تعبير البروتينات الفلورية في إدارة شؤون الإعلام المختلفة (من 4 إلى 12)، يسمح بتحديد يوم التعبير كحد أقصى في كل نظام النباتية. المقارنة بين تركيز اجفب (ميكروغرام/غرام، مؤجرة)، في هذه الأيام تعبير الحد الأقصى، وأبرز أن الأحمر البنجر هو أفضل أداء النظام الأساسي من حيث البروتين المؤتلف الغلال.

ولهذا السبب، تم اختبار البنجر الأحمر كذلك لتسليم ناقلات القائم على الفيروسات النباتية بنظام الشفط، الذي يعتبر أكثر ملاءمة ل الإنتاج الصناعي على نطاق واسع اللقاح13.

ونظرا لأن بروتوكول قياسي تسلل الفراغ هو الأمثل ل أنواع التبغ5، إنشاء مجموعة من المعلمات للتعديل الداخلي للأنواع النباتية التي تعتبر نقطة حرجة. ثم، كان الأمثل في بروتوكول أجروينفيلتريشن فراغ البنجر الأحمر. لدينا أدلة تبين أن التخفيف المتبعة حاسمة لتحسين مستويات التعبير البروتين، في حين تركيز المنظفات لزيادة نفاذية ليف. وأظهرت النتائج أن نظام المصنع والتكنولوجيا تتلاءم مع هذا الغرض العمل.

وأعرب عن شكلين مختلفين من GAD65 و GAD65mut و ∆87GAD65mut، التي كانت تتميز سابقا للتعبير عنها في بينثاميانا أ7، عرض التعريب الخلوية الفرعية المختلفة، في البنجر الأحمر تسلل الفراغ. وأعدت ثلاث replicates البيولوجية لكل عينة. ويتألف كل تكرار البيولوجية مجموعة أوراق تسلل ثلاثة من نباتات مختلفة، عينات من 2 إلى 14 نقطة في البوصة لكل أشكال GAD65. تمت مقارنة مستوى التعبير لتحديد البروتين تراكم أعلى في الأنسجة النباتية.

التحديد الكمي النسبي بتحليل لقياس كثافة أثبتت أن ∆87GAD65mut قد برنامج مستوى تعبير أعلى من نظيرتها سليمة. هذا يمكن أن يكون سبب لها التعريب سيتوسوليك بينما GAD65mut، سبب لها بقايا مرساة هذا النموذج إلى غشاء الخلية، انخفاض العائد7، مما يعكس استقرار بروتين أقل. وكان ∆87GAD65mut تراكم متوسط المستوى في أنسجة نبات البنجر الأحمر 201.4 ± 29.3 ميكروغرام/غرام مؤجرة، وكافية للبدء بتطوير اللقاح الفموي T1D.

وأخيراً، بعد اختيار أنسب شكل منصة والتكنولوجيا والبروتين، أننا تقدمنا بإعداد لعلاج ما بعد حصاد للأوراق المصابة. منذ أنسجة نبات يتكون من 95 في المائة مياه، مفيد لعلاج جفاف لمنع التلوث بالكائنات الدقيقة. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن علاج التجفيف يمكن أن تطبق على العينة، دون أن يؤثر ذلك على مستويات البروتين المؤتلف في الأوراق. إزالة المياه إذ التي lyophilization يزيل التلوث البكتيري (بيوبوردين)، بما في ذلك المؤتلف A. tumefaciens المستخدمة لإجراء أجروينفيلتريشن.

وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل تغليف البروتين الحيوي أن ∆87GAD65mut يهضم تماما بعد محاكاة هضم المعدة. وهذا يوحي بأن معاملة التجفيف يضر جدار الخلية النباتية، كشف البروتين المؤتلف لتشكيل البيئة المعدة الحمضية والانزيميه.

ويمثل الحفاظ على سلامة جزيء بروتين أو ببتيد عبر القناة الهضمية الانتقال إلى الموقع لاستيعاب قضية للمخدرات عن طريق الفم تسليم14. ومن ثم، بعد معالجة الجفاف، اللقاح المحتملة بشكل صحيح يصاغ للتغلب على البيئة المعدة دون أن تفقد سلامتها. في تصنيع اللقاح جاد المشتقة من النباتات، ويمكن تطبيق التغليف في قذيفة مستقرة نسبيا كنظام لتحسين فعاليتها، مما يسمح لها أن تكون محمية ومستقرة على طول الطريق التسليم الشفوي15.

تم استكشاف مختلف التقنيات للتغلب على المشاكل المرتبطة بتسليم شفوي من الجزيئات الكبيرة مثل بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا في كومبليكسيشن المائية الاصطناعية مع الأنسولين السريع والإنسولين مما يدل كفاءة عالية تغليف حرر في الأمعاء ب طريقة تعتمد على درجة الحموضة16،17.

كان التحقيق كلا التكافؤ المستقلب الرئيسي والثانوي النباتات معربا عن ∆87GAD65mut بالمقارنة بتسلل وعدم تسلل عناصر التحكم باستخدام إحصاءات محكمة التحكيم الدائمة. الاختلافات بين النباتات تسلل الإعراب عن ∆87GAD65mut وتسلل عناصر لم تكن كبيرة، بينما شكلت النباتات البرية من نوع غير تسلل مجموعة منفصلة. هذه النتائج تشير إلى أن النباتات تسلل تتميز من محطات غير المعالجة بالتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد بفضل نواتج الأيض البكتيرية أو نواتج الأيض التي تنتجها المصانع بسبب التسلل، كما هو موضح مسبقاً في الأدب13. عموما أثبت هذا التحليل أن تراكم ∆87GAD65mut له أثر ضئيل على التمثيل الغذائي الشامل.

تماما هذه النتائج تشير إلى أن اللقاح الفموي المحتملة، ممثلة بأنسجة نبات البنجر الأحمر المعصوفه معربا عن ∆87GAD65mut الحصول على استغلال التكنولوجيا التعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية، ومناسبة للمناعي عن طريق الفم T1D التجريبية المحاكمات. تكنولوجيا ناقل التعبير الفيروسات النباتية أصبحت جذابة للغاية في مجال التعبير عابرة، نظراً لقدرتها على إنتاج البروتينات الخارجية على حد سواء سريعاً وعلى مستويات عالية. تستند هذه التكنولوجيا موجه فككت الذي يحمل الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا تعتمد وحركة البروتين5 فقط ولذلك فإنه يفقد العدوى في النباتات؛ نتيجة لذلك، ينبغي أن تستبعد انتقاله المحتملة على البشر.

ويمكن تمديد البروتوكول التجريبي ذكرت هنا لكثير من الأكل الأنواع المختلفة، مثل الخس، تشينوبوديوم كابيتاتوم و اكسبانسا تيتراجونيا. منذ يترك هذه الأنواع، بما في ذلك أحمر البنجر والسبانخ، التي اكتشفت سابقا كتعبير جيدة النبات نظم5، يمكن أن تستخدم كأغذية غير مطبوخة، قد تستخدم التكنولوجيا المقترحة هنا لتصنيع اللقاحات الصالحة للأكل أو إنتاج الأغذية الوظيفية المجهزة الحد الأدنى أو الأعلاف.

مزيج أنواع البروتين/النباتات المؤتلف، تحتاج إلى إدارة شؤون الإعلام من الحصاد الذي يعطي أعلى مستوى تراكم البروتين المؤتلف يحدد تجريبيا على أساس حالة بحالة اعتماداً على البروتين المؤتلف وأعرب عن وعلى المضيف الأنواع النباتية18.

تطبيق هذه التكنولوجيا لإنتاج اللقاح الفموي إمكانات كبيرة تصبح بديلاً للأمصال التقليدية في المستقبل القريب، بالإضافة إلى أونكوليتيك مكافحة الفيروسات واللقاحات ذاتي للأورام الليمفاوية والأورام الصلبة، و [مونوكلونل] إلى الهدف السرطان19،20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها المشروع المشترك "استخدام النباتات لإنتاج لقاح للأكل لمرض السكري المناعة الذاتية (أديفا)" (معرف المشروع: 891854) ممولة من جامعة فيرونا في إطار نداء عام 2014.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    - Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    - Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    - System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   - Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    - 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83, (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20, (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9, (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1, (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11, (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23, (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5, (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1, (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12, (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics